Штам актиноміцета streptomyces avermitilis imv ac 2161, який продукує авермектини

Штам актиноміцету Streptomyces avermitilis IMV Ac 2161, який продукує авармектини, сумарний вміст яких складає 30-85 мкг в 1 мл спиртового екстракту. (19) (21) 99126577 (22) 03.12.1999 (24) 15.02.2001 (33) UA (46) 15.02.2001, Бюл. № 1, 2001 р. (72) Ісаєнко Володимир Миколайович, Іутинська Галина Олександрівна, Чугуй Валентина Олексіївна, Крамаренко Раїса Миколаївна, Козирицька Валентина Євгенівна, Валагурова Олена Володими 34390 Фізіолого-біохімічні ознаки. Оптимальна температура росту 28°С. Оптимальне значення рН 6,8-7,4. Відношення до вуглеводів. Добре асимілює глюкозу, лактозу, арабінозу, рафінозу, ксилозу, частково сахарозу, рамнозу, інозит, не росте на фруктозі, маніті, целюлозі. Інші фізіолого-біохімічні ознаки штаму Ас 2161 представлені в табл. 2. Здатність штаму, що патентується, продукувати комплекс з 8-ми окремих авермектинів доведено наступними прикладами. Приклад 1. Продукування авермектинів в умовах поверхневого вирощування на твердих середовищах. Штам спочатку вирощували на косяках в пробірках з 5 мл картопляно-глюкозного агару (КГА) протягом 10 діб при 28°С. Склад КГА: до відвару 200 г очищеної картоплі у 1 л водопровідної води додають 3,0 г СаСО3, 0,15 г (NH4)2SO4, 20,0 г глюкози та 20,0 г агару. Стерилізують без глюкози 20 хв при 1 атм; концентрований розчин глюкози пастеризують окремо тричі і вносять до середовища перед розплавленням; рН середовища 7,2. Через 10 діб косяки з культурою заливали 5 мл 96%-ного етилового спирту на 30 хв для екстракції авермектинів з міцелію, а потім фільтрували через паперовий фільтр. Сумарний вміст авермектинів у спиртових екстрактах визначали колориметричним методом (Мосин В.А., Дриняев В.А., Мирзаев М.Н. Авермектины: колориметрический метод определения в культуральной жидкости Streptomyces avermitilis и кристаллических препаратах // Биотехнология. 1993. - № 1. - С. 9-12). В цих же екстрактах паралельно визначали вміст окремих авермектинів за допомогою тонкошарової хроматографії (ТШХ) на пластинках із силікагелем в системі гексан-ацетон-етанол у співвідношенні 56:24:4 (Дриняев В.А., С терлина Т.С., Березкина Н.Е. и др. Авермектины: естественная изменчивость штамма продуцента Streptomyces avrmitilis BKM Ac 1301 // Биотехнология. - 1993.№ 11-12. - C. 21-25). Штам Ac 2161, вирощений в умовах твердого середовища, продукує, за даними ТШХ, А1а, А2а, А1в, А2в, В1а, В2а, В1в і В2в авермектини, сумарний вміст яких в 1 мл спиртового екстракту сягає 30-36 мкг. Приклад 2. Продукування авермектинів в умовах глибинного вирощування в рідкому середовищі. Спочатку вирощували посівну культур у у 50 мл посівного середовища (ПС) в колбах об'ємом 750 мл протягом 28 годин при 28°С. Швидкість обертання качалки становила - 240 хв-1. Склад ПС (%): соєве борошно - 1,5; дріжджовий автолізат - 0,5; глюкоза - 2,0; рН середовища до стерилізації - 7,4. Посівний матеріал (5%) вносили в колби з 95 мл ферментаційного середовища (ФС). Склад ФС (%): соєве борошно - 1,2; дріжджовий автолізат - 0,4; кук урудзяний екстракт - 0,3; крейда - 0,45; К2НРО4 - 0,05; глюкоза - 5,0; водопровідна вода до 1 л. Середовище без глюкози стерилізується 20 хв при 1,5 атм; рН середовища до стерилізації - 7,6. Концентрований розчин глюкози стерилізували окремо і вносили перед засівом. Вирощування штаму проводили протягом 7 діб при 28°С в умовах перемішування. Авермектини екстрагували з міцелію у такий спосіб: по 10 мл рідкої культури вміщували у центрифужні пробірки і осаджували міцелій при 3000 хв-1 протягом 20 хв. Осад заливали охолодженою до 7-10°С дистильованою водою, перемішували і знову відділяли міцелій центрифугуванням при 3000 хв-1 протягом 10 хв. До вологої біомаси додавали 10 мл 96%-го етанолу і через 20 хв екстракції знову центрифугували за таких самих умов протягом 10 хв. У спиртовому екстракті визначали сумарний вміст авермектинів колориметричним методом з орциновим реактивом та вміст кожного з них окремо за допомогою високоефективної рідинної хроматографії (Miller T.W., L. Chalet, Cole D.J. et al. Avermectins, new family of potent anthelmintic agents: isolation and chromatographic properties // Antimicrob. Agents and Chemother. - 1979. - V. 15, #3. - p. 368-372). Запропонований штам актиноміцету Streptomyces avermitilis IMV Ac 2161 в умовах глибинного культивування продукує 68-75 мкг авермектинів в 1 мл спиртового екстракту. Вміст окремих авермектинів при цьому такий (%): A1 (A1a, A1 в) - 4,8; А2 (А2а, А2в) - 85,7; В1 (В1а, В1в) - 4,8; В2 (В2а,В2в) - 4,8. Штам, що патентується, має підвищену біосинтетичну здатність і синтезує 30-75 мкг авермектинів в 1 мл спиртового екстракту. 2 34390 Таблиця 1 Культуральні ознаки штаму актиноміцету Streptomyces avermitilis IMV Ac 21 б 1, який продукує авермектини Середовище Повітряний міцелій Субстратний міцелій 1 Чапек-агар (сахарозонітратний агар ) 2 3 Розчинний пігмент 4 Слабкий, світлосіруватий Безбарвний Відсутній Яєчно-альбуміновий агар Слабкий, темно-сірий із світло-сірим обідком Безбарвний Відсутній ISP-5 (гліцеринаспарагіновий агар ) Сірувато-білуватий Світло-коричневий, місцями з червонуватим відтінком Світло-бурий, слабочервонуватий ISP-4 (крохмалевоаміачний агар) ISP-6 (пептоново-дріжджовий агар з залізом) М’ясо-пептоновий агар Ваксмана (желатиновий поживний агар) Укол в желатин Сіруватий зі світлоСвітло-коричнюватий з че- Слабо-жовтувато-букоричнюватим відтінком з рвонуватим відтінком рий білими плямами Сірувато-білуватий із Темно-коричневий до чор- Темно-коричневий до слабким коричнюватим ного чорного відтінком Колонії гладенькі; світлоВідсутній Бур увато-жовтуватий бур уватий Відсутній Бур уватий Бурий Відсутній Темно-коричневі пластівці Темно-коричневий по кільцю Коричнево-жовтуватий по кільцю Темно-коричневий з жовтуватим відтінком Темно-коричневий Лакмусове молоко Відсутній Збиране молоко Відсутній Скибка картоплі Відсутній Темно-коричневий Світло-коричневий Темно-коричневий ISP-7 (тирозиновий пожив- Світло-сірий з домішками Світло-коричневий Світло-коричневий ний агар) білого КГА Сіро-коричнюватий з до- Темно-коричневий з жовту- Від бурого до світло(картопляно-глюкозний мішками білого ватим відтінком коричневого агар) Сіро-коричнюватий з до- Світло-бурий, місцями черГаузе-1 (мінеральний агар) Відсутній мішками білого вонуватий Сіруватий з світлокоСлабкий буруватоГаузе-2 (органічний агар) Бур увато-жовтуватий ричнюватим відтінком з жовтуватий домішками білого СР-1 (глюкозо-нітратний Слабкий, білуватий, з ві- Безбарвний, з віком жовтуВідсутній агар) ком сіруватій ватий Сірий з бурим відтінком ЖовтуватоГріна (молочний агар) Коричневий та з білим коричневий Світло-коричнюватий Сірувато-коричнюватий 3 Світло-коричнюватий Соєвий агар з жовтуватим відтіндомішками білого з жовтим відтінком ком Світло-сіруватоСвітло-коричневий до темГороховий агар Світло-коричневий білуватий з слабким буно-коричневого рим відтінком 3 34390 Таблиця 2 Фізіолого-біохімічні ознаки штаму актиноміцету Streptomyces avermitilis IMV Ac 2161, який продукує авермектини Показник Утилізація джерела вуглецю Утворення меланіну Гідроліз крохмалю Гідроліз казеїну Розрідження желатину Гідроліз ліпідів Руйнування клітковини Пептонізація молока Коагуляція молока Відновлення метиленової сині Відновлення нітратів Утворення H2S Утворення тирозинази Антибактеріальна активність Відношення до антибіотиків Результат спостереження Добре росте на: глюкозі, лактозі, мальтозі, арабінозі, рафінозі, ксилозі Слабо росте на: сахарозі, рамнозі, інозиті Не росте на: фруктозі, маніті, целюлозі Утворює Гідролізує добре Гідролізує слабо Розріджує добре Не гідролізує Не руйнує Пептонізує середньо Не коагулює Відновлює активно Відновлює до аміаку Не утворює Утворює середньо Не виявляє (тест-культури - Staphylococcus aureus 209, Escherichia coli 240533, Mycobacterium sp. B5, Proteus vulgaris, Bacillus subtilis 36, B. thuringiensis, Candida albicans 885/653 Чутливий до еритроміцину, неоміцину, гентаміцину, канаміцину та тетрацикліну. Не чутливий до ампіциліну __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2001 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 4