Спосіб діагностики фіброзних змін скловидного тіла при травматичному гемофтальмі

Спосіб діагностики фіброзних змін скловидного тіла при травматичному гемофтальмі, що полягає в проведенні УЗ-сканування, який відрізняється тим, що при наявності вітреоретинальної шварти визначають рівень відносного вмісту фагоцитуючих клітин та CD5 і, якщо їх рівень більше ніж 70 % та 17 % відповідно, діагностують наявність фіброзних змін скловидного тіла з точністю 83,1 % і виконують вітректомію. (19) (21) u200909525 (22) 17.09.2009 (24) 12.04.2010 (46) 12.04.2010, Бюл.№ 7, 2010 р. (72) КРАСНОВИД ТЕТЯНА АНДРІЇВНА, ВЕЛИЧКО ЛЮДМИЛА МИКОЛАЇВНА, НАРОВЧЕНКО ТЕТЯНА ВІТАЛІЇВНА (73) ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "ІНСТИТУТ ОЧНИХ ХВОРОБ І ТКАНИННОЇ ТЕРАПІЇ ІМ. В.П. ФІЛАТОВА АМН УКРАЇНИ" 3 48865 вання травматичного гемофтальма є досить актуальною задачею офтальмології. Із системних факторів слід зазначити стан загальної імунологічної реактивності організму, вік, інші хвороби та поранення (Браунштейн Н.Е. 1952). Особливо несприятливими вважаються імунодефіцитні стани, зниження фагоцитарної активності клітин крові, активізація аутоімунних реакцій організму до тканин ока [Бездетко П.А., Коваленко Ю.В. 2003]. Травми очного яблука супроводжуються збільшенням проникності гематоофтальмічного бар'єра (ГОБ). Вітреальні геморагії являють собою крайній варіант порушення проникності ГОБ і СТ стає своєрідним депо імунокомпетентних клітин і імуноглобулінів, а з боку організму можливий розвиток аутоімунних реакцій [Захарова И.А., 2000, Глинчук Я.И. 1987; Baudounin 1990; Charteries 1993; Бездетко П.А., Коваленко Ю.В. 2003]. Останнім часом з'явилася можливість вивчення не тільки кількісного змісту імунних клітин, а також їхньої функціональної активності за допомогою активаційних антигенів (CD), що виявляються моноклональными антитілами з подібною специфічністю та високою точністю експресії на певних клітинах і на певних фазах їхнього розвитку й функціонального стану. З існуючого різноманіття CD нами був обраний CD 5. CD5 - кластер диференціації, що експресується на субпопуляції IgM-секретуючих В-клітинах, які також називають В-1 клітинами, а також на Тклітинах. Вважається, що CD5(+) В-клітини являють собою унікальну субпопуляцію В клітин, що регулюють аутоімунну систему і є основними продуцентами природних аутоантитіл [Peterson LK, Tsunoda I, Fujinami RS. Role of CD5+B-1 cells in EAE pathogenesis // Autoimmunity. - 2008. - Vol. 41 (5). - P. 353-62]. Експериментальні дослідження демонструють, що збільшення експресії CD5 і на Т-, і на В-клітинах захищає проти аутоімунітету, запобігаючи крайнім його проявам шляхом продукції цитокінів, таких як IL-10 [Dalloul A. CD5: a safeguard against autoimmunity and a shield for cancer cells // Autoimmun Rev. - 2009. - Vol. 8 (4). P. 349-53]. В офтальмотравматології CD 5 і 25 застосовувалися при дослідженні вітреального вмісту при симпатичній офтальмії [Liversidge J, and oth. Retinal antigen specific lymphocytes, TCR-gamma delta T cells and CD5+B cells cultured from the vitreous in acute sympathetic ophthalmitis // Autoimmunity. - 1993. - Vol. l5. - № 4. - P. 257-66]. Даних відносно визначення CD5 у периферичній крові та вітреальному вмісті при травматичному гемофтальмі в доступних інформаційних джерелах не знайдено. 4 Відомі дослідження із прогнозування результатів лікування пацієнтів з IgA нефропатією шляхом визначення в них достовірного підвищення в периферичній крові та ниркових біоптатах CD19(+)CD5(+) В-клітин у порівнянні з контролем. При цьому у хворих з позитивним результатом лікування відзначали достовірне зниження цих клітин, тоді як з негативним - рівень їх не змінювався [Yuling H, and oth. CD19+CD5+ В cells in primary IgM nephropathy // J Am Soc Nephrol. 2008. - Vol. 19 (11). - P. 2130-9]. Найбільш близьким до запропонованому нами способу є спосіб діагностики фіброзних змін СТ при травматичному гемофтальмі за допомогою УЗ-сканування [Логай И.М., Ковальчук А.Г., Красновид Т.А. УЗИ диагностика тяжести гемофтальма в раннем посттравматическом периоде // Офтальмол. журнал. - 1998. - № 4. - с. 302-307]. Однак описаний спосіб доопераційної діагностики дозволяє лише побічно судити про фіброзні зміни СТ по наявності ВРШ, по ступеню рухливості, обсягу, ехогенності та щільності помутнінь СТ. Крім того зазначений спосіб діагностики розглядає в однобічному порядку тільки УЗ ознаки гемофтальму і не враховує спільного впливу інших вагомих факторів, пов'язаних з наявністю фіброзу СТ. В основу корисної моделі поставлене завдання вдосконалення способу діагностики фіброзних змін СТ при травматичному гемофтальмі шляхом урахування спільного впливу найбільш значимих клінічних та імунологічних ознак. Варто сказати, що активаційні антигени (CD) не використовувалися раніше для діагностики фіброзних змін СТ. Внесені в пропонований об'єкт зміни полягають у визначенні у хворих із травматичним гемофтальмом відносного вмісту фагоцитуючих клітин і CD5 у периферичній крові, а також в урахуванні спільного впливу найбільш значимих клінічних і УЗ ознак, пов'язаних з наявністю фіброзу СТ. Технічний результат, що може бути отриманий при здійсненні винаходу, полягає в одержанні можливості діагностики фіброзних змін СТ при травматичному гемофтальмі залежно від відносного вмісту фагоцитуючих клітин і CD5 у периферичній крові хворих і урахування впливу декількох клінічних ознак, пов'язаних з наявністю фіброзу СТ за допомогою моделі множинної логістичної регресії. Поставлене завдання вирішується тим, що спосіб діагностики фіброзних змін СТ при травматичному гемофтальмі полягає в проведенні УЗсканування, який відрізняється тим, що при наявності ВРШ визначають рівень відносного вмісту фагоцитуючих клітин та CD5 і якщо рівень фагоцитуючих клітин більше 70 %, a CD5 більше 17 % діагностують наявність фіброзних змін СТ з точністю 83,1 % і виконують вітректомію. Причинно - наслідкові зв'язки: Причина Наслідок Визначення в периферичній крові відносного вмісту дозволяє діагностувати фіброз скловидного тіла в фагоцитуючих клітин і CD5 і перевищення їх значень 83,1 % випадків і рекомендувати проведення вітреквище 70 % і 17 % відповідно, при наявності вітреотомії. ретинальних шварт по УЗ-скануванню 5 Переваги розробленого способу лікування полягають у досягненні можливості діагностики фіброзних змін СТ залежно від рівня відносного вмісту фагоцитуючих клітин і CD5 у периферичній крові хворих із травматичним гемофтальмом, при наявності вітреоретинальних шварт за даними УЗсканування. Таким чином, як видно із проведеного аналізу, кінцева мета винаходу забезпечується сукупністю суттєвих відмітних ознак. Опис пропонованого нами способу. При неможливості визначення фіброзних змін СТ за допомогою офтальмоскопії при травматичному гемофтальмі (через катаракту, ретролентальні помутніння СТ, густу геморагічну суспензію в СТ), проводять УЗ-сканування і при виявленні вітреоретинальної шварти, проводять дослідження в периферичній крові відносного вмісту фагоцитуючих клітин і CD5. У хворого надщесерця з кубертальної вени за допомогою стерильного одноразового шприцу беруть 5 мл крові у стерильну пробірку з 1 мл розчину гепарину активністю 100 од. Із венозної крові отримують суспензію клітин, які виділяються в градієнті щільності фікол - верографіну (d=1,076-1,078) методом центрифугирования. На предметне скло наносять по 25-30 мкм суспензії клітин у концентрації 2-4 млн/мл і готують мазки крові відповідно кількості використованих моноклональних антитіл. Далі отримані мазки крові фіксуються у камері для фіксації парами 10 % розчину формаліну. Після цього на мазки крові наносять моноспецифічні сироватки моноклональних антитіл і інкубують їх у вологій камері один час при кімнатній температурі. Після цього струшують антитіла першого шару і промивають скло. Далі наносять антитіла другого шару - специфічні антитіла проти імуноглобулінів миші і інкубують 30 хвилин у вологій камері при кімнатній температурі. Далі струшують антитіла другого шару, промивають мазок та фільтровальним папером видаляють зайву вологу. Після цього для візуалізації клітин наносять ПАП - комплекс і інкубують у вологій камері при кімнатній температурі. Ядра клітин дофарбовують метиловим зеленим або гематоксиліном Майера, висушують на повітрі. Під імерсійним світлооптичним мікроскопом проводять рахунок кількості клітин лімфоцитів з червоним обідком (клітини, які експресирують моноклональні антитіла) на 100 звичайних лімфоцитів, отримуючи таким чином відносну кількість вмісту клітин у %. Помножуючи отримане число на загальну кількість лімфоцитів, отримають абсолютну кількість клітин в кл/мкл. Якщо рівні відносного вмісту фагоцитуючих клітин і CD5 вище 70 % і 17 % відповідно з імовір 48865 6 ністю в 83,1 % діагностують наявність фіброзу СТ і рекомендують проведення BE. Клінічні випробування проводилися у відділенні відновлювально-реконструктивної мікрохірургії травматичної патології ока інституту очних хвороб і тканинної терапії ім. акад. В.П. Філатова АМН України. Визначення імунного статусу з використанням моноклональних антитіл проведено у 65 хворих із травматичним гемофтальмом. Переважна більшість становили чоловіки (89,2 %). Середній вік пацієнтів склав 33,95±12,67(M±SD) років. У дослідження ввійшли: 39 пацієнтів, яким через відсутність розсмоктування гемофтальма проводилася BE; 14 пацієнтів, у яких спостерігалося розсмоктування гемофтальму й оперативне лікування не проводилося; і 12 чоловік із травматичним гемофтальмом і відшаруванням сітківки з вираженою ПВР, що також вимагало проведення BE. У периферичній крові визначали: абсолютний і відносний вміст Т-лімфоцитів по CD3+, Т-хелперів по CD4+, Т-супресорів по CD8+, їхнє співвідношення (CD4/CD8) -імунорегуляторний індекс, Влімфоцитів по CD 19+, природних кіллерів по CD 16+, а також функціональну активність лімфоцитів по CD 5, CD 25, CD 38 і CD 54 з використанням моноклональних антитіл; фагоцитарну активність нейтрофілів, рівень сироваткових імуноглобулінів класів А, М, G, рівень сенсибілізації організму до антигенів (АГ) тканин ока (кришталика, судинної оболонки, СТ і сітківки). У пацієнтів, яким проводилася BE під час операції забиралося СТ в обсязі 0,5 мл до введення інфузійної рідини в око для визначення експресії маркерів активації лімфоцитів CD 5, CD 25, CD 38 і CD 54. Діагноз фіброзу СТ встановлювався інтраопераційно під час BE при неможливості його спостерігати при наявності катаракти, ретролентальних помутнінь СТ або густої геморагічної суспензії СТ. З метою визначення клініко-імунологічних факторів ризику, пов'язаних з наявністю фіброзу СТ для чисельної їхньої оцінки, ми скористалися концепцією відносного ризику, що розглядає співвідношення між пацієнтами з певним наслідком хвороби залежно від впливу факторів, з якими цей результат зв'язаний. Якщо результат захворювання є бінарною перемінною, тобто приймаючою два значення - позитивний результат (відсутність фіброзу) або негативний результат (наявність фіброзу), а також фактори ризику також є бінарними, або можуть бути перетворені в бінарні, то ці співвідношення обчислюються із чотирипільної таблиці 1 з використанням поняття відношення шансів. 7 48865 8 Таблиця 1. Чотирипільна таблиця для розрахунку показників відносного ризику Клінічний результат Фактор ризику Позитивний Усього Негативний Наявність а b a+b Відсутність с d c+d Усього а+с b+ d n=a+b+c+d Поняття відношення шансів являє собою відношення ймовірності настання певного клінічного результату до ймовірності його відсутності. Пацієнти, які мають досліджуваного фактора ризику, мають імовірність розвитку негативного клінічного результату рівну а/а+b, і ймовірність не настання такого результату рівну b/a+b. Звідси, шанси одержання негативного клінічного результату в присутності фактора ризику рівні: a/(a+b):b/(a+b)=a/b. Аналогічно розраховуються шанси одержання клінічного результату при відсутності фактора ризику: c/d. Показник ризику, виражений через відношення шансів, що оцінює ступінь впливу фактора ризику на досліджуваний клінічний результат, обчислюється в такий спосіб: a b a b OR c b c d (1), де a, b, с, d - абсолютне число відповідних спостережень (див. таблицю 1). Даний показник показує в скільки разів збільшується або зменшується шанс розвитку якого-небудь стану при впливі досліджуваного фактора. Цей показник приймає значення від 0 до ∞ і дорівнює 1 тільки при відсутності ефекту. Відношення шансів більше одиниці характеризує більшу (підвищену) поширеність клінічного результату серед осіб, які мали досліджуваний фактор ризику, що свідчить про його позитивний внесок у розвиток конкретного клінічного результату. З метою вивчення комплексного впливу групи факторів на клінічний результат (наявність фіброзу СТ) ми використовували метод багатофакторного аналізу, реалізований у вигляді математичного моделювання з використанням логістичної регресії, що дозволяє оцінити спільний вплив багатьох факторів на залежну перемінну, яка приймає два значення. При цьому як оцінка відносного ризику, пов'язаного з дією фактора використовується експонентний коефіцієнт рівняння логістичної регресії. У загальному виді рівняння логістичної регресії записується так: odds (yj≠0)=exp(xjb+b0) (3), де odds - шанс, пов'язаний з імовірністю формулою: odds odds Pвипадку odds 1 (4), хj - значення незалежних перемінних (факторів), bj - коефіцієнти які необхідно визначити. Нами для визначення коефіцієнтів був використаний метод Квазі-Ньютона. Статистичний аналіз проводився з використанням пакета Statistica 6.0. Результати. Перш ніж приступити до аналізу клінічних і імунологічних ознак, пов'язаних з наявністю фіброзних змін СТ ми перевірили, що відмінностей по статі, віку та строкам проведення імунологічних досліджень із моменту травми в групах хворих з і без фіброзу СТ не має (таблиці 2 і 3). Таблиця 2. Стать Чоловіки (n=58) Жінки (n=7) Розподіл хворих по статі в групах з і без фіброзу СТ. Фіброз СТ Наявність (n=34) Відсутність (n=31) 26 (44,83 %) 5(71,43 %) 32(55,17 %) 2 (28,57 %) χ2 Р 1,77 0,183 9 48865 10 Таблиця 3. Середні значення віку хворих і строків проведення імунологічних досліджень у групах з і без фіброзу СТ (M(SD). Фіброз СТ р* Відсутність (n=31) Наявність (n=34) Вік (роки) 35,68±13,01 32,38±12,34 0,299 Строки проведення імунологічних досліджень із моменту 75,48±89,05 56,82±38,46 0,270 травми (дні) Примітка: р*- статистично значимі розходження між порівнюваними групами за критерієм Ст'юдента. Першим етапом дослідження було порівняння середніх значень імунологічних показників периферичної крові в групах хворих з і без фіброзу СТ. У таблиці 4 зазначені тільки ті показники, що вірогідно різняться (або близькі до достовірного). У хворих з фіброзом СТ у периферичній крові вста новлене достовірне підвищення відносної кількості фагоцитуючих клітин і рівня сенсибілізації організму до АГ судинного тракту, а також близьке до достовірного підвищення відносного змісту CD5 і CD 16. Таблиця 4. Порівняння середніх значень імунологічних показників периферичної крові у хворих із травматичним гемофтальмом залежно від наявності або відсутності фіброзу СТ (M±SD). Фіброз СТ Наявність Імунологічні показники периферичної крові р* р** (n=34) Відсутність (n=31) Відносна кіл-ть Ек-кліток CD 16 (%) Відносна кіл-ть фагоцитуючих клітин (%) Сенсибілізація до АГ сосудистого тракту Відносна кіл-ть CD5 (%) 13,71±4,80 65,61±17,05 11,16±6,08 15,68±6,00 16,09±5,11 76,65±16,13 13,71±4,88 18,76±6,58 0,058 0,009* 0,066 0,053 0,072 0,007* 0,027* 0,055 Примітка: р*- статистично значимі розходження між групами за критерієм Ст'юдента; р** - статистично значимі розходження між групами за критерієм Манна-Уітні. Визначення достовірних відмінностей середніх значень імунологічних показників, представлених у таблиці 4, дало нам підставу більш детально їх проаналізувати. У таблиці 5 представлені тільки найбільш значимі (або близькі до них) імунологічні та клінічні показники, пов'язані з наявністю фіброзу СТ. Оскільки імунологічні показники є кількісними перемінними, то для кожного з них визначали оптимальне або граничне значення чутливості та специфічності, при якому мав місце розвиток фіброзу СТ. Так серед хворих з фіброзом СТ у периферичній крові відносна кількість фагоцитуючих клітин вище 70 % була в 68,42 % хворих, відносна кількість CD5 вище 17 % була в 65,52 % хворих. Значення 70 % і 17 % є в цьому випадку оптимальними або граничними значеннями чутливості й специфічності, які пов'язані з наявністю фіброзу СТ. 11 48865 12 Таблиця 5. Оцінка ймовірності наявності фіброзу СТ залежно від імунологічних і клінічних показників по даним одноваріантної логістичної регресії. 95 % ДИ Фіброз СТ КлінікоГрадація імунологічні ознаки (знаχ2 р OR НижВерхній показники чення х) ній Відсутність Наявність (n=31) (n=34) 0 - ≤70 % 19 (70,37 %) 8 (29,63 %) Відносна кіл-ть 9,52 0,002 5,15 1,72 15,36 1 - >70 % (біфагоцит, кл. 12(31,58 %) 26 (68,42 %) льше) 0 - ≤17 % 21 (58,33 %) 15 (41,67 %) Відносна кіл-ть 3,66 0,055 2,66 0,95 7,47 CD5 1 - >17 % 10 (34,48 %) 19 (65,52 %) Сенсибілізація 0 - 0,50, те такий результат відносили до групи з негативним клінічним результатом. Якщо р