Спосіб прогнозування ризику розвитку проліферативного процесу міометрія в жінок, хворих на лейоміому матки

Реферат: Винахід належить до медицини, а саме до гінекології. Спосіб прогнозування ризику розвитку проліферативного процесу міометрія в жінок, хворих на лейоміому матки (ЛМ), полягає у імуногістохімічному дослідженні неураженого зразка міометрія, вилученого під час консервативної лейоміктомії, оцінці маркера проліферації Кі-67 за розробленою шкалою і визначенні ступеня виразності проліферативного процесу, де при значенні маркера Кі-67 від 0 до 10 судять про низький рівень ризику розвитку проліферативного процесу (РПП), при значенні від 10 до 30 - середній ризик РПП, а при значенні Кі-67 вище 30 - високий ризик розвитку проліферативного процесу. UA 115730 C2 (12) UA 115730 C2 UA 115730 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід належить до медицини, а саме до гінекології, і може бути використаний для прогнозування ризику розвитку проліферативного процесу міометрія в жінок, хворих на лейоміому матки (ЛМ). Актуальність заявленого способу визначається тим, що лейоміома матки є найбільш розповсюдженою доброякісною пухлиною у жінок репродуктивного віку, причому в останні роки з'явилася тенденція до збільшення частоти зустрічності лейоміоми матки в молодих жінок 20-30 років. Швидкий ріст лейоміоми матки може відбуватися за рахунок живлення вузла, розвитку набряку і дегенеративних змін (хибний тип росту) чи за рахунок підсилення проліферації міоцитів (істинний тип росту). Відомо, що проліферуюча міома матки має значно менш благоприємний перебіг. У пацієнток з даним типом пухлини частіше мають рецидиви пухлини, цих жінок також відносять до групи ризику по розвитку гіперпластичних процесів ендометрія і молочних залоз, а також по розвитку кістозних і злоякісних утворень в яєчниках. У зв'язку з цим, особливу актуальність являє собою розробка точних лабораторних критеріїв диференційної діагностики типу росту лейоміоми матки, котрі допомогли б лікарю своєчасно розробити оптимальну тактику ведення хворої і зробити вибір між консервативним і оперативним методами лікування. Найбільш близьким до заявленого технічного рішення є спосіб диференційної діагностики типу росту лейоміоми матки шляхом імунологічного дослідження периферичної венозної крові, при цьому визначають відносну кількість СД4-ІL-10 + лімфоцитів, і при значенні цього показника, що дорівнює 5,8 % і більше діагностують істинний ріст лейоміоми матки, а при значенні менше 5,8 % - хибний ріст лейоміоми матки в жінок репродуктивного віку. Однак недоліком вказаного способу є те, що він не дозволяє з достатнім ступенем вірогідності прогнозувати ризик розвитку і впливати на проліферативний процес, виконуючи лише генетичне дослідження венозної крові; відсутня можливість прогнозування рецидивів и ріст пухлини. В основу винаходу поставлено задачу вдосконалення способу прогнозування ризику проліферативного процесу міометрія в жінок, хворих на лейоміому матки шляхом додаткового гістохімічного проводять імуногістохімічне дослідження неураженого зразка міометрія, вилученого під час міомектомії, оцінка маркера проліферації Кі-67 за розробленою шкалою, що дозволить з високим ступенем вірогідності прогнозувати ступінь виразності проліферативного процесу міометрія, точно веріфікувати тип пухлини, що в свою чергу дозволить призначити адекватне лікування. Поставлена задача вирішується тим, що, згідно з винаходом, додатково проводять імуногістохімічне дослідження неураженого зразка міометрія, вилученого під час консервативної лейоміктомії, оцінюють маркер проліферації Кі-67 за розробленою шкалою визначення ступеня виразності проліферативного процесу і при значенні маркера Кі-67 від 0 до 10 судять про низький рівень ризику розвитку проліферативного процесу (РПП), при значенні від 10 до 30 визначають середній ризик РПП, а при значенні Кі-67 вище 30 прогнозують високий ризик розвитку проліферативного процесу. Спосіб виконується наступним чином. Імуногістохімічне дослідження матеріалу (тканини лейоміоматозних вузлів, міометрія, ендометрія матки) виконували за загальноприйнятою методикою шляхом демаскування антигенів у НВЧ-печі на серійних парафінових зрізах. Індекс проліферації (ІП) визначали маркером проліферації Кі-67 у незміненому міометрії поза ділянкою лейоматозних вузлів у поодиноких ядрах лейоміоцитів, ендотеліоцитах стінки судин, фібробластах. Незмінений міометрій вилучали трепан-біопсійною голкою під час консервативної міомектомії. Ядерний антиген Кі-67 - це протеїн, який виявляють лише клітини, що діляться. Діагностична цінність антигену Кі-67 полягає у тому, що протеїн не нагромаджується і не залишається у звичайних клітинах. Період його існування становить 1,5-2 год. Антиген Кі-67 є основною частиною нуклеарного матриксу 10-ї хромосоми фази мітозу і сприяє виявленню пухлинних клітин, що знаходяться в активній фазі клітинного циклу. Він проявляється чітким забарвленням ядер у темно-коричневий колір, більш інтенсивний колір ядерець, найбільш виразно — мітотичних фігур. Первинні специфічні мононуклеарні антитіла Кі-67 ядер проліферуючих клітин виявляли імуногістохімічним дослідженням на депарафінованих зрізах із попереднім демаскуванням антигену в цитратному буфері (рН 6,0) на водяній бані протягом 30 хвилин. Згідно з методикою як первинні антитіла використовували МкАТ до Кі-67 (Clone MIB-1) із застосуванням наборів DAKO Cytomation (Mouse/Rabbit PolyVueTM HRP/DAB Detection System). 1 UA 115730 C2 5 10 15 20 25 Оцінювали результат реакції за допомогою загальновизнаної системи EnVision (система візуалізації К 801221 En Vision FLEX, Dako Autostainer Instruments) та фотографували світловим мікроскопом (збільшення □ 400). Виявляли та підраховували клітини, ядра яких експресували моноклональні маркери (збільшення □ 40 окуляр □ 16 на 1000 клітин) [121]. Індекс проліферації Кі-67 вираховували співвідношенням кількості специфічно забарвлених ядер до кількості усіх ядер у відсотках на 1000 клітин: ІП10 % - низький, ІП 10-30 % - середній, ІП30 % - високий. Визначення високопотенційного міометрія до розвитку проліферативних процесів, тобто ЛМ проліферативного типу, може бути використане як патогенетичне обґрунтування до органозберігаючих операцій та терапії, спрямованої на пригнічення проліферації та посилення апоптозу, особливо у жінок репродуктивного віку. За рівнем ІП визначали обсяг терапії у післяопераційному періоді, профілактику ЛМ проліферативного типу. Хірургічна тактика. Виходячи із патоморфології, що ЛМ - це моноклон, який макроскопічно складається з основного вузла великих розмірів і "дочірніх" вузлів невеликих розмірів навколо нього, судин матки, у хірургічній тактиці важливими є: - видалення не лише одного вузла великих розмірів, а і дрібних навколо нього, тобто всього конгломерату, а отже, "зони росту"; - візуалізація судин у "ложі"; - ретельний гемостаз; - видалення субсерозних, інтрамуральних вузлів без проникнення у порожнину матки. Останнє є важливим за наявності репродуктивних планів жінки. Після ушивання тканин матки, досягнення гемостазу виконують за допомогою інтраопераційної пункційної біопсії (ПТБ) для визначення проліферативної активності у тканинах матки поза ділянкою лейоматозного вузла. Автором розроблено шкалу оцінки ступеня виразності проліферативних процесів за індексом проліферації (таблиця 1) Таблиця 1 Шкала оцінки ступеня виразності проліферативних процесів за індексом проліферації, % ІП низький середній високий Простого типу, малосимптомна Міксоїдна 1,0 1,1 25,0 42,7 Проліферативного типу, симптомна Мітотично Геморагічно Клітинна активна клітинна 1,2 1,4 1,3 25,2 25,6 25,4 44,2 47,7 46,2 Примітка. ІП  10 % - низький; ІП 10-30 % - середній; ІП  30 % - високий. 30 35 40 Результати імуногістохімічного дослідження. Досліджено тканини ЛМ, видалених при хірургічних втручаннях у 87 жінок репродуктивного віку. Із них 15 (група Б) - ЛМ простого типу, 72 (група В) - ЛМ проліферативного типу різних гістологічних варіантів: клітинний - 18 (25,0 %), міксоїдний - 18 (25,0 %), геморагічно клітинний - 18 (25,0 %), мітотично активний - 18 (25,0 %). Виявляли індекс проліферації за допомогою маркера проліферації Кі-67 у тканинах лейоматозних вузлів, у незмінених тканинах міометрія. Незмінений міометрій вилучали трепанбіопсійною голкою під час консервативної міомектомії. Характеристика проліферативної активності тканин є фактором, який визначає швидкість росту пухлини, ризик злоякісного перетворення, біохімічну відповідь на лікувальні заходи, подальший терапевтичний алгоритм тощо. Індекс проліферації (ІП) Кі-67 обчислювали за співвідношенням кількості специфічно забарвлених ядер до кількості усіх ядер у відсотках при аналізі понад 1000 клітин. Цей індекс виявляли у незміненому міометрії поза ділянкою лейоматозних вузлів у поодиноких ядрах лейоміоцитів, ендотеліоцитах стінки судин, у фібробластах. Визначення ІП за антигеном Кі-67 у тканинах лейоматозних вузлів і незміненому міометрії представлено у таблиці 2. 2 UA 115730 C2 Таблиця 2 Значення індексу проліферації за антигеном Кі-67 у видалених тканинах матки при лейоміомі матки у групах дослідження, % Досліджуваний матеріал ядра гладких міоцитів вузлів лейоміоми ядра гладких лейоміоцитів у міометрії поблизу вузлів клітиниекстрацелюлярного матриксу незмінений міометрій за межами пухлини Б, n=15 Міксоїдна, n=18 В, n=72, гістологічні варіанти Мітотично Клітинна, Геморагічно активна, n=18 клітинна, n=18 n=18 8,7 50,1* 52,7* 59,7* 56,9* 0,9 25,0** 25,2** 25,6** 25,4** 1,1 35,3** 35,4** 35,6** 35,4* 0,9 1,1 1,2 1,4 1,3 Примітки: 1. * - р0,05). Таким чином, дані показники слід використовувати з високим ступенем вірогідності в прогнозуванні виникнення проліферативних процесів у матці. Для клініциста вкрай важливим є визначення клінічної (малосимптомна, симптомна) форми ЛМ, окрім локалізації вузлів за МКХ-10, та її морфологічний тип: проста або один із варіантів проліферативно активної. За морфологічною класифікацією малосимптомна ЛМ визначається як проста, симптомна ЛM - проліферативного типу. Гістологічними варіантами ЛМ проліферативного типу є: клітинний (8892/0), епітеліоїдний (8891/0), міксоїдний (8896/0), ліполейоміома (8890/0), геморагічно-клітинна, мітотично-активна тощо. Оцінка інтенсивності проліферації за допомогою маркера Кі-67 передбачає визначення індексу проліферації (ІП) у відсотках клітин, які експресують Кі-67, із 1000 у препараті: при кількості клітин 10 % - ІП визначався як низький, при 10-30 % - середній ІП, при 30 % - високий ІП. Проведені нами дослідження показали, що високий ступінь інтенсивності проліферації за маркером Кі-67 у ядрах гладких міоцитів вузлів симптомної мітотично-активної ЛМ перевищував ІП малосимптомної ЛМ у 6,9 разів (р0,05). Отже, ІП за маркером Кі-67 достовірно підвищується при ЛМ проліферативного типу, при зниженому рівні апоптозу, порушеннях процесів проліферації, неоангіогенезу, запальних процесах, проявах стромальнопаренхіматозних змін. Маркер клітин проліферації (Кі-67) є діагностичним і прогностичним критерієм у прогнозуванні виникнення проліферативних процесів у матці та при визначенні профілактичних заходів. Таким чином, у порівнянні з прототипом, запропоноване технічне рішення дозволяє, за рахунок виконання гістохімічного дослідження міометрія неураженого зразка під час консервативної міомектомії, достовірно прогнозувати ризик розвитку проліферативного процесу міометрія, з високим ступенем вірогідності веріфікувати діагноз і тип пухлини, що дозволить призначити адекватну тактику лікування. 5 UA 115730 C2 5 Джерело інформації Пат. 236І216 СІ Російська Федерація, МПК G01N 33/53. Способ дифференциальной диагностики типа роста миомы матки / Сотникова Н.Ю., Посисеева Л.В., Бойко О.М., Анциферова Ю.С., Малышкина А.И./ заявник та патентовласник Федеральное государственное учреждение "Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи" (RU). ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 10 15 Спосіб прогнозування ризику розвитку проліферативного процесу міометрія в жінок, хворих на лейоміому матки шляхом виконання гістохімічного дослідження міометрія, який відрізняється тим, що додатково проводять імуногістохімічне дослідження неураженого зразка міометрія, вилученого під час консервативної лейоміктомії, оцінюють маркер проліферації Кі-67 за розробленою шкалою визначення ступеня виразності проліферативного процесу і при значенні маркера Кі-67 від 0 до 10 судять про низький рівень ризику розвитку проліферативного процесу (РПП), при значенні від 10 до 30 визначають середній ризик РПП, а при значенні Кі-67 вище 30 прогнозують високий ризик розвитку проліферативного процесу. Комп’ютерна верстка В. Мацело Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6