Спосіб утворення кріопротектора

Изобретение относится к амидам карбоновых кислот, в частности к получению криопротектора - оксиэтили 48-88 fl*"*4*41***"— fr^** —> рованного ацетамида (ОЭА), который может найти применение при низкотемпературном консервировании ядросодержащих клеток. Цель изобретения повышение защитных свойств ОЭА. Получение его ведут оксиэтилнрованием N-ацетилэтачоламина при мольном соотношении его к окиси этилена 1:4-5, 85-95°С и давлении в атмосфере азота, Полученный продукт подвергают молекулярной дистилляции при 98~100°С и давлении 4 -10"'-5-10'" кПа. По сохранении жизнеспособности клеток ОЭА превосходит М-окснэтилгепта-(оксиэтилен)-морфолин (ОЭМ) на 10-20%, формирование монослоя на 100% происходит в случае ОЭА на вторые» а в случае ОЭМ на третьи сутки. 11 табл. 1 1448627 Изобретение относится к консерважитея 15-20% полиэтиленоксида (ПЭО) ции животных клеток, конкретно к спо(такое количество не изменяет криособу получения нового криопротектора, протекторных свойств ОЭА, тем более представляющего собой оксиэтилирочто при разведении его количество в ванный ацетамид, который может найти смеси составляет 0,2-1%). При этом применение при низкотемпературном четко установлено отсутствие низкоконсервировании ядросодержащих клемолекулярных гомологов - моно- и ток, в частности клеточных культур, диэтиленгликолей (табл.1). вьщеленных из различных органов жи- JQ Узкие фракции ОЭА анализируются вотных. методом газожидкостной хроматографии на ЛХМ - 8МД. Условия анализа: Целью изобретения является повыдетектор - катарометр, фаза - хрошение защитных свойств криопротектоматон N-супер с 5% ПМС-100, темперара. Изобретение иллюстрируется следу- 15 тура испарителя пробы и детектора 225 и 230 С соответственно, гаэ-ноющйми примерами. ситель - гелий - со скоростью ' П р и м е р 1. 206 г (2 М) свеже50 мм/мин, ток катарометра 120"г.А. перегнанного N-ацетилэтаноламина Температуру термостата программиру(температура кипения 155-157 С при 0,28 кПа, коэффициент преломления 20 ют от 80 до 280°С* со скоростью 0 8°С/м, скорость протяжки ленты репри 20°С (n'j ) 1,4724) помещают в гистратора - 240 мм/ч, объем прообогреваемый реактор из нержавеющей бы - 3-4 мкл. стали, снабженный электромешалкой 50-150 об/мин, термопарой, системой Продукт анализируют в виде три2 метилсияиловых производных (обработохлаждения и устройством для дискретка гексаметилдисалозаном с триметилной подтачи окиси этилена, и нагрехлорсилозаном). вают до 70-8О°С. Реактор продувают Структура полученного соединения током инертного газа, сбрасывают давподтверждена ПМР-слектрами. ление и подают этиленоксид, поддерВ спектре ПМР исходного N-ацетилживая температуру 85-95°С и давление 30 этаноламина имеется сигнал метильной 200-600 кПа. После подачи расчетного количества окиси этилена (352 г) прогруппы с с t,88 м.д. и синглет гидроГ дукт перемешивают 0,5-1 ч при 80ксильной группы с tf 3,75 м.д. Пос85°С, периодически продувая реактор ледний не обнаруживает спин-спиновоазотом (соотношение реагентов 1:4). 35 го взаимодействия с метиленовой группой за счет быстрого обмена этоНеочищенный продукт - вязкая, бесго протона в Н-комплексах с растворицветная или желтоватого цвета жидтелем и в самоассоциатах. Сигнал кость, легко растворимая в воде, протона иминогруппы с^ын 7,30 м.д. спиртах, ацетоне, эфире, четыреххло40 уширен за счет спин-спинового взаристом углероде. имодействия с метиленовой группой Очистку полученного продукта и квадрупольного момента азота. В (540 г, 95%) производят путем обрасвою очередь протоны метиленовой ботки разбавленного водного раствора группы у азота представлены квадруактивированным углем марки А, катионообменной смолой КУ-2-8 с. Воду от 45 плетом с^3,23 м.д., образованным синтезированного соединения отделяют, спин-сшшовым взаимодействием с проотгоняя ее в вакууме (0,4-0,45 кПа, токами соседней метиленовой группы 27-32°С). Выход соединения - 500 г и иминогруппы с одинаковыми кон(92%). стантами 1нссн~1 иыск- 5 Гц. Протоны ОСН ^-группы представлены Продукт синтеза подвергают фракци-50 триплетом с химическим сдвигом d онированию на молекулярно-дистилля3,53 м.д. ционной установке (ДМ). В спектре ПМР оксиэтилированного Целевая фракция, кипящая при 98продукта химические сдвиги всех про100°С, остаточном давлении 4-5-10 кПа 53 тонсодержащих групп изменяются несоставляет 350 г (70%). значительно: ^tv3 1,83 м.д., ^ан По данным газохроматографического 3,89 м.д*, ^ин 7,23 м.д., cf C C H l анализа в целевых фракциях оксиэти3-30 м.д., о%с*ч 3,55 м.д. Интенлированного ацетамида (ОЭА) содер 3 UA8627 сивность сигнала OCHj-групп возрасЖизнеспособность клеток после тает относительно остальных сигналов криоконсервированиясоставляет } и на данном спектре равна 14+1 про96 + 1,3%. По истечении рвух суток тонным единицам, что соответствует культивирования монослой выполнен следующей структурной (группе) форклетками на 100%. муле оксиэтилированного продукта: Митотическая активность размороО женных клеток не отличается от таИ ковой нативных клеток (39»О±6,1%) и •н 10 составляет в первые сутки 38,2+3,4% вторые 42,3+1,2%, третьи 42,6+2,6%, сн П р и м е р 2. Способ осуществляСигналов протонов групп, отличных ют аналогично примеру 1, ко с тем от описанных, в спектрах исследованотличием, что N-ацетилэтаноламкн беных соединений не наблюдается. 15 рут в количестве 0,5 М (51В5 г ) , а Исследование криопротекторных окись этилена - 0,5 М (22 г ) , т.е. свойств полученного соединения просоотношение реагентов 1:1. Выход водят следующим образом: целевой фракции 60 г (85,5%). Состав Монослой трехсуточной культуры фракции - см. табл.2. • клеток почки эмбриона свиньи, еерКриоконсервирование культуры кле>0 сенизированной (СПЭВ) 245-го пассажа, ток СПЭВ с полученным криопротектоимеют с поверхности культуральных ром осуществляют аналогично примеру 1, сосудов при температуре Э7°С с помоЖизнеспособность клеток после криоконсервкрования составляет щью диспергирующей смеси, состоящей из 0,02% раствора Версена и 25 64,2+0,Ї2%. Монослой выполнен на 60% 0,25% раствора трипсина Дифко, взяпо истечении четырех суток культивитых в соотношении 9:1. Жизнеспособрованияs отмечались признаки переность клеток, оцениваемая методом рождения клеток. суправитального окрашивания трепаП р и м е р 3, Способ оеуаіествляновым синим составляет 98%, Полу30 ют согласно примеру 1 9 но с тем от~ " ченные клетки разбавляют средой 199S личием, что Й-эцетклэтаноламин берут содержащей 20% сыворотки крупного в количестве 0 s 5 М (51,5 г ) 9 окись рогатого скота до плотности их в этилена - ' М (44 г ) ? т . е . соотносуспензии 10>10 6 в 1 мл. К суспеншение реагентов 1:2. Выход целевой зии кпеток в соотношении 1:1 добав35 фракции 74 г (82%). Состав Фракции ляют раствор образца ОЭА, полученсм. т я б л . 3 , ного по примеру 1 (конечная концентКонсервирование культуры клеток рация 5%), приготовленного на среде СПЭВ с полученным образцом осуществляют аналогично примеру 1. Жизнеспо199, рН 7,4. После 30 мин экспо40 собность клеток после криоконсервизиции при 22°С суспензию клеток рования составляет 69,712,11%. Монорасфасовывают в стеклянные ампулы слой выполнен з*а 100% по истечении по 5,0 мл. Охлаждение осуществляют четырех суток культивирование. со скоростью 1°С/мин до -10°С, заП р и м е р 4. Способ осущестчлятем I O V M K H Д О -180°С С последующим 45 ют согласно примеру І , но с тем отпогружением в жидкий азот. Замороличием, что N-адетипэтаноланин берут женные пробы хранят з течение 1 мес, в количестве 0,5 М (51,5 г ) , окись в жидком азоте, раьморажнззют в возтшіена - 1 f 5 М (66 г ) , т»е» соотнодяной бане при 40°С. Размороженную шение реагентов 1:3. Зыход целеаой суспензию клеток СПЭВ разбавляют 50 фракции 98 г (75%). Состав фракции питательной средой 199» содержащей см» 10% сыворотки крупного рогатого скоКриоконсервирование культуры клета, рН 7,2, до посевной концентрации ; ток СПЭВ с полученным образцом осу0,4 «10 в 1 мл. ществляют аналогично примеру 1* Культивирование осуществляют з Жизнеспособность клеток после конкультуральных сосудах емкостью V^.5 мл 5S сервирования - 86,1i1,82%. Монослой при 37°С. Замену питательной среды осуществляют по истечении 10 ч кульвыполнен на 100% по истечений трех тивирования. суток культивирования. '5 14 48627 6 Из примеров 2-4 видно, что по меП р и м е р 8, Способ осуществляв ре снижения количества N-эцетилэтают аналогично примеру 1, но с тем от~ ноламина в продуктах оксиэтилироваличием, что продукт синтеза подверния криопротекторяая активность ОЭА гают фракционированию при Ю З ^ С . 5 возрастает. Данные по составу приведены в П р и м е р 5. Способ осуществтабл.8. ляют в соответствии с примером 1, Криоконсервирование культуры клеток только N-ацетилэтайоламия берут в коСПЭВ с полученным образцом осуществличестве 0,5 М (51,5 г ) , а окись эти- 10 ляют аналогично примеру 1. лена - 2,5 М (110 г ) , соотношение Жизнеспособность клеток после конреагентов 1:5. сервирования - 85,1iO,18%. Монослой Выход целевой фракции 100 г выполнен на 100% по истечении трех (62%). Состав фракции - см. табл.5. суток. Криоконсервирояание культуры кле- 15 Таким образом, повышение температок СПЭВ с полученным образцом осутуры перегонки приводит к появлению ществляют аналогично примеру 1. в целевой фракции более высокомолеЖизнеспособность клеток после конкулярных компонентов (п=5,6), снисервирования - 94,8±1,62%. Монослой жающих криопротекторные свойства ОЭА. выполнен на 100% по истечении двух 20 П р и м е р 9. Способ осуществлясуток. ют аналогично примеру 1, но с тем отличием, что продукт синтеза подП р и м е р 6. Способ осуществлявергают фракционированию при давлеют согласно примеру 1, только с тем нии 5 -Ю"* кПа, температура отгонки исключением, что N-ацетилэтаноламин 25 120-125°С, продукт при этом осмоляберут в количестве 0,5 М (51,5 г ) , ется, становится ярко-желтого цвета, а окись этилена - 3 М (132 г ) , т.е. криопротекторные свойства такого соотношение реагентов 1:6. соединения понижаются. Выход целевой фракции 80,2 г Данные по фракционному составу (49%). Состав фракции - см. табл. 6. Криоконсервирование культуры кле- 30 приведены в табл.9. Криоконсервирование культуры ток СПЭВ с полученным образцом осуклеток СПЭВ с полученным образцом ществляют аналогично примеру 1. осуществляют аналогично примеру 1, Жизнеспособность клеток после Жизнеспособность клеток после конконсервирования 82,4^2,14%. Монослон сервирования - 82,3-1,21%. Монослой выполнен на 100% по истечении трех 35 выполнен на 100% на третьи сутки • суток культивирования. культивиров ания, Анализ фракционного состава проТаким образом, при повышении давдуктов оксиэтилирования показывает, ления получается продукт со сниженчто увеличение количества присоеди40 ньіми криозащитными свойствами. ненной окиси этилена приводит к П р и м е р '10. Криоконсервироуменьшению выхода целевой фракции и вание культуры клеток СПЭВ осуществснижению ее криопротекторных свойств, ляют с N-ацетилэтаноламином в качто объясняется появлением в продукчестве криопротектора аналогично те оксиэтилирования олигомеров с примеру 1. более длинными оксиэтиленовыми це4 5 Жизнеспособность клеток после конпочками (п=5, 6 и т.д.). ' сервирования - 56,4І1,6. Монослой П р и м е р 7. Способ осуществлявыполнен на 50% на 5-е сутки культиют согласно примеру 1, но с тем отвирования, признаки перерождения клеличием, что продукт синтеза подверд 0 ток. Таким образом, сам исходный гают фракционированию при 95°С. Анапродукт обладает очень низкими криолиз фракции приведен в табл.7, протекториыми свойствами. Сравнение свойств нового криоКриоконсервирование культуры клепротектора и известного [N-оксиэтилток СПЭВ с полученным образцом осугепта-(оксиэтилен)-морфолина (ОЭМ) ществляют аналогично примеру 1. 5 5 проводили как при оптимальных услоЖизнеспособность клеток после конвиях криоконсервирования (табл.10), сервирования - 51,311,76%. Монослой так и при одинаковых условиях для выполнен на 5-е сутки на 60%. Наблюидентичных концентраций (табл.11). даются признаки перерождения клеток. 8 7 1448627 Таким образом, описываемый способ содержащего иминогрулпу, при повыпозволяет получать криопротектор с шенной температуре и давлении в атулучшенными защитными свойствами мосфере азота, о т л и ч а ю щ и й * по сравнению с известным криопро» с я тем, что, с целью повышения тектором N-оксиэтилгепта-(оксиэтнзащитных свойств криопротектора, в лен)-морфолином, а именно по сохкачестве соединения,, содержащего ранности жизнеспособных клеток ОЭА иминогруппу, используют N-ацетилпревосходит О М на 10-20%, формиЭ этаноламин» оксиэтилирование осурование монослоя на 100% происходит ю ществляют при 85-95°С, давлении в случае ОЭА на вторые, а в случае 200-600 кПа и мольном соотношении О М на третьи сутки. Э N-ацетилзтаноламинг окись этилена, равном 1 : ( 4 - 5 ) , а полученный проФ о р м у л а и з о б р е т е н и я дукт подвергают молекулярной дисСпособ получения криопротектора 15 тилляции при температуре 98-100°С р 6 путем оксиэтилирования соединения, и давлении 4 -10~ь-5- W 6 6 кПа. т а5л е і ОЭА і 1 2 3 4 5 0 17,7 39,6 23,8 3,9 6 і • 7 г. лица 2 ПЭО П=4 24,7 . 10,6 п-5 5,2 1,5 п-6 і 1 1- Т аб л иц а : П-1 П-і ОЭА п-8 1,2 Т а б л н ц а 9,1 п=2 п=3 5 п=4 * 30,7 27,4 4 ЛЭО ОЭА п=1 3 ПЭО ; п=3 п~4 п=5 пв=6 п-7 3 0 , 5 3 5 , 5 1 8 , 7 7*5 9 15 ОЭА 52 ПЭО Т а б п=1 н ц а 15,7 п=6 п п=8 • ' 2 15,1 1 10 1448627 т а б л и ц а ОЭА п-2 п=3 28, 0 1 42 •о ПЭО п=7 •п=8 п=5 10,0 т 20 а б л и ц а ОЭА =1 п»2 0 п 20, 2 п =3 6 ПЭО п=4 39 • 5 Ь п=5 п=6 п=7 п=8 12,5 10,1 1.7 Т а б л н ц а 16 7 ОЭА ПЭО п-1 п-2 п=3 7 93 Т а б л и Ц а ОЭА «-2 п«3 п=4 п-5 ц=6 7,0 я п 1 29,3 31. 7 15, 2 2,8 Л' п=8 0 п=2 п-3 23,3 28,5 15 Т а б л и ц а АЭО п«1 а пэо 9 ТТЭП • п=5 п=6 п=7 20 .8 7, 5 1,2 18,2 11 12 Т а б л и ц а 1448627 Показатели 10 Наименование криопротектора ОЭМ ОЭА ОЭА I ОЭМ Конечная концентрация криопротектора в суспензии| % 10 Время эквилибрации, мин 30 40 +22 Температура эквилибрации, °С 30 +22 +4 Режим замораживания 1*7мин до -1D D C, затем 10°/мин до -1806С> погружение в жидкий азот 'Жизнеспособность 96,5І2,16 Время формирования монослоя при культивировании, сутки на 2-е 1°/мин до -10°С, затем 10°/мин до -180°С, погружение о жидкий азот 1°/мин до -15°С, затем 10°/мин до -180°С, погружение в жидкий азот 1°/мин до -15°С, затем 10°/мин до -180°С, погружение в жидкий азот 86,311,92 94,6П,34 78,411,16 на 3-й на 2-е на 3-й а б л и ц а Наименование криопротектора Показ атели ОЭА ОЭМ ОЭА Конечная концентрация криопротектора в суспензии, % 10 Вреья эквилибрации, мин Температура эквилибрации,°С Режим замораживания 11 40 +22 10 40 40 +22 ОЭМ +22 +22 1°/мин до - Ю ° С , затем 10^/мин до -180°С, погружение в жидкий азот 1°/мин до -10°С, затем 10°/мин до -180°С, погружение в жидкий азот 1 /мин до -15°С, затем 10°/мин до -1В0°С, погружение в жидкий азот 1°/мин до жидкий азот Жизнеспособность 94,8i2s62 74,4+2,12 93,8*2,84 69 9 2i? s 41 Время формирования монослоя при культивировании, сутки 2-е 4-е 2-е -15°С, затем 10°/мин до -180еС» погружение в 1448627 Редактор З.Ходакова ., —.„—«._————-.— Составитель В.Мякушева Техред А.Кравчук Корректор М.Васильева _ , . — — • Заказ 1509/ДСП Тираж 231 Подписное ВНИИЇЇИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКИТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. і Л Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, h \