Штам бактерій corynebakterium insidiosum продуцент полісахариду, що стимулює утворення фактору некрозу пухлини і інтерлейкіна -1

Изобретение относится к микробиологии, а именно к штаммам микроорганизмов, используемых в микробиологической и медицинской промышленности для получения иммуномодуляторов, в частности полисахаридов, обладающих способностью стимулировать образование фактора некроза опухоли (ФНО) и интерлейкина-1 (ИЛ-1) в клетках человека и животных. В качестве продуцента липополисахарида, проявляющего способность индуцировать образование ФНО и ИЛ-1, используется EsCherichia coli [1]. Выращивание указанного продуцента проводится на средах, содержащих дорогостоящие реактивы - мясо - пептонный бульон, мясопептонный агар. Выход липополисахарида - 4-5% от сухой массы клеток. Липополисахарид получают экстракцией клеток горячим водным фенолом. Этот реактив является очень токсичным для людей. Наличие липида А в составе липополисахарида обуславливает его токсические свойства, пирогенность. Максимально переносимая доза липополисахарида в опытах на белых мышах 0,125-5,00 мг/мг; ЛД50 равняется 2-3,5 мг/кг. Кроме того, получаемые водно-фtнольным методом липополисахариды содержат обычно высокий процент нуклеиновых кислот. Указанные обстоятельства обусловливают невозможность терапевтического применения липополисахаридов для человека и животных. В связи с этим перспективным является использование штаммов микроорганизмов, выращивание которых проводится на дешевых синтетических средах, получение полисахаридов из которых будет более экономичным, безвредным и менее трудоемким. Эти штаммы проявляют высокую активность в стимуляции образования ФНО и ИЛ-1. Предлагаемый биополимер иной химической природы, в нем отсутствует липид А, обусловливающий токсичность липополисахаридов. В связи с тем, что полисахариды нетоксичны, они могут быть использованы в качестве терапевтических препаратов. В основу изобретения поставлена задача получения активного штамма микроорганизма - продуцента полисахарида, являющегося эффективным индуктором образования ряда цитокинов ФНО и ИЛ-1. Поставленная задача решается тем, что в качестве микроорганизма-продуцента полисахарида используют штамм бактерий Corynebacterium insidiosum ИМВ 7246б. Штамм Corynobacterium insidiosum ИМВ 7246б, обладающий указанными свойствами, выделен из пораженных стеблей люцерны. Для этой цели часть пораженной ткани на границе с внешне здоровой тканью вырезали скальпелем, промывали в течение 15-20 мин несколькими порциями стерильной воды. Затем растительную ткань растирали в стерильной ступке с небольшим количеством стерильной воды и образующуюся гомогенную кашицу высевали петлей на поверхность агара а чашках Петри. Чашки помещали в термостат (температура (25±3)°С). Питательными средами для выделения бактерий обычно служат: картофельный агар, картофельный агар + 10% глюкозы, картофельный агар +1% дрожжевого экстракта, мясопептонный агар. Культуру хранят: на косяках с картофельным агаром при комнатной температуре либо в пробирках на косяках с картофельным агаром, поверхность которого заливают минеральным маслом. Состав среды картофельный агар: на 1 л дистиллированной воды 200 г картофеля, 0,5% хлористого натрия, 1,5-2,0% агара, рН 7,0-7,2. Штамм Corynobacterium insidiosum ИМВ 7246б депонирован в коллекции культур Всесоюзного научно-исследовательского института антибиотиков Минмедмикропрома и имеет регистрационный № 2060. Штамм C.insidiosum ИМВ 7246б имеет следующие морфологические и биохимические признаки. Морфологические признаки. Клетки - неспороносные палочки (0,4-0,6 0,7-1,1 мкм), прямые, иногда слабо изогнутые. Располагаются одиночно, парами, могут Y-образно. Грамположительные. Культуральные признаки. Хорошо растет на обычных питательных средах. На картофельном агаре - колонии круглые, гладкие, приподнятые, блестящие, слабо слизистые, прозрачные, желтого цвета. На мясопептонном агаре - колонии круглые, гладкие, более прозрачные, чем при росте на картофельном агаре, слабо слизистые, желтого цвета, со временем маслообразной консистенции. При росте в мясопептонном бульоне - культура растет умеренно, образует нежную пленку и осадок. Культура растет в аэробных условиях, оптимальная температура роста 21-24°С. минимальная 1°С, максимальная 28-31 °С. Биохимические признаки. Культура не образует кислоту из глюкозы, лактозы, мальтозы, сахарозы, маннита, рамнозы салицина. Молоко лептонизирует, желатин слабо разжижает, нитраты не редуцирует, не образует индол и сероводород. Используют глюкозу, са харозу, лактозу, галактозу, глицерин, крахмал. Факторы роста - биотин, никотиновая кислота, гистидин, пуриновые и пиридиновые основания. Безвредность. Штамм C.insidiosum ИМВ 7246б не вирулентен, не токсичен для теплокровных животных. Введение 24-часовой культуры C.insidiosum ИМВ 7246б внутрибрюшинно, подкожно и перорально в дозах 5 и 10 млрд микробных клеток на 1 мышь. а также фильтратов среды роста (после культивирования бактерий на жидкой синтетической среде) не вызывало у животных патологического процесса, регистрируемого клинически или при макроскопическом изучении внутренних органов животных. Штамм ИМВ 7246б C.insidiosum непатогенен для теплокровных животных. Выращивание бактериальной массы C.unsidiosum ИМВ 7246б и получение полисахарида из него осуществляли следующим образом. Для получения инокулята используют 24-часовую культур у, выращенную на картофельном агаре при (25±3)°С. Выращивание продуцента осуществляют в колбах объемом 500 мл, содержащих 200 мл жидкой синтетической среды следующего состава, г/л: МgO 4 0,2; Na4HPO4 6,0; КН2РО 4 3,0; NH4Cl 1,0; глюкоза 5,0. Стоимость 1 л среды дешевле более чем в 10 раз. Из выращенной культуры продуцента выделяют целевой продукт мягким щелочным гидролизом клеток. Пример 1. Культуру C.insidiosum ИМВ 7246б, хранящуюся на косяках с картофельным агаром, засевают на косяк той же средой и выращивают в термостате при (25±3)°С в течение 24 ч. Затем культуру смывают с косяков жидкой питательной средой описанного состава и засевают в колбы емкостью 500 мл, содержащие 200 мл аналогичной питательной среды; выращивают в условиях качалок (240 об/мин) а течение 35 ч. Клетки осаждают центрифугированием при 5000 об/мин в течение 20-25 мин, промывают физиологическим раствором и подвергают гидролизу в 5%-ном растворе КОН/100 мл на 10 г влажных клеток в течение 1,5-2,0 ч. Гидролизат диализуют против водородной, а затем дистиллированной воды до нейтрального значения рН, центрифугируют для осаждения неразрушенных клеток, а также загрязняющих компонентов клеточной стенки при 5 000 об/мин в течение 20-25 мин. Полисахарид осаждают из надосадочной жидкости добавлением 5-ти объемов спирта. Осадок освобождают от липидов последовательной обработкой ацетоном, эфиром, а затем смесью хлороформа с метанолом (2:1) и подвергают ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-ТСК гелях. Полисахарид, целевой продукт, элюируют 0,25 М фосфа тным буфером, рН 6,0. Фракции полисахарида собирают, диализуют против водопроводной, а затем дистиллированной воды, лиофильно высушивают. В целевом продукте содержится до 80% углеводородов. Моносахаридный состав целевого продукта изучали методом газожидкостной хроматографии и 13С-ЯМРспектроскопии. Установлено, что полисахарид состоит из тетрасахаридных повторяющихся звеньев, представленных остатками галактозы и рамнозы. В качестве кислого компонента присутствует пировиноградная кислота. Молекулярная масса полисахарида, установленная гель-фильтрацией на сефарозе 6В, составляет ~ 70000. Выход очищенного полисахарида составляет ~ 10% от сухой массы клеток. Выделенный полисахарид проверяют на способность стимулировать образование ФНО и ИЛ-1. Способность полисахарида индуцировать образование ОНО и ИЛ-1 исследовали в культуре стимулированных тиогликолатов мышиных перитонеальных микрофагов (МФ). Перитонеальные МО собирали путем промывания брюшной полости мышей линии ДВА средой RPMI-1640, отмывали центрифугированием и вносили в лунки плат (Linbro) в концентрации 1,0.106 клеток/мл. После 2 ч инкубации при 37°С в атмосфере 5% СО2 и 95% влажности монослой МФ в каждой лунке тщательно отмывали для удаления неприлипших клеток. Затем в лунки вносили свежую среду с 2 мМL-глутамина и 80 мкг/мл гентамицина, а также исследуемый полисахарид в соответствующей концентрации. После 20 ч культивирования надосадочные жидкости культур МФ тестировали на наличие в них ФНО и ИЛ-1. Исследование активности ФНО в супернатантах макрофагальных культур проводили по методу (Fish et al). В качестве клеток-мишеней используют мышиные фибропласты линии L929, полученные из коллекции клеточных культур Института цитологии АН СССР. Единицы цитотоксической активности ФНО рассчитывали по уровню 50%-ной цитотоксичности путем использования Logitlog преобразования и анализа полученных прямых. Стандартная кривая построена по рекомбинантному ФНО. Содержание ИЛ-1 в исследуемых супернатантах МФ оценивали по их комитогенному эффекту в реакции бластной трансформации (РБТ) мышиных тимоцитов в присутствии субоптимальной дозы (0,5 мкм/мл КонА). Результаты РБТ оценивали по уровню включения 3H-тимидина во вновь синтезируемую ДНК лимфоцитов. Интенсивность включения метки в культуры лимфоцитов определяли на b -счетчике. Способность полисахарида C.insidiosum ИМВ 7246 б в концентрации 10 мкг/мл стимулировать образование ФНО и ИЛ-1 перитонеальными МФ мышей более чем в два раза превышает способность липосахарида Escherichia coli 055:В5, производимого американской фирмой "Sigma" (см. таблицу). Таким образом, предлагаемый штамм ИМА 7246б C.insidiosum является штаммом, продуцирующим полисахарид, являющийся активным индуктором образования факторов некроза опухоли и интерлейкина-1. Выращивание культуры продуцента более, чем в 10 раз дешевле выращивания E.coli. Полисахарид в отличие от липополиса-харида E.coli является не токсичным и не обладает побочным действием. Изобретение может быть использовано в микробиологической промышленности и в медицине, при этом не требуется дополнительных ассигнований для осуществления технологических процессов выращивания продуцента и выделения из него полисахарида.