Спосіб раннього прогнозування ризику розвитку раку тіла матки в жінок із гіперпроліферативними процесами ендометрія

Реферат: Спосіб раннього прогнозування ризику розвитку раку тіла матки в жінок із гіперпроліферативними процесами ендометрія включає генетичне дослідження тканини ендометрія. Використовують напівкількісний метод МС ПЛР, для чого виділяють ДНК із зразків тканини з використанням реактиву DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen), при цьому бісульфітну обробку ДНК проводять за допомогою набору EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen) відповідно до протоколу, кількість ДНК для бісульфітної обробки ДНК у всіх пробах доводять до 1 мкг/мл, проводять ампліфікацію ДНК за допомогою набору Hot Start DNA Polymeraza Kit за програмою: 95 °C - 15 хв.; 95 °C - 30 с, 50 °C - для неметилованої ДНК та 60 °C - для метилованої ДНК, 72 °C - 30 с, 39 циклів; 72 °C - 10 хв., потім проводять електрофорез ПЛР-продуктів у 2 % агарозі, далі фарбують етидіум бромідом протягом 20 хв., аналізують відносний вміст метилованої і неметилованої ДНК за допомогою програми Quantity One ID Analysis Software (BIO-RAD, USA) на приладі VersaDoc MP 4000 System (BIO-RAD, USA) за формулою М(%)=A×100/A+В, де: А - площа пику метилованої ДНК, В - площа пику неметилованої ДНК і при значеннях вмісту метилованої ДНК гена SFRP2 вище 25 % прогнозують ризик розвитку раку тіла матки у пацієнток із гіперпроліферативними процесами ендометрія. UA 116765 U (54) СПОСІБ РАННЬОГО ПРОГНОЗУВАННЯ РИЗИКУ РОЗВИТКУ РАКУ ТІЛА МАТКИ В ЖІНОК ІЗ ГІПЕРПРОЛІФЕРАТИВНИМИ ПРОЦЕСАМИ ЕНДОМЕТРІЯ UA 116765 U UA 116765 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до області медицини, а саме гінекології і онкології, і може бути використана для раннього прогнозування ризику розвитку раку тіла матки у жінок із гіперпроліферативними процесами ендометрія. Метилування ДНК є фізіологічним епігенетичним процесом регуляції багатьох внутрішньоклітинних процесів, пов'язаних із проліферацією, розділенням клітин, тканиноспецифічним диференціюванням, який призводить до довгострокового пригнічення експресії генів [1, 4]. Секретуючі білки сімейства SFRPs є антагоністами Wnt-регуляторного шляху, які пригнічують цей сигнальний шлях у здорових людей. Wnt-сигнальний шлях сприяє регуляції проліферації і диференціювання клітин. При деяких злоякісних пухлинах, таких як колоректальний рак, пухлини голови і шиї, рак шлунка метилування генів антагоністів Wntсигнального шляху є причиною неконтрольованої клітинної проліферації [2, 3]. У роботах [4, 5] було виявлено метилування генів, у тому числі генів Wnt-регуляторного шляху, у хворих на рак ендометрію, що допомогло розробити алгоритми лікування хворих на гіперпластичні процеси з урахуванням метилування генів та прогнозувати ризик розвитку раку ендометрію. В роботі Di Domenico (2011 p.) було проведено визначення метилування генів-інгібіторів Wnt-шляху сімейства SFRP (SFRP1, SFRP2, SFRP4, SFRP5) та показано, що гіперметилування цих генів може бути ранньою подією ендометріального тумороґенезу [4]. Найбільш близьким аналогом до корисної моделі є розробка, в якій шляхом визначення метилування генів MLH1, RASSF1, GSTP1, р16, RAR-b, CDX1 прогнозується розвиток раку тіла матки при патологічних станах ендометрія у жінок репродуктивного віку [6]. Виявлення метилування генів-супресорів пухлинного росту проводили методом метилчутливої ПЛР (полімеразної ланцюгової реакції). Але методика метилчутливої ПЛР є недостатньо чутливою для кількісного визначення малого числа метилованих основ у досліджуваних зразках. В основу корисної моделі поставлено задачу вдосконалення способу раннього прогнозування ризику розвитку раку ендометрію шляхом напівкількісної оцінки в зразках тканини ендометрію вмісту метилованої ДНК гена SFRP2 у пацієнток із гіперпроліферативними процесами ендометрію, що дозволить за рахунок напівкількісної оцінки ризику злоякісної трансформації гіперпроліферативних процесів ендометрію швидко та з високим ступенем вірогідності на ранніх етапах прогнозувати ризик розвитку раку ендометрію та вибирати адекватну тактику ведення в хворих з цією патологією. Оскільки метилування промотора гена SFRP2 може грати провідну роль в ініціації та розвитку злоякісної пухлини ендометрія було досліджено статус метилування гена, що вивчається, у хворих із гіперпроліферативними процесами ендометрію. Поставлена задача вирішується тим, що, згідно з корисною моделлю, у способі раннього прогнозування ризику розвитку раку тіла матки в жінок із гіперпроліферативними процесами ендометрія використовують напівкількісний метод МС ПЛР, для чого виділяють ДНК із зразків тканини з використанням реактиву DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen), при цьому бісульфітну обробку ДНК проводять за допомогою набору EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen) відповідно до протоколу, кількість ДНК для бісульфітної обробки ДНК у всіх пробах доводять до 1 мкг/мл, проводять ампліфікацію ДНК за допомогою набору Hot Start DNA Polymeraza Kit за програмою: 95 °C-15 хв.; 95 °C-30 с, 50 °C - для неметилованої ДНК та 60 °C - для метилованої ДНК, 72 °C30 с, 39 циклів; 72 °C-10 хв., потім проводять електрофорез ПЛР-продуктів у 2 % агарозі, далі фарбують етидіум бромідом протягом 20 хв., аналізують відносний вміст метилованої і неметилованої ДНК за допомогою програми Quantity One 1D Analysis Software (BIO-RAD, USA) на приладі VersaDoc MP 4000 System (BIO-RAD, USA) за формулою M (%)=A×100/A+В, де: A площа пику метилованої ДНК, В - площа пику неметилованої ДНК і при значеннях вмісту метилованої ДНК гена SFRP2 вище 25 % прогнозують ризик розвитку раку тіла матки у пацієнток із гіперпроліферативними процесами ендометрію. Спосіб виконують наступним чином. Вивчення метилування промотора гена SFRP2 було проведено напівкількісним методом МС ПЛР. Операційний матеріал для аналізу було взято від 9 хворих з неатиповою гіперплазією ендометрію, у 10 жінок із атиповою гіперплазією ендометрію і в 5 хворих на рак ендометрію. ДНК виділяли із зразків тканини з використанням реактиву DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen), при цьому бісульфітну обробку ДНК проводили за допомогою набору EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen) відповідно до протоколу, кількість ДНК для бісульфітної обробки ДНК у всіх пробах доводили до 1 мкг/мл, проводили ампліфікацію ДНК за допомогою набору Hot Start DNA Polymeraza Kit за програмою: 95 °C-15 хв.; 95 °C-30 с, 50 °C - для неметилованої ДНК та 60 °C для метилованої ДНК, 72 °C-30 с, 39 циклів; 72 °C-10 хв., потім проводили електрофорез ПЛР 1 UA 116765 U 5 10 15 20 25 30 35 40 продуктів у 2 % агарозі, далі фарбували етидіум бромідом протягом 20 хв., аналізували відносний вміст метилованої і неметилованої ДНК за допомогою програми Quantity One 1D Analysis Software (BIO-RAD, USA) на приладі VersaDoc MP 4000 System (BIO-RAD, USA) за формулою M (%)=A×100/A+В, де: А - площа пику метилованої ДНК, В - площа пику неметилованої ДНК і при значеннях вмісту метилованої ДНК гена SFRP2 вище 25 % прогнозують ризик розвитку раку тіла матки у пацієнток із гіперпроліферативними процесами ендометрію. МС ПЛР - метод, що дозволяє оцінити статус метилування індивідуальних CpG-острівців та дає можливість конструювати праймери, які вибірково ампліфікують послідовності, що містять або не містять метиловані залишки цитозину в CpG-острівцях. Зміст МС ПЛР полягає в підборі праймерів до послідовності метилованої ДНК, яку досліджують та в якій у випадках метилування ДНК азотиста основа CG після бісульфітної обробки залишається як CG, а у випадках неметилування ДНК CG трансформується в TG, при цьому, перша пара праймерів ампліфікує тільки метильовані ДНК, а друга пара - лише неметильовані ДНК. Подальший електрофорез продуктів ПЛР в агарозному гелі показує наявність у досліджуваній пробі метилованої або неметилованої ДНК. Фрагмент дослідження методом МС ПЛР гена SFRP2 в зразках хворих із гіперпроліферативними процесами ендометрію представлений на фіг. 1, де під зразком № 1 зазначено контроль (метилування ДНК на 50 %); зразок № 2 - атипова гіперплазія ендометрію; зразки № 3, № 4, № 5 - неатипова гіперплазія ендометрію; зразки № 6, № 7 - рак ендометрію. На фіг. 1 видно, що ступінь метилування ДНК у порівнянні з контролем змінюється залежно від морфологічного типу гіперпроліферативного процесу ендометрію: у пацієнток з неатиповою гіперплазією (№ 3, № 4, № 5) найнижчий, у хворих на рак ендометрію (№ 6, № 7) - найвищий. На фіг. 2 показано вміст метилованої ДНК гена SFRP2 у жінок з неатиповою гіперплазією в порівнянні з пацієнтками, що страждають на рак ендометрію. У групі з неатиповою гіперплазією ендометрію вміст метилованої ДНК дорівнював 10,8±2,4 %, у хворих на рак ендометрію коливався в межах 42,3±10,2 %. На фіг. 3 зображено вміст метилованої ДНК гена SFRP2 у пацієнток з атиповою гіперплазією та хворих на рак ендометрію. У хворих із атиповою гіперплазією цей показник дорівнював 20,5±4,1 %, на рак ендометрію -42,3±10,2 %. На фіг. 4 представлені результати визначення вмісту метилованої ДНК гена SFRP2 у пацієнток з неатиповою і атиповою гіперплазією ендометрія, а саме, у останніх дорівнював 20,5±4,1 %, у групі з неатиповою гіперплазією - 10,8±2,4 %. Таким чином, на наданих фігурах показано достовірне розходження вмісту метилованої ДНК гена SFRP2 у випадках раку ендометрію в порівнянні з неатиповою гіперплазією (р=0,005) і атиповою гіперплазією ендометрію (р=0,045). Проведений за допомогою МС ПЛР аналіз ДНК гена SFRP2 з тканини пацієнток з неатиповою гіперплазією ендометрію показав незначний вміст метилованої ДНК досліджуваного гена, що склав у середньому 10,8±2,4 %. У хворих з атиповою гіперплазією цей показник дорівнював 20,5±4,1 % і був достовірно вищим, ніж у жінок з неатиповою гіперплазією ендометрію (р=0,012, таблиця 1). Вміст метилованої ДНК гена SFRP2 у хворих на рак ендометрію в середньому склав 42,3±10,2 %, при цьому в однієї хворої метилування ДНК не було виявлено (таблиця 1). Таблиця 1 Група Неатипова гіперплазія ендометрію Атипова гіперплазія ендометрію Рак ендометрію Вміст метилованої ДНК гена SFRP2, % 10,8±2,4 20,5±4,1 (р=0,012) 42,3±10,2 (р=0,005) 45 50 Таким чином, отримані дані аналізу метилування гена SFRP2 у зразках ендометрію пацієнток із гіперпроліферативними процесами дозволяють використовувати цей показник як маркер раннього прогнозування ризику онкотрансформації гіперпроліферативних процесів ендометрію. Вміст метилованої ДНК гена SFRP2 у тканині ендометрію жінок із гіперпроліферативними процесами більше, ніж 25 % дають можливість віднести їх до групи 2 UA 116765 U 5 10 15 20 25 30 35 40 ризику розвитку раку ендометрію, диктують необхідність пильного спостереження та правильно скерованої тактики ведення таких хворих. Метод МС ПЛР дозволяє не лише діагностувати наявність метилування за принципом "є" або "ні", а також дає можливість визначати вміст метилованої ДНК гена SFRP2 шляхом напівкількісної оцінки, яка є швидкою, зручною та високовірогідною. Отже, аналізуючи результати досліджень, що відображені в таблиці та на представлених фігурах, можна зазначити: - показано достовірне розходження вмісту метилованої ДНК гена SFRP2 між пацієнтками хворих на рак ендометрію і неатиповою гіперплазією (р=0,005), а також атиповою гіперплазією ендометрію (р=0,045); - результати дослідження зразків пацієнток з неатиповою гіперплазією ендометрію показали незначний вміст метилованої ДНК гена SFRP2-10,8±2,4 %; - вміст метилованої ДНК гена SFRP2 у тканині ендометрію хворих з атиповою гіперплазією ендометрію дорівнював 20,5±4,1 % і був достовірно вище, ніж у жінок з неатиповою гіперплазією ендометрію; - вміст метилованої ДНК гена SFRP2 у хворих на рак ендометрію був найвищим серед досліджуваних груп і в середньому склав 42,3±10,2 %, при цьому в однієї хворої метилування ДНК не було виявлено. Таким чином, у порівнянні з прототипом корисна модель за рахунок застосування напівкількісної методики визначення вмісту метилованої ДНК гена SFRP2 шляхом МС ПЛР для прогнозування ризику розвитку раку ендометрію в жінок із гіперпроліферативними процесами ендометрію дозволяє швидко, з високим ступенем вірогідності на ранніх етапах захворювання, прогнозувати ймовірність виникнення раку тіла матки. Спосіб є швидким, надійним, може слугувати прогностичним критерієм можливої злоякісної трансформації гіперпроліферативних процесів ендометрію. Спосіб дає можливість виділяти групи ризику серед жінок з гіперпроліферативними процесами ендометрію, які потребують особливого нагляду та тактики ведення. Джерела інформації: 1. Yannick Delpu. DNA Methylation and Cancer Diagnosis // Int. J. Моl. Sci. - 2013. - 14(7):1502915058. 2. DNA methylation inhibitors in cancer: Recent and future approaches / C. Gros, J. Fahy, L. Halby [et al] // Biochimie. - 2012. - 94(11): 2280-2296. 3. Xianyong Ma. Endometrial Carcinogenesis and Molecular Signaling Pathways / Ma Xianyong, X. Ma Charles, Wang Jianghui // American Journal of Molecular Biology. - 2014. - 4: 134-149. 4. Epigenetic fingerprint in endometrial carcinogenesis: the hypothesis of a uterine field cancerization / Di Domenico M, Santoro A, Ricciardi C, Iaccarino M. [et al] //Cancer BiolTher. - 2011. 12(5): 447-57. 5. Шалькова М.Ю. Рак ендометрію: метилування генів hMLH1 і АРС як фактори ризику та закономірність прогресування: автореф. дис. на здобуття наук. ступеня канд. мед. наук: спец. 14.01.07 "Онкологія" / М.Ю. Шалькова. - Київ, 2008. - 22 с. 6. Пат. 2466390 Российская Федерация, МПК G01N. Способ прогнозирования развития рака тела матки при патологических процессах эндометрия у женщин репродуктивного возраста / Сидорова И.С., Унанян А.Л., Власов Р.С., Залетаев Д.В., Вознесенский В.И; заявитель и патентообладатель ГОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России. № 2011105301; заявл. 15.02.2011; опубл. 10.11.2012, Бюл. № 31. - 7 с. 45 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 50 55 60 Спосіб раннього прогнозування ризику розвитку раку тіла матки в жінок із гіперпроліферативними процесами ендометрія, що включає генетичне дослідження тканини ендометрія, який відрізняється тим, що використовують напівкількісний метод МС ПЛР, для чого виділяють ДНК із зразків тканини з використанням реактиву DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen), при цьому бісульфітну обробку ДНК проводять за допомогою набору EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen) відповідно до протоколу, кількість ДНК для бісульфітної обробки ДНК у всіх пробах доводять до 1 мкг/мл, проводять ампліфікацію ДНК за допомогою набору Hot Start DNA Polymeraza Kit за програмою: 95 °C - 15 хв.; 95 °C - 30 с, 50 °C - для неметилованої ДНК та 60 °C - для метилованої ДНК, 72 °C - 30 с, 39 циклів; 72 °C - 10 хв., потім проводять електрофорез ПЛР-продуктів у 2 % агарозі, далі фарбують етидіум бромідом протягом 20 хв., аналізують відносний вміст метилованої і неметилованої ДНК за допомогою програми Quantity One ID Analysis Software (BIO-RAD, USA) на приладі VersaDoc MP 4000 System (BIO-RAD, USA) за формулою М(%)=A×100/A+В, де: А - площа пику метилованої ДНК, В - площа пику 3 UA 116765 U неметилованої ДНК і при значеннях вмісту метилованої ДНК гена SFRP2 вище 25 % прогнозують ризик розвитку раку тіла матки у пацієнток із гіперпроліферативними процесами ендометрія. 4 UA 116765 U Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5