Розчин для консервування клітинних культур

СРЕДА ДЛЯ КОНСЕРВИРОВАНИЯ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР, содержащая питательную среду и криопротектор, о т л и ч а ю щ а я с я тем, что, с целью повышения жизнеспособности клеток, в качестве криопротектора используют оксиэтилированный глицерин со степенью полимеризации п=3 при следующем соотношении компонентов, мас.%: Оксиэтилированный глицерин 3-15 Питательная среда Остальное і ЬЧЬЛі, г. Li 1 1 192762 Изобретение относится к криобиологии и может быть использовано при низкотемпературном консервировании культур клеток. Цель изобретения - повышение жизнеспособности клеток. Способ осуществляют в консервирующей среде, содержащей питательную среду, среду 199 или 0,5%-ный гидролизат лактальбумина на растворе Хэнкса и криопротектор, в качестве криопротектора используют оксиэтилированный глицерин со степенью полимеризации п=3 (ОЭГ п=3) в конечной концентрации 3-15%, причем компоненты среды втяты в следующем соотношении, мас.%: ОЭГ п=3 3-15 Питательная среда До 100 рН 7,2-7,4 П р и м е р 1. Образовавшийся монослой клеток 2-суточной перевиваемой линии почки овцы (П0-2) хорошего исходного качества (клетки имели полигональную форму, присущую эпителеподобным клетіам, границы между клетками четко выражены, в клетках отсутствуют видимые признаки цитопатологии роста) снимают с поверхности стекла культуральных сосудов с помощью диспергирующей смеси, состоящей из 0,02%-ного раствора Вереена и 0,25%-ного раствора трипсина Дифко в соотношении 9:1, предварительно ополоснув слой раствором Хенк са СрН 7,2) • Процедуру снятия клеток со стекла осуществляют при 3 7 С. При появлении первых признаков отделения клеток диспергирующую смесь осторожно сливают, после чего легким потряхиванием снимают оставшиеся на поверхности стекла клетки. Жизнеспособность клеток, оцененная методом суправительного окрашивания, 95%. 5 Ю 15 20 25 30 25 40 45 Клеточную взвесь разбавляют питательной средой 199, доводя плотность клеток до 10x10 в 1 мл. К суспензии клеток в соотношении 1:1 при постоянном перемешивании добавляют 50 6%-ный раствор оксиэтилнрованного глицерина (ОЭГ) п=3 и доводят рН до 7,2 путем добавления 5%-ного раствора биокарбоната натрия. Таким образом, среда, в которой гс находятся клетки, содержит, мас.%: ОЭГ п=3 3 Среда 199 ' До 100 2 Затем производят расфасовку клеточной взвеси по 2 мл в стеклянные ампулы, которые запаивают после 20-минутной эквилибрации при 22°С. Замораживание клеточной суспензии осуществляют в аппарате программного замораживания, сначала со скоЙ ростью 2 град./мин до -5 С, затем _ , р со скоростью 20 град./мин до -100 С. Замороженные образцы культуры переносят на длительное хранение в стационарное хранилище с жидким азотом. После месячного хранения в жидком азоте ампулы с клетками оттаивают в водяной бане при +40°С. Размороженную культуру клеток ПО-2 разбавляют питательной средой 199, содержащей 10% сыворотки крупного рогатого скота, инактивированной при +56 С в течение 30 мин, и канамицина сульфата из расчета 100 ед/мл с рН 7,2, до посевной концентрации 0,4x10 клеток в I мл, Культивирование осуществляют в культуральных сосудах емкостью 0,25 л при +37°С, замену питательной среды осуществляют по истечении 10 ч культивирования. Жизнеспособность клеток оценивают методом суправитального окрашивания 0^2%-ным раствором трипанового синего по колониеобразующей активности и по характеру формирования монослоя. Уровень восстанавливаемых из замороженного состояния клеток 85%. По истечении 3 сут. культивирования монослой выполнен клетками на 85% поверхности культурального сосуда. Клетки имеют свойственную им полигональную форму, границы между клетками отчетливо выражены, в цитоплазме отсутствуют видимые признаки цитопатологии их роста. П р и м е р 2. Все этапы подготов'ки клеток к низкотемпературному консервированию и отогреву осуществляют аналогично примеру 1, а консервирование осуществляют в среде следующего состава, мае.%: ОЭГ п=3 5 Среда 199 До 100 При этом на первом этапе замораживание ведут со скоростью 2 град./ /мин до -10°С. После размораживания уровень восстановления клеток 92%, после 3 сут. культивирования монослой выполнен клетками на 100%. 1192762 П р и м е р 3. Все этапы подготовОЭГ п=3 15 ки клеток к низкотемпературному конСреда 199 До 100 сервированию и отогреву осуществляют На первом этапе замораживание веаналогично примеру 1, а консервировадут со скоростью 2 град./мин до -20^0, ние осуществляют в среде, содержаПосле размораживания уровень восстащей, мас.%: новления клеток 85%, монослой после 2 сут. хранения выполнен клетками ОЭГ п=3 10 на 94%. • Сред-а 199 До 100 На первом этапе замораживание Во всех четырех примерах клетки ведут со скоростью 2 град./мин имеют свойственную им полигональную до -15°С. форму, границы между клетками отчетливо выражены, в цитоплазме отсутстПосле размораживания уровень вуют видимые признаки цитопатологии восстановления клеток 85%, а после их роста. 3 сут. культивирования монослой выполнен клетками на 90% поверхности 15 культурального сосуда. Результаты экспериментов приведены в таблице. П р и м е р 4. Подготовку клеток Как видно из таблицы, наилучший к консервированию и отогреву осущеэффект криозащиты отмечается при ствляют аналогично примеру 1, а консервирование- осуществляют в среде, 20 содержании в среде ОЭГ п=3 в 5%-ной концентрации. содержащей, мае.%: Состав криоэащитной среды, Уровень восстановленных Формирование монослоя кле мас.% ток на третьи сутки кульклеток, % ОЭГ п=3 Среда 199 3 До 100 85 85 5 До 100 92 100 10 - До 100 85 90 15 До 100 85 Редактор О.ІОрковецкая Составитель М.Поэняк Техред О.Неце Корректор Б.Синицкая Заказ 7194/6 Тираж 742 Подписное БНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г.Ужгород, ул.Проектная, 4