Спосіб визначення ефективної родючості ґрунту

Реферат: UA 116281 U UA 116281 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі сільського господарства, ґрунтознавства, агроекології, ґрунтової біології та біохімії гумусу, та може бути використано для визначення ступеня ефективної родючості ґрунту. У практиці сільського господарства відомо спосіб визначення ефективної родючості ґрунту [АС № 1432987630-15 Способ определения эффективного плодородия почв] згідно з яким по інтенсивності розкладу целюлози в ґрунті визначають її біологічну активність в лабораторних умовах. Даний спосіб може визначати також біологічну активність в польових умовах та з ціллю скорочення часу на проведення аналізу витримують целюлозу в стерилізованих мішечках в залежності від температури та вологості в досліджуваному шарі ґрунту від 12 до 20 діб. Після чого по втраті вологи (гігроскопічності) та маси судять про біологічну активність по ступеню розкладу целюлози в ґрунті. Так як ґрунтові умови необхідні для життєдіяльності мікроорганізмів, які розкладають целюлозу ідентично умовам, які обумовлюють формування врожаю. За допомогою даного методу можливо вираховувати якісні відмінності родючості різних шарів ґрунту. Але спосіб є малоінформативним та не враховує агрохімічні показники, а саме доступні поживні та мінеральні речовини ґрунту, які вивільняються при розкладення органічної речовини ґрунту. Органічна речовина ґрунту - гетерогенна суміш різних регулярних та нерегулярних біополімерів, які відрізняються різною швидкістю трансформації. Целюлоза та лігнін стійкі сполуки які розкладаються поступово за допомогою каскаду гідролітичних реакцій, тому за допомогою зважування дуже важко судити про ступінь розкладення стійких сполук, що знижує точність даного методу. Також цей спосіб має дуже тривалий час проведення (до 20 діб). Відомо спосіб [Петербургский А.В. Практикум по агрономической химии. М.: Колос, 1968], заснований на принципі, визначенні нітрифікуючої здатності ґрунту за кількістю нітратів, вироблених ґрунтом при мінералізації органічної речовини ґрунту, що визначаються до і після 12-денного компостування зразка ґрунту при температурі +28С і вологості 60 % від повної вологоємності. Нітрифікуючу здатність ґрунту визначають як різницю між кінцевим і початковим вмістом нітратів в прокомпостованому ґрунті. Цей спосіб скорочує термін проведення аналізу за рахунок компостування ґрунту та визначає нітратну форму азоту, що збільшує точність порівняно з вищезгаданим. Недоліком способу є недостатня точність, тривалість аналізу, низька інформативність, так як вихідний вміст нітратів не входить в підрахунок мобілізованого азоту, спосіб враховує лише одну нітратну форму азоту та не дає уявлення про найближчі резерві органічних сполук, при мінералізації яких вивільняється доступний для рослин азот. Тривала інкубація ґрунту в -3 +4 оптимальних умовах без відчуження продуктів мінералізації (NO , NH ) призводить до поглинання їх ґрунтовою біотою, що значно знижує точність визначення. Відомо спосіб [Биохимический способ определения эффективного плодородия дерновоподзолистых почв, Банкина Т.Α., Патенты РФ А01С 21, G01N 33/24]. Запропонований спосіб відрізняється підвищенням точності, скороченням часу проведення аналізу, підвищенням інформативності способу. Технічний результат досягається тим, що прискорюється процес мобілізації доступного для рослин азоту за рахунок підвищення температури при компостуванні ґрунту до +34-36 С, яка є оптимальною для життєдіяльності ґрунтової мікрофлори і роботи гідролітичних ферментів, які здійснюють мінералізацію органічних азотовмісних сполук [Хазиев Ф.Х. Методы почвенной энзимологии. Наука. - 1990]. Таким чином в даному способі скорочується час компостування ґрунту до 7-8 діб, що відповідає моменту максимальної напрацювання ґрунтової біотою мінеральних і здатних до мінералізації органічних сполук азоту. Для визначення реально доступного для рослин азоту використовувався апарат Кьельдаля, а про родючість ґрунту судять за величиною врожайності культур. Але, даний спосіб має тривалий час аналізу через використання численних лабораторних аналізів, які дають багатобічну інформацію але разом з цим потребують матеріальних затрат, також не враховуються трансформаційні процеси органічної речовини ґрунту (гуміфікацію, окисно-відновні реакції, комплексоутворення/хелатоутворення), а тільки ферментативна активність, що знижує точність. Також спосіб включає тривалий час проведення аналізу пов'язаний з компостуванням ґрунтових зразків. У зв'язку з цим останнім часом у галузі хімії ґрунтів гостро постала проблема вдосконалення методологічних підходів для аналізу ґрунтових зразків та їх витяжок. Необхідність виходу на новий рівень методологічного забезпечення, що пов'язаний з використанням сучасних фізикохімічних методів стає необхідною потребою. Одним з таких фізико-хімічних методів аналізу зразків, які не потребують попередньої підготовки, або обробки зразка, що викликає їх модифікацію є метод електронного парамагнітного резонансу (ЕПР), що дозволяє отримувати 1 UA 116281 U -9 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 пряму інформацію з високою чутливістю (приблизно 10 ) про структурні перетворення в живих біосистемах (Ингрем Д. Электронный парамагнитный резонанс в биологии). Завдяки наявності в органічній речовині гумінових кислот (ГК), у яких головним компонентом є ароматична система конденсованих хінонних (циклічних) структур, ґрунт має парамагнітні центри. Утворення ароматичної структури пов'язано з конденсацією циклічних структур (бензольних та фенольних кілець, які утворюються завдяки біодеградації целюлози, лігніну та інших компонентів) завдяки, їх полімеризації через семихіноні радикали (СР). Семихінонні радикали дуже активні структури, які проявляють парамагнітні властивості завдяки вільному неспареному електрону. ЄПР спектроскопія дозволяє отримати кількісну та якісну інформацію щодо наявності та взаємодії СР. Наявність оксигеновмісних функціональних груп у циклічних структурах ароматичної системи дозволяє ГК взаємодіяти з металами перемінної валентності (Fe, Μn, ΑΙ, Mg та інші) ґрунту завдяки хелатному ефекту. При цьому відбувається кореляція вмісту Fe та Μn з фенолгідроксильними групами алюмінію з карбоксильними (Орлов Д.А. Гумусовые кислоты почв и общая теория гумификации). Відомо, що вміст ГК корелює з родючістю ґрунту, яка залежить від біологічної активність гумінових кислот (ГК), що залежить від парамагнітної активності. В залежності від природи та розподілу парамагнітних центрів в ГК, змінюються фізико-хімічні показники ґрунту особливо в ризосфері (наприклад окисно-відновні реакції з іонами перемінної валентності), що впливає на доступність та накопичення поживних мінеральних компонентів для рослин. Парамагнітні центри представлені семихінонними радикалами (СР) ароматичної структури ГК. При трансформації органічної речовини відбувається π-електронні перестройки в ароматичній системі ГК та утворення різних парамагнітних хелатних комплексів з металами перемінної валентності, що зумовлює зміну окисно-відновних реакцій (ОВР) та утворення доступних форм мінеральних компонентів для рослин (Н. Патыка. Агробиология ризосферы растений, 2015). При зміні напрямку ОВР відбувається утворення водорозчинних доступних металокомплексів у вигляді хелатних сполук ГК з металами перемінної валентності. У процесі лужного гідролізу при екстракції гумусових кислот також утворюються семихінони, які є акцепторами/донорами електронів для металів перемінної валентності (И.И. Лиштван, В.П. Стригуцкий. Принципиальные аспекты ЄПР-спектроскопии гумусовых образований). При цьому формуються парамагнітні центри не тільки пов'язані з семіхіноними радикалами, а і центри, пов'язані з делокалізованим електроном координаційного комплексу з металом через дативний зв'язок (електронно-донорний механізм), завдяки циклічному хелатному ефекту (Мельсон Г.А. Координационная химия макроциклических соединений). Концентрація таких хелатних комплексів при гідролізі ГК відповідає активним центрам зв'язування в нативному (природному) стані, що обумовлює ефективну родючість ґрунту. Доступність металів ґрунту рослинам, здійснюється завдяки хелатним комплексам з ГК. При зміні зовнішніх умов синтезу ГК, наприклад підвищенні гідролітичної активності мікробного ценозу ґрунту, за якої відбувається підвищення мінералізації органічної речовини, полімеризація ГК в високомолекулярні сполуки зменшується (Пикколо А. Супрамолекулярная структура гумусових веществ). В наслідок чого, збільшується кількість низькомолекулярних сполук, що активно вступають та координуються вільними іонами металів ґрунту з утворенням різних хелатних комплексів, які доступні рослинам в ризосфері ґрунту. Найбільш близьким до заявленого є спосіб визначення ефективної родючості ґрунту [Патент РФ № 2236777. "Биохимический способ определения эффективного плодородия дерновоподзолистых почв"], що включає компостування відібраних та підготовлених ґрунтових зразків, визначення лабораторно-аналітичним методом, мінерального та мобілізованого азоту за співвідношення яких визначають ступінь родючості ґрунту. Цей спосіб характеризується прискореним (7-8 днів) компостуванням суміші за рахунок підвищення температури процесу (35 °C) та збільшенням виходу доступного органічного азоту (та інших поживних речовин) при мінералізації органічної речовини. В основу корисної моделі поставлено задачу вдосконалення способу визначення ефективної родючості ґрунту за рахунок встановлення нових показників якісного складу гумусу, що дають змогу більш швидко та точно визначити наявність доступних рослинам речовин, які обумовлюють ефективну родючість ґрунту за різного агрогенного навантаження. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі визначення ефективної родючості ґрунту, який включає відбирання ґрунтових зразків, висушування, подрібнювання, видалення рослинних залишків, згідно з винахідницьким задумом додатково проводиться з ґрунтових зразків протягом 12-24 годин лужна екстракція гумінових кислот, за якою з використанням ЕПР аналізу у трьох (або чотирьох) сантиметровому діапазоні сканування (3-4 Тесла) отримують в кожному зразку спектри ГК, за якими встановлюють кількість хелатних 2 UA 116281 U 3+ 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 парамагнітних металокомплексів з залізом (Fe ) та за відомою формулою визначають кількість парамагнітних центрів: НПЦ=А×Н, де НПЦ - кількість парамагнітних центрів; А - амплітуда широкої лінії ЕПР спектра; Η - ширина широкої лінії ЕПР спектра в умовних одиницях, що відповідають кількості доступних поживних речовин рослинам та обумовлюють ефективну родючість ґрунту. Під час виділення гумінових кислот відбуваються неминучі внутрішньо-молекулярні перестройки в ароматичній частині надмолекулярного комплексу нативної ГК, що обумовлює перемінний склад виділених препаратів. У процесі лужного гідролізу при екстракції гумусових кислот утворюються активні хіноні структури - семихінони, які є акцепторами/донорами електронів для металів перемінної валентності в результати формуються парамагнітні центри пов'язані з делокалізованим електроном координаційного комплексу з металом. Концентрація таких хелатних металокомплексів при гідролізі ГК відповідає активним центрам зв'язування в нативному (природному) стані, що обумовлює ефективну родючість ґрунту, так як доступність металів ґрунту рослинам, здійснюється завдяки хелатним комплексам з ГК. Заявлений спосіб дозволяє отримати дані з виходу доступних для рослин речовин у вигляді 3+ Fe хелатних комплексів без попередніх тривалих компостувань та вегетаційних дослідів, протягом 12-24 годин, а також дані про вплив агротехнічних прийомів на ефективну родючість ґрунту. Даний спосіб дозволяє включати у визначення ефективної родючості інші показники урожайність, параметри гумусової системи (загальний, доступний вуглець, вміст фракцій гумусових речовин), агрохімічні показники (азоту), а також інші фізико-хімічні методи, наприклад інфрачервону спектроскопію, що дозволяє збільшити точність та інформативність даного методу. Приклад здійснення способу На польовому досліді з визначення ефективності технологій обробітку, різного ступеня інтенсивності обробітку ґрунту проводився відбір ґрунтових зразків чорнозему типового (один тип ґрунту) з глибини 0-20 см, за загальноприйнятою методикою з таких варіантів обробітку: 1. Традиційний обробіток (оранка 20-22 см). 2. Пряма сівба (No Till). 3. 40-річний переліг чорнозему типового того ж агроценозу. На даному польовому досліді, який був закладений у 2006 році відбір ґрунтових зразків з даних варіанті обробітку ґрунту був здійснений восени 2014 року. Відібрані ґрунтові зразки висушують, розтирають, видаляють не розкладені органічні рештки, та проводять протягом 12 годин екстрагування твердофазних препаратів гумінових кислот згідно вітчизняної методики Д.С. Орлова (препаративне виділення другої фракції ГК), після якої проводять ЕПР аналіз виділених препаратів ГК. Для виділення твердофазних препаратів ГК після декальцинації ґрунту (обробка H2SO4), проводили розчинення гумінових кислот в 0,1н NaOH та оставляли відстоювати на 12 годин. Після відстоювання проводили відділення глинистих мінералів за допомогою центрифуги (3000 об/хв). Осадження гумінових кислот здійснювали 10 % НСI, за тим розчин гелю гумінових кислот кристалізували на водяній бані до повітряно-сухого стану. В результаті отримували кристалічний порошок, чорного кольору - препарат гумінових кислот. Реєстрація спектрів проводиться на ЕПР-спектрометрі (JES-ME-3х), який працює в трисантиметровому діапазоні довжин хвиль (X-band) з частотою модуляції 100 кГц. Отримані зразки препаратів гумінових кислот, які являють собою чорний кристалічний порошок, поміщають в кварцові ампули (фірми JEOL) та зважують, для нормування по вазі. Як стандарт при визначенні g-факторів (фактор надтонких та тонких взаємодій) та інтенсивності ЕПРспектрів використовувався полікристалічний зразок діфенілпікрилгідразил (ДФПГ), середнє значення g-фактора якого дорівнює 2,0036±0,0003, тобто значенню вільного електрона. Це значення використовували як стандартні мітки для визначення невідомого g-фактора, близького до 2,00. Враховуючи, що кожна молекула ДФПГ має один неспарений електрон, ДФПГ використовували також як еталонний зразок для вимірювання інтенсивності ЕПР-спектрів. За методикою проведення ЕПР аналізу, використовували для калібрування розгортки магнітного 3+ поля спектрометра іони (Сr ), присутні в монокристалах рубіна (штучний кристал з Аl2О3) і вимірювання відносної інтенсивності ліній ЕПР-спектра. Досліджувані зразки в кварцових ампулах поміщали в пучність СВЧ магнітного поля резонатора ЕПР спектрометра. Після чого отримуються спектри на самописці прибору (Фіг. 1). 3 UA 116281 U 5 10 15 20 25 30 35 Записані спектри досліджуваних зразків гумінових кислот виділених з чорнозему типового за різного обробітку ґрунту мають вигляд який представлений на фіг. 1 (ГК виділенні з варіанту No till), на якому показано форма ЕПР сигналу. На всіх проаналізованих ЕПР зразках ГК відсутні компоненти тонкої та надтонкої взаємодії (взаємодія неспареного електрона з ядром атома ГК), що обумовлює постійну ширину ліній ЕПР спектра усіх зразків ГК. Форма ліній цих ЕПР спектрів не залежить від способу обробітку, і відрізняється, лише інтенсивністю - амплітудою сигналу. Амплітуда ЕПР сигналу залежить від інтенсивності обробітку ґрунту. У всіх досліджуваних зразках гумінових кислот утворюються парамагнітні центри з однаковою структурою (один тип парамагнітних центрів). Отриманні спектри ЕПР мають величину g-фактора 2,0036 близьку до g-фактору ДФПГ і широку нероздільну лінію (в діапазоні до 4 Тесла) між точками перегину кривої поглинання близько 1,2 Тесла, як показано на рисунку 2, що вказує на формування хелатних комплексів ГК 3+ з залізом (III) - Fe . Значення g-фактора 2,0036 на всіх досліджуваних зразках ГК вказує на присутність неспарених електронів, що зумовлено наявністю в зразках ГК вільних семихінонних (СХ) радикалів ароматичної структури ГК (Ингрем Д. Электронный парамагнитный резонанс в биологии, 1972). Широка лінія ЕПР спектра вказує на наявність парамагнітних центрів, які представлені хелатними комплексами з парамагнітними металами перемінної валентності, а 3+ саме іони Fe , які взаємодіють з оксигеновмісними функціональними групами структурних елементів ароматичної структури ГК (хінонами) та утворюють координаційні сполуки однієї 3+ природи - Fе хелатні комплекси. У зв'язку з тим, що ширина даних лінії спектра ЕПР не змінюється, для визначення концентрації парамагнітних центрів порівнювалися амплітуди еталона (ДФПГ) та досліджуваних зразків (відношення амплітуди зразків та еталону) після чого отримані значення відношень нормувалися за вагою на 1 грам, що дорівнює значенню концентрації парамагнітних центрів 3+ пов'язаних з Fe хелатними комплексами в умовних одиницях (у. о.). Для вирахування концентрації парамагнітних центрів зразка ГК виділеного з чорнозему перелогу вимірювали на записаному спектрі (по міліметрівці) амплітуду ДФПГ зразка ГК (А) (фіг. 1), потім амплітуду (А) широкої лінії (між точками перегину кривої 1-1,2 Тесла, фіг. 2). Після чого вираховували відношення встановлених значень амплітуд ДФПГ перелогу та амплітуди широкої лінії перелогу (А зразка /А еталона). Потім значення нормувалося за вагою зразків які були звішені перед ЕПР аналізом: А зразка перелогу /А еталона ДФПГ перелога: 90/73=1,23 Вага зразка ГК перелогу 0,3 г, нормування на 1 грам: 1,23×0,3=4,10 Концентрація парамагнітних центрів зразка перелогу = 4,10 у.о. Розраховані дані концентрацій парамагнітних центрів виділених зразків представлені на таблиці 1. Таблиця 1 Варіанти Переліг Оранка Пряма сівба 40 45 50 Амплітуда зразка, Тесла 90 57 85 Амплітуда еталона, Тесла 73 50 68 А зразка/ А еталона Вага зразка, грам 1,23 1,20 1,25 0,3 0,1 0,3 Кількість парамагнітних центрів (у.о.) 4,10 12,00 4,70 На фіг. 3 наведена концентрація парамагнітних центрів досліджуваних зразків (при похибці 3+ вимірювань 0,4), та виявлено, ще найбільша концентрація Fe хелатних парамагнітних центрів відповідає чорнозему типовому обробленого оранкою. У процесі виділення ГК на стадії лужного гідролізу відбулась значна електронна перестройка ароматичної системи, що викликала утворення більшої кількості хелатних сполук порівняно з іншими варіантами. 3+ Таким чином, за оранки відбувається утворення більшої кількості доступних Fe хелатних комплексів, що обумовлює родючість чорнозему типового та зміну напрямку ОВР в сторону утворення більшої кількості окисних форм металів. Зміна ОВР в напрямок відновлення сприяє накопиченню більш пасивного гумусу, що обумовлює зниження біологічної активності ГК та ефективної родючості ґрунту. В польовому досліді урожайність була найвища на варіанті традиційного обробітку - оранки. Наявність металлокомплексів також підтверджуються 14 Фур'є спектроскопією виділених ГК, як з фенол гідроксильними так і карбоксильними групами. Найбільша інтенсивність мінералізації (показник C/N) була на варіанті оранки (Попірний М.А. Парамагнітні властивості гумінових 4 UA 116281 U 5 кислот чорнозему типового ті їх зміна за різного способу обробітку, 2016). В результаті збільшення родючості чорнозему типового пов'язано з підвищенням біодеградації органічної речовини та утворенням більшої кількості хелатних структур з ГК при збільшенні інтенсивності обробітку (оранка). Заявлений спосіб дозволяє отримати дані з виходу доступних для рослин речовин у вигляді 3+ Fe хелатних комплексів, які дають можливість своєчасно впливати за використанням агротехнічних прийомів на ефективну родючість ґрунту та, як наслідок, підвищувати урожайність сільськогосподарських культур. 10 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 20 Спосіб визначення ефективної родючості ґрунту, який включає відбирання ґрунтових зразків, висушування, подрібнювання, видалення рослинних залишків, який відрізняється тим, що додатково проводять з ґрунтових зразків протягом 12-24 годин лужну екстракцію гумінових кислот, за якою з використанням ЕПР аналізу у трьох- (або чотирьох-) сантиметровому діапазоні сканування (3-4 Тесла) отримують в кожному зразку спектри ГК, за якими 3+ встановлюють кількість хелатних парамагнітних металокомплексів з залізом (Fe ), та за відомою формулою визначають кількість парамагнітних центрів: NПЦ=А×Н, де NПЦ - кількість парамагнітних центрів; А - амплітуда широкої лінії ЕПР спектра; Η - ширина широкої лінії ЕПР спектра в умовних одиницях, що відповідають кількості доступних поживних речовин рослин та обумовлюють ефективну родючість ґрунту. 25 5 UA 116281 U Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6