Спосіб одержання протипухлинного препарату

Корисна модель відноситься до галузі медицини, зокрема до розробки препаратів медичного призначення і може бути використана для виготовлення засобу, ефективного проти злоякісних новоутворень. Зростаюча частота виникнення онкозахворювань спонукає до пошуку нових антибластичних засобів із залученням сполук як природного (рослинного чи мікроорганізменного), так і синтетичного походження. Відомий спосіб одержання речовини з протипухлинною активністю шляхом культивування мікроорганізмів штаму Bacillus subtilis B-7025 протягом 7-9 діб на середовищі Гаузе або екстракті пшеничних висівок, відокремлення культуральної рідини, її осадження сульфатом амонію з наступним діалізом, концентруванням, гельфільтрацією, отримання активних фракцій і їх висушування в вакуумі до сухої речовини [1]. Даний спосіб вибраний за прототип і є найбільш близьким до запропонованого способу одержання протипухлинного препарату. Недоліком запропонованого способу є використання великої кількості реактивів, значна тривалість процесу отримання діючої речовини, переважне застосування речовини як ад'ювантного агента при приготуванні протипухлинних вакцин, а не як безпосереднього антибластичного перорального засобу. Завданням корисної моделі є розробка нового способу одержання препаратів, що володіють протипухлинними властивостями, з розширенням спектру протипухлинних засобів за рахунок імуностимулюючих властивостей препарату та спрощенням способу його введення в організм хворих із злоякісними новоутвореннями. Поставлене завдання досягається таким чином. Одержання протипухлинного препарату здійснюють способом, який включає: 1) культивування штаму мікроорганізмів Bacillus subtilis-6633 протягом 2-5 діб на поживному середовищі м'ясо-пептонному агарі (МЛА) [2], який додатково містить активну добавку - фітокомплекс із водно-спиртових витяжок рослин: веснівки дволистної, воронячого ока, аконіту молдавського, подорожника ланцетолистого, вовчих ягід та розчину солі заліза двохвалентного (0,2мл фітокомплексу на 6-9мл МПА); 2) відділення резистентних мікроорганізмів і перенесення їх на свіжоприготовлений м'ясо-пептонний бульйон (МПБ); 3) культивування відділених мікроорганізмів при рН 7,8 протягом 6-8 діб; 4) відділення центрифугуванням супернатанту, який осаджують 60% сірчанокислим амонієм протягом 1,53год; 5) розчинення відцентрифугованого осаду в фосфатному буфері рН 7 [3] у співвідношенні 1:3. Одержаний розчин використовують як протипухлинний препарат у дозі 0,1мл на 100г маси організму. Заявлений спосіб здійснюють таким чином. Отримують резистентні до фітокомплексу бактерії штаму Bacillus subtilis - 6633. Фітокомплекс включає спиртові витяжки рослин: аконіту молдавського (Aconitum moldavicum Hagi) розведення 1:60 (40% етиловий спирт) - 0,2мл, вовчих ягід (Daphne mesereum L.) - 1:100 (40% етиловий спирт) - 1мл, воронячого ока (Paris quadrifolia L.) - 1:100 (40% етиловий спирт) - 1мл, веснівки дволистої (Majantemum bifolium F.W. Schmidt) 1:50 (20% етиловий спирт) - 1мл, подорожник ланцетолистий (Plantago lanceolata L.) - 1:5 (40% етиловий спирт) - 1мл та FеСl3 - 2мг. Фітокомплекс вводять у стерильний м'ясо-пептонний агар у кількості 0,2мл на 6-9мл МП А. Мікроорганізми у кількості 0,1мл висівають методом суцільного газону на поверхню МПА у чашки Петрі. Інкубацію здійснюють при температурі 37°С протягом 3-7 діб, в залежності від темпу проростання. Пророслі колонії переносять у 2мл фізіологічного розчину й інокулюють у МПБ (100мл), рН 7. Культивують протягом 6-8 днів при температурі 37°С. Продукти метаболізму відділяють центрифугуванням при 5000об/хв протягом 20хв. Супернатант зливають і осаджують 60% сірчанокислим амонієм протягом 2год. Після відцентрифугування (режим попередній), осад розчиняють у фосфатному буфері рН 7 у співвідношенні 1:3. Одержаний розчин використовують як протипухлинний препарат у дозі 0,1мл на 100г маси організму. Ефективність протипухлинного засобу ілюструється наступними прикладами експериментальних досліджень. Безпородним білим щурам масою 110-130г здійснювали підшкірну імплантацію карциноми Герена шляхом введення 30% суспензії ракових клітин (кількістю 1011) у фізрозчині в ділянку стегна. Засіб застосовували перорально протягом 14 діб, починаючи з 10 доби розвитку пухлини. Аналіз показників протипухлинної активності засобів, створених на основі продуктів метаболізму Bacillus subtilis-6633 показав, що максимальний позитивний ефект виявляв препарат, який містив продукти життєдільності змінених (резистентних) культур Bacillus subtilis. Тривалість життя тварин-пухлиноносіїв у цьому випадку не відрізнялася від контрольних (інтактних) тварин, а ступінь гальмування росту карциноми Герена варіював в межах 80-100%. Тривалі експериментальні дослідження виявили відсутність прояву рецидивів у тварин-пухлиноносіїв. При застосуванні засобу, створеного на основі продуктів життєдіяльності незмінених (чутливи х) культур Bacillus subtilis, збільшувалася тривалість життя тваринпухлиноносіїв, проте не спостерігалося значної регресії злоякісного новоутворення. Таблиця 1. Вплив бактеріального засобу на тривалість життя та ступінь гальмування росту карциноми Герена у тварин Групи тварин Щурі-пухлиноносії (самки, m=120±10г) Щурі-пухлиноносії, що в якості протипухлинного засобу отримували продукти метаболізму незмінених (чутливих) Bacillus subtilis-6633 Щурі-пухлиноносії, що в якості протипухлинного засобу отримували продукти метаболізму змінених (резистентних) Bacillus subtilis-6633 Тривалість життя, доба Ступінь гальмування росту карциноми Герена, % 21±3 60±5 як інтактні тварини 20 (прояв рецидивів) 95 (відсутність рецидивів) Проведені біохімічні дослідження крові тварин-пухлиноносіїв, яким вводили запропонований протипухлинний засіб, вказували на нормалізацію вмісту глобулінів, альбуміну, гемоглобіну, глюкози, середніх молекул та амілазної активності, рівень яких значно змінювався у динаміці росту карциноми Герена. Перевагами препарату є його відносно легке виділення (культивування мікроорганізмів на доступному середовищі, відділення продуктів життєдіяльності, осадження та розчинення діючих агентів), пероральне застосування протягом нетривалого часу, стійке одужання пухлиноносіїв без проявів рецидивів, відсутність токсичної дози, широкий спектр антимікробної дії. Джерела інформації: 1. Патент 59483 UA, МПК С2 7С07К14/32, А61Р35/00 Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України, Потебня Г.П., Танасієнко О.А., Лісовенко Г.С., Черемшенко Н.Л., Чехун В.Ф. Цитотоксичний лектин з протипухлинною активністю - 15.09.2003, Бюл. №3, 2003. 2. Векірчик К.М. Практикум з мікробіології. - К.: Либідь, 2001. - 144с. 3. Кучеренко М.Є., Бабенюк Ю.Д., Войціцький В.М. С учасні методи біохімічних досліджень. - К.: Фітоцентр, 2001. - 424с.