Штам streptomyces marinolimosus – антагоніст фітопатогенних мікроорганізмів

Реферат: Винахід належить до штаму Streptomyces marinolimosus IMB Ас-5025, який має антагоністичну активність стосовно мікроорганізмів-збудників захворювань рослин. UA 107122 C2 (12) UA 107122 C2 UA 107122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід належить до сільськогосподарської мікробіології та біотехнології, а саме до нового штаму актиноміцетів, що характеризується високою антагоністичною активністю стосовно фітопатогенної мікрофлори, зокрема здатністю до інгібування росту фітопатогенних мікроорганізмів, та може використовуватися для одержання біопрепаратів проти збудників грибних та бактеріальних хвороб рослин. Останні 2-3 роки бактеріальні хвороби рослин вийшли на рівень епіфітотій, викликаючи втрати урожаю до 30 %, а в окремих випадках 50-80 %. Має місце розвиток як бактеріозів, так і змішаних інфекцій, викликаних декількома збудниками, зокрема, бактеріомікозів. Фітопатогени, окрім зниження кількості і якості урожаю, сприяють накопиченню в рослинах, особливо в продуктах урожаю, мікотоксинів, небезпечних для здоров'я людини і тварин: знижують імунітет, сприяють зростанню онкологічних захворювань. На сьогодні провідне місце у системі захисту рослин від фітопатогенів та запобігання зниження врожаю посідають хімічні засоби. Проте використання пестицидів призводить до небажаних з точки зору екології наслідків. Розвиток та впровадження екологічно орієнтованих систем сільського господарства, одержання екологічно чистих продуктів є одним з найбільш перспективних напрямків розвитку сучасного сільського господарства. Основна роль у цьому підході належить біопрепаратам на основі корисних мікроорганізмів, які забезпечують захист рослин від фітопатогенів за рахунок екологічно безпечних засобів. Біопрепарати, створені на основі живих культур мікроорганізмів чи продуктів їх метаболізму, є високо ефективними, екологічно безпечними і все ширше впроваджуються в практику сільського господарства. Проте асортимент біологічних засобів захисту рослин, на відміну від хімічних, на сьогоднішній день є недостатнім. Тому одним з важливих напрямків досліджень є створення ефективних та екологічно безпечних біопрепаратів на основі нових штамів мікроорганізмів, зокрема, стрептоміцетів. Стрептоміцети - широко розповсюджена в ґрунті група мікроорганізмів. Вони завжди привертали до себе увагу дослідників, завдяки їх здатності утворювати у процесі життєдіяльності різноманітні біологічно активні речовини. Серед ґрунтових мікроорганізмів стрептоміцети відомі як продуценти біологічно активних сполук, зокрема антибіотиків. Такі сполуки являють собою макроциклічні лактони, хінони, ароматичні сполуки, аміноглікозиди, пептоліпіди, пептиди, амінокислоти тощо. Спектр їх дії доволі широкий: пригнічення синтезу клітинних оболонок бактерій і грибів, порушення функцій мембран, пригнічення синтезу білків, пуринів, піримідинів, нуклеїнових кислот, енергетичного метаболізму, окислювального фосфорилування тощо; серед них є також антибіотики антиметаболіти та імунодепресанти. Відомий штам Streptomyces avermitilis; ІMB Ас-5015, який є продуцентом авермектинів сполук з антипаразитарною активністю, що використовуються у складі інсектоакаронематоцидних препаратів (UA69639, опубл. 15.08.2006 року). Вказаний штам є основою нематоцидного препарату "Аверком", який ефективний стосовно паразитів рослин, проте не виявляє активності щодо фітопатогенних бактерій. Препарат Мікостоп (фірма Кеміра, FI) на основі штаму актиноміцета Streptomyces griseoviridis (Хлопцева Р.И. Использование биофунгицидов Микостоп и Триходермин (на основе Streptomyces griseoviridis и Trichoderma spp.j в борьбе с фитопатогенными грибами возбудителями корневой гнили огурца, - Экологическая безопасность в АПК, № 3, 2003, с. 451456) зареєстровано для використання в Росії. Зазначений штам є ефективним проти кореневих гнилей, проте не виявляє впливу на бактеріальні інфекції. У Росії було одержано штам актиноміцета Streptomyces felleus, що виявляє антагоністичні властивості по відношенню до фітопатогенних грибів (RU2052501, опубл. 20.01.1996 року). Зазначений штам входить до складу біопрепарату Арілін, який використовується для боротьби з фітопатогенними грибами. Вказаний штам є вибраним за прототип даного винаходу. Основним недоліком цього штаму є те, що його активність направлена на грибних інфекції у рослин та не проявляється стосовно бактеріальних збудників захворювань. Задача даного винаходу полягає у розширенні спектра антагоністичної активності, направленої як проти фітопатогенних бактерій, так і грибів, що є особливо актуальним у при змішаних інфекціях рослин. Вказана задача вирішується за рахунок одержання нового штаму Streptomyces marinolimosus ІMB Ас-5025, який має антагоністичну активність стосовно мікроорганізмівзбудників захворювань рослин. Штам Streptomyces marinolimosus ІMB Ас-5025 ізольовано у 2009 році з каштанового ґрунту мису Каліакра методом поверхневого розсівання водної суспензії ґрунту. 1 UA 107122 C2 5 10 15 20 25 30 Культурально-морфологічні та фізіолого-біохімічні особливості штаму: Streptomyces marinolimosus ІMB Ас-5025 утворює прямі конідієносці; спори мають гладку поверхню. Культура утворює колонії округлої форми, складчасті, шкіряні. Окрас колоній від білого до коричневого в залежності від складу агаризованого середовища. Культуральні та фізіолого-біохімічні властивості наведені в Таблицях 1 та 2. Активність штаму: штам Streptomyces marinolimosus ІMB Ас-5025 утворює комплекс біологічно активних речовин, що виявляють високу антагоністичну активність проти фітопатогенних бактерій, грибів. Спосіб, умови та склад середовища для довгострокового зберігання штаму: найкраще зберігається у ліофілізованому стані. Штам попередньо вирощують на вівсяному агарі протягом 10-14 діб при 28 °C. Спори і міцелій змивають стерильною водою, змішують з захисним сахарозно-желатозним середовищем (1:1) і ліофілізують в ампулах. Після висушування ампули запаюють і зберігають при кімнатній температурі у темряві. Вівсяний агар (г/л): вівсяні пластівці 20,0; агар 18,0; вода водогінна до 1 л; рН - 7,2. Сахарозно-желатозне захисне середовище: 30 %-ий розчин сахарози та 10 %-ий розчин желатину готують окремо. Сахарозу стерилізують текучим паром три рази; желатин стерилізують 20 хв. при 1,5 атм, в результаті чого утворюється желатоза. Готові компоненти з'єднують перед застосуванням у співвідношенні 1:1. Спосіб, умови та склад середовища для культивування штаму: Streptomyces marinolimosus ІMB Ас-5025 добре росте на багатьох агаризованих (див. Табл. 1) та відповідних рідких середовищах при температурі 26-28 °C. Склад рідкого середовища для визначення антагоністичної активності проти фітопатогенних бактерій та грибів (г/л): соєва мука - 12,0; дріжджовий автолізат - 4,0; кукурудзяний екстракт - 3,0; СаСО3-4,5: К2НРО4-0,5; глюкоза - 50,0; вода водогінна до 1 л; рН - 7,2. Генетичні особливості штаму - ауксотрофність, резистентність до антибіотиків, фагів та інші): Streptomyces marinolimosus ІMB Ас-5025 - типовий гетеротроф - утворює прямі спороносці (конідієносці) і спори (конідії) з гладкою поверхнею. Штам чутливий до еритроміцину, поліміксину, неоміцину, канаміцину, рифампіцину, офлокацину, перфлокацину, фуразолідону, олеандоміцину (зони затримки росту - від 10 до 36 мм), не чутливий до азитроміцину, ністатину, стрептоміцину, ампіциліну, бензилпеніциліну, цефенімому, цефтазидину, фурадоніну, метициліну. Таблиця 1 Культуральні властивості штаму Streptomyces marinolimosus ІMB Ас-5025 Середовище Субстратний міцелій Жовто-коричневий Жовто-бурий Мінеральний агар (Гаузе-1) Органічний агар (Гаузе-2) Глюкозо-нітратний агар Кремово-жовтий (модиф.Чапека) Картопляно-глюкозний агар (КГА) Жовто-коричневий Крохмалево-амонієвий агар (КАА) Кремово-тілесний Гліцерин-аспарагіновий агар (ГасА) Темно-тілесний Глюкозо-нітратний агар (СР-1) Буро-коричневий Сахарозо-нітратний агар (Чапека) Світло-коричневий Сусло-агар (СА) Кремово-карміловий Дріжджово-солодовий агар (ISP-2) Пісочний Желатиновий агар (ЖА) Жовто-коричневий М'ясо-пептонний агар (МПА) Жовто-коричневий Вівсяний агар (ISP-3) Жовто-коричневий 2 Пігментне забарвлення Повітряний міцелій Білий Розчинний пігмент Жовтий Білий Білий з жовтим Білий Коричневий з білим Сіро-білий Білий Білий Біло-коричневий Жовтий Жовто-бурий Шкірястий Жовто-бурий Жовтий UA 107122 C2 Таблиця 2 Фізіолого-біохімічні властивості штаму Streptomyces marinolimosus ІMB Ас-5025 Показник Утилізація джерел вуглецю Утворення меланіну Розрідження желатину Пептонізація молока Коагуляція молока Гідроліз крохмалю Відновлення нітратів Утворення H2S Руйнування клітковини Відношення до антибіотиків 5 10 15 20 25 30 35 40 Результат спостереження Росте на глюкозі, рамнозі, сахарозі, маніті; інозиті, сорбіті, маніт;слабо росте на арабінозі, ксилозі, фруктозі, целюлозі, лактозі Не утворює Не розріджує але росте Не пептонізує Не коагулює Гідролізує Відновлює до аміаку Утворює Не руйнує Чутливий до еритроміцину, неоміцину, поліміксину, канаміцину і рифампіцину; не чутливий до ністатину, ампіциліну. Запропонований згідно з винаходом штам Streptomyces marinolimosus ІMB Ас-5025 може бути використаний як основа комбінованого біопрепарату проти фітопатогенної мікрофлори. Даний винахід може бути проілюстрований приведеними нижче прикладами конкретного здійснення. Приклад В експерименті досліджували антагоністичну активність заявленого штаму Streptomyces marinolimosus ІMB Ас-5025. Культуру заявленого штаму вирощували на агаризованому або у рідкому середовищі (глибинним способам), при температурі +28±1 °C протягом 10 діб. У першому випадку використовували чашки Петрі або пробірки (по 20 мл середовища у кожну). У другому випадку культури вирощували на роторних качалках (n=240 об./хв.) у скляних колбах об'ємом 750 мл (50 мл на одну колбу). Посівний матеріал (маточна культура) вирощували впродовж доби і засівали ферментаційне середовище у кількості 5 % від об'єму. Склад агаризованих середовищ для вирощування стрептоміцетів (г/л): Вівсяний агар (ISP-3) - вівсяні пластівці 20; розчин мікроелементів (FeSO 4·7H2O-0,1; 3 МnСl2·4Н2О - 0,1; ZnSO47·H2O-0,1 в 100 см дистильованої води) 1 мл; агар 18; дистильована вода 1 л; рН 7,2. Вівсяні пластівці заливали гарячою водою на 10 годин, потім доводили до кипіння, відфільтрувати через кілька шарів марлі, поєднували з розплавленим у воді агаром і доводили об'єм до 1 л. Склад рідких поживних середовищ для вирощування стрептоміцетів в умовах глибинного культивування (г/л): середовище для посівної культури (МС) (г/л): соєве борошно - 15; дріжджі сухі - 5; глюкоза 20; водогінна вода до 1 л, рН 6,2; ферментаційне середовище (ФС 2) (г/л): соєве борошно - 12,0; дріжджовий автолізат - 3,0; кукурудзяний екстракт - 3,0 мл; глюкоза - 70,0; СаСО3-4,5; К2HРО4-0,3; водогінна вода до 1 л, рН 6.8-7,0, стерилізація 0,75 атм 20 хвилин; Фітопатогенні мікроміцети для визначення антагоністичної активності запропонованого штаму вирощували протягом 7 діб у термостаті за температури 28 °C при використанні наступних агаризованих середовищ: Агар Чапека (АЧ) (г/л) - глюкоза - 20; NaNO3-2; К2НРО4-1; MgSO4·7H2O-0,5; КСl-0,5; FeSO40,01; агар - 15; дистильована вода - до 1 л; рН 7,0-7,3, доводили молочною кислотою до рН 5,05,5. Сусло агар (СА) (г/л) - сусло 7° по Баллінгу - 1 л; СаСО3-1; агар - 15-25. До відповідної концентрації цукру сусло доводили водогінною водою. Сусло стерилізували при 0,5 атм протягом 20-30 хв., рН 5,3. Фармакопейні бактерії (Basillus subtilis B-901, В. subtil is B-903, Proteus vulgaris, Staphylococus aureus, Eshirihiya coli, Candida albicans) вирощували на м'ясо-пептонному агарі. Антогоністичні властивості стрептоміцетів визначали методом агарових блоків (поверхневе вирощування) або методом циліндриків (глибинне вирощування) (Бурцева С.А., Сирбу Т.Ф., Сланина Т.Ф. Антагонистические свойства новых штаммов микроорганизмов, выделенных из почв Молдовы // Мікробіологія і біотехнологія. 2007. № 1. - С. 40-45 або Методы почвенной микробиологии и биохимии / Под ред. Д. Г. Звягинцева. - М.: Изд-во Московского университета, 1991.-303 с.). 3 UA 107122 C2 5 10 15 20 25 Вказані методи базуються на дифузії продуктів метаболізму стрептоміцетів або рідкої культури у поживний агар, засіяний тест-культурою. Тест-культури висівали на поверхню відповідного поживного середовища, розтирали скляним стерильним шпателем для отримання рівномірного суцільного росту, накладали агарові блоки культури стрептоміцету, або розміщували скляні циліндрики, в які вносили по 0,2 мл культуральної рідини чи етанольних екстрактів біомаси стрептоміцету. Про наявність антагоністичної активності стрептоміцету свідчили зони відсутності росту тест-об'єкту навколо блоків після інкубації від 2 до 7 діб у термостаті за температури 28 °C. Вимірювали діаметр зон відсутності росту, мм. У дослідах використовували наступні фітопатогенні бактерії, отримані з колекції відділу Т фітопатогенних бактерій ІMB НАНУ: Pseudomonas syringae 8511 (УКМ В-1027 ) збудник захворювань бузку; P. syringae pv. atrofaciens 8291 (УКМ В-1015) - пшениці: Р. syringae pv. atrofaciens 7886 (УКМ В-1016) - пшениці; P. syringae pv. atrofaciens 9129 (УКМ B-l 154) - вівса і пшениці; P. syringae pv. coronafaciens 9060 - вівса; P. savastanoi pv. glicinea 8571 - сої; P. savastanoi pv. glicinea 8541 (УКМ B-l019) - сої; P. corrugata 9070 - томатів; Xanthomonas vesicatoriae 7790 - томатів і перцю; X. translucens 7696 - пшениці; X. axonopodis pv. glycines 9075 (УКМ B-l 162) - сої; X. axonopodis pv. glycines 8609 - сої; Clavibacter michiganensis ssp. michiganensis 102 - картоплі і томатів; Pantoea agglomeruns 8490 - бобових, а також фітопатогенні гриби, отримані з колекції відділу фізіології і систематики мікроміцетів ІMB НАНУ: Alternaria alternata 16814 - збудник альтернаріозу плодів томатів; Fusarium oxysporum 54201 збудник фузаріозу плодів томатів; F, oxysporum n.33 - збудник кореневої гнилі гороху; Nigrospora oryzae 16864 - збудник нігроспоріозу кукурудзи. Антагоністична активність заявленого штаму Streptomyces marinolimosus ІMB Ас-5025 стосовно фармакопейних культур є представленою у Таблиці 3. Антагоністична активність запропонованого штаму стосовно фітопатогенних бактерій та грибів представлена у Таблиці 4. Таблиця 3 Антагоністична активність штаму Streptomyces marinolimosus ІMB Ас-5025 стосовно фармакопейних культур мікроорганізмів Культури стрептоміцетів Streptomyces marinolimosus ІMB Ас-5025 В. subtilis В 901 Зони відсутності росту тест-культури, мм В. subtilis В P. vulgaris S. aureus С. albicans 903 15,5 10,5 11 17 0 E. coli 17,5 Таблиця 4 Антагоністична активність штаму Streptomyces marinolimosus ІMB Ас-5025 стосовно фітопатогенних бактерій та грибів Фітопатогенні бактерії та гриби Pseudomonas syringae В-1027Т P. syringae pv. atrofaciens B-1015 P. syringae pv. atrofaciens B-1016 P. syringae pv. coronafaciens B-1154 P. syringae pv. coronafaciens 9060 P. savastanoi pv. glycinea 8571 (соя) P. savastanoi pv. glycinea B-1019 P. corrugata 9070 Xanthomonas visicaloriae 7790 X. translucens 7696 X. anoxopodis pv. glycines B-1162 X. anoxopodis pv. glycines 8609 Clavibacter michiganensis ssp. michiganensis 102 Pantoea agglomerans 8490 Alternaria alternate 16814 Fusarium oxysporum 54201 F. oxysporum n.33 Nigrospora oryzae 16864 Зони відсутності росту тест-культур, мм 0/12** 0/0 42/26 28/22 0/34 16/16 26/14 0/18 0/0 16/22 0/20 0/18 14/30 48/0 21/30 19,5/16 14/12 27/23 Примітка: *«-» - не визначали. ** у чисельнику - екстракт з міцелію; у знаменнику - культуральна рідина; 4 UA 107122 C2 Таким чином, запропонований новий штам Slreptomyces marinolimosus ІMB Ас-5025 виявляє виражену антагоністичну активність стосовно широкого спектра фітопатогенів, як бактерій, так і грибів, що являє собою значну перевагу у порівнянні із відомими технічними рішеннями. 5 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ Штам Streptomyces marinolimosus IMB Ac-5025 - антагоніст фітопатогенних мікроорганізмів. Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5