Спосіб посилення ампліфікації хордопоксвірусу

1. Спосіб посилення ампліфікації хордопоксвірусу, який відрізняється тим що вірус відтворюють у культуральному середовищі при температурі культивування, нижчій за 37 ºС, причому хордопоксвірус являє собою модифікований вірус коров’ячої віспи Анкара (МВА), переважно МВА-BN, депонований у ECACC за номером V00083008, або його похідну. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що поксвірус відтворюють у клітинах птахів. 3. Спосіб за п. 2, який відрізняється тим, що клітини птахів являють собою клітини-фібробласти курячих ембріонів. 4. Спосіб за будь-яким з пп. 1-3, який відрізняється тим, що хордопоксвірус відтворюють при температурі культивування від близько 26 °С до близько 36 °С. 5. Спосіб одержання хордопоксвірусу, який відрізняється тим, що згаданий хордопоксвірус відтворюють у фібробластах курячих ембріонів при температурі культивування від 26 °С до 32 °С. 6. Спосіб за п. 5, який відрізняється тим, що хордопоксвірус вибрано з групи, яка включає авіпоксвіруси та ортопоксвіруси. 7. Спосіб за п. 6, який відрізняється тим, що ортопоксвірус є вірусом коров’ячої віспи. 8. Спосіб за п. 7, який відрізняється тим, що вірус коров’ячої віспи вибирають зі штаму Elstree та модифікованого вірусу коров’ячої віспи Анкара (МВА), переважно МВА-BN, депонованого у ECACC за номером V00083008, або його похідної. 9. Спосіб за будь-яким з пп. 1-8, який відрізняється тим, що хордопоксвірус відтворюють при температурі культивування 10. Спосіб за будь-яким з пп. 1-9, який близько 30 °С. відрізняється тим, що відтворення вірусу відбувається протягом принаймні 24 годин. UA (21) 2004010355 (22) 02.07.2002 (24) 25.04.2008 (86) PCT/EP02/07280, 02.07.2002 (31) PA 2001 01122 (32) 18.07.2001 (33) DK (46) 25.04.2008, Бюл.№ 8, 2008 р. (72) ХАУЛІ ПОЛ, GB/AU, ХЕЛЛЕР КАРЛ, РЕТЕ ІНГМАР (73) БАВАРІАН НОРДІК А/С (56) US4567147, 28.01.1986 SLONIM D ET AL: "Influence of the incubation temperature on the dynamics of reproduction and plaque formation of three strains of Vaccinia virus in cell cultures." JOURNAL OF HYGIENE, EPIDEMIOLOGY, MICROBIOLOGY, AND IMMUNOLOGY. CZECHOSLOVAKIA 1972, vol. 16, no. 4, 1972, pages 473-479 SLONIM D ET AL: "REPRODUCTION IN CHICK CHORIO ALLANTOIC MEMBRANE AND LETHAL EFFECT IN CHICK EMBRYOS OF 3 STRAINS OF VACCINIA VIRUS IN RELATION TO THE INCUBATION TEMPERATURE" JOURNAL OF HYGIENE EPIDEMIOLOGY MICROBIOLOGY AND IMMUNOLOGY (PRAGUE), vol. 17, no. 1, 1973, pages 21-25 SLONIM D ET AL: "Relation of infectious and lethal activities of three strains of Vaccinia virus to the incubation temperature." JOURNAL OF HYGIENE, EPIDEMIOLOGY, MICROBIOLOGY, AND IMMUNOLOGY. CZECHOSLOVAKIA 1972, vol. 16, no. 4, 1972, pages 480-485 FUCHS N ET AL: "Virus isolation and titration at 33 degrees and 37 degrees C." MEDICAL MICROBIOLOGY AND IMMUNOLOGY. GERMANY, WEST 1975, vol. 161, no. 2, 1975, pages 123-126 MINGLE J A ET AL: "Maintenance of primary African green monkey kidney (pAGMK) and Vero cells at room temperature (25 degrees). A system for virus isolation in community practice." CANADIAN JOURNAL OF MICROBIOLOGY. CANADA MAR 1974, vol. 20, no. 3, March 1974 (1974-03), pages 391-397 2 (19) 1 3 82466 4 14. Спосіб за будь-яким з пп. 1-13, який 11. Спосіб за будь-яким з пп. 1-10, який відрізняється тим, що поксвірус не є відрізняється тим, що відтворення вірусу температурочутливим мутантним вірусом. відбувається протягом принаймні 2-3 днів. 15. Спосіб за будь-яким з пп. 1-14, який 12. Спосіб за будь-яким з пп. 1-11, який відрізняється тим, що поксвірус не є відрізняється тим, що хордопоксвірус є вірусом, температурно адаптованим вірусом. корисним як вакцина або вектор для генної терапії. 16. Спосіб за будь-яким з пп. 1-15, який 13. Спосіб за будь-яким з пп. 1-12, який відрізняється тим, що до культурального відрізняється тим, що він проводиться у середовища не додають ліпіди або сурфактанти. стаціонарних колбах. Даний винахід стосується способу розмноження поксвірусу, зокрема Chordopoxvirus, у якому поксвірус культивується за температури нижче 37°С. Спосіб забезпечує посилене відтворення вірусу за умов зниженої температури. Родина Poxviridae являє собою велику родину комплексних ДНК-вмісних вірусів, що реплікуються у цитоплазмі клітин хребетних та безхребетних. Родину Poxviridae можна поділити на підродини Chordopoxvirinae (поксвіруси хребетних) та Entomopoxvirinae (поксвіруси комах) [Fields Virology / під ред.: Fields, B.N., Knipe, D.M., Howley, P.M.; 3є вид. / ISBN 0-7817-0253-4 / див. зокрема частину 83]. Підродина Chordopoxvirinae включає численні поксвіруси тварин (класифіковані як різні роди), такі як поксвіруси верблюдів, поксвіруси овець, поксвіруси кіз або пташині поксвіруси, зокрема поксвірус диких птахів, а також поксвіруси, що мають особливе відношення до людей, такі як вірус віспи або вірус коров'ячої віспи. Поксвіруси, зокрема chordopoxvirinae, являють собою важливі патогени людей та тварин. Вакцинація проти поксвірусних інфекцій має довгу історію. Близько двох століть тому людям проводили профілактичну інокуляцію коров'ячим поксвірусом з метою імунізації проти віспи. Пізніше імунізацію проводили вірусом коров'ячої віспи. Однак, вакцинація проти віспи з застосуванням цього вірусу коров'ячої віспи несподівано призводила до важких ускладнень, таких як поствакцинальний енцефаліт, загальна коров'яча віспа або контактна інфекція. Пізніше Антон Маір розробив нову вакцину, яка не виявляла цих ускладнень. Поксвірусна вакцина складалася з поксвірусів модифікованого вірусу коров'ячої віспи Анкара (MBА) і використовувалася для вакцинації проти віспи у близько 150000 вакцинацій без виникнення будь-яких ускладнень, пов'язаних з вакцинацією. Навіть діти з імунологічною недостатністю не зазнавали значних побічних ефектів. МВА одержували шляхом мутації та відбору дикого вірусу коров'ячої віспи Анкара після 575 пасажів у культуральних фібробластах курячих ембріонів. Безпечність цього МВА відображають біологічні, хімічні та фізичні характеристики. МВА має зменшену молекулярну вагу, шість делецій у геномі, а також він дуже послаблений для клітин ссавців, тобто ДНК та білок синтезуються, але фактично вірусні частинки не продукуються. Вакцинація проти віспи була дуже вдалою. У 1979 році Всесвітня Організація Охорони Здоров'я проголосила про викорінення віспи. Відповідно, масова вакцинація дітей була припинена і лише працівники лабораторій та представники збройних сил деяких держав проходили вакцинацію. З викоріненням віспи найголовніша причина поксвірусних інфекцій у людей була усунена. Однак, деякі поксвіруси, які не є людськими, мають знижену специфічність до господаря, тобто можуть спричинити інфекцію не лише у їх типових господарів (наприклад, корови для коров'ячого поксвірусу), але й у інших тварин (наприклад, котів та собак). Люди також можуть заражатися таким чином. Оскільки частина популяції вже не імунна проти коров'ячої віспи, поксвірусні інфекції тваринних видів можуть бути небезпечними для них. Хатні тварини - головне джерело інфекції для людей. Відповідно, вакцинація хатніх тварин проти поксвірусів має велике значення. На додачу, поксвіруси являють собою важливі вектори для експресії чужорідних генів, наприклад для використання як вакцини або у генній терапії, тобто шляхом переносу послідовностей нуклеїнових кислот у клітини-мішені, де вони піддаються експресії. Враховуючи це, необхідний дієвий та недорогий спосіб продукування поксвірусів. Поксвіруси можуть ампліфікуватися у різноманітних типах клітин. Наприклад, chordopoxvirinae, зокрема МВА, ампліфікуються у клітинній культурі первинних або вторинних фібробластів курячих ембріонів (ФКЕ). Клітини одержують з ембріонів курячих яєць, які інкубували 10-12 днів. Клітини ембріонів після цього відокремлюють та очищують. Ці первинні клітини ФКЕ можна використовувати як безпосередньо, так і після одного пасажу як вторинні клітини ФКЕ. Надалі первинні або вторинні клітини ФКЕ інфікуються МВА. Для ампліфікації МВА інфіковані клітини інкубуються 23 дні за температури 37°С [див., наприклад, Meyer, Η. та ін. 1991; J. of General Virology 72, 1031-1038; Sutter та ін. 1994, Vaccine, т.12, №11, 1032-1040]. Хоча інші хордопоксвіруси ампліфікуються у різних типах клітин, така сама температура - 37°С вибирається і у інших випадках. Наприклад, вірус коров'ячої віспи, одержаний з АТСС (№ VR1354), який культивується у клітинах HeLa S3 (клітинах карциноми матки людини), також інкубують 3 дні при 37°С (Current protocols in molecular biology 1998, Частина 16, Розділ 16.16, John Wiley & Sons, Inc). Далі, МВА, адаптований для вирощування у клітинах Vero (клітини нирки мавпи) також ампліфікується при 37°С. Таким чином, незалежно 5 82466 6 підвищений вихід вірусних частинок на одну від клітин, що використовуються для ампліфікаціїї, інфіковану клітину. та незалежно від виду або штаму хордопоксвірусу Поставлена мета забезпечується способом ампліфікація проводиться за температури 37°С. одержання поксвірусів, зокрема хордопоксвірусів, Такий вибір температури добре узгоджується з у якому вірус-продукуючі клітини культивуються за загальним рівнем знань спеціалістів у даній галузі: температури нижче 37°С. практично всі поксвіруси, що ампліфікуються у Несподівано було виявлено, що спосіб згідно з лабораторіях, були отримані з теплокровних винаходом призводить до значного посилення тварин з температурою тіла приблизно 37°С. ампліфікації вірусу за зниженої температури Оскільки хордопоксвіруси адаптовані до росту у (нижче 37°С), що, в свою чергу, виражається у таких тваринах, вони адаптовані до росту за підвищеному виході вірусу по відношенню до температури 37°С, тобто вони мають кількості інфікованих клітин. Враховуючи це, для найефективніше ампліфікуватися за температури одержання тієї ж кількості вірусу необхідна менша 37°С. кількість клітин. Ця перевага набуває особливого З тих же причин ентомопоксвіруси значення в разі модифікованого вірусу коров'ячої культивують за температур, нижчих, ніж 37°С: віспи Анкара (МВА), оскільки одержання клітин температура тіла комах значно нижча за 37°С та ФКЕ, необхідних для ампліфікації МВА, складне та значним чином залежить від температури дороге. Далі, зниження температури інкубації оточуючого середовища. Таким чином, на дозволяє знизити енерговитрати протягом процесу противагу хордопоксвірусам, ентомопоксвіруси ампліфікації поксвірусу і, таким чином, знизити адаптовані до вирощування за нижчих вартість одержання вірусу. температур. [Патенти US 5721352 та US 5174993] Термін "поксвірус", що використовується у розкривають оптимальну температуру для росту даній заявці, стосується переважно поксвірусів ентомопоксвірусу виду Amsacta moorei підродини Chordopoxvirinae (поксвіруси хребетних) Entomopoxvirases (AmEPV), яка становить 28°С у [Fields Virology / під ред.: Fields, B.N., Knipe, D.M., лабораторних умовах. Однак, ці патенти не Howley, P.M.; 3є BHm.flSBN 0-7817-0253-4 / див. розкривають культивування хордопоксвірусів за зокрема частину 83]. Терміни "хордопоксвіруси", цих температурних умов. вакцин проти інших Далі, виробництво "Chordopoxvirinae" та "поксвіруси хребетних" вірусних інфекцій загалом проводиться за використовуються у даній заявці як такі, що взаємо температури 37°С. Лише деякі кореві вакцини заміняють один одного. Прийнятними виробляються за нижчої температури. У цьому хордопоксвірусами є поксвіруси родів випадку кореві вакцини, які зазвичай Orthopoxvirus, Parapoxviras, Avipoxvirus, виробляються за температури 37°С і які часто Capripoxvirus, Lepripoxviras, Sulpoxviras, спричиняють важкі побічні ефекти, послаблюються Molluscipoxviras та Yatapoxvirus. тривалим пасажуванням вірусу за температури Найприйнятнішими є поксвіруси родів 32°С. Після 85 пасажів штаму за температури Orthopoxvirus та втіленні поксвірус, що одержаний У кращому Avipoxviras. 32°С штам послаблюється, тобто хвороботворна способом згідно з даним винаходом, є здатність вірусу значно знижується [Plotkin, поксвірусом, зокрема хордопоксвірусом, що Orenstein: Vaccines, 3є видання, 230-232]. В корисний як вакцина або який може бути підсумку, віруси теплокровних тварин, і зокрема використаний як вектор для генної терапії з метою віруси коров'ячої віспи, очікувано найкраще введення потрібних генів до клітини-господаря. ампліфікуються за температури 37°С, оскільки їх Придатні вірусні штами добре відомі фахівцям у виявляють у тварин з такою температурою тіла, і даній галузі. Придатні штами можуть бути адаптація до нижчих температур досягається одержані, наприклад, з Американської Колекції лише після численних пасажів за вказаної нижчої Типів Культур (АКТК) або з Європейської Колекції температури. Далі, адаптація до нижчої Культур Тваринних Клітин (ЄККТК). температури пов'язана з послабленням і, таким Як вказано вище, найприйнятнішими чином, часто з послабленою репродуктивною поксвірусами для одержання згідно з даним здатністю вірусу. [Патент US 5616487] розкриває спосіб способом є авіпоксвіруси та ортопоксвіруси. вироблення стабілізованого вірусу, зокрема Прикладами ортопоксвірусів є віруси коров'ячої стабілізованого ретровірусу, шляхом віспи, такі як віруси штамів Elstree, Western культивування вірус-продукуючих клітин з Reserve, Wyeth, NYVAC, NYCBON, Paris, стабілізуючим агентом за температури нижче Copenhagen, більш прийнятні різноманітні штами 37°С. Як стабілізуючі агенти використовують ліпіди MBA, особливо MBA-BN, депонований у ЄККТК за або сурфактанти. Патент особливо вказує на номером V00083008, або його похідні. MBA-BN та використання Pluronic F-68 та Ліпідного його похідні детально описані у заявці Концентрату як стабілізуючих агентів. Вказано що [РСТ/ЕРО1/13628, яка називається "Варіант Ліпідний Концентрат містить холестерол, риб'ячий модифікованогодепонованого вірусу єАнкара"].що "Похідним" вірусу коров'ячої віспи вірус, жир, Pluronic F-68, d-альфа-токоферолу ацетат та виявляє по суті такі самі характеристики росту, Tween 80. В іншому втіленні [US 5616487] зокрема таку ж температурну залежність, як і розкриває спосіб культивування специфічних депонований штам, але може відрізнятися від ретровірус-продукуючих клітин за температури, нього принаймні однією частиною геному. нижчої за 37°С, у якому одержаний ретровірус Спосіб відповідно до даного винаходу може стабілізовано з використанням стабілізатора, застосовуватись до вірусів дикого типу, зазначеного вище. Об'єктом даного винаходу була розробка послаблених та рекомбінантних вірусів, способу одержання поксвірусів, зокрема відповідно. хордопоксвірусів, який забезпечував би 7 82466 8 одержання вірусу, може бути одне й те саме або "Послаблений вірус" - це вірус, що походить різне. Всі вони являють собою звичайні стандартні від патогенного вірусу, але після інфікування середовища, відомі фахівцям в даній галузі. За організму господаря виявляє знижену летальність необхідності можна додати антибіотики, додаткові або хвороботворність порівняно з неослабленим амінокислоти та/або ембріональну сироватку батьківським вірусом. Приклади послаблених теляти. поксвірусів відомі фахівцям в даній галузі. Відповідно до кращого втілення, середовище, Прикладом послабленого вірусу коров'ячої віспи є яке використовується у способі згідно з даним штам МВА, зокрема штам, депонований у ЄККТК винаходом, не містить ліпіди або сурфактанти для за номером V00083008 (дивись вище). стабілізації вірусной ліпідної оболонки. У ще Термін "рекомбінантний вірус" стосується кращому варіанті, середовище, яке будь-яких вірусів, що мають вбудований до використовується у способі відповідно до даного вірусного геному чужорідний ген, який не є винаходу, не містить жодного з наступних звичайною частиною вірусного геному. Чужорідний стабілізуючих агентів: Pluronic F-68, комбінація ген може бути терапевтичним геном, геном, який кодує пептид, що містить принаймні один епітоп, Pluronic F-68 та Tween 80Ô або Ліпідний який індукує імунну відповідь, касетою Концентрат хGibco/BRL, Gaithersburg, MD, каталог антизмістовної експресії або рибозимним геном. №21900-014ї, що містить холестерол, риб'ячий Способи створення рекомбінантних вірусів відомі жир, Pluronic F-68, d-альфа-токоферолу ацетат та фахівцям в даній галузі. Найприйнятнішим Tween 80. Фахівцям в даній галузі відомі клітини, які поксвірусним вектором є МВА, зокрема МВА 575 можна використовувати у способі згідно з даним та MBA-BN (дивись вище). відомо з рівня техніки, На противагу тому, що винаходом. Тип та особливості клітини несуттєві автори даного винаходу виявили, що з шести протягом всього періоду, коли клітина може бути температур між 26°С та 37°С поксвіруси, зокрема інфікована відповідним вірусом, та протягом хордопоксвіруси, ампліфікуються найменш періоду, коли віруси-нащадки одержані з ефективно за температури інкубації інфікованої клітини. Найприйнятніше складність (культивування) 37°С. Несподівано було виявлено, інфекції має бути нижчою за 1. що такий спосіб ампліфікації поксвірусів, зокрема Особливо прийнятними є клітини хребетних, хордопоксвірусів, призводить до підвищеного наприклад клітини ссавців або птахів. виходу вірусу, якщо вірус-продукуючі клітини Відповідно до кращого втілення, клітинами культивуються за температури нижче 37°С, краще хребетних, які можуть використовуватися у способі між 36,5°С та 26°С або між приблизно 26°С та згідно з даним винаходом для вірусів коров'ячої приблизно 36°С, ще краще між 28°С та 33°С, віспи, зокрема вірусів коров'ячої віспи штамів навіть ще краще між 28°С та 32°С, найкраще за Elstree та МВА, є фібробласти курячих ембріонів температури 30°С. Інший прийнятний температурний діапазон (ФКЕ). Було цілком несподіваним, що спосіб складає від 30°С до 36,5°С. Особливо гарні відповідно до даного винаходу може результати були одержані у піддіапазонах від 30°С здійснюватися на клітинах ФКЕ, оскільки курчата до 35°С, від 30°С до 33°С та від 30°С до 32°С. мають нормальну середню температуру тіла 41°С. Найприйнятніша температура становить 30°С. Таким чином, температури, що використовуються Термін "близько" стосовно значень згідно з даним винаходом, нижчі 37°С, краще між температури стосується переважно особливо 36,5°С та 26°С, ще краще між 28°С та 33°С, навіть зазначених температур та температур, що на ще краще між 28°С та 32°С, найкраще за 0,5°С вище або нижче особливо зазначених температури 30°С, настільки відрізняються від температур. Наприклад, температуру "близько нормальної температури тіла курчати, що може 30°С" слід розуміти як температуру в діапазоні від скластися враження, що ці клітини не можуть 29,5°С до 30,5°С. Більш загальними словами, у способі використовуватися для відтворення вірусу відповідно до даного винаходу відповідні коров'ячої віспи за таких температур. Такі самі поксвіруси одержуються шляхом культивування міркування мають місце у випадку температур в інфікованих клітин за температури, що нижча за діапазоні від 30°С до 36,5°С, від 30°С до 33°С, від температуру тіла тварин, включаючи людину, які є 30°С до 32°С та особливо за температури 30°С. природніми господарями відповідних поксвірусів. Далі, спосіб відповідно до даного винаходу Наприклад, природнім господарем вірусу найприйнятніше проводиться у стаціонарних коров'ячої віспи вважаються буйволи [Baxby, D.: колбах. Jenner's smallpox vaccine: the riddle of vaccinia vims Наступною перевагою є те, що спосіб веде до and its origin. London: Heinemann Educational; підвищеного виходу "нормальних" вірусних 1981:1-214]. Культивування вірус-продукуючих клітин штамів, що не потребує температуро-чутливої краще проводити принаймні 24 години, ще краще мутації або довгого і ускладненого адаптування до принаймні 2 дні або принаймні 3 дні. Зазвичай зниженої температури. Іншими словами, вільні від вірусу клітини вирощують за непотрібно використовувати адаптовані до температури 37°С, доки не буде одержана зниженої температури або температуро-чутливі достатня кількість клітин. Потім культуру клітин мутанти для досягнення вищого виходу вірусних інокулюють вірусом і температуру знижують до частинок за нижчої температури порівняно з 37°С. вищезазначених значень. В альтернативному Відомо, що адаптовані до зниженої втіленні культуру клітин вносять до середовища з температури віруси або температуро-чутливі вищезазначеною температурою до того, як вона мутанти краще ампліфікуються за нижчої інокульована вірусом. Середовище, яке використовується для температуриж однак, такі штами зазвичай мають культивування клітин до інфікування та для меншу репродуктивну здатність, ніж неадаптовані 9 82466 10 вищезазначеного способу, особливістю якого є або нетемпературо-чутливі мутанти. Таким чином, те, що вірус є вірусом коров'ячої віспи; велика перевага способу згідно з винаходом вищезазначеного способу, особливістю якого є прихована у тому факті, що у способі може те, що вірус є модифікованим вірусом коров'ячої застосовуватися будь-який вид нормального, віспи Анкара (МВА), краще MBA-BN, депонованим високорепродуктивного вірусного штаму. у ЄККТК за номером V00083008, або його Вірус, одержаний відповідно до даного похідним; винаходу, найприйнятніше використовувати як вищезазначеного способу, особливістю якого є вакцину або для приготування композиції, що те, що він проводиться у стаціонарних колбах; використовується у протоколі генної терапії. Таке вищезазначеного способу, особливістю якого є використання поксвірусу добре відоме з рівня те, що поксвірус не є температуро-чутливим техніки. Фіг.1. мутантним вірусом; На Фіг.1 наведені поодинокі значення з вищезазначеного способу, особливістю якого є експерименту 1, виконаного двічі (представлені як те, що поксвірус не є вірусом, адаптованим до точки). Колонки показують середні значення. Для зниженої температури; порівняння з поодинокими значеннями див. табл.1. вищезазначеного способу, особливістю якого є Фіг.2. те, що вірус відтворюється у клітинахНа Фіг.2 наведені поодинокі значення з фібробластах курячих ембріонів; експерименту 2, виконаного двічі (представлені як вірусу, одержаного відповідно до будь-якого з точки). Колонки показують середні значення. Для вищезазначених способів; порівняння з поодинокими значеннями див. табл.2. композиції, що містить вірус, вказаний вище; Фіг.3. вакцини, що містить вірус, вказаний вище; На Фіг.3 точки вказують на поодинокі значення композиції для використання у генній терапії, з експериментів з чотирма різними температурами яка включає вірусний геном вірусу, одержаного (експеримент 3), виконаних двічі. Колонки відповідно до будь-якого з вищезазначених показують середні значення. Для порівняння з способів; поодинокими значеннями див. табл.3. використання вірусу, одержаного відповідно Фіг.4. до будь-якого з вищезазначених способів, як На Фіг.4 точки вказують на поодинокі значення вакцини; з експериментів з чотирма різними температурами використання вірусу, одержаного відповідно (експеримент 4), виконаних двічі. Колонки до будь-якого з вищезазначених способів, у генній показують середні значення. Для порівняння з терапії. поодинокими значеннями див. табл.4. Приклади Фіг.5. Нижченаведені приклади подані з метою На Фіг.5 колонки представляють середні додатково проілюструвати винахід. значення експериментів, виконаних тричі за Приклад 1: Вплив температури на температури 30°С та 37°С. Для порівняння з розмноження MBA поодинокими значеннями див. табл.5. Умови культивування клітин Даний винахід стосується наступних об'єктів: Первинні клітини ФКЕ висівали у стаціонарні способу одержання поксвірусу, зокрема колби з густиною посіву клітин 2*107 клітин хордопоксвірусу, особливістю якого є те, що вірус ФКЕ/185см2. Клітини висівалися у VP-SFM+4мМ Lвідтворюється за температури культивування глутаміну та 1% антибіотиків/антимікотиків. На нижче 37°С; четвертий день після посіву густина клітин була вищезазначеного способу, особливістю якого є визначена як 5*107 клітин ФКЕ/185см2. Клітини те, що вірус відтворюється за температури інфікували MBA-BN (депонованого у ЄККТК за культивування від близько 26°С до близько 36°С; номером V00083008) в дозі 0,1ТСID50/клітина, вищезазначеного способу, особливістю якого є використовуючи RPMI w/o FCS. Інфікування, після те, що вірус відтворюється за температури якого відбувалося інкубування протягом 72 годин, культивування від близько 28°С до близько 33°С; проводилося за температури 30°С та 37°С (у вищезазначеного способу, особливістю якого є експериментах 1 та 2 з двома різними те, що вірус відтворюється за температури препаратами ФКЕ), за температури 30, 33, 35 та культивування від близько 30°С до близько 33°С; 37°С (експеримент 3) та 26, 28, 30 та 33°С вищезазначеного способу, особливістю якого є (експеримент 4). Експерименти проводилися двічі те, що вірус відтворюється за температури для кожної температури. Реплікація вірусу культивування близько 30°С; припинялася шляхом перенесення клітин до вищезазначеного способу, особливістю якого є середовища і заморожування середовища разом з те, що відтворення вірусу відбувається протягом клітинами при -20°С. Таким чином суміш принаймні 24 годин; заморожували/відтаювали ще двічі для вищезазначеного способу, особливістю якого є механічного вивільнення вірусу з клітин. Для те, що відтворення вірусу відбувається протягом експериментів з 4 різними температурами принаймні 2-3 днів; зараження реплікація вірусу припинялася вищезазначеного способу, особливістю якого є заморожуванням стаціонарних колб при -20°С. те, що поксвірус є вірусом, корисним як вакцина Таким чином суміш заморожували/відтаювали ще або вектор для генної терапії; тричі для механічного вивільнення вірусу з клітин. Титри вірусу з кожної з стаціонарних колб вищезазначеного способу, особливістю якого є визначали із застосуванням імуногістохімічного те, що поксвірус вибрано з групи, яка включає аналізу. Інфіковані клітини забарвлювали авіпоксвіруси та ортопоксвіруси; антитілами, специфічними до вірусу коров'ячої 11 82466 12 лами, специфічними до вірусу коров'ячої віспи. відрізнялися більше, ніж на ±0,5 log від загального Після цього додавали HRP-зв'язані антитіла проти середнього. вірусу коров'ячої віспи. Після додавання субстрату Результати інфіковані клітини набували білого або Враховуючи можливі варіації росту первинних коричневого забарвлення. Результати аналізу клітин ФКЕ, експерименти проводилися з двома оцінювали з використанням формули Spearman та різними клітинними препаратами для порівняння Kaerber для визначення ТСID50/мл (інфікуюча доза температур зараження 30°С та 37°С. Результати культури тканин). Експерименти були проведені двох незалежних експериментів з зараження двічі. Як критерій прийнятності результатів наведені у таблицях 1-2 та на Фіг.1-2. титрування використовували стандартний MBA-BN Результати експериментів 1 та 2 вказують на з відомим титром для внутрішнього контролю значне підвищення виходу вірусу за температури кожного експеримента з титрування. Результати 30°С порівняно з 37°С. Було досягнуте підвищення експериментів приймалися до уваги лише в тому на 0,5 log у експерименті 1 та близько 0,7 log у разі, якщо значення стандарту MBA-BN не експерименті 2. Дані перших двох експериментів є багатообіцяючими в світлі того, що підвищення виходу МВА може бути досягнуто зниженням температури інкубації після зараження. Таким чином, було вирішено продовжувати експерименти та перевірити інші температури з метою знайти оптимальну температуру зараження. Використовувалися температури 30, 33, 35 та 37°С. Результати цього експерименту наведені у табл.3 та на Фіг.3. Порівняння виходу за температури 37°С та за нижчих температур зараження (35, 33, 30°С) показало очевидне підвищення за нижчих температур. Найкращий титр вірусу [ТСID50/мл] був одержаний в цьому експерименті за температури зараження 30°С, причому він був на 0,8 log вищий за одержаний за температури 37°С. У наступному експерименті у стаціонарних колбах були перевірені температури, навіть нижчі за 30°С, з метою перевірки, чи справді температура 30°С є оптимальною для розмноження МВА у клітинах ФКЕ. Таким чином були перевірені температури 26, 28, 30 та 33°С. Результати цього експерименту наведені у табл.4 та на Фіг.4. Найвищий вихід в цьому експерименті спостерігався за температури інкубації після зараження 30°С. Порівнюючи дані попереднього (4 температури між 30 та 37°С) та даного експерименту, було виявлено, що 30°С є оптимальною температурою інкубації після зараження для розмноження МВА у клітинах ФКЕ у стаціонарних колбах. При аналізі вірусних титрів окремих температур з цих двох експериментів, очевидно, що температура інкубації 37°С забезпечує найнижчий вихід вірусу з-поміж 6 досліджених. Згідно з дослідженнями, виходи вірусу при досліджених температурах розташовані наступним чином: 30°С>33°С/28°С>35°С/26°С>37°С. Приклад 2: Вплив температури на розмноження вірусу коров'ячої віспи Elstree В іншій серії експериментів вірус коров'ячої віспи штаму Elstree також перевірявся щодо температурної залежності. МВА та Elstree розмножувалися у клітинах ФКЕ. Для експерименту первинні клітини ФКЕ висівали у стаціонарні колби з густиною посіву клітин 2*107 клітин ФКЕ/175см2. Клітини висівалися у культуральне середовище+4мМ L-глутаміну та 1% антибіотиків/антимікотиків. На четвертий день після посіву густина клітин була визначена як 5*107 клітин ФКЕ/175см2. Клітини інфікували MBA-BN та Elstree в дозі 0,1 ТСID50/клітина, використовуючи RPMI w/o FCS. Інфікування, після якого відбувалося інкубування протягом 72 годин, проводилося за температури 30°С та 37°С. Реплікацію вірусу припиняли заморожуванням стаціонарних колб за температури -20°С. Цю суміш заморожували/відтаювали тричі для механічного вивільнення вірусу з клітин. Титр вірусу з кожної стаціонарної колби визначали титруванням відповідно до SOP/MVA/04. Як критерій прийнятності результатів титрування використовували стандартний МВА F6 з відомим титром для внутрішнього контролю кожного експеримента з титрування. Результати експериментів приймалися до уваги лише в тому разі, якщо значення стандарту MBAF6 не відрізнялися більше, ніж на ±0,5 log. Результати експериментів зараження наведені у таблиці 5 та на Фіг.5. Результати експериментів з MBA-BN вказзують на значне підвищення виходу вірусу за температури 30°С порівняно з 37°С (0,667 log). У експерименті з Elstree було досягнуте підвищення на 1,125 log за температури 30°С порівняно з 37°С. 15 Комп’ютерна верстка О. Гапоненко 82466 Підписне 16 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601