Спосіб лікування захворювань тварин, викликаних mycoplasma hyopneumoniae

Даний винахід відноситься до способів лікування або запобігання захворювання або розладу у тварин, що спричинені інфекцією Mycoplasma hyopneumoniae (M. hyo), шляхом введення тварині віком від трьох (3) до десяти (10) днів однієї дози ефективної кількості вакцини М. hyo. Вакцина М. hyo може бути у вигляді інактивованого або модифікованого живого препарату цілих клітин або частин клітин, у вигляді субодиничної вакцини, у вигляді нуклеїнової кислити або ДНК-вакцини. Вакцина М. h yo, що вводиться у відповідності з даним винаходом, може бути одержана синтетичним або рекомбінантним шляхом. М. h yo представляє собою бактеріальний патоген, що викликає ензоотичну пневмонію у свиней. Ензоотична пневмонія представляє собою хронічне захворювання, що приводить до слабкого перетравлення їжі, низькорослості та схильності до вторинних легеневих інфекцій. М. hyo легко передається через секреторні виділення респіраторного тракту та шля хом передачі від свиноматки поросятам, ця інфекція є широко поширеною на свинофермах. Приблизно 99% свиней у США є інфікованими, це приносить збитки промисловості по виробництву свинини на суму близько 300 мільонів доларів щорічно. Більшість відомих вакцин проти М. hyo базувалися на інактивованих препаратах цілих клітин М. hyo, при цьому такі препарати містили ад'ювант. Крім того, вакцини, що містять імуногенні поліпептиди або білки, можуть бути синтезовані або одержані шляхом клонування та проведення рекомбінантної експресії генів М. h yo. Гени М. hyo, здатні до експресії таких поліпептидів або білків in vivo, можуть також використовува тися як вакцини. Приклади вакцин М. h yo на основі цілих інактивованих вакцин включають RESPISURE та STELLAMUNE, що є комерційно доступними від Пфайзер Інк., США. Крім того, були описані декілька рекомбінантно одержаних імуногенних поліпептидів та білків М. hyo, що можуть бути корисними як субодиничні вакцини. Міжнародна заявка [WO 96/28472] описує шість видів білкових антигенів М. h yo з молекулярною масою 46-48, 52-54, 60-64, 72-75, 90-94 та 110-114 кілодальтон та розкриває частинні білкові послідовності антигенів з молекулярною масою 52-54, 60-64 та 72-75 кілодальтон, а також нуклеотидну та амінокислотну послідовності повної довжини антигену з молекулярною масою 46-48 кілодальтон. Клонування гену, що кодує білок М. hyo P46, тобто, р46, було також описане Futo та ін.. [1995; J.Bacteriol 177: 1915-1917]. Ця ж група показала, що генний продукт, експресований in vitro, був корисним у діагностиці антитілогенезу на М. hyo інфекції без перехресної реактивності до інших видів Mycoplasma [Futo та ін., 1995, J.CIin. Microbiol. 33: 680-683]. Послідовності та діагностичне використання гена р46, описане [Futo та ін., було також описано у публікації європейського патенту №0475185 А1]. Wise та Кіт [1987, J.Bacteriol., 169: 5546-5555] показали, що у M.hyo існують чотири види інтегральних мембранних білків, які називаються р70, р65 (Р65 вище), р50 та р44, при цьому три останніх є модифікованими ліпідами, приєднаними за допомогою ковалентного зв'язку, та індукують сильну імунну відповідь. Протективні впливи імунної відповіді не були оцінені. Було клоновано ген, який кодує білок Р65, а його послідовності та можливості застосування у вакцинах та при діагностиці були описані у патенті США [№5,788,962]. Міжнародна патентна заявка [WO 91/15593] описує п'ять білків M.hyo, що мають молекулярну вагу 105, 90, 85, 70 та 43 кілодальтон. Послідовність повної довжини гена, що кодує білок з молекулярною вагою 85 кілодальтон (білок С), була описана як частина нуклеотидних послідовностей, що кодують інші чотири білки. Патент США [№5,252,328] (Faulds) розкриває амінотермінальні послідовності ііиунореактивних білків M.h yo, молекулярна маса яких складає 36, 41, 44, 48, 64, 68, 74,5, 79, 88,5, 96 та 121 кілодальтон. Інші білки, ідентифіковані на основі їх електрофоретичної рухливості мали молекулярну масу 22,5, 34 та 52 кілодальтон, але для них не були розкриті білкові послідовності. Хоча згідно з патентом США [№5,252,328] було запропоновано використовувати ці білки у вакцинних композиціях, не було представлено жодних результатів стосовно дослідження вакцини. Публікація міжнародної заявки [WO95/09870] розкриває біохімічні способи очистки адгезинів M.hyo, інтегральних мембранних білків мікоплазми, що відповідають за адгезію до війок зовнішнього епітелію респіраторного тракту організму хазяїна. [WO 95/09870] також пропонує аналізи та можливі способи застосування цих білків, наприклад, у вакцинах та при діагностиці. Дослідницька робота King та ін. [1997; Vaccine 15: 25-35] розкриває Mhp1, адгезин з молекулярною масою 124 кілодальтон, що є штамовим варіантом Р97. Варіант Р97 з молекулярною вагою 94 кілодальтон було ідентифіковано Wilton та ін. [1998, Microbiology 144: 1931-1943]. Крім того, було показано, що ген р97 є частиною оперона, який також кодує другий білок з передбачуваною молекулярною масою приблизно 102 кілодальтона, який називається Р102 [Hsu та ін., 1998, Gene 214: 13-23]. Minion та Hsu запропонували використання Р102 у вакцинах [публікація міжнародної патентної заявки WO99/26664], але не було представлено жодних досліджень стосовно вакцини. Жодна з відомих вакцин M.hyo не була описана для ефективного однодозового лікування у свиней у віці приблизно від 3 до 10 днів. Така вакцина буде усувати необхідність багаторазового дозування, і таким чином, значно зменшить затрати праці та коштів, асоційовані з масовою вакцинацією поголів'я свиней у всьому світі. Таким чином, існує необхідність ефективної вакцини M.hyo, що може вводитися свиням у формі однодозової вакцини у віці приблизно від 3 до 10 днів для захисту та запобігання захворювань та розладів, спричинених M.h yo. Даний винахід забезпечує спосіб лікування або запобігання захворювання або розладу у тварин, спричиненого інфекцією Mycoplasma hyopneumoniae, що включає введення тварині у віці приблизно від 3 до 10 днів ефективної кількості однодозової вакцини Mycoplasma hyopneumoniae. Спосіб за даним винаходом усуває необхідність використання додаткових доз для того, щоб генерува ти та/або підтримати імунітет до M.hyo. Даний спосіб однодозової вакцинації забезпечує захист як серонегативних, так і серопозитивних поросят проти контрольного зараження вірулентним збудником M.h yo. Спосіб за даним винаходом є ефективним при лікуванні або запобіганні симптомів, викликаних інфекцією M.hyo, включаючи, наприклад, запобігання та зменшення уражень легень у свиней. Спосіб за даним винаходом охоплює введення свиням ефективної кількості однодозової вакцини M.hyo, при цьому вакцина M.h yo включає препарат цілих клітин або частин клітин, такий, як бактерии, або модифікований живий препарат, субодиничну вакцину, таку, як субодинична вакцина, що містить один або більше пептидів чи білків, які мають походження від M.hyo, імуногенних фрагментів таких поліпептидів або білків, або гени чи нуклеїнові кислоти, які здатні до експресії in vivo. Поліпептиди, білки, їх імуногенні фрагменти, а також гени або нуклеїнові кислоти, що забезпечуються вакциною M.hyo можуть бути синтезовані або рекомбінантно одержані при використанні способів, відомих у даній галузі те хніки. Вакцина M.hyo, що вводиться у відповідності з даним винаходом, може включати додаткові компоненти, такі, як ад'ювант. Різноманітні ад'юванти, що можуть використовуватися, включають ті, що описані у даній заявці, а також ті, що відомі у даній галузі техніки. Даний винахід охоплює спосіб лікування або запобігання захворювання або розладу у тварини, що спричинені інфекцією Mycoplasma hyopneumoniae, такий спосіб охоплює введення тварині у віці від приблизно 3 до приблизно 10 днів ефективної кількості однодозової вакцини Mycoplasma hyopneumoniae. Спосіб однодозової вакцинації за даним винаходом усуває необхідність введення додаткових доз свині для того, щоб генерувати та/або підтримати імунітет проти M.hyo. Тільки для глибшого розкриття, але не для обмеження, детальний опис винаходу розділений на наступні підрозділи, які описують або ілюструють окремі ознаки, втілення або застосування даного винаходу. У деяких втіленнях вакцини, що використовуються у способі за даним винаходом, включають інактивовані препарати цілих частин або частин клітин М.hyo (бактерии) або модифіковані живі вакцини та фармацевтично прийнятний носій, або інактивований препарат цілих клітин або частин клітин M.hyo (бактерии), або модифіковану живу вакцину та ад'ювант. В інших специфічних втіленнях вакцини, що використовуються у способі за даним винаходом, включають імуногенний білок або поліпептид чи їх фрагмент, а також фармацевтично прийнятний носій, або імуногенний білок або поліпептид чи їх фрагмент та ад'ювант. Визначення та скорочення Термін „лікування або запобігання" стосовно інфекції М. hyopneumoniae як такий, що використовується у контексті даної заявки, означає інгібування реплікації бактерії М. h yopneumoniae для інгібування її передачі або для запобігання розвитку М.hyopneumoniae, що вже попала в організм хазяїна, та для полегшення симптомів захворювання або розладу, спричиненого інфекцією М.hyopneumoniae. Лікування вважається терапевтичним, якщо при цьому виникає зменшення бактеріального навантаження, зменшення легеневих інфекцій та/або збільшення споживанні їжі та/або збільшення росту. Спосіб за даним винаходом є, наприклад, ефективним у запобіганні або зменшенні уражень легень. Термін „ вакцина M.hyo", як такий, що використовується в контексті даної заявки, відноситься до вакцини, що є корисною у запобіганні або лікуванні розладу або захворювання, спричиненого інфекцією М. hyo. Вакцина М. hyo може включати будь-яку вакцину, ефективну при лікуванні або запобіганні інфекції свиней М. h yo. Вакцина M.h yo, що може використовуватися за даним винаходом, може включати, наприклад препарати цілих клітин або частин клітин M.h yo, інактивовані або модифіковані живі вакцини, субодиничну вакцину, що містить один або більше поліпептидів або білків, що мають походження від M.hyo, або імуногенні фрагменти таких білків або поліпептидів, один або більше генів або нуклеїнових кислот M.h yo, які кодують один або більше поліпептидів або білків, що мають походження від M.hyo, або їх імуногенні фрагменти, при цьому ці гени або нуклеїнові кислоти є здатними до експресії in vivo у свиней. Поліпептиди, білки M.h yo, імуногенні фрагменти таких поліпептидів та білків, або гени чи нуклеїнові кислоти M.h yo можуть бути синтезовані або рекомбінантно одержані при використанні способів, що відомі у даній галузі техніки. Бажано, коли вакцина M.hyo, що використовується у способі за даним винаходом, представляє собою бактерії. Термін „тварина", як такий, що використовується у контексті даної заявки, відноситься до усіх тварин, відмінних від людини, включаючи ссавців. Термін „свиня", як використовується у контексті даної заявки, відноситься до L поросят, підсвинок, молодих свиней, свиноматок, хряків та членів родини Suidae. Бажано, коли спосіб за даним винаходом застосовують до тварини, що є відмінною від людини; більш бажано, до свині. Термін «бактерии», як такий, що використовується у контексті даної заявки, відноситься до препарату інактивованих цілих клітин або частин клітин M.h yo, що є прийнятним як вакцина. Термін «ефективна кількість» відноситься до кількості M.h yo, що є достатньою для ініціювання імунної відповіді у особини, якій її вводять. Імунна відповідь може включати, без обмеження, індукцію природженого, клітинного та/або гуморального імунітету. Інактивовані (на основі цілих клітин або частин клітин) та модифіковані живі вакцини Способи приготування традиційних інактивованих або модифікованих живих вакцин для використання у способі за даним винаходом є відомими у даній галузі те хніки. Бактерини M.hyo, що можуть використовуватися у методі вакцинації за допомогою однієї дози, можуть бути одержані з різних доступних джерел. Наприклад, бактерини M.hyo можуть бути приготовлені з ізолятів M.h yo. Різноманітні ізоляти M.h yo відомі для спеціалістів у даній галузі та є доступними, наприклад, з Американської колекції типових культур, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209. Такі ізоляти включають, наприклад, АТСС №25095, 25617, 25934, 27714 та 27715. Ізоляти M.hyo можуть також бути одержані безпосередньо з уражених легень природно та експериментально інфікованих свиней при використанні відомих у даній галузі техніки способів. Ізоляти M.h yo можуть бути інактивовані при використанні різноманітності відомих способів, наприклад, обробки бактеріальних ізолятів за допомогою бінарного етиленіміну (ВЕІ), як описано у патенті США [№ 5,565,205], або за допомогою інактивації при використанні, наприклад, формаліну, тепла, BPL, опромінення або глутаральдегіду. Бактерини M.hyo, прийнятні для використання у способі за даним винаходом, можуть бути одержані з різних комерційно доступних джерел. Такі джерела включають, але не обмежені: RESPIFEND (Fort Dodge, American Home Products), HYORESP (Merial Ltd), M+PAC (Schering Plough), PROSYSTEM Μ (Interval), INGLEVAC Μ (Boehringer), RESPISURE (Pfizer Inc.) та STELLAMUNE MYCOPL ASMA (Pfizer Inc.). Бажане джерело бактерину M.h yo для використання у способі за даним винаходом представляє собою RESPISURE та STELLAMUNE MYCOPLASMA. Особливо бажаним джерелом бактерину M.h yo для використання у способі за даним винаходом є RESPISURE-1 (Pfizer Inc.), що містить штам Р-5722-3 (NL1042), який можна одержати від Purdue University, США. Бажано, коли штам Р-5722-3 інактивують за допомогою ВЕІ та посилюють дію його за допомогою доступного ад'юванту, переважно, AMPHIGEN (Hydronics, США). Бажана доза складає приблизно 2,0мл. Консерванти, що традиційно використовуються з цією метою, включають мертіолят/ЕДТА. Можна додавати носій, бажано PBS. Приготування модифікованих живих вакцин, наприклад, шляхом атенуації вірулентних штамів при пасивуванні у культурі, відоме у даній галузі техніки. Субодиничні вакцини Спосіб за даним винаходом може бути реалізований при використанні субодиничних вакцин, що містять очищені імуногенні білки, поліпептиди M.h yo та імуногенні фрагменти таких білків та поліпептидів. Такі білки та поліпептиди можуть бути приготовлені при використанні методів, відомих у даній галузі техніки. Крім того, для визначення чистоти та гомогенності білка можуть використовуватися способи, відомі спеціалісту у даній галузі техніки, електрофорез зразка в поліакриламідному гелі, після чого проводять візуалізацію поліпептидної смуги у забарвленому гелі. Вищого ступеня розрізнення можна досягти, використовуючи ВЕРХ або інші подібні способи, відомі у даній галузі техніки. У специфічному втіленні вакцина, що використовується у даному винаході, включає принаймні один білок M.h yo, такий, як наприклад, але не обмежуючись, Р46, Р65, Р97, Р102, Р70, Р50 та Р44. В інших втіленнях вакцина, що використовується у способі за даним винаходом, включає бактерии M.h yo (інактивовані цілі клітини або частини клітин або модифіковані живі клітини) або білок чи поліпептид M.h yo або їх імуногенний фрагмент та принаймні один інший імуноген (інактивовані цілі клітини або частини клітин або модифіковані живі клітини) або імуногенний чи антигенний білок, поліпептид або їх імуногенний фрагмент, при цьому бажаним є вірусний, бактеріальний або паразитарний поліпептид. Приклади таких інших патогенів та білків, поліпептидів або їх імуногенних фрагментів включають, але не обмежені, вірус грипу свиней (SIV), вір ус репродуктивного та респіраторного захворювання свиней (PRRS або загадкова хвороба свиней), діарею після відлучення свиней від материнського годування (PWD) та проліферативний ентерит свиней (РРЕ). Така композиція є особливо корисною як комбінована вакцина. У подальшому специфічному втіленні імуногенні фрагменти таких білків або поліпептидів мають послідовність, що містить принаймні 10, принаймні 20, принаймні 30, принаймні 40, принаймні 50 або принаймні 100 суміжних амінокислот імуногенних білків та поліпептидів, що використовуються у способі за даним винаходом, включаючи, але не обмежуючись, Р46, Р65, Р97, Р102, Р70, Р50 та Р44. Крім того, білки M.hyo для використання у вакцинах є суттєво чистими або гомогенними. Спосіб за даним винаходом використовує білки або поліпептиди, які є типово очищеними від хазяйських клітин, що експресують рекомбінантні нуклеотидні послідовності, які кодують ці білки. Така очистка білків може бути проведена за допомогою різноманітності способів, добре відомих спеціалісту у даній галузі. [Див, наприклад, способи, описані у «Методи ензимології», 1990, видавництво університету, Сан Дієго, „Очистка білків: принципи та практика", 1982, Спрингер-Верлаг, Нью-Йорк]. Очищені поліпептиди та білки M.hyo та їх імуногенні фрагменти можуть також бути приготовлені при використанні способів синтезу. Композиція вакцини Прийнятні препарати вакцин, що використовуються за даним винаходом, включають розчини, що вводяться шляхом ін'єкції, рідкі розчини або суспензії; можуть також бути приготовлені тверді форми, прийнятні для приготування розчинів або суспензій у рідині перед ін'єкцією. Препарат може також бути емульгований. Активні імуногенні інгредієнти часто перемішують з ад'ювантами, які є фармацевтично прийнятними та сумісними з активним інгредієнтом. Поліпептиди можуть бути введені у склад вакцини як нейтральні форми або форми солі. Фармацевтично прийнятні солі включають солі приєднання кислоти (утворені з вільними аміногрупами пептиду), при цьому вони утворюються з неорганічними кислотами, такими, як наприклад, соляна або фосфорна кислота, або з органічними кислотами, такими, як оцтова, щавлева, винна, малеїнова, тощо. Солі, утворені вільними карбоксильними групами, можуть також походити від неорганічних основ, таких, як, наприклад, гідроксиди натрію, калію, амонію, кальцію, або заліза, а також таких органічних основ, як ізопропіламін, триметиламін, 2-етиламіноетанол, гістидин, прокаїн, тощо. Вакцинні композиції, що використовуються за даним винаходом, включають ефективну для імунізації кількість імуногену M.hyo та фармацевтично прийнятний носій. Вакцинні препарати включають ефективну для імунізації кількість одного або більше антигенів та фармацевтично прийнятний носій. Фармацевтично прийнятні носії добре відомі у даній галузі техніки та включають, але не обмежені, фізіологічний розчин, забуферений фізіологічний розчин, декстрозу, воду, гліцерин, стерильний ізотонічний водний буфер та їх комбінації. Один приклад такого прийнятного носія представляє собою фізіологічно збалансоване культуральне середовище, що містить один або більше стабілізуючих агентів, таких, як стабілізовані, гідролізовані білки, лактоза, тощо. Носій бажано є стерильним. Композиція повинна бути прийнятною для способу введення. Використання очищених антигенів як вакцинних препаратів можна проводити за допомогою стандартних способів. Наприклад, очищений(і) білок(ки) можна доводити до прийнятної концентрації, поєднуючи з будь-яким прийнятним вакцинним ад'ювантом та спаковуючи для використання. Прийнятні ад'юванти можуть включати, але не обмежені: мінеральні гелі, наприклад, гідроксид алюмінію; поверхневоактивні речовини, такі, як лізолецитин; глікозиди, наприклад, сапонін та похідні сапоніну, такі, як Quil А або GPI-0100; катіонні сурфактанти, наприклад, DDA (галогеніди четвертинних амонійних вуглеводнів, поліоли плюроніку; поліаніони та поліатомні іони; поліакрилові кислоти, неіонні блок-полімери, наприклад, Плюронік F-127 (B.A.S.F., USA); Авридин та Рантидин; пептиди; рекомбінантні мутантні лабільні токсини, такі, як лейкотоксин (fmLT) або холерний токсин (СТ); хімічно зв'язані або високоспоріднені молекулярні транспортери; мінеральні олії, наприклад, Montanide ISA-50 (Seppic, Paris, France), карбопол, Амфіген (Hydronics, USA, Omaha, NE, USA), Альгідрогель (Superfos Bioctor, Frederkssund, Denmark), масляні емульсії, наприклад, емульсії мінеральної олії, такої як BayolF/Arlacel A та води, або емульсії рослинної олії, води та емульгатора, такого, як лецитин; галуни, MDP, N-ацетил-мураміл-L-треоніл-D-ізоглютамін (thrMDP), N-ацетил-нор-мураміл-L-аланіл-D-ізоглютамін, N-ацетилмураміл-L-аланіл-D-ізоглютамін, Nацетилмураміл-L-аланіл-D-ізоглютаміл-L-аланін-2-(1'-2'-дипальмітоїл-sn-гліцеро-3-гідроксифосфорилокси)етиламін; холестеринові цитокіни та комбінації ад'ювантів. Поліатомні іони можуть також функціонувати як диспергувальні, загуснювальні агенти та агенти проти спікання, які дозволяють вакцинам ресуспендуватися як монодисперсна суспензія після тривалого періоду витримування. Комбінації ад'ювантів можуть бути присутніми у водній, інкапсульованій (контрольованого або відстроченого вивільнення) формі або у вигляді мікроінкапсульованих форм. Імуноген може також бути введений у ліпосоми або кон'югований з полісахаридами та/або з іншими полімерами для використання у вакцинній композиції. У випадках, якщо рекомбінантний антиген є гаптеном, наприклад, молекулою, що є антигенною на стільки, що може селективно реагувати зі спорідненими антитілами, але не є імуногенною на стільки, щоб викликати імунну відповідь, то при цьому гаптен може ковалентно зв'язуватися з носієм або імуногенною молекулою; наприклад, великий білок, такий, як сироватковий альбумін, буде забезпечувати імуногенність для гаптену, що злитий з нею. Гаптен-носій може бути приготовлений для використання як вакцини. Вакцини на основі генів та нуклеїнової кислоти Спосіб за даним винаходом можна використовувати при застосуванні генів або нуклеїнових кислот M.h yo, що кодують імуногенні білки, поліпептиди та імуногенні фрагменти таких білків та поліпептидів. Такі гени та нуклеїнові кислоти можуть експресуватися in vivo та можуть бути приготовлені при використанні методів, відомих у даній галузі. У специфічному втіленні вакцини, що використовуються у даному винаході, включають принаймні один ген або нуклеїнову кислоту, що кодують білок M.hyo, такий як, але без обмеження, Р46, Р65, Р97, Р102, Р70, Р50 та Р44. Ще в одному специфічному втіленні гени або нуклеїнові кислоти, що використовуються у способі за даним винаходом, кодують імуногенні фрагменти білків або поліпептидів M.hyo, що мають послідовність, яка включає принаймні 10, принаймні 20, принаймні 30, принаймні 40, принаймні 50, або принаймні 100 суміжних амінокислот імуногенних білків та поліпептидів, що використовуються у способі за даним винаходом, включаючи, але не обмежуючись Р46, Р65, Р97, Р102, Р70, Р50 та Р44. В інших втіленнях способу за даним винаходом ген або нуклеїнові кислоти, що використовуються, вводяться відомими способами, такими, як наприклад, використання генної пушки. Ще в інших втіленнях способу за даним винаходом ген або нуклеїнові кислоти, що використовуються, представляють собою вакцини на основі ДНК. Крім того, нуклеїнова кислоти або гени можуть бути присутніми в поєднанні з ліпосомами або іншими агентами, що покращують трансфекцію, як відомо у даній галузі те хніки. Способи приготування та доставки ДНК-вакцин відомі у даній галузі техніки. [Див., наприклад, Крішнан Б.Р. "С учасний стан ДНК-вакцин у ветеринарній медицині" Огляд способів поліпшення доставки лікарських засобів, Elsevier Science (2000)]. Експресійні системи Для експресії антигенних білкових послідовностей за винаходом використовується різноманітність хазяйських векторних експресіиних систем. Такі хазяйські векторні експресійні системи представлені векторами, за допомогою яких кодуючі послідовності, що представляють інтерес, можуть бути одержані та послідовно очищені, але можуть також представляти собою клітини, які можуть при трансформації або трансфекції за допомогою прийнятних нуклеотидних кодуючих послідовностей, експресувати генні продукти М.h уо, що використовуються у способі за даним винаходом in situ. Останні включають, але не обмежені, бактерії (наприклад, E.coli, B.subtiiis), трансформовані за допомогою рекомбінантної ДНК бактеріофага, плазмідними або космідними експресійними ДНК-векторами, що містять тпрЗ кодуючі послідовності; дріжджі (наприклад, Saccharomyces, Pichia), трансформовані за допомогою рекомбінантних дріжджових експресіиних векторів, що містять послідовності, які кодують генний продукт М.h уо; клітинні системи комах, інфіковані за допомогою рекомбінантних вірусних експресіиних систем (наприклад, бакуловірусних), що містять кодуючі послідовності М.hуо; рослинні клітинні системи, інфіковані за допомогою рекомбінантних вірусних експресіиних векторів (наприклад, вірус мозаїки цвітної капусти, CaMV, вір ус тютюнової мозаїки, TMV) або трансформованих за допомогою рекомбінантних плазмідних експресіиних векторів (наприклад, Тіплазміди), що містять кодуючі послідовності М.hуо; або клітинні системи ссавців (наприклад, COS, CHO, DHK, 293, 3Т3), що несуть рекомбінантні експресійні конструкції, які містять промотори, що мають походження від геному клітин ссавців (наприклад, металотіонеїновий промотор) або з вірусів ссавців (наприклад, пізній промотор аденовірусу; промотор 7,5К вірусу вакцини). У переважному втіленні експресійна система є бактеріальною системою. Поліпептиди та білки M.hyopneumoniae та їх імуногенні фрагменти можуть також експресуватися та доставлятися при використанні живих рекомбінантних вір усних та бактеріальних векторів, таких, як аденовірус або Salmonella. Існуючі на даний момент вектори є також відомими та доступними у даній галузі техніки або можуть бути сконструйовані середнім спеціалістом у даній галузі при використанні добре відомих способів. Дозування та моделі введення Згідно з даним винаходом одна доза ефективної кількості вакцини M.hyo, що вводиться поросятам віком приблизно від 3 до приблизно 10 днів, забезпечує ефективний імунітет проти подальшого введення M.h yo. Бажано, коли вакцина M.hyo вводиться поросятам у віці від приблизно 6 до приблизно 8 днів. Більш бажано, коли вакцина M.h yo вводиться поросятам у віці 7 днів. Кількість вакцини на основі бактерину M.h yo, що є ефективною при введенні однієї дози, містить від приблизно 1´106 до приблизно 5´1010 змінюючих забарвлення одиниць (CCU) на дозу. Бажано, коли вакцина на основі бактерину M.h yo, що забезпечує ефективний імунітет, в одній дозі містить приблизно від 1´108 до 5´1010 CCU/доза та більш бажано, приблизно від 5´108 до 5´1010 CCU/доза. Згідно з даним винаходом, коли вводиться бажаний бактериновий продукт но основі RESPISURE-1, кількість RESPISURE-1 на одну дозу введення складає від приблизно 0,5 до приблизно 3,0мл, бажано від приблизно 1,5 до приблизно 2,5мл, та більш бажано-приблизно 2мл. Кількість вакцини RESPISURE-1, яка є субодиничною вакциною, що містить один або декілька білків або поліпептидів чи імуногенних фрагментів таких білків або поліпептидів, ефективна у способі за даним винаходом, становить від приблизно 0,01мкг до приблизно 200мкг. Кількість вакцини RESPISURE-1, що представляє собою вакцину, яка містить один або більше генів або нуклеїнових кислот M.h yo (бажано ДНК), які кодують імуногенні білки або поліпептиди чи імуногенні фрагменти таких білків або поліпептидів, ефективна у способі за даним винаходом, складає від приблизно 0,1мкг до приблизно 200мг. У відповідності з даним винаходом введення може бути досягнуте за допомогою відомих способів, включаючи пероральне, інтраназальне, мукозальне, місцеве, трансдермальне та парентеральне (наприклад, внутрішньовенне, інтраперитонеальне, інтрадермальне, підшкірне або внутрішньом'язове). Введення можна проводити при використанні безголкових пристроїв. Введення можна проводити при використанні комбінації способів, наприклад, перше введення при використанні парентерального способу, а подальше введення при використанні мукозального способу. Бажаним способом введення є внутрішньом'язовий спосіб введення. Ефективні дози (імунізаційні кількості) вакцин за винаходом можуть також бути екстрапольовані з кривих залежності відповідь-доза, що одержані за допомогою модельних тестови х систем. Дані способи вакцинації забезпечують протективний імунітет як для серопозитивних на M.h yo поросят, так і для серонегативних на M.h yo поросят. Серопозитивні поросята означають таких поросят, які мають у сироватці антитіла проти M.hyo. Серонегативні поросята означають таких поросят, які не мають у сироватці здатних до виявлення рівнів антитіл проти M.hyo. Даний винахід далі ілюструється, але не обмежений, наступними прикладами. Приклад 1 Приготування бактерину Μ Використовували бінарний етиленімін (ВЕІ) для інактивації штаму NL1042 M.hyo. У кінці періоду росту рН культури доводили до 7,8±0,2, та рН підтримували у таких межах принаймні одну годину. У цей час простерілізований за допомогою фільтру водний розчин 2брометиламінгідроброміду (ΒΕΑ) додавали до заключної концентрації приблизно 4,0мМ. При наявності підвищених значень рН ΒΕΑ хімічно змінюється на ВЕІ. Культуру інкубували при темепаратурі 37±2°С при постійному перемішуванні протягом принаймні 24 годин. Через 24 години інкубації простерілізований за допомогою фільтру водний розчин тіосульфату натрію додавали до заключної концентрації приблизно 4мМ для нейтралізації надлишку ВЕІ. Культуру інкубували при температурі 37±2°С при постійному перемішуванні протягом 24 годин. Після інактивації, перед нейтралізацією за допомогою тіосульфату натрію, брали зразки та тестували їх на повну інактивацію. Свіже середовище, що містить 0,0026% феноловий червоний, інокулювали при використанні 5-20% інокулюму та інкубували при температурі 37±2°С протягом принаймні одного тижня перед перевіркою на зміну кольору, що є індікатором недостатності процесу інактивації. Серійні зразки тестували на стерильність у тіогліколатному бульоні при температурі 37±2°С, та триптиказному соєвому бульоні при кімнатній температурі. Інактивована культура може бути перенесена в стерильні колби та зберігалася при температурі 2-8°С перед створенням вакцини. Ефективність визначали у серологічному аналізі для кількісної оцінки антигену в остаточному контейнері. Ефективність вакцин, що використовуються у дослідженнях по вивченню ефективності, визначає мінімальну ефективність, що має бути присутня у вакцині на дату закінчення строку зберігання. Серійні зразки або зразки з заключного контейнеру кожного серійного продукту або першого субсерійного продукту тестували на M.h yo так, як описано нижче. Бактерии зберігали при темпераутрі -50°С у колбах на 100мл. Колби розморожували та субаліквоти 15мл зберігали при температурі 5 +/- 2°С до використання. Для визначення ефективності поєднаного серійного продукту зразки порівнювали зі стандартними та визначали RP одиниці для серійного продукту. Серійний або субсерійний продукт повинен бажано містити принаймні 6,33 RP на початку терміну зберігання та принаймні 5,06 RP упродовж періоду зберігання. RP означає відносну ефективність. RP може бути визначена шляхом порівняльної кількісної оцінки антигену у порівнянні зі стандартною вакциною. У цьому випадку стандартна вакцина має за визначенням RP=1,0. Однодозовий продукт за даним винаходом бажано має RP=6,33, що у 6,33 рази вище, ніж для стандартної. Як консервант додають мертіолят у заключній концентрації, що не перевищує 0,01% (об./ваг.). 10%-ний розчин етилендіамін тетраоцтової кислоти (ЕДТА, сіль динатрію або тетранатрію) додавали як консервант у кінцевій концентрації приблизно 0,07% (об./ваг). Приклад 2 Тварини Свиней у віці приблизно 1 тиждень відбирали для вакцинації. Серологічний статус на M.h yo оцінювали в аналізі ELISA. Поросят, які мали значення ELISA £0,50, вважали серологічно негативними на M.hyo. Поросят, які мали значення ELISA більше, ніж 0,50, вважали серологічно позитивними на M.hyo. Вакцини Для вакцинації поросят використовували бактерии M.h yo RESPISURE-1 (Pfizer Inc.). Ефективність вакцини визначали перед використанням шляхом порівняльної кількісної оцінки антигену у порівнянні зі стандартним бактерином M.hyo. Стандартна вакцина (RP=1,0) містила приблизно 8000 одиниць антигену (приблизно від 1 до 2´108 CCU життєздатних клітин, зібраних перед інактивацією) на дозу, визначених у твердофазному імуноаналізі, що визначає кількість антигену M.h yo у вакцині. Той самий рідинний ад'ювант (AMPHIGEN), що використовується у композиції RESPISURE-1, використовували як плацебо розчин (тобто без бактеріальних клітин). Інокулюм для контрольного зараження Інокулюм для контрольного зараження забезпечували як аліквоти 10мл легеневого гомогенату, замороженого при температурі -70°С, а потім ідентифікували як похідний штам M.hyo 11 (L1 36). Інокулюм розморожували, а потім розводили у бульоні для вирощування мікоплазм Фріса до досягнення розведення 1:25, потім витримували на льоду перед введенням. Кожне порося одержувало 5мл інтраназальної дози (по 2,5мл на кожну ніздрю) суспензії 1:25 у дні, що вказані у кожному з наступних прикладів. У кожний день контрольного зараження аліквоти легеневого інокулюму культивували для підтвердження відсутності бактеріальної контамінації. Другу аліквоту повторно титрували на кожний третій день. Представлені результати свідчать, що інокулюм містить приблизно І 106-107 змінюючих забарвлення одиниць (ССU)/мл M.h yo. Експериментальна процедура Поросят ідентифікували за допомогою вушни х бірок у той час, коли вони залишалися зі свиноматкою [День(-1)]. Поросят розподіляли на загони для обробки згідно з загальною рендомною блоковою моделлю. Поросят згруповували, грунтуючись на приплоді та загоні, в якому поросят утримували після відлучення від свиноматки. На День 0 поросят піддавали вакцинації або за допомогою 2мл внутрішньом'язової дози бактерину M.h yo RESPISURE-1 (Pfizer Inc.), або за допомогою 2мл внутрішньом'язової дози плацебо. Кожне порося отримувало 5мл інтраназальної дози 1:25 суспензії інокулюму для контрольного зараження у дні, вказані у кожному з наступних прикладів. Усіх поросят піддавали моніторингу та щоденно перевіряли на наявність клінічних ознак захворювання. У вказаний час після першого дня контрольного зараження усіх поросят забивали, а трепи піддавали розтину. Видаляли легені та проводили їх оцінку. Таке дослідження включало оцінку ступеня патології, асоційованого з респіраторним захворюванням, що спричинені мікоплазмами. Кожну долю легень перевіряли та описували пошкодження для оцінки проценту ураження кожної долі. Реєстрували ступінь грубих пошкоджень. Дані аналізу Ефективність оцінювали, грунтуючись на проценті пошкоджень легень, типових для інфекції M.hyo. Поросят у групі обробки (вакциновані) визначали як таких, що мають процент загального пошкодження легень, який був значно (PS0.05) меншим, ніж для поросят у групі плацебо. Процент загального пошкодження легень Грубий процент втягнення у процес кожної долі легень визначали шляхом оцінки при використанні наступних співвідношень індивідуальних долей легень до загальної маси легень: права краніальна 10%, ліва середня 10%, ліва каудальна 25%, права краніальна 10%, права середня 10%, права каудальна 25% та додаткова 10%. Представлені значення для долей легень потім підсумовували для кожної долі для одержання проценту загального пошкодження легень [Pointon та ін., 1992]. Приклад 3 Захист від контрольного зараження вірулентним штамом M.hyo оцінювали у поросят, які є серологічно позитивними на М.hуо, при використанні однієї дози бактерину М.h уо RESPISURE-1 (Pfizer Inc.), що вводили поросятам e віці від 3 до 8 днів. Проводили п'ять повторних аналізів ефективності у час або поблизу часу вакцинації. Відносну ефективність (RP) визначали шляхом відносної кількісної оцінки антигену у порівняні зі стандартною вакциною. Стандартна вакцина, що має RP=1,0, містила приблизно 8000 одиниць антигену M.h yo. RP, визначене з цих п'яти аналізів, складало 5,42, 3,96, 4,71, 5,49 та 4,36, відповідно. На День 0 поросят у групі обробки T02 (див. Таблицю 1 нижче) піддавали вакцинації за допомогою 2мл внутрішньом'язової дози бактерину M.hyo RESPISURE-1 (Pfizer Inc.). Поросят у гр упі Т01 піддавали вакцинації внутрішньом'язово 2мл розчину плацебо. Кожне порося отримувало 5мл інтраназальної дози 1:25 суспензії інокулюму для контрольного зараження у дні 178, 179 та 180. У кожний з трьох днів аліквоту матеріалу для контрольного зараження культивували під час інокуляції для підтвердження відсутності бактеріальної контамінації. Другу аліквоту повторно титр ували для підтвердження того, що контрольне зараження містить приблизно 107 CCU/мл M.hyo. Усіх поросят піддавали моніторингу та щоденно перевіряли ознаки клінічного захворювання. Через 30 днів після контрольного зараження усіх поросят забивали, а трупи піддавали розтину. Видаляли та проводили оцінку легень. Таке дослідження включало оцінку ступеня патології, асоційованої з респіраторним захворюванням, що спричинені мікоплазмами. Кожну легеневу долю перевіряли та описували пошкодження для оцінки проценту ураження кожної долі. Реєстрували ступінь грубих пошкоджень. Таблиця 1 Група обробки Сполука для вакцинації Т01 Т02 Плацебо Вакцина Число Вакцинація День 0 26 26 26 26 Контрольне: зараження День 1781 День 1791 День 1801 26 26 26 24а 22·3 22а 1 Вірулентний інокулюм M.h yo Поросят 71 та 73 видаляли з досліду перед контрольним зараженням, оскільки обидві тварини втратили свої вушні мітки, і таким чином не можна було встановити їх ідентичність 3 Порося 36 було знайдене померлим на День 178 з причини ускладнень, що викликані анестетиком. Порося 31 було знайдене померлим на День 179 з причини ускладнень, що викликані анестетиком. 2 Результати стосовно пошкоджень легень підсумовані в Таблиці 2. Результати показали, що вакциновані поросята (Т02) мали значно (Р=0,0385) нижче значення найменшого квадрату проценту пневмонічних пошкоджень легень, ніж у плацебо поросят (Т01) (2,0 проти 4,5%). Таблиця 2 Підсумування проценту загального пошкодження легень Обробка Т01 Т02 Сполука Плацебо Вакцина Кількість поросят 26 22 Значення найменшого квадрату 4,5а 2,0b Інтервал від 0 до 36,75 від 0 до 13,75 a,b Значення з різними індексами є статистично значущими (Р=0,0385) Результати показують, що однодозова вакцинація поросят у віці приблизно від одного тижня за допомогою бактерину M.h yo RESPISURE-1, індукує захист проти подальшого контрольного зараження за допомогою вірулентної M.h yo. Приклад 4 Захист проти контрольного зараження оцінювали у поросят, що є серологічно негативними на M.hyo, при використанні однієї дози бактерину M.hyo RESPISURE-1, що вводиться поросятам у віці від 3 до 8 днів. П'ять повторних аналізів ефективності вакцини проводили під час або приблизно у час вакцинації. RP визначали шляхом відносної кількісної оцінки антигену у порівнянні зі стандартною вакциною. Стандартна вакцина, що мала RP=1,0, містила приблизно 8000 одиниць антигену M.h yo. RP, одержані з цих трьох аналізів, складали 5,42, 3,96, 4,71, 5,49 та 4,36, відповідно. На День 0 поросят групи Т02 піддавали вакцинації за допомогою 2мл внутрішньом'язової дози бактерину M.hyo RESPISURE-1. Поросят групи Т01 піддавали вакцинації внутрішньом'язово за допомогою 2мл розчину плацебо. Кожне порося отримувало 5мл інтраназальної дози 1:25 суспензії інокулюму для контрольного зараження у Дні 173, 174 та 175. У кожний з трьох днів аліквоту матеріалу для контрольного зараження піддавали культивуванню під час інокуляції для підтвердження відсутності бактеріальної контамінації. Другу аліквоту повторно титрували для підтвердження того факту, що інокулюм для контрольного зараження містить приблизно 106 CCU/мл M.hyo. Усіх поросят піддавали моніторингу та щоденно перевіряли на наявність клінічних ознак захворювання. Через двадцять дев'ять днів після першого дня контрольного зараження усіх поросят забивали, а трепи піддавали розтину. Видаляли легені та проводили їх оцінку. Таке дослідження включало оцінку ступеня патології, асоційованої з респіраторним захворюванням, що спричинене мікоплазмами. Кожну легеневу долю перевіряли та описували пошкодження для оцінки проценту ураження кожної долі. Реєстрували ступінь грубих пошкоджень. Таблиця 3 підсумовує експериментальну модель. Таблиця 3 Обробка Група Т01 Т02 Вакцинація Сполука Плацебо Вакцина Кількість 26 26 Вакцинація День 0 26 26 Контрольне зараження День 1731 День 1741 День 1751 4 25* 24 24 233 205 20 Вірулентна М.h yo. 2 Порося 123 забивали на День 19 з причини хронічного септичного поліартриту 3 Порося 222 було знайдене померлим на День 40. Розтин виявив велику кількість перикардіальної рідини та геморагію епікарду. Порося 102 забивали на День 95 з причини ректального пролапсу. Порося 204 було знайдене померлим на День 145. Не проводили розтин з причини сильного розкладання трупу. 4 Порося 244 було знайдено померлим на День 174 після першого дня контрольного зараження з причини ускладнень, спричинених анестетиком. 5 NEEA для підрахунку для трьох поросят Результати стосовно ураження легень підсумовано у Таблиці 4. Загальний аналіз свідчить, що вакциновані поросята (Т02) мали значно (Р=0,0001) нижче процентне значення найменшого квадрату пневмонічного пошкодження легень, ніж поросята, яким вводили розчин плацебо (Т01) (0,3 проти 5,9%). Таблиця 4 Процентні значення загального пошкодження легень Обробка Т01 Т02 Сполука Плацебо Вакцина Процент легень з пошкодженнями Кількість поросят, що мають пошкодження легень Значення 24 5,9а 20 0,3b Інтервали від 0 до 36 від 0 до 6 аb Значення з різними індексами є статистично відмінними (Р=0,0001). Результати дослідження показують, що одна вакцинація поросят за допомогою бактерину M.h yo RESPISURE-1 індукує захист від подальшого експериментального контрольного зараження за допомогою вірулентної M.h yo. Приклад 5 Захист проти контрольного зараження вірулентною М.hyo оцінювали у поросят, що є серологічно негативними на М.hyo, при використанні однієї дози бактерину М.hyo RESPISURE-1 при введенні поросятам у віці від 3 до 8 днів. П'ять повторюваних аналізів на ефективність для бактерину проводили під час приблизно під час вакцинації. RP визначали кількісною оцінкою антигену у порівнянні зі стандартною вакциною. Стандартна вакцина, що має RP=1,0, містила приблизно 8000 одиниць антигену M.h yo. RP, отримані з цих п'яти аналізі, складали 5,42, 3,96, 4,71, 5,49 та 4,36 відповідно. На День 0 поросят групи обробки Т02 піддавали вакцинації внутрішньом'язово за допомогою 2мл розчину плацебо. Кожне порося отримувало 5мл інтраназальної дози (по 2,5мл на кожну ніздрю) 1:25 суспензії інокулюму для контрольного зараження у Дні 76, 77 та 78. У кожний з трьох днів аліквоту матеріалу для контрольного зараження культивували під час інокуляції для підтвердження того факту, що продукт для контрольного зараження містить приблизно 106 CCU/мл M.hyo. Усіх поросят піддавали моніторингу та щоденно перевіряли на наявність клінічних ознак захворювання. Через 29 днів після першого дня контрольного зараження усіх поросят забивали, а трупи піддавали розтину. Видаляли легені та проводили їх оцінку. Таке дослідження включало оцінку ступеня патології, асоційованої з респіраторним захворюванням, що спричинене M.hyo. Кожну легеневу долю перевіряли та описували пошкодження для оцінки проценту ураження кожної долі. Реєстрували ступінь консолідації. Таблиця 5 підсумовує експериментальну модель. Таблиця 5 Група обробки Т01 Т02 Сполука для вакцинації Плацебо Вакцина Число 26 26 Вакцинація День 0 26 26 Контрольне зараження День1761 День1771 День 1781 2 23 23 23 213 21 21 1 Вірулентний інокулюм M.h yo Поросята 237 та 239 виявилися позитивними у тесті на пневмонію, що спричинена M.h yo, на День 0. Цих поросят видаляли з досліду та забивали на День 14. Порося 220 було знайдено померлим на День 3, оскільки було задавлене свиноматкою. 3 Поросята 238, 240 та 277 виявилися позитивними у тесті на пневмонію, спричинену M.h yo на День 0. Цих поросят видаляли з досліду та забивали на День 14. Порося 280 забивали на День 7 з причини відмови від їжі. Порося 177 забивали на День 40 з причини хронічного синдрому виснаження. 2 Результати пошкодження легень підсумовані у Таблиці 6. Загальний аналіз свідчить, що вакциновані поросята (Т02) мали значно (Р=0,0001) нижчі значення найменших квадратів пневмонічного пошкодження легень, ніж плацебо-поросята (Т01) (0,5 проти 9,9%). Таблиця 6 Процент загального пошкодження легень. Процент легень з пошкодженням Обробка Т01 Т02 а,b Сполука Плацебо Вакцина Число поросят 23 21 Значення пошкодження легень 9,9а 0,5° Значення з різними індексами є статистично відмінними (Р=0,0001). Інтервали від 0 до 45 від 0 до 5