Спосіб створення соматичних гібридів капусти білоголової

Спосіб створення соматичних гібридів капусти білоголової різних сортових генотипів, який вклю C2 1 3 76700 4 ють працювати зі змішаними популяціями батьківханічним шляхом, або дією ферментів клітинну ських клітин об'ємом 10-10 клітин, при цьому у оболонку [10]. процес злиття може залучатися 5-30% культивоСучасні технології дозволяють отримати веливаних протопластів [2]. Головними проблемами ку кількість рослинних клітин з відокремленою при проведенні дослідів по соматичній гібридизаоболонкою, але з функціонально діючою плазмації є: лемою. Більшість проведених дослідів свідчить 1) створення селективних умов для відокремпро те, що протопласти потребують створення і лення гетероплазматичних продуктів злиття від дотримання певних фізіологічних умов свого розбатьківських клітин, або гомоплазматичних продувитку які послідовно забезпечать процеси репарактів; ції клітинної оболонки, поділу клітин. 2) відпрацювання ефективної методики регеутворенню мікроколоній і навіть цілих рослин нерації рослин з гетероплазматичних продуктів [11]. Головними регулюючими компонентами роззлиття. витку культури протопластів на стадії до репарації Для вирішення першої проблеми у клітинноклітинної оболонки є поєднання трьох факторів: інженерній технології по створенню соматичних 1) дотримання оптимальної (гіпертонічної) осгібридів розроблено декілька експериментальних мотичної напруг и поживного середовища за рахупідходів: нок використання осмотичноактивних речовин - механічна ізоляція гетерокаріонів [3] та їх пе(ОАР) для підтримання протопластів у життєздатресів на окремі поживні середовища для культивуному стані до утворення клітинної оболонки; вання; 2) ауксин-цитокініновий гормональний баланс, - створення антибіотикостійких мутантів росв якому співвідношення ауксинів і цитокінінів ї на лин, як потенційних партнерів соматичної гібридикористь ауксинів, що забезпечує ініціацію клітиннозації, де стійкість до антибіотика можливо викориго поділу протопластів після утворення клітинної стати, як ідеальну генетичну маркерну ознаку, яку оболонки; можуть успадковувати гібридні рослини і за раху3) оптимальний добір трофічних компонентів нок чого можливий їхній добір на поживних серепоживного середовища для переходу метаболічдовищах у присутності антибіотика, що виконує них систем і обмінних процесів у ізольованих пророль селективного агента [4]; топластів на існування по за межами рослинного - інактивація батьківських клітин біохімічними організму. отрутами або радіоактивним опроміненням, що Після репарації клітинної оболонки сформовавикликає беззворотню інактивацію життєво важлині рослинні клітини поводять себе так, як у звичайвих ферментів або молекул, однак функціонування ній суспензійній культурі [12], а тому і змінюються клітин можливо відновити за рахунок злиття [5]; умови культивування. Потрібні: редукція концент- використання батьківських форм рослин зі рації ОАР, можливе поступове змінення гормонаспонтанними або індукованими мутаціями, що вильного балансу на користь цитокінінів. Існуюча кликають різноманітні дефектні ознаки у функціоекспериментальна практика потребує проводити нуванні життєво важливих органів або метаболічемпіричний добір усіх трьох регулюючих факторів них систем (наприклад: розлад у синтезі культивування [10] і тому на теперішній час розроамінокислот, моносахарів і т.п.; мутації пластому, блена певна кількість протоколів поживних серещо порушують пігментацію чи то фотосинтетичну довищ для культивування протопластів, які застоактивність) з метою генетичної комплементації, совувались для обмеженого числа генотипів або порушених функцій у гібридів [6,7,8]; видів рослин. Серед наведених вище схем клітин- добір гібридних клітин за рахунок спеціально ної селекції для використання у соматичній гібрипідібраних умов культивування, при яких батьківдизації сільськогосподарсько цінних видів рослин ські клітини не можуть відновлювати мітотичну найбільш практичними слід вважати ті, які дозвоактивність і переходити до організованого зросляють працювати з початковим рослинним матерітання (морфогенезу), тоді як гібридні клітини це в алом, що не зазнав генетичних мутацій з метою змозі зробити [9]. штучного створення маркерних ознак у батьківсьСлід відзначити, що кожна з запропонованих ких клітин для добору гібридних. Оскільки у такому схем клітинної селекції не може претендувати на випадку виникає небажана випадковість у поруабсолютну універсальність оскільки відпрацьовушенні спадкування корисних ознак у батьківських валась на конкретних рослинних об'єктах, що марослин [10]. Тобто, при проведенні дослідів по ють тільки їм властиві фізіологічні та морфогенесоматичній гібридизації найкращим варіантом дотичні властивості у культурі протопластів. бору гібридних клітин слід вважати інактивацію "Запозичення" будь-якого способу добору при виабо ізоляцію батьківських клітин за рахунок застокористанні на іншому рослинному об'єкті, може сування спеціальних селективних умов культивупризвести або до небажаних трудомістких процевання, а не штучного генетичного маркірування дур по штучному створенню генетичномаркіровабатьківських генотипів. них ліній рослин, або створити умови при яких Приклад 1. Результати застосування препарапротопласти беззворотньо втрачають свою життєтів з метою відпрацювання схеми клітинної селекздатність. Ллє незважаючи на те протопласти ції у клітинно-інженерній технології по створенню будь-якого виду рослин мають декілька спільних соматичних гібридів білоголової капусти. структурних особливостей та морфофізіологічних Рослинний матеріал і методика проведення реакцій на дію зовнішніх факторів культивування. дослідів з використанням пропонованих препараЗа сучасною уявою протопластом називають ізотів. льовану рослинну клітину, що має зруйновану меЯк об'єкти дослідження нами було відібрано 5 76700 6 чотири сорти капусти білоголової, які відрізняютьальгінатна плівка з іммобілізованими в ній протося різними морфогенетичними властивостями у пластами. Після процедури фіксації в альгінатній культурі in vitro, а також строками вегетації у плівці культури переносили на рідке поживне сепольових умовах. Зокрема, три сорти пізньостиглої редовище ТМмод2 [14] (Таблиця 1), яке було застокапусти - Харківська зимова, Українська осінь і совано, як найкращий варіант поживного середоЯрославна селекції Інституту овочівництва і башвища з дослідно підібраними і вивченими танництва УААН та один сорт ранньостиглої капуоптимальними концентраціями трофічних компости - Дітмаршер Фрюер (Dithmarscher Fruher) сенентів, ОАР, препаратів ауксинової і цитокінінової лекції фірми "Nunhems zaden" (Голландія). Для дії для стимуляції цитокінезу гіпокотильних і мевідпрацювання схеми клітинної селекції і тестузофільних протопластів (Таблиця 2), як у випадку вання препаратів використовували культури меокремого, так і при змішаному культивуванні після зофільних і гіпокотильних протопластів вищенавепроцедури злиття. Для подальшого формування дених сортів капусти, які вирощували in vitro. Для калусної культури, утворені мікроколонії клітин на отримання мезофільних протопластів використостадії 3-го та 4-го мітотичних циклів переносили на вували листя 3-4-тижневих рослин, а для гіпокотирідке середовище ТМмод3 [13] (Таблиця 1) для дольних протопластів 7-9 добову розсаду, пророщерощування. Середовище ТМмод3 повністю поновну у темряві. Тканини листа і гіпокотилів розрізали лювали кожні 10 днів і використовували до утвона смуги 1мм завширшки і а інкубували окремо рення колоній діаметром 0,5-1,5мм. Після чого один від одного у ферментному розчині, що вміальгінатну плівку розчиняли за допомогою 0,3М щував 0,5% Macerozyme ("Calbiochem", США), розчину цитрата натрію в 0,4М манітолу. Потім 0,5% Onozuka R-10 ("Jacult Biochemicals", Японія), колонії клітин переносили на агаризоване регене0,5М сахарози та 5мМ СаСl2 (рН5,6) в темряві при раційне середовище ТМмод4 [14] (Таблиця 1) і ви28°С протягом 16-18год. У подальшому ізольовані рощували при 25°С на світлі інтенсивністю 5клк та протопласти двох типів тканин відокремлювали від фотоперіодом 16год. Калус пересаджували кожні залишків тканини шляхом фільтрування через медва тижні на свіже поживне середовище ТМмод4. талеві фільтри з діаметром пор 64мкм. Фільтрат Рослини, що регенерували, переносили на безгопереносили в центрифужні пробірки на 10мл та рмональне середовище МС для укорінення. центрифугували зі швидкістю 700обертів/хв. проТестування запропонованих препаратів протягом 7хв. Кільце флотованих протопластів відбиводилось після процедури злиття мезофільних і рали пастерівською піпеткою та відмивали не мегіпокотильних протопластів з застосуванням контнше двох разів в середовищі W5 (Medgyesy et al. рольного і дослідного режимів культивування. 1980), осаджуючи їх кожного разу центрифугуванУ контрольному режимі культивування було ням протягом 5хв. при 700обертів/хв. Для злиття застосовано поживне середовище ТМмод2, наведевикористовували у якості партнерів соматичної не у Таблиці 1. гібридизації мезофільні і гіпокотильні протопласти, У дослідному режимі культивування було заа процедуру злиття виконували згідно протоколу стосовано поживне середовище ТМмод2 наведене у (Menczel & Wolf, 1984) [13], спеціально відпрацьоТаблиці1 до складу якого було введено: 0,315Μ ваному для представників роду Brassica. ПротоΟАΡ (глюкози), замість 0,5М, а також трофічні і пласти двох типів тканин змішували у співвідногормональні компоненти аналогічно контрольному шенні 1:1 (або 1:3). Після центрифугування (5хв. режиму. Після висіву культур протопластів на по700обертів/хв.) у середовищі W-5, надосадочну живне середовище і культивування протягом 16-18 рідину вилучали, після чого отримували густу сугодин рівень ОАР також доводили до рівня контспензію протопластів у середовищі W-5 (об'ємом рольного режиму, тобто до 0,5М. близько 1мл). Дві краплі суспензії протопластів Використані у біотестах фітогормони: БАП (загальний об'єм 0,1мл) наносили на поверхню (бензиламінопурин), зеатин, НОК, 2,4-Д виробництва компанії "Sigma" (США). пластикової чашки Петрі (60 15см) і залишали на Для кожного, дослідного і контрольного варіа15-20хв. для осадження протопластів і прикріпнтів режиму культивування, для визначення стилення їх до дна чашки. Зверху до суміші додавали муляторної дії кожен аналізований препарат додарозчин для злиття і витримували 5-7хв. Після довали у концентрації 1, 3 і 5мг/л у поживні давання розчин) для злиття суспензію протоплассередовища TMмод2, ТМмод3 і ТМмод4. тів розводили середовищем W-5 і витримували у Для підрахунку результатів біотестів враховуньому протягом двох годин суспензію. Потім обевали такі показники: режно піпеткою відбирали середовище W-5 і куль1) процент утворених ініціальних клітин на сетивували продукти злиття та не злиті протопласти редовищі ТМмод2: в рідкому поживному середовищі з подальшою 2) ефективність висіву протопластів (ЕВП) оціфіксацією в альгінатній плівці відповідно Damm нювали у відсотках, як співвідношення кількості and Willmitzer (1988). Для цього до протопластів калусних колоній, що сформувалися на середовидодавали 0,5М манітолу так, щоб концентрація щі ТМмод3 до загальної кількості протопластів; протопластів складала 80 104клітин/мл. Суспензію 3) частоту регенерації (ЧР) визначали у відсопротопластів змішували з однаковим об'ємом тках, як співвідношення кількості калусних колоній, 2,8%-ного розчину альгінату натрію в 0,4М манітоздатних до морфогенезу на середовищі ΤΜмод4 до лі. У подальшому 1мл суміші переносили в чашки загальної кількості отриманих колоній на середоПетрі діаметром 50мм з агаризованих середовивищі ТМмод3. щем, яке вміщувало 20мМ СаСl2 в 0,4М манітолі та Порівняльна характеристика фізіологічного розподіляли по поверхні середовища так, щоб стану культур мезофільних і гінокотильних протовнаслідок присутності іонів Са2+ утворилась тонка 7 76700 8 пластів у дослідному і контрольному режимах кутривалі за часом, які наступають після латентного льтивування без застосування препаратів. періоду протягом від декілька годин до декілька Як показали результати досліду по вивченню діб. Довготривалою реакцією є клітинний поділ, регуляторної дії гормонально- і осмотичноактивдиференціровка і морфогенез [15]. Тому за харакних компонентів поживного середовища ТМмод2 на тером регуляторної дії запропоновані препарати процес відновлення мітотичної активності двох мали протекторну дію по відновленню (у дослідтипів протопластів найкращим співвідношенням є: ному режимі культивування), або по підсиленню 0,5Μ ΟΑΡ (глюкози); 1мг/л нафтилоцтової кислоти стимуляції (у контрольному режимі культивування) (НОК) і 0,2мг/л 2,4-дихлорфеноксиоцтової (2,4-Д) елонгації і поділу клітин, тобто саме тих процесів, кислоти, як препаратів ауксинової дії та 0,5мг/л які контролюються у рослинах ауксинами. Поперецитокініну бензиламінопурин (БАП) (таблиця 2). дні результати вивчення фізико-хімічних та фізіоДодавання вищезазначених фізіологічно-активних логічних властивостей інших препаратів похідних речовин, у такому експериментально підібраному N-окису піридину свідчать про високу регуляторну співвідношенні, у поживне середовище стимулюдію цього класу сполук на активізацію Н+-АТФази, вало одночасні елонгацію і ініціацію цитокінезу яка регулює роботу протонної Н+-помпи, що призклітин (Таблиця 2), що є необхідною передумовою водить до активізації транспорту протонів [16]. початкового росту мікроколоній клітин. При чому, Саме така регуляторна дія належить і ауксинам. як свідчать результати інших варіантів досліду Однією зі стереотипних реакцій рослинних клітин використання тільки однієї НОК разом з цитокініна дію осмотичного стресу є збільшення синтезу ном БАП (при 0,5Μ глюкози) призводить тільки до інгібіторів росту (етилену і АБК), гальмування поелонгації клітин без ініціації клітинного поділу. Доділу і інших метаболічних процесів, які відбувадатковим вивченням різних концентрацій осмотика ються при звичайних умовах [17]. Тому одним з (при найкращому співвідношенні фітогормонів) імовірних механізмів позитивної дії препаратів встановлено, що концентрація 0,5Μ глюкози с опполягав у збереженні роботи Н+-помпи і інших іонтимальною для двох типів протопластів. 0,4Μ глюно-обмінних процесів під час проведення гіпотонікози є оптимальним для гіпокотильних протопласчного стресу. Дією осмотичного стресу дослідному тів, 0,315Μ глюкози є руйнівною для мезофільних режимі культивування було зруйновано мезофільпротопластів і повністю припиняє цитокінез гіпоконі протопласти усіх генотипів капусти, як у варіантильних протопластів (Таблиця 2). Абсолютні знатах з застосуванням препаратів, так і без них. Одчення проценту ініціальних клітин для кожного нак, комбінована дія препаратів з гормонами генотипу капусти наведено у Таблиці 3. поживного середовища стимулювала мітози меПорівняльна характеристика фізіологічного зофільних протопластів при концентрації 0,4Μ стану культур мезофільних і гіпокотильних протоглюкози, яка виявилася квазиекстремальною для пластів у дослідному і контрольному режимах кузбереження структури і життєздатного стану цього льтивування з застосуванням препаратів. типа клітин (див Таблицю 3). Окреме застосування Як свідчать результати біотестів (див. Таблиця препаратів, як стимуляторів ауксинової дії на ініці3), головна регуляторна дія препаратів виражалаацію мітотичної активності протопластів позитився в стимуляції підвищеної адаптогенної реакції ного результату не дало. гіпокотильних протопластів, до впливу застосоваРезультати тестування препаратів з застосуного осмотичного стресу у дослідному режимі куванням дослідною режиму культивування після льтивування, При застосуванні препаратів у контпроцедури злиття мезофільних і гіпокотильних рольному режимі культивування спостерігалось протопластів. підвищення кількості ініціальних клітин на відміну У якості донорів мезофільних протопластів бувід варіанту, де препарати не застосовувались. ло використано ранньостиглий сорт капусти білоПри концентрації 3мг/л, кожна аналізована сполуголової Дітмаршер Фрюер, який є модельним гека, виявила найбільший регуляторний ефект, тому нотипом за своїми морфогенетичними у Таблиці 3 наведено результати біотестів препавластивостями у культурі протопластів Тобто, при ратів саме з такою концентрацією. При меншому застосуванні контрольного режиму культивування значенні концентрації 1мг/л препарати давали цей генотип формував рослини-регенеранти з каменший ефект, а при концентрації 5мг/л спостерілусної тканини [18]. У якості донорів гіпокотильних гався або частковий інгібіторний вплив аналізовапротопластів було використано пізньостиглі сорти них сполук на ініціацію мітотичної активності пробілоголової капусти: Харківська зимова, Українсьтопластів, або кількість ініціальних клітин була в ка осінь і Ярославна. На відміну від сорту Дітмармежах варіанту з застосуванням концентрації шер Фрюер, протопласти цих генотипів формува3мг/л для кожної аналізованої сполуки (дані не ли тільки неморфогенний калус при застосуванні наведені; Як відомо, згідно запропонованих принконтрольного режиму культивування. Враховуючи, ципів гормональної регуляції у культурах тканини і експериментально підтверджену можливість руйклітин in vitro [15], будь-який морфогенетичний нації мезофільних і збереженню гіпокотильних процес контролюється концентраційними співвідпротопластів під впливом дії осмотичного стресу, ношеннями екзогенних фітогормонів - ауксинів і нами було проведено злиття мезофільних протоцитокінінів у поживному середовищі. У зв'язку з пластів модельного і генотипу Дітмаршер Фрюер з чим ауксинам відводиться регуляторна роль у гіпокотильними протопластами інших генотипів з процесах елонгації і поділу клітин [15]. Елонгація застосуванням дослідного режиму культивування. клітин є надзвичайно швидкою реакцією рослин на Головною метою цього досліду було відпрацюванобробку ауксинами і вже починається через 10ня структурних елементів схеми клітинної селекції 15хв. [15]. Окрім швидкої реакції існують більш і вивчення регуляторної дії запропонованих пре 9 76700 10 паратів для збереження життєздатного стану гетержаних регенерантів була наявність подвоєного роплазматичних продуктів злиття. Результати цьочисла (4n) ядерних хромосом внаслідок міжсортого досліду, представлені у Таблиці 4. Введення вої амфідиплоїдизації (злиття соматичних клітин після процедури злиття до складу поживного сеобох партнерів гібридизації). Тому для підтверредовища ТМмод2 аналізованих препаратів, стимудження їх гібридної природи було застосовано лювало відновлення мітотичної активності, як у цитологічний аналіз. Гібридні рослини було отригібридних клітин, так і у гіпокотильних протопласмано у всіх запланованих дослідах по соматичній тів, що не вступили у процес злиття після застосогібридизації (див. Таблицю 5). ваного гіпотонічного шоку. При цьому застосуванАналіз регуляторної дії запропонованих преня 16-18-годинного осмостресу виявилося паратів у дослідах по соматичній гібридизації видостатнім для повної руйнації плазмалем і загибеявив найбільший регуляторний вплив препаратів лі мезофільних протопластів, а також гомоплазмаді(N-окис 2-метилпіридин)мідь(ІІ)хлориду та ді(Nтичних продуктів злиття, які утворилися від мезоокис піридин)мідь(ІІ)хлориду на збереження житфільних протопластів. Характерною тєздатного стану і відновлення мітотичної активморфологічною особливістю гетероплазматичних ності клітин у порівнянні від інших протестованих продуктів злиття, що утворилися внаслідок злиття сполук (див. Таблицю 4). Кінцевим результатом мезофільних і гіпокотильних протопластів було проведених біотестів стала розробка схеми клінерівномірне розташування цитоплазми обох партинної селекції по створенню соматичних гібридів тнерів гібридизації. А саме цитоплазма від мезобілоголової капусти, яка має декілька суттєвих фільного протопласта локалізувалась у центрі переваг у порівнянні з раніше застосованими. Погібридної клітини, а цитоплазма від гіпокотильного перше, при її застосуванні не потребується попепротопласта утворювала захисний шар, за рахуредньої о штучного створення генетично маркіронок локалізації біля зовнішньої плазмалеми гібриваних батьківських генотипів капусти для ідентифідної клітини. Таке специфічне розташування гібкації і добору гібридних клітин. По-друге, в основі ридної цитоплазми у перші години після використання осмостресу, в якості селективного процедури злиття призводило до збереження зафону для добору гетерокаріонів є спільна для всіх хисних функцій плазмалем гібридних клітин, подівидів рослин стереотипна фізіологічна реакція бно гіпокотильним протопластам, для яких гіпотоклітин на дію цього фактору культивування [19]. нічний стрес (0,315М глюкози) виявився Тому аналогічний спосіб добору гібридних клітин квазиекстремальним, але не руйнівним. Застосуможливо розробити для протопластів будь-якого вання способу культивування протопластів з імовиду рослин, після додаткового визначення поробілізацією в альгінатну плівку дозволило провести гових значень концентрації ОАР, при яких відбувавізуальну ідентифікацію і фенологічні спостереється ініціація цитокінезу клітин. Третє, проаналіження за окремими клітинами, у тому числі за гезовані нами препарати стимулювали адаптогенну тероплазматичними продуктами злиття. Після переакцію протопластів до дії осмотичного стресу, ріоду культивування, згідно представленого що дозволило вирішити технічну проблему по відпротоколу поживних середовищ (див. Таблицю 1) новленню мітотичної активності клітин. Якщо пребуло отримано рослини-регенеранти у трьох запарати застосовувати у технологічному процесі по планованих дослідах по міжсортовій соматичній створенню соматичних гібридів, то добір гетерокагібридизації сорту Дітмаршер Фрюер з сортами ріонів відбувається вже на ранній стадії культури капусти селекції Інституту овочівництва і баштанпротопластів, що значно полегшує ідентифікацію і ництва УААН. подальший добір гібридних рослин на завершальПри цьому головною ознакою гібридності одених стадіях культивування. Таблиця 1 Поживні середовища для культивування протопластів та регенерації рослин капусти білоголової Компоненти, мг/л* 1 NH4NO3 ΚΝΟ3 СаСl2 2Н2О MgSO4 7H O KН2РО4 Na2ЭДТА FeSO4 7H2O H3ВОз MnSO4 5H2O ZnSO4 7H2O NaMoO4 2H2O KJ CoSO4 6H2O CuSO4 5H2O TMмод2 2 Мікроелементи: 200 1500 440 370 170 Fe-хелат: 37,3 27,8 Μікроелементи: 3,0 13,2 2,0 0,25 0,75 0,025 0,025 ТМмод3 3 ТМмод4 4 200 1500 440 370 170 200 1900 440 370 170 37,3 27,8 37,3 27,8 3,0 13,2 2,0 0,25 0,75 0,025 0,025 3,0 13,2 2,0 0,25 0,75 0,025 0,025 11 76700 12 Продовження таблиці 1 Компоненти, мг/л* Мезоінозит Гліцин Bl B6 PP Гідролізат казеїну Глутамін HOK AC** БАП зеатин 2,4-Д Глюкоза TMмод2 ТМмод3 Вітаміни та ін. біологічно-активні речовини 100 100 2 2 10 10 1 1 1 1 150 150 0 500 1,0 0,1 3,0 3,0 0,5 0,5 0 0,5 0,2 0,2 90100 72000 (0,5М) (0,4М) Ксилоза Сахароза рН 125 0 5,8 125 0 5,8 ТМмод4 100 2 10 1 1 150 500 0,1 3,0 0 1,0 0 27000 (0,15М) 0 40000 5,8 * Примітка: для культивування протопластів капусти використано модифікований варіант, поживного середовища Шахіна ТМ-2 (Shahin, 1985) [13], зокрема для ініціації цитокінезу клітин - ТМмод2, для нарощування мікроколоній ТМмод3, для регенерації рослин - ТМмод4. **Примітка: АС - аналізовані сполуки, які додавалися у середовища з метою тестування їх осмопротекторної дії, як під час проведення гіпотонічного шоку (0,315Μ глюкози) у дослідному режимі культивування, так і при оптимальних контрольних режимах культивування для гіпокотильних (0,4Μ глюкози) і мезофільних (0,5Μ глюкози) протопластів. Таблиця 2 Результати проведення досліду по вивченню комбінованої дії гормонально- і осмотично активних компонентів поживного середовища ТМмод2, на фізіологічний стан двох типів протопластів, відібраних генотипів капусти білоголової Варіант досліду: 1 2 3 4 5 Досліджені комбінації гормонів поживних середовищ (мг/л): 2,4-Д НОК БАП 1,0 0,2 0,5 1,0 0,5 0,2 1,0 0,5 0,2 1,0 0,5 0,2 1,0 0,5 Досліджені концентрації ОАР, виражені у молях: 0,5 0,5 0,5 0,315 0,4 Морфофізіологічні реакції різних типів протопластів: гіпокотильні мезофільні ркв ркв ел ел ел, цтк, рмк ел, цтк, рмк ел фрп ел, цтк,рмк ел Умовні позначення: ркв - реакція клітин відсутня, ел - елонгація, цтк - цитокінез, рмк - ріст мікроколоній клітин, фрп фізична руйнація протопластів. * Примітка: у даному випадку відображено період від висіву протопластів на поживне середовище до початку клітинного поділу, яке спостерігалось у найкращому (третьому) варіанті досліду. Таблиця 3 Результати біотестів препаратів у культурі протопластів капусти білоголової in vitro Генотип Тип протокапусти: пластів: ХЗ УО Яр ДФ Г/п м/ф г/п м/ф г/п м/ф г/п м/ф Процент ініціального поділу клітин при різних концентраціях ОАР у поживному середовищі ТМмод2* ді(N-окис 2аква N-окис .3аква N-окис 4ді(N-окис 2,6без застосування ді(N-окис піридин) метилпіридин) мідь метилпіридин мідь метилпіридин мідь диметилпіридин препаратів мідь (ІІ) хлорид (ІІ)хлорид (ІІ) хлорид (ІІ)хлорид мідь (ІІ) хлорид ** ** ** ** ** ** 0,4 0,5 0,4 0,5 0,4 0,5 0,4 0,5 0,4 0,5 0,4 0,5 0,315 0,315 0,315 0,315 0,315 0,315 0 23,6 24,2 17,4 27,6 25,2 15,9 23,8 25,7 10,3 25,9 25,2 11,9 26,1 24,4 19,4 25,6 27,2 мрп 0 16,8 мрп 6,8 19,7 мрп 7,3 18,1 мрп 3,2 29,2 мрп 5,1 19,2 мрп 3,1 10,5 0 19,7 20,4 15,8 21,4 24,0 14,5 20,5 21,3 18.8 21,4 23,5 15,2 23,3 20,9 14,2 17,9 20,0 мрп 0 13,7 мрп 4,8 15,9 мрп 4,1 15,8 мрп 5,8 16,2 мрп 6,8 17,7 мрп 2,9 13,9 0 16,8 17,9 19,0 19,5 21,7 12,4 16,9 16,4 9,8 15,4 21,1 10,3 15,4 16,9 19,5 22,2 25,3 мрп 0 5,9 мрп 4,3 6,8 мрп 4,2 6,7 мрп 2,6 7,4 мрп 4,7 8,8 мрп 4,6 9,7 0 27,8 29,1 18,3 26,6 30,1 17,4 28,0 29,9 20,0 34,6 39,5 27,8 38,3 40,3 23,6 35,5 41,1 мрп 0 10,4 мрп 11,7 16,9 мрп 9,7 16,7 мрп 15,1 23.3 мрп 19,0 26,1 мрп 11,6 20,4 Умовні позначення: 1) у колонці "генотипи капусти1': ХЗ - Харківська зимова, УО - Українська осінь, Яр - Ярославна. ДФ - Дітмаршер фрюер; 2) у колонці "тип протопластів": г/п - гіпокотильні м/ф - мезофільні ; 3) у колонці: "концентрації ОАР": - мрп - механічна руйнація протопластів. * Примітка : підрахунок кількості ініціальних клітин проводили на 20 добу культивування. **Примітка: гіпотонічний вплив проводили протягом перших 16-18 годин культивування, після чого концентрацію осмотичного агента поживного середовища доводили до рівня контрольного режиму культивування, тобто до 0,5М. 13 76700 14 Таблиця 4 Результати застосування запропонованих препаратів у клітинно-інженерній технології по створенню соматичних міжсортових гібридів білоголової капусти Значення застосованих показників стану культури протопластів на різних стадіях культивування: Комбінації злиття процент ініціальних клітин ефективність висіву прото- частота утворення калусних на серед. ТМмод2, % пластів на серед. ТМмод3, % клонів на серед. ТМмод4, % 1 2 3 4 5 24,2±0,23 5,57±0,79 7,3±0,56 дi(N-окис 2- ХЗ ДФ 20,4±0,67 3,67±0,21 4,7±1,73 метилпіридин)-мідь УО ДФ (ІІ)хлорид 21,7±0,21 3,45±0,71 1,3±0,56 Яр ДФ 25,7±0,67 5,34±0,89 6,1±0,34 ХЗ ДФ ді(N-окис піридин)21,3±0,34 4,17±0,18 5,3±0,77 УО ДФ мідь(ІІ)-хлорид 15,4±0,45 3,14±1,56 1,0±1,37 Яр ДФ 25,2±0,19 3,27±0,35 5,2±0,43 аква N-окис 3- ХЗ ДФ 21,5±0,30 3,56±0,54 3,2±0,17 метилпіридин-мідь(ІІ) ХЗ ДФ хлорид 21,1±0,73 2,14±0,47 1,3±0,21 УО ДФ 23,4±0,67 4,18±0,35 3,1±1,79 аква N-окис 4- Яр ДФ 20,9±0,71 3,79±0,28 2,6±0,68 метилпіридинХЗ ДФ мідь(ІІ)хлорид 16,9±0,34 2,30±0,56 1,0±0,33 УО ДФ 26,2±0,55 2,47±0,11 3,6±0,57 ді(Ν-окис 2,6-ди- Яр ДФ 20,6±0,17 2,21±0,27 1,9±0,21 метилпіридин)ХЗ ДФ мідь(ІІ)хлорид 24,7±0,39 1,89±0,49 0,0 Яр ДФ Назва препарату Таблиця 5 Кількість одержаних міжсортових соматичних гібридів білоголової капусти після застосованого способу добору гібридних клітин у культурі протопластів in vitro Комбінації злиття протопластів Процент Кількість сформованих калусних клонів: Кількість Цитологічний аналіз рівня різних генотипів капусти*: злиття: плоїдності хромосом: загальна з регенерацією рослин гібридів: 18,4 104 4 4 36 ДФ ХЗ 16,7 86 6 6 36 ДФ УО 20,3 91 2 2 36 ДФ Яр * Примітка: умовні позначення у колонці "Комбінації злиття протопластів різних генотипів капусти": ХЗ - Харківська зимова, УО - Українська осінь, Яр - Ярославна, ДФ - Дітмаршер Фрюер. Джерела інформації: 1. Пріоритет матеріалів заявки на патент України №2002010589. 2. Keller W.A., Meechers G.: Z.Naturforsch. с, 1973, 28, Р.737-741. 3. Kao K.N. -Моl. and Gen.Genet., 1977, 150, Р.225-230. 3. 4. Maliga P.: Int. Rev. Cytol. Perspectives in Plant Cell and Tissue Culture.-New York: Acad. press, 1980.- Suppl.2.- Р.225-250. 5. Wright W.E., Hayflick L.- Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1975, 72, Р.1812-1816. 6. Глеба Ю.Ю. Культура изолированных протопластов табака как модель для генетической инженерии: Автореф. дис... канд. биол. наук Киев, 1974. - 24с. 7. Sidorov V.A., Maliga Р.- Моl. and Gen. Genet., 1982, 186, P.328-332. 8. Evans D.A., Cromoro O.J., de Carvalho M.T.V.- Z. Phlanzenphysiol., 1980, 98, P.355-358. 9. Carlson P.S., Smith H.H., Dearing R.D.- Proc. Nat. Acad. Sci USA, 1972, 69, P.2292-2294. 10. Глеба Ю.Ю., Сытник К.М. Клеточная ин женерия растений. - Киев: Наук, думка, 1984. 160с. 11. Kao K.N., Michayluk M.R. - Planta, 1974, 115, P.355-567. 12. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. М.: Наука, 1964. - 272с. 13. Menczel L., Wolfe К. - Plant Cell Reports, 1984, 3, P.196-198. 14. Shahin E.A. - theor. Appl. Genet., 1985, 69, P.235-240. 15. Theologis A. - Rev. Plant Physiol 1986, 37, P.407-138 16. Пономаренко С.П. Українські регулятори росту. Елементи регуляції в рослинництві: Зб. наук, праць. - Київ: ВВП "Компас", 1998 - 360с. 17. Гродзинский Д.М. Надежность растительных систем. – Киев, 1983. - 366с. 18. Bauer R., Ryschka U., Leike H. - In: Novak F.J., Havel L., Dolezel J. (eds) Plant tissues and cell culture - Apllication to crop improvement. 19. Деверолл Б. Дж. Защитные механизмы растений. - М., 1980. - 126с. 15 Комп’ютерна верстка Т. Чепелева 76700 Підписне 16 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601