Спосіб фіксації тканин для електронно-мікроскопічного дослідження з додаванням гамма-аміномасляної кислоти

Реферат: Спосіб фіксації тканин для електронно-мікроскопічного дослідження з додаванням гаммааміномасляної кислоти включає стандартний процес перфузії органів, зрошення поверхні вибраної зони; занурення тканин у фіксуючий розчин та відмивання шматочків після першої фіксації в буферному розчині. При цьому для приготування фіксуючих розчинів роблять суміш 1 % глютаральдегіду та 2,5 % параформальдегіду (1 фіксатор - перфузат) і 2 % розчину тетроксиду осмію (2 фіксатор); та для відмивання шматочків після першої фіксації в буферному розчині обов'язково додають гамма-аміномасляну кислоту. UA 112588 U (12) UA 112588 U UA 112588 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі медицини, а саме до нейроморфології. У літературі відомо багато методів фіксації мозку [Боголепов Н.Н. "Методы электронномикроскопического исследования мозга". - М.: Мед., 1976]. Техніка Карновського (1965) є найбільш поширеною. Суть її у фіксації за допомогою перфузії судинного русла, доповненої дофіксацією перфузату 12-14 годин з відмиванням в фосфатному буфері і зануренням в 2 % розчин тетроксиду осмію на 2 години, що і завершує цю стадію підготовки матеріалу для електронно-мікроскопічного дослідження (ЕМД). Автори провідних методик підкреслюють, що дотримання технік не рятує від появи артефактів фіксації при електронній мікроскопії об'єкта, особливо від змін екстра клітинного простору [K.K. Patel, I.F. Hartmanand M.M. Cohen, J. Neurol. Sci, 1971. - 12: 275-288]. Згідно з цим методом, вводили розчин глютамінової кислоти в рідину для інкубації шматочків і до розчинення осмію (1 гр. на 100 мл розчину) та домоглися ефекту зменшення набухання клітин і звуження екстра клітинного простору. Враховуючи, що відносини в нервовій тканині не просто осмотичні, а включають енергетичний обмін [Франк та ін., 1968. K.K. Patel et al.,1971], передбачалось, що введення фактора перевтілення глютамінової кислоти гамма-аміномасляної кислоти (ГАМК) в перфузат і фосфатний буфер могло також запобігти появі артефактів фіксації, що виникають при пошкодженні нервових структур у процесі взяття шматочків мозку in vivo. Задачею корисної моделі є пошук такої фіксації, яка покращує ультраструктуру тканин нервових елементів ЦНС і ПНС, і так само соматичних органів. Поставлена задача вирішується у способі фіксації тканин для електронно-мікроскопічного дослідження з додаванням гамма-аміномасляної кислоти, що включає стандартний процес перфузії органів, зрошення поверхні вибраної зони; занурення тканин у фіксуючий розчин та відмивання шматочків після першої фіксації в буферному розчині, у якому, згідно з корисною моделлю, для приготування фіксуючих розчинів роблять суміш 1 % глютаральдегіду та 2,5 % параформальдегіду (1 фіксатор - перфузат) і 2 % розчину тетроксиду осмію (2 фіксатор); для відмивання шматочків після першої фіксації в буферному розчині обов'язково додають гаммааміномасляну кислоту: фізіологічність дає - 1М фосфатний буфер рН 7,2-7,4, та ГАМК, яка додана до обох фіксаторів і буферу в пропорції 1 грам на 100 мл кожного розчину. Спосіб здійснюється наступним чином. Для максимального наближення до прижиттєвого стану клітин і нейропілю в суміш по Карновському (перфузат) і в фосфатний буфер додавали ГАМК в пропорції 1 грам на 100 мл. Після перфузії через серце сумішшю розчинів 1 % глютаральдегіду та 2,5 % параформальдегіду на 1М фосфатному буфері рн=7,4 декапітації і розтину черепа тварин перед видаленням шматочків ми скористалися аплікацією охолодженим до 2-5 градусів фіксатором з ГАМК на поверхню мозку. Виділені шматочки мозку для дофіксації розміщали також в перфузат, приготований на буфері, що містить ГАМК. Розсікали на тонкі пластинки, відмивали фосфатним буфером з ГАМК. Оптимальною є перфузія протягом 15-30 хвилин, зрошення та дофіксація зануренням в свіжому охолодженому перфузаті 30-60 хвилин, подрібнення та продовження дофіксації 12 годин, промивання фосфатним буфером з ГАМК та постфіксація в 2 % тетраоксиді осмію 2 години (Ph 7,2-7,4). Триразовим промиванням дистильованої водою закінчували процес фіксації і переходили до наступного етапу підготовки тканини для ЕМД - дегідратації. Таким чином, відмінністю способу стало додавання ГАМК в перфузат і в буферний розчин, застосований для розведення обох фіксаторів у вищезазначеній пропорції, промивання шматочків після фіксації в перфузаті цим буферним розчином та фіксація в осмії з ГАМК. Даний спосіб був застосований до ЕМД різних об'єктів, а саме до кори мозку, периферійних нервів в контролі регенерації щурів та у хворих пухлин шлунка (електронограми фіг. 1-7). Фіг. 1: Електронограма 1: Нервова тканина ЦНС сенсомоторної кори щура. Контроль. Міжклітинні щілини вузькі. Відростки без ознак вакуолізації та зрушення структур. Збільшення 9450. Фіксація перфузією, зрошенням та зануренням. Фіг. 2: Електронограма 2: Астроцит сенсомоторної кори щура. Міжклітинні простори вузькі. Органели та контактні відростки активні. Збільшення 9450. Фіксація (див. приклад 1). Фіг. 3: Електронограма 3: Міжнейронні зв'язки. Мієлінові волокна. Нейропіль сенсомоторної кори півкуль інтактного щура. Збільшення 9450. Фіксація (див. приклади 1 та 2). Фіг. 4: Електронограма 4: Мієлінові та безмієлінові волокна посттравматичної регенерації сідничного нерва щура. Контроль регенерації у периферійному відростку. Збільшення 3800. Фіксація зрошенням та зануренням. Фіг. 5: Електронограма 5: Становлення мієлінової оболонки в периферичному відростку сідничного нерва щура після травматичної регенерації 30 днів. Активні лемоцити 17.03.2016, Значний розвиток колагену. Набряку строми немає. Збільшення 3800. Фіксація зрошенням та зануренням. 1 UA 112588 U 5 10 15 20 25 30 Фіг. 6: Електронограма 6: Хвора на саркому шлунка К. Історія хвороби № 1976. Слизова оболонка, поверхневий епітелії поза пухлиною. Міжклітинні зв'язки не порушені, ознак набряку немає. Збільшення 18000. Фіксація зануренням. Фіг. 7: Електронограма 7: Хворий Г. Історія хвороби № 2255. Аденокарцинома шлунку. Клітини пухлини. Збільшення 10000. Фіксація зануренням. Позитивний ефект способу полягає в тому, що подібне поєднання процесів фіксації найвище наближає стан нервової тканини до прижиттєвого вигляду, діючи на елементи нейропілю та їх взаємини, екстраклітинні простори, на судини нервової тканини і структури гематоенцефалічного бар'єру. Наведені приклади електронограм підтверджують, що цей спосіб дозволяє визначити зміни, що найбільш рано виникають внаслідок забою тварин, наближаючи субмікроскопічні дані до стану структур непошкодженої тканини in vivo. Спосіб надійний в плані подальшого ЕМД нервової системи, механізмів впливу ГАМК на тканини через фіксатори. Він представляється не тільки як спосіб для фіксації нервової тканини методом перфузії, але й для фіксації тільки зануренням, наприклад, елементів периферійної нервової системи або шматочків соматичних органів. У всіх випадках використання даних розчинів ми спостерігали досить хорошу ультраструктуру нервових елементів тканин ЦНС і ПНС за відсутності артефактів фіксації. Спроба застосування подібного прийому до фіксації тканин інших органів для ЕМД за допомогою даного засобу підкріпила позитивні результати (тканини шлунка). ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб фіксації тканин для електронно-мікроскопічного дослідження з додаванням гаммааміномасляної кислоти, що включає стандартний процес перфузії органів, зрошення поверхні вибраної зони; занурення тканин у фіксуючий розчин та відмивання шматочків після першої фіксації в буферному розчині, який відрізняється тим, що для приготування фіксуючих розчинів роблять суміш 1 % глютаральдегіду та 2,5 % параформальдегіду (1 фіксатор перфузат) і 2 % розчину тетроксиду осмію (2 фіксатор); та для відмивання шматочків після першої фіксації в буферному розчині обов'язково додають гамма-аміномасляну кислоту: фізіологічність дає - 1М фосфатний буфер рН 7,2-7,4, та ГАМК, яку додають до обох фіксаторів і буферу в пропорції 1 грам на 100 мл кожного розчину. 2 UA 112588 U 3 UA 112588 U 4 UA 112588 U 5 UA 112588 U Комп’ютерна верстка М. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6