Спосіб одержання біоцидного препарату

Реферат: Спосіб одержання біоцидного препарату на основі високодисперсного металевого срібла включає синтез наночастинок відновленням іонів срібла з водного розчину сполуки срібла відновником в полімерній матриці. Як матрицю використовують полімери, що формують клітинну стінку мікроорганізмів, біомасу яких просочують водним розчином сполуки срібла або відновника та проводять реакцію відновлення іонів срібла до утворення наночастинок срібла в біоматриці в кількості 0,5-8 % мас з подальшим відділенням одержаного нанобіокомпозита від рідини центрифугуванням та приготуванням суспендованих або ліофілізованих форм препарату. UA 72033 U (12) UA 72033 U UA 72033 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до хіміко-фармацевтичної промисловості і стосується технології одержання біоцидного препарату на основі високодисперсного металевого срібла, який може знайти застосування в медицині, ветеринарії, а також харчовій промисловості та косметології. Як відомо, колоїдне срібло є природним антибіотиком і використовується як біоцидний агент проти бактерій, вірусів і грибів, включаючи антибіотикостійкі штами цих мікроорганізмів. Виражена біологічна (антимікробна) активність колоїдного срібла використовується в екологічних та медичних цілях, наприклад срібні частинки використовують у фільтруючих пристроях для очищення води, високодисперсне металеве срібло використовують для приготування лікарських бактерицидних препаратів. З літературних джерел відомо, що при синтезі наночастинок срібла із забезпеченням закріплення на їхній поверхні біомолекул підвищується не тільки стабільність, але й афінність частинок до клітин патогенних мікроорганізмів, що сприяє інактивації останніх. Відомі комерційні бактерицидні лікарські препарати протаргол і коларгол, які являють собою колоїдні композиції, що містять срібло, й стабілізовані високомолекулярними сполуками білкової природи. Протаргол містить 7,5-8,0 % колоїдного оксиду срібла, а коларгол містить 70 % колоїдного металевого срібла. Головним недоліком технології одержання відомих препаратів є її складність через мінливість складу і неоднорідність вихідної білкової сировини (желатина або казеїн). З метою спрощення технології отримання бактерицидних засобів, що містять срібло, запропонована водорозчинна бактерицидна композиція, що містить 0,01-2,33 мас. ч. високодисперсного металевого срібла на 1 мас. ч. стабілізатора - синтетичної високомолекулярної сполуки полі-N-вінілпіролідону-2 [патент RU № 2088234, опубл. 27.08.1997 р.] Бактерицидну композицію одержують взаємодією нітрату срібла з водно-спиртовим розчином полі-N-вінілпіролідону-2 в темряві при t=65-75 °C в атмосфері інертного газу з подальшим висушуванням водно-спиртового розчину до порошкоподібного стану. Отриману композицію, що містить 7-8 % колоїдного срібла, можна використовувати для приготування ефективних бактерицидних засобів, що містять срібло, з відтворюваними фізико-хімічними характеристиками, зниженою токсичністю і алергенністю в порівнянні з комерційними бактерицидними лікарськими препаратами (протаргол, коларгол), проте технологія їхнього одержання досить складна, тому що необхідна атмосфера інертного газу, підігрів, забезпечення темряви. Стабільність композиції, що одержують відомим способом, забезпечується застосованим у синтезі колоїдного срібла полімером. Стабільність синтезованих наночастинок срібла можна також забезпечити, проводячи їх синтез у полімерній матриці. У патенті RU № 2385293 опубл. 27.03.2010 p. запропоновано спосіб одержання матеріалів з бактерицидною дією, що включає синтез наночастинок відновленням срібла до нульвалентного стану з розчину його солей, який проводять в катіонообмінній матриці КУ-2-8; як сіль срібла використовують 0,01 М розчин нітрату срібла, а як відновник - 6 % розчин гідразину в 2,5 %-ому розчині гідроксиду натрію, що розводять у 2-3 рази або 0,1 М розчин хлориду олова (II) в 1,6 М розчині соляної кислоти. У першому випадку матрицю спочатку насичують розчином нітрату срібла, а потім приводять у контакт з відновником, а в другому - навпаки, спочатку розчин хлориду олова приводять у контакт з матрицею, потім відмивають її від надлишку хлориду олова, після чого пропускають розчин нітрату срібла з добавкою 25 %-ого розчину аміаку, а після завершення синтезу матрицю промивають послідовно водою, яка попередньо очищена від кисню та солей, із 6 %-вим розчином знекисненої сірчаної кислоти. Відомий спосіб дозволяє одержувати композитний матеріал наночастинки - іонообмінник, який містить агрегативно стійкі матрично ізольовані в сульфокатіонообміннику гелевої природи наночастинки срібла з середнім розміром 25-40 або 70-85 нм й може бути використаний як матеріал з бактерицидною дією для очищення питної води та інших цілей. Відомий спосіб є найбільш близьким за технічною сутністю до запропонованого способу; недоліками його є відносно великий розмір частинок срібла і нерозчинність у воді одержуваного матеріалу, що значно обмежує можливості його застосування в медичних цілях. Задачею корисної моделі є розробка високотехнологічного способу одержання біоцидного препарату на основі високодисперсного срібла, який забезпечує спрощення процесу синтезу, підвищення ефективності та розширення сфери застосування одержуваного препарату в медицині. Поставлена задача вирішується запропонованим способом одержання біоцидного препарату на основі високодисперсного металевого срібла, який включає синтез наночастинок срібла відновленням іонів срібла з водного розчину його сполуки відновником в полімерній 1 UA 72033 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 матриці, при цьому як полімерну матрицю використовують полімери, що формують клітинну стінку мікроорганізмів. Відповідно до корисної моделі біомасу мікроорганізмів просочують водним розчином сполуки срібла або відновника і проводять реакцію відновлення до утворення наночастинок срібла в біоматриці в кількості 0,5-8 % з наступним відділенням отриманого нанобіокомпозитного матеріалу від рідини центрифугуванням і приготуванням суспендованих або ліофілізованих форм препарату. Як сполуку срібла використовують азотнокисле срібло у вигляді водного розчину з концентрацією 0,001-0,1 М, а як відновник застосовують моносульфат гідразину в концентрації 0,005-0,5 Н або борогідрид натрію в концентрації 0,0005-0,05 Н. Для одержання біоцидного препарату у формі водної суспензії нанобіокомпозит розбавляють слаболужним розчином у співвідношенні, що забезпечує необхідну кількість срібла в готовому препараті. Для приготування сухих форм біоцидного препарату синтезований нанобіокомпозит піддають ліофілїзації відомими способами, наприклад висушуванню в замороженому стані під вакуумом. Сухі форми препарату, що заявляється, легко переводяться у вихідний нативний стан додаванням води або фізіологічного розчину для подальшого застосування в медичних цілях або для інших потреб. У способі, що заявляється, роль полімерної матриці виконують полімери, що формують клітинну стінку мікроорганізмів, біомаса яких бере участь у процесі. В результаті обробки біомаси, просоченої розчином одного з компонентів реакції відновлення, іншим її компонентом відбувається виділення металевого срібла з розчину і осадження наночастинок срібла на поверхні або всередині клітинних стінок мікроорганізмів, що виконують при цьому роль нанореакторів. У заявлених умовах процесу забезпечується синтез стабільних однорідних за розміром (1-3 нм) і рівномірно розподілених в об'ємі біомаси (біоматриці) частинок і в результаті утворюється композитний матеріал наночастинки срібла - біоматриця (нанобіокомпозит), який є основою для різних форм готового біоцидного препарату. Як біоматриця для отримання біоцидних препаратів може бути використана біомаса мікроорганізмів різних таксономічних груп. У наведених нижче прикладах використовували штами дріжджового грибка Candida albicans, культури грампозитивних бактерій Bacillus cereus і культури грамнегативних бактерій Escherichia coli і Pseudomonas fluorescens. Біомасу кожного із зазначених мікроорганізмів вирощували в конічних колбах об'ємом 200 мл на рідкому поживному середовищі, приготовленого з панкреатичного гідролізату рибного борошна при 26-37 °C протягом 18 годин. При культивуванні дріжджів в середовище додатково вносили 1 % сахарози. Біомасу відокремлювали від культуральної рідини на центрифузі при 4800 g і двічі відмивали дистильованою водою. Зібрану біомасу далі використовували для отримання біоцидного препарату. Як вихідну сполуку срібла використовували азотнокисле срібло, а як відновники моносульфат гідразину та борогідрид натрію. Для одержання біоцидного препарату попередньо нарощену біомасу мікроорганізмів просочували водним розчином азотнокислого срібла, потім проводили реакцію відновлення іонів срібла, що закріпилися в біоматриці, моносульфатом гідразину або борогідридом натрію до утворення наночастинок срібла необхідного розміру в потрібній кількості ("внутрішній" біосинтез частинок), або спочатку просочували біомасу мікроорганізмів водним розчином відновника, а потім обробляли водним розчином азотнокислого срібла для відновлення іонів срібла до нуль-валентного стану та формування наночастинок срібла, що розподіляються в біоматриці ("зовнішній" біосинтез частинок). В обох варіантах біосинтезу отримували нанобіокомпозитний матеріал "наночастинки срібла - біоматриця", що має біоцидні властивості і слугує основою для приготування рідких (суспендованих) і сухих (ліофілізованих) форм препарату. У групі прикладів №№ 1-8 та таблиці 1 описані конкретні умови процесу і дані про властивості отриманих зразків нанобіокомпозиту при використанні моносульфату гідразину, а в прикладах №№ 9-16 і таблиці 2 наведена аналогічна інформація про процес в разі відновлення борогідридом натрію. Приклади 1-8 В прикладі 1, а також в прикладах 2-8 реакція відновлення іонів срібла відбувається за схемою: + + 0 + 2N2H4+Ag +½О2+Н = Ag +½Н2О2+2NH4 +N2 Для проведення процесу "внутрішнього" біосинтезу частинок срібла 1,5 г вологого осаду біомаси мікроорганізму, отриманого, як описано вище, просочували 1 мл розчину AgNO3 і 2 UA 72033 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 витримували 30 хв при слабкому перемішуванні. Після цього суспензію осаджували на центрифузі при 4800 g протягом 15 хв, двічі переосаджували в дистильованій воді і контролювали розчином NaCl на відсутність вільних іонів срібла. Осад біомаси, що містить іони срібла, ресуспендували в 4 мл розчину сульфату гідразину і проводили процес відновлення іонів срібла при перемішуванні протягом 30 хв до утворення в біоматрицї наночастинок срібла. Отриману суміш центрифугували при 4800 g і двічі відмивали осад дистильованою водою, яку попередньо залужували 0,1 М розчином NaOH до рН = 9,5. Для проведення "зовнішнього" біосинтезу наночастинок срібла в біоматриці спочатку просочували біомасу мікроорганізмів водним розчином моносульфату гідразину, а потім проводили реакцію відновлення обробкою розчином AgNO3 при дотриманні всіх інших описаних вище умов процесу. Дані про використану в кожному з прикладів 1-8 культуру мікроорганізмів і концентрацію розчинів реагентів в обох варіантах синтезу представлені в таблиці 1. Там же наведені характеристики одержуваного в результаті "внутрішнього" біосинтезу (зразки Г1) і "зовнішнього" біосинтезу (зразки Г2) продукту: вміст срібла в нанобіокомпозиті в мг на г біомаси по сухій речовині і середній розмір частинок срібла в нм. Приклади 9-16 В прикладах 9-16 відновлення іонів до нуль-валентного стану проводили борогідридом натрію. Реакція відновлення протікає за схемою: + 0 8Ag +ВН4 +8ОН -8Ag +Н2ВО3 + 5Н2О. Всі основні умови процесу як у випадку "внутрішнього, " так і "зовнішнього" біосинтезу частинок срібла в біоматриці аналогічні описаним вище в прикладах 1-8, однак відновник додають в кількості 2 мл на 1 мл розчину солі срібла і воду для промивки залужують до рН=1011. Дані про використану культуру мікроорганізмів в кожному з прикладів 9-16, концентрацію розчинів реагентів в обох варіантах синтезу, а також характеристика отриманого нанобіокомпозита представлені в таблиці 2. Зразки в цій групі прикладів, що одержані при "внутрішньому" біосинтезі частинок, позначені індексом Б1, а при "зовнішньому" - індексом Б2. На основі отриманих зразків нанобіокомпозита готували зразки бактерицидного препарату у формі водної суспензії або у вигляді сухих ліофілізованих форм. Приклад 17 Для одержання ряду зразків препарату у формі водної суспензії, вологий осад нанобіокомпозита після відмивки лужним розчином розводили дистильованою водою з додаванням лугу до рН =10, при цьому нанобіокомпозит за прикладами 1, 3, 9, 11 розводили до 3 вмісту срібла в готовому препараті 0,25 мкмоль/см , а за прикладами 2, 4, 10 і 12 - до 3 1,2 мкмоль/см . Приклад 18 На основі нанобіокомпозитів, одержаних за парними варіантами прикладів, готували сухі форми біоцидного препарату, що заявляється, для чого осад нанобіокомпозита після промивки піддавали ліофільній сублімаційному сушінню: висушування в замороженому стані під вакуумом. Одержані за прикладом 17 зразки суспензій і одержані за прикладом 18 сухі форми препарату досліджували для оцінки біоцидних властивостей. Біоцидну активність рідких форм препарату, одержаних за прикладом 17, оцінювали за показником "ступеня пригнічення росту" (S, %) тестової культури мікроорганізмів. Значення S визначали за формулою: S=100 (1-D/Dок), %, де: K=Dк/Dок, Dок - оптична щільність клітинної суспензії тестової культури при засіві, Dк - те саме через 18 годин росту, Dо - оптична щільність суспензії тестової культури з внесеної добавкою зразка препарату при засіві, D - те саме через 18 годин росту. 5 3 Концентрація клітин тестової культури при засіві становила 5,2∙10 КОЕ/см . Оптичну щільність суспензій визначали при довжині хвилі λ=540 нм і довжині оптичного шляху l=5 мм. Значення показника пригнічення росту тестових культур мікроорганізмів при внесенні різних 3 об'ємів (0,5 і 0,7 см ) суспензії, одержаної як описано в прикладі 17 на основі зразків нанобіокомпозиту за прикладами 1, 2, 3, 4 (варіанти Г1, Г2) і за прикладами 9, 10, 11, 12 (варіанти Б1, Б2) наведені в табл. 3. 3 UA 72033 U 5 10 15 20 25 Аналогічні дані антибактеріальної активності отримані і для зразків запропонованого бактерицидного препарату з інших прикладів його одержання. Поверхневу біоцидну активність суспендованих і ліофілізованих форм препарату, що заявляється, визначали методом вирощування на чашках Петрі. Для цього чашки Петрі з поживним агаром засівали газоном, вносячи 100 мкл бактеріальної суспензії Escherichia coli 5 3 ВКПМ з концентрацією 5,2∙10 КОЕ/см . На чашках з засівом розміщували паперові диски діаметром 6 мм, які були просочені зразками препарату, отриманого як описано в прикладі 17, 3 або регідратацією 100 мг кожного з одержаних за прикладом 18 ліофілізованих зразків в 2,5 см дистильованої води з додаванням лугу до рН=10. Протягом доби інкубували в термостаті, а потім заміряли ширину зони пригнічення росту (в мм) від краю диска, визначали середнє значення цього показника з 4-х паралельних дослідів. Отримані для досліджених зразків препарату дані наведені в таблиці 4. Наведені в таблицях 1, 2 дані показують, що спосіб, який заявляється, дозволяє одержувати нанобіокомпозитний матеріал з різним вмістом високодисперсного срібла в залежності від концентрації вихідного розчину AgNO3, вибору культури мікроорганізмів і варіанта проведення біосинтезу, причому середній розмір наночастинок срібла від цих факторів практично не залежить. Дані табл. 3 свідчать про біоцидну активність отриманих препаратів у формі водних суспензій і підтверджують їх високу ефективність. При цьому, як видно з табл. 4, ліофілізовані форми препарату виявляють більш високу поверхневу антибактеріальну активність в порівнянні із зразками у формі свіжоприготовленої водної суспензії нанобіокомпозита. Таким чином, спосіб, що заявляється, дозволяє одержувати ефективний біоцидний засіб на основі композитного матеріалу, який містить агрегативно стійкі наночастинки срібла об'ємно розподілені в біоматриці, й може виготовлятися у вигляді водних суспензій або у ліофілізованїй формі та застосовуватися в медицині, ветеринарії та ін. областях. Технологія процесу проста, синтез протікає на повітрі при кімнатній температурі, не вимагає дорогих і дефіцитних реагентів, а мікробіологічна біоматриця є доступною і відтворюваною сировиною. Таблиця 1 Культура Приклади мікроорганізму в біоматриці 1 2 3 4 5 6 7 8 Candida albicans УКМ 690 Candida albicans УКМ 690 Escherichia coli ВКПМ В123 8 Escherichia coli ВКПМВ1238 Bacillus cereus ВКПМ В5039 Bacillus cereus ВКПМ В5039 Pseudomonas fluorescens ВКПМ В5040 Pseudomonas fluorescens ВКПМ В5040 Концентрація AgNO3, M Концентрація розчину моносульфату гідразину, Н Вміст cрібла нанобіокомпозиті мг/г Г1 Г2 Середній розмір частинок, нм 5∙10 3 0,01 5,22 4,96 1,62 5∙10 2 0,1 54,7 51,9 1,83 5∙10 3 0,01 5,35 7,56 2,14 5∙10 2 0,1 58,8 76,2 2,15 5∙10 3 0,01 6,32 6,11 2,17 5∙10 2 0,1 69,2 67,7 2,34 5∙10 3 0,01 5,95 7,45 2,37 5∙10 2 0,1 61,9 77,9 2,55 30 4 UA 72033 U Таблиця 2 Приклади 9 10 11 12 13 14 15 16 Культура мікроорганізму в біоматриці Концентрація AgNO3, M Candida albicans УКМ 690 Candida albicans УКМ 690 Escherichia coli ВКПМВ1238 Escherichia coli ВКПМВ1238 Bacillus cereus ВКПМ В5039 Bacillus cereus ВКПМ В5039 Pseudomonas fluorescens ВКПМ В5040 Pseudomonas fluorescens ВКПМ В5040 Концентрація розчину борогідриду натрію, Н Вміст срібла в нанобіокомпозиті, мг/г Б1 Б2 Середній розмір частинок, нм 5∙10 3 0,001 Н 5,11 5,21 1,52 5∙10 2 0,01 Н 53,9 52,6 1,60 5∙10 3 0,001 Н 5,67 6,98 2,01 5∙10 2 0,01 Н 58,9 71,4 2,12 5∙10 3 0,001 Н 5,54 6,65 2,03 5∙10 2 0,01 Н 58,7 68,1 2,14 5∙10 3 0,001 Н 6,43 6,56 2,23 5∙10 2 0,01 Н 65,5 67,2 2,36 Таблиця 3 Суспензія нанобіокомпозита за прикладами №№ Приклад 1, Г1 Приклад 2, Г1 Приклад 3, Г2 Приклад 4, Г2 Приклад 9, Б1 Приклад 10, Б1 Приклад 11, Б2 Приклад 12, Б2 Тестова культура мікроорганізмів Escherichia coli ВКПМВ1238 Escherichia coli ВКПМВ1238 Candida albicans УКМ 690 Candida albicans УКМ 690 Escherichia coli ВКПМВ1238 Escherichia coli ВКПМВ1238 Candida albicans УКМ 690 Candida albicans УКМ 690 S, % Об'єм добавленої 3 суспензії, см 0,5 0,7 89,26 92,06 92,24 100 97,66 98,52 99,07 99,22 96,63 97,3 100 100 92,56 97,02 98,26 100 Таблиця 4 Ширина зони пригнічення росту, мм Суспензія нанобіокомпозита за прикладами №№ Свіжоприготована суспензія Ліофілізований препарат Приклад 2, Г1 4 7 Приклад 4, Г2 4 9 Приклад 6, Г1 3,5 8 Приклад 8, Г2 5 7 Приклад 10, Б1 5,5 6 Приклад 12, Б2 6 11 Приклад 14, Б1 5 7 Приклад 16, Б2 6 10 5 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 1. Спосіб одержання біоцидного препарату на основі високодисперсного металевого срібла, що включає синтез наночастинок відновленням іонів срібла з водного розчину сполуки срібла відновником в полімерній матриці, який відрізняється тим, що як матрицю використовують 5 UA 72033 U 5 10 15 полімери, що формують клітинну стінку мікроорганізмів, біомасу яких просочують водним розчином сполуки срібла або відновника та проводять реакцію відновлення іонів срібла до утворення наночастинок срібла в біоматриці в кількості 0,5-8 % мас з подальшим відділенням одержаного нанобіокомпозита від рідини центрифугуванням та приготуванням суспендованих або ліофілізованих форм препарату. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що використовують мікроорганізми, вибрані з групи: Candida albicans, Bacillus cereus, Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens. 3. Спосіб за пп. 1 або 2, який відрізняється тим, що використовують розчин азотнокислого срібла в концентрації 0,001-0,1 М. 4. Спосіб за пп. 1, 2 або 3, який відрізняється тим, що як відновник використовують моносульфат гідразину в концентрації 0,005-0,5 Н. 5. Спосіб за пп. 1, 2 або 3, який відрізняється тим, що як відновник використовують борогідрид натрію в концентрації 0,0005-0,05 Н. 6. Спосіб за будь-яким з пп. 1-5, який відрізняється тим, що одержаний нанобіокомпозит суспендують в слаболужному водному розчині. 7. Спосіб за будь-яким з пп. 1-5, який відрізняється тим, що одержаний нанобіокомпозит ліофільно висушують. Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6