Олігонуклеотид для ампліфікації послідовностей нуклеїнових кислот, спосіб ампліфікації цільової послідовності нуклеїнової кислоти, набір для здійснення реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти

1 Олігонуклеотид для ампліфікації послідовностей нуклеїнових кислот, який має загальну структуру R або R Де 51 - перша ПОСЛІДОВНІСТЬ нуклеотидів довжиною, приблизно, від 5 до 50 нуклеотидів, 52 - друга ПОСЛІДОВНІСТЬ довжиною від одного до трьох нуклеотидів, Nu - нуклеотид, до складу якого входить пуринова або піримідинова основа, яка включає в себе екзоциклічний амін, R - модифікаторна група, яка ковалентно зв'язана з Nu через екзоциклічний амін і має структуру R н де Ri та R2, незалежно, - водень, С-і-С-ю алкільна група, алкоксильна група, фенільна група, феноксильна група, заміщена фенільна група, нафтильна група або заміщена нафтильна група 2 Олігонуклеотид за п 1, де R-2-нафтилметильна група, бензильна група або заміщена бензильна група 3 Олігонуклеотид за п 1 або за п 2, де R - заміщена бензильна група, яка має структуру R3 - С-і-Сб розгалужена або лінійна алкільна група, метоксильна група або нітрогрупа 4 Олігонуклеотид за п 3, де R3 - С1-С4 розгалужена або лінійна алкільна група, метоксильна група або нітрогрупа 5 Олігонуклеотид за п 3 або п 4, де R3, приєднується у пара-позицм 6 Олігонуклеотид за будь-яким з пп 1 - 5, де Nu — аденозин 7 Олігонуклеотид за будь-яким з пп 1 - 6, де R вибирають з групи, яка включає в себе бензил, р метилбензил, р -трет-бути л бензил, рметоксибензил, О -нітробензил та 2-нафтилметил 8 Спосіб ампліфікації цільової ПОСЛІДОВНОСТІ нуклеїнової кислоти, який включає здійснення реакції ампліфікації з використанням щонайменше одного олігонуклеотиду за будь-яким з пп 1-7 9 Спосіб за п 8, де згаданий спосіб є полімеразно-ланцюговою реакцією 10 Набір для здійснення реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти, який включає в себе олігонуклеотид за будь-яким з пп 1-7 О со 00 49843 Цей винахід має відношення до молекулярної біологи та хімії нуклеїнових кислот, зокрема, він має відношення до способів та реактивів для поліпшення виходу реакцій ампліфікації нуклеїнових кислот Цей винахід, таким чином, може бути використоно у будь-якій галузі, у якій використовують ампліфікацію нуклеїнових кислот Винахід полімеразно-ланцюгової реакції (PCR) зробив можливим ампліфікацію послідовностей нуклеїнової кислоти in vitro, PCR описано у патентах США №№ 4683195, 4683202 та 4965188, Сайкі (Saiki) та ІНШІ, Science 230 1350-1354, Маліс (Mulhs) та ІНШІ, 1986, Cold Springs Harbor Symp Quant Biol 51 263-273, та Маліс і Фалуна (Failona), 1987, Methods Enzymol 155 335-350 Розвиток та застосування PCR широко описані у літературі Наприклад, цілий ряд питань, пов'язаних з PCR, обговорюють у "PCR Technologyprinciples and applications for DNA amplification, (видавець ГА Ерліх (НА Erhch) Stockton press, Нью-Йорк, PCR Protocols Agmde to methods and applications, 1990 (видавець M A IHHIC (M A Inms) та ІНШІ), Academic Press, Сан Дієго, та PCR Strategies, 1995 (видавець MA Інніс та ІНШІ), Academic Press, Сан Дієго Продавці, наприклад, компанія Perkm Elmer (Норфолк, шт Конектикут), продають реактиви для PCRTa публікують протоколи PCR З часу появи оригінальних публікацій відносно ампліфікації нуклеїнових кислот було описано різні способи ампліфікації нуклеїнових кислот, які базуються на використанні праимерів, у тому числі, але не обмежуючись, лігазно-ланцюгова реакція (LCR, By (Wu) та Уоллес (Wallace), 1989, Genomics 4 560-569 та Берані (Barany) 1991, Proc Natl Acad Sei USA 88 189-193), полімеразно-лігазноланцюгова реакція (Берані, 1991, PCR Methods and Apphc 1 5-16), Gar-LCR (публікація заявки PCT № WO 90/01069), Repair Cham Reaction (публікація заявки на Європатент № 43918 2А2), 3SR (Кво (Kwoh) та ІНШІ, 1989, Proc Natl Acad Sei USA 86 1173-1177, Гвателлі (Guatelh) та ІНШІ, 1990, Proc Natl Acad Sei USA 87 1874-1878, публікація заявки PCT № WO 92/0880A) та NASBA (патент США № 5130238) Оглядову статтю щодо систем ампліфікації, дивись Абрамсон (Abramson) та Маєрс (Myers), 1993, Current Opinion in Biotechnology 4 41-47 Специфічність реакцій ампліфікації на основі праимерів залежить від специфічності гібридизації праимерів При підвищених температурах, які використовують при типовій ампліфікації, праймери гібридизуються лише до передбачуваної цільової ПОСЛІДОВНОСТІ Ампліфікаційні реакційні суміші, однак, збираються, як правило, при кімнатній температурі, тобто значно нижче температури, необхідної для забезпечення специфічності гібридизації праймеру За таких менш жорстких умов праймери можуть неспецифічне зв'язуватись з іншими лише частково комплементарними послідовностями нуклеїнових кислот або з іншими праймерами та ініціювати синтез небажаних продуктів подовження, які можуть бути ампліфіковані разом з цільовою ПОСЛІДОВНІСТЮ Ампліфікація неспецифічних продуктів подовження праймеру може конкурувати з ампліфікацією необхідних цільових послідовностей і може значно знижувати ефективність ампліфікації необхідної ПОСЛІДОВНОСТІ Одним з типів неспецифічного продукту ампліфікації, який часто спостерігається, є незалежний від матриці артефакт реакцій ампліфікації, який називають "праймером-димером" Праймером-димером є двонитковий фрагмент, довжина якого, у типовому випадку, майже дорівнює сумі довжини двох праимерів, і який з'являється тоді, коли один з праимерів подовжує другий Одержаний конкатенат утворює небажану матрицю, яка, завдяки своїй короткій довжині, ефективно ампліф і кується Неспецифічна ампліфікація може бути зменшена шляхом зменшення утворення продуктів подовження праимерів до початку реакції За одним зі способів, який називають протоколом "гарячого запуску", один або більше критичних реактивів вводяться до реакційної суміші тільки тоді, коли температура підвищиться до рівня, достатнього для забезпечення необхідної специфічності гібридизації Завдяки цьому, реакційна суміш не може підтримувати подовження праймеру під час, коли умови проходження реакції не забезпечують специфічної гібридизації праймеру Ручні способи гарячого запуску, за якими реакційні пробірки відкривають після початкового етапу високотемпературної інкубації і додають бракуючі реактиви, є трудомісткими і підвищують ризик контамшування реакційної суміші У альтернативному варіанті, термочутливі матеріали, наприклад, віск, можна використовувати для відокремлення або видалення компонентів реакції, як описано у патенті США № 5411876 (Чу (Chou) та ІНШІ) 1992, Nucl Acids Res 20(7) 1717-1723 За цими способами, термочутливі матеріали розтоплюються під час високотемпературної інкубації, яка попереджає проведення реакції, завдяки чому реагенти змішуються Наступний спосіб зменшення утворення продуктів подовження праймеру перед початком реакції полягає на термооборотному інгібуванні ДНКполімерази за допомогою ДНКполімеразаспецифічних антитіл, як описано у патенті США № 5338671 Антитіла інкубують з ДНКполімеразою у буфері при кімнатній температурі перед збиранням реакційної суміші для забезпечення утворення комплексу антитіло-ДНКполімераза Антитілоопосередковане інгібування активності ДНК-полімерази шактивується високотемпературним інкубуванням, яке попереджає реакцію Недолік цього способу криється у тому, що продукування антитіл, специфічних до ДНКполімерази, є дорогим та трудомістким, особливо у великих кількостях Крім того, додавання антитіл до реакційної суміші може потребувати перепланування реакції ампліфікації Утворення продуктів подовження до початку реакції може також інгібуватись додаванням до реакційної суміші однониткового зв'язування білку, який нековалентно зв'язується з праймерами теплооборотним способом та інгібує подовження праймеру запобіганням гібридизації Неспецифічна ампліфікація може також бути зменшена ферментативним розкладом продуктів подовження, які утворились до початку реакції, за 49843 допомогою способів, які описано у патенті США № 5418149 Розклад ново синтезованих продуктів подовження досягається шляхом включення до реакційної суміші дезоксиуридин-5'-трифосфату та урацилглікозидази з інкубуванням реакційної суміші при 45 - 60°С перед здійсненням реакції ампліфікації Подовження праймеру веде до утворення ДНК, яка вміщує урацил, яка розкладається урацилглікозидазою за умов, які попереджають ампліфікацію Недолік цього способу криється у тому, що розклад продукту подовження конкурує з утворенням продукту подовження і видалення неспецифічного продукту подовження праймеру, скоріш за все буде менш повним Перевагою цього способу є те, що ДНК, яка вміщує урацил, введена до реакційної суміші, як контамшант з попередньої реакції, також розкладається і, таким чином, спосіб також послаблює проблему контамшування PCR підсиленою нуклеїновою кислотою з попередніх реакцій Звичайні способи молекулярної біологи та хіми нуклеїнових кислот, які знаходяться у межах можливостей цієї галузі, у повному обсязі роз'яснено у літературі Дивись, наприклад, Сембрук (Sambrook) та ІНШІ, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк, Ohgonucleotide Synthesis (M Дж Гейт (MJ Gait), видавець, 1984), Nucleic Acid Hybridization (БД Гейме (В D Harnes) та С Дж Хігпнз (S J Higgms), та серію Methods in Enzymology (Academic Press, Inc) Цей винахід надає ковалентно модифіковані олігонуклеотидні праимери для ампліфікації послідовностей нуклеїнової кислоти in vitro Наслідком застосування модифікованих праймерів за цим винаходом є зменшення неспецифічної ампліфікації, особливо, утворення праймеру-димеру та/або супровідне підвищення виходу передбачуваної цільової матриці відносно ампліфікації, яка здійснюється з застосуванням немодифікованих праймерів За одним з аспектів цей винахід має відношення до олігонуклеотидного праймеру для ампліфікації ПОСЛІДОВНОСТІ нуклеїнової кислоти загальної структури R R o r де Si - перша ПОСЛІДОВНІСТЬ нуклеотидів довжиною, приблизно, від 5 до 50 нуклеотидів, S2 - друга ПОСЛІДОВНІСТЬ довжиною від одного до трьох нуклеотидів, N - нуклеотид, до складу якого входить пуринова або піримідинова основа, до складу якої входить екзоциклічний амін, R — модифікаторна група, де R ковалентне пов'язана з N через екзоциклічний амін і де R має структуру Н 2 , де Ri та F?2, незалежно, - водень, С-і-С-ю алкі льна група, алкоксильна група, фенільна група, феноксильна група, заміщена фенільна група, нафтильна група або заміщена нафтильна група АЛКІЛЬНІ групи можуть бути розгалуженими або нерозгалуженими У переважному варіанті втілення, якщо N - модифікований звичайний нуклеотид, у такому разі, N - модифікований аденозид, цитодин або гуанозин, а модифікаторна складова ковалентно зв'язана з екзоциклічним аміном аденшової, гуаншової або цитозинової основи У більш переважному варіанті втілення, N -модифікований аденозин У переважному варіанті втілення, R - 2нафтилметильна група, бензильна група або заміщена бензильна група Переважні заміщені бензильні групи мають таку структуру де R3 - С-і-Сб розгалужена або лінійна алкільна група, більш переважно, С1-С4 розгалужена або лінійна алкільна група, метоксильна група або нітрогрупа У переважному варіанті, R3 приєднується у пара-позицп У більш переважному варіанті втілення, R бензильна, р-метилбензильна, р-третбутилбензильна, р-метоксибензильна або 2нафтилметильна група За іншим аспектом цей винахід має відношення до ампліфікаційних праймерів, які модифікуються фотолабільним ковалентним приєднанням модифікаторної групи, наслідком чого є часткове або повне інгібування подовження праймеру Фотолабільний модифікатор може бути зв'язаним або з ендоциклічним аміном як, наприклад, у модифікованих нуклеотидів, опис яких наведено перед тим, або з атомом у КІЛЬЦІ За одним з варіантів втілення, щонайменше, одна нітробензильна група приєднана до екзоциклічного аміну аденшової, гуаншової або цитозинової основи з кінцевого нуклеотвду Іншим аспектом цього винаходу є пара або набір праймерів, де щонайменше, один з праймерів модифіковано, як описано перед тим У переважному варіанті втілення, обидва члени пари праймерів або усі члени набору праймерів модифіковані Інший аспект цього винаходу має відношення до способів ампліфікації нуклеїнової кислоти, які включають здійснення реакції ампліфікації з застосуванням модифікованих праймерів за цим винаходом Інший аспект цього винаходу має відношення до способів ампліфікації цільової нуклеїнової кислоти, які включають здійснення реакції ампліфікації з застосуванням фотолабільних модифікованих праймерів за цим винаходом, де реакційну суміш опромінюють світлом, достатнім для видалення модифікаторної групи та яке дозволяє утворення продуктів подовження праймерів За одним з варіантів втілення цього винаходу, опромінення здійснюють, як окремий етап перед початком реакції ампліфікації, однак, після того, як реакційну суміш було нагріто до температури, яка перевищує, при 49843 близно, 50°С За іншими варіантами втілення, етап опромінювання поєднують з попереднім етапом процесу ампліфікації, наприклад, етапом оборотної транскрипції у реакції ампліфікації РНК або етапом початкової денатурації у реакції ампліфікації ДНК Інший аспект цього винаходу має відношення до наборів для ампліфікації послідовностей нуклеїнової кислоти in vitro, до складу яких входить пара праймерів, з-посеред яких, щонайменше, один праймер модифіковано, як описано перед тим До наборів за цим винаходом також може входити один або більше ампліфікаційних реагентів, наприклад, ДНК-полімераза або ДНК-лігаза, нуклеозидтрифосфатаза та ВІДПОВІДНІ буфери Короткий опис малюнків На фігурі 1 показано результати ампліфікації РНК В1Л-1, здійсненої за допомогою бензилуваних праймерів, як описано у прикладі 5 На фігурі 2 показано результати ампліфікації РНК цитомегаловірусу людини (HCV), здійсненої за допомогою бензилуваних праймерів, як описано у прикладі 6 На фігурі 3 показано результати ампліфікації РНК HCV, здійсненої за допомогою праймерів, модифікованих за допомогою однієї з трьох модифікаторних груп, як описано у прикладі 7 На фігурі 4 показано результати ампліфікації РНК HCV, здійсненої за допомогою фотолабільних модифікованих праймерів, як описано у прикладі 8 На фігурі 5 показано результати ампліфікації ДНК мікобактерій, здійсненої за допомогою праймерів, модифікованих бензильною групою, та праймерів, модифікованих р-третбутилбензильною групою, як описано у прикладі 10 На фігурі 6 показано загальну схему реакції, придатну для синтезу бензил- або заміщеної бензил-модифікованої скляної підложки з контрольованим розміром пор (dACPG) Для надання допомоги у розумінні цього винаходу, далі наведено визначення декількох термінів Терміни "нуклеїнова кислота" та "олігонуютеотид" означають полідеоксирибонуклеотиди (до складу яких входить 2-деокси-О-рибоза), полірибонуклеотиди (до складу яких входить D-рибоза) та полінуклеотид будь-якого іншого типу, який є Nглікозидом пуринової або піромідинової основи або модифікованою пуриновою або піримідиновою основою Різниця у ДОВЖИНІ МІЖ термінами "нуклеїнова кислота" та "олігонуютеотид" не береться до уваги і ці терміни будуть використовуватись взаємозамінне Ці терміни означають лише первинну структуру молекули Ці терміни означають лише первинну структуру молекули Таким чином, до цих термінів належать дво- або однониткові ДНК, а також дво- або однониткові РНК Термін "звичайний", у відношенні до основ нуклеїнової кислоти, нуклеозидів або нуклеотидів, означає ті з них, які зустрічаються природно у полінуклеотид ах, опис яких наводиться До чотирьох звичайних (які також називають чоловічими) дезоксирибонуклеотидів ДНК належать пуринові основи аденін та гуанін та піримідинові основи цитозин 8 та тимін До чотирьох звичайних рибонуклеотидів РНК належать пуринові основи аденін та гуанін та піримідинові основи цитозин та урацил На додаток до вищезгаданих звичайних основ, до складу деяких нуклеїнових кислот у незначних кількостях входить ряд інших пуринових або піримідинових похідних, які називають екзотичними або мінорними основами Термін "незвичайні", який використовують у цьому описі, у відношенні до основ нуклеїнової кислоти, нуклеозидів або нуклеотидів означає екзотичні або мінорні основи нуклеїнової кислоти, нуклеозиди або нуклеотиди та модифікації, ПОХІДНІ або аналоги звичайних основ, нуклеозидів або нуклеотидів, і включає синтетичні нуклеотиди, які мають модифіковані основні складові та/або модифіковані цукрові складові (дивись Protocols for Ohgonucleotide Conjugates, Methods in Molecular Biology, том 26 (видавець Судхір Агравал (Sudhir Agrawal), Humana Press, Тотова, шт Нью-Джерсі (1994), та Ohgoiuicleotides and Analogues, A Practical Approach (видавець Фріц Екштейн (Fritz Eckstein), IRL Press, Oxford University Press, Оксфорд) Олігонуклеотиди можна виготовити будь-яким придатним способом, у тому числі, наприклад, тонуванням або рестрикцією ВІДПОВІДНИХ послідовностей та прямим ХІМІЧНИМ синтезом за допомогою, наприклад, такого способу, як фосфотриефірний спосіб Наранга (Narang) та ІНШІ, 1979, Meth Enzymol 68 90-99, фосфодіефірний спосіб Брауна (Brown) та інших, 1979, Meth Enzymol 68 109-151, діетилфосфорамідитний спосіб Бокажа (Beaucage), та інших, 1981, Tetrahedron Lett 22 1859-1862, та спосіб твердофазного носія за патентом США № 4458066 Огляд способів синтезування наведено у Гудчайлда (Goodchild), 1990, Bioconjugate Chemistry 1 (3) 165-187, що включено до цього опису посиланням Термін "парування основ", а також термін "парування основ Уотсона-Кріка", який використовують у цій галузі, означає добре відоме водневе зв'язування комплементарних пар аденш-тимін та гуанш-цитозин у двонитковій структурі ДНК, аденш-урацил та гуанш-цитозин у гібридній молекулі РНК/ДНК та аналогічне зв'язування нуклеотидних пар незвичайного типу Термін "гібридизація" означає утворення дуплексної структури двох однониткових нуклеїнових кислот внаслідок парування комплементарних основ гібридизація може відбуватись між повністю комплементарними нитками нуклеїнової кислоти або між "по суті, комплементарними" нитками нуклеїнової кислоти, до складу яких входять незначні ділянки помилкового парування Умови, за яких будуть гібридизуватись тільки повністю комплементарні нитки нуклеїнової кислоти називаються "жорсткими умовами гібридизації" або "послідовно-специфічними умовами гібридизації" Стабільні дуплекси, по суті, комплементарних послідовностей можна одержувати за менш жорстких умов гібридизації, рівень припустимого помилкового парування можна контролювати ВІДПОВІДНИМ регулюванням умов гібридизування Фахівці у галузі технології нуклеїнових кислот можуть визначати стабільність дуплексів емпіричним шляхом, розглядаючи ряд змінних, які включають, наприклад, 49843 довжину та концентрування пар основ олігонуклеотидів, іонну силу та КІЛЬКІСТЬ ПОМИЛКОВО спарованих пар основ, ВІДПОВІДНО до настанов, які надаються цією галуззю техніки (дивись, наприклад, Сембрук та ІНШІ, 1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Колд Спрін Харбор Нью-Йорк, та Ветмар (Wetmur), 1991, Critical Review in Biochem and Мої Biol 26 (3/4) 227-259) Термін "праймер" означає олігонуклеотид, здатний діяти, як сайт ініціювання синтезу за умов, за яких ІНІЦІЮЄТЬСЯ синтез продукту подовження праймеру, комплементарного до нитки нуклеїнової кислоти, тобто у присутності будь-якого з 4 різних нуклеозидтрифосфатів та агента подовження (наприклад, ДНК-полімерази або ревертази) у відповідному буфері та при ВІДПОВІДНІЙ температурі Термін "праймер", який використовують у цьому описі, охоплює олігонуклеотиди, які використовують у процесах ампліфікації, опосередкованих літуванням, у яких один олігонуклеотид "подовжується" шляхом літування до другого олігонуклеотиду, який гібридизується у суміжній позиції Таким чином, термін "подовження праймеру", який використовують у цьому описі, означає як полімеризацію окремих нуклеозидтрифосфатів з використанням праймеру, як сайту ініціації синтезу ДНК, так і літування двох праимерів з утворенням подовженого продукту Праймером, у переважному варіанті, є однониткова ДНК Відповідна довжина праймеру залежить від його можливого використання, але, у типовому випадку, складає 6 - 50 нуклеотидів Молекули коротких праимерів потребують, звичайно, більш низьких температур для утворення достатньо стабільних гібридних комплексів з матрицею Праймер не повинен відбивати точну ПОСЛІДОВНІСТЬ матричної нуклеїнової кислоти, однак, повинен бути у достатній мірі комплементарним для гібридизування з матрицею Схема придатних праимерів для ампліфікації даної цільової ПОСЛІДОВНОСТІ добре відома у цій галузі і описана у літературі, яку було цитовано у цьому описі Праимери можуть мати додаткові особливості, які дозволяють визначати або іммобілізувати цей праймер, однак, не змінюють головну властивість праймеру, а саме, здатність діяти, як сайт ініціації синтезу ДНК Наприклад, до складу праимерів може входити додаткова ПОСЛІДОВНІСТЬ нуклеїнової кислоти на 5' КІНЦІ, яка не гібридизується до цільової нуклеїнової кислоти, однак полегшує тонування ампліфікованого продукту Ділянку праймеру, яка є достатньо комплементарною до матриці для гібридизації, називають у цьому описі ділянкою гібридизації Терміни "ціль", "цільова ПОСЛІДОВНІСТЬ", "цільова ділянка" та "цільова нуклеїнова кислота" означають ділянку або ПОСЛІДОВНІСТЬ нуклеїнової кислоти, яка повинна бути ампліфікована Як застосовують у цьому описі, праймер є "специфічним" для цільової ПОСЛІДОВНОСТІ, якщо КІЛЬКІСТЬ присутніх помилкових парувань між праймерною ПОСЛІДОВНІСТЮ та цільовою ПОСЛІДОВ НІСТЮ є менша, ніж КІЛЬКІСТЬ присутніх помилкових парувань між праймерною ПОСЛІДОВНІСТЮ та нецільовими послідовностями, які можуть бути прису 10 тніми у зразку Можна підібрати умови гібридизації, за якими стабільні дуплекси утворюються тільки тоді, коли КІЛЬКІСТЬ присутніх помилкових парувань не перевищує КІЛЬКІСТЬ присутніх помилкових парувань між праймерною ПОСЛІДОВНІСТЮ та цільовою ПОСЛІДОВНІСТЮ За таких умов, праймер може утворювати стабільний дуплекс тільки з цільовою ПОСЛІДОВНІСТЮ Таким чином, використання цілеспецифічних праимерів за придатних жорстких умов ампліфікації надає можливість здійснення специфічної ампліфікації тих цільових послідовностей, до складу яких входять ЦІЛЬОВІ сайти зв'язування праймеру Застосування умов ампліфікації, специфічних для ПОСЛІДОВНОСТІ, надає можливість здійснення специфічної ампліфікації тих цільових послідовностей, до складу яких входять точно комплементарні сайти зв'язування праймеру Термін "неспецифічна ампліфікація" означає ампліфікацію послідовностей нуклеїнової кислоти окрім цільової ПОСЛІДОВНОСТІ, що є наслідком гібридизації праимерів до послідовностей, окрім цільової ПОСЛІДОВНОСТІ, які потім виступають, як субстрат для подовження праймеру Гібридизацію праймеру до нецільової ПОСЛІДОВНОСТІ називають "неспецифічною гібридизацією" і вона може відбуватись при більш низькій температурі, послабленій жорсткості умов, та за умов, які попереджають процес ампліфікації Термін "праймер-димер" означає незалежний від матриці неспецифічний продукт ампліфікації, який є наслідком подовжень праймеру у разі, коли інший праймер виконує роль матриці Незважаючи на те, що праймер-димер часто виявляється конкатемером двох праимерів, тобто димером, трапляється також конкатемери більше, ніж двох праимерів Термін "праймер-димер" використовують у цьому описі у видовому відношенні для охоплення незалежного від матриці неспецифічного продукту ампліфікації Термін "реакційна суміш" означає розчин, до складу якого входять реактиви, необхідні для здійснення даної реакції До складу ампліфікаційної "реакційної суміші", що означає розчин, який включає реактиви, необхідні для здійснення реакції ампліфікації, входять, у типовому випадку, олігонуклеотид ні праимери та ДНК-полімераза або ДНК-лігаза у відповідному буфері До складу "реакційної суміші PCR", у типовому випадку, входять олігонуклеотидні праимери, термостабільна ДНКполімераза, дезоксинуклеозид-5'-трифосфат та дивалентний катіон металу у придатному буфері Реакційну суміш називають повною, якщо до її складу входять усі реактиви, необхідні для проведення реакції, та неповною, якщо вона включає лише піднабір необхідних реактивів Фахівцю у цій галузі техніки зрозуміло, що складові реакційної суміші держать, звичайно, у вигляді окремих розчинів, до складу кожного з яких входить піднабір повного набору компонентів, з міркувань зручності, СТІЙКОСТІ при збереженні або для забезпечення регулювання концентрацій компонентів у залежності від застосування, і що компоненти реакційної суміші об'єднують перед проведенням реакції з метою утворення повної реакційної суміші Далі, фахівцю у цій галузі зрозуміло, що компоненти реакційної суміші пакуються окремо для продажу і 12 11 49843 що до складу придатних комерційних наборів модів належать 3-метиладенін, 7-метилгуанін, 3же входити будь-який піднабір компонентів реакметилгуанш, 5-метилцитозин та 5-пдрокси метилційної суміші, який включає модифіковані праймецитозин ри за цим винаходом Модифікаторна група обмежує здатність модифікованої основи до участі у утворенні водневоМодифіковані праймери го зв'язку, оскільки модифікатор заміщує один Ампліфікаційні праймери за цим винаходом атом водню Атом водню, який залишається, ще модифікуються ковалентним приєднанням групи може приймати участь у утворенні водневого зв'ядо одного з 4 нуклеотидів на 3' кінцевій ДІЛЯНЦІ зку Таким чином, модифікатори можуть впливати праймеру за одним з варіантів втілення, модифіяк на кінетику, так і на термодинаміку гібридизації кований праймер за цим винаходом включає ПОПередбачається ціла низка модифікаторних груп, СЛІДОВНІСТЬ нуклеїнової кислоти, яка має загальну які посідають наступні властивості структуру 1 впливають на (але не запобігають) УотсонR R Кріківське парування модифікованої основи з комплементарної основою, 5 ' - S x - N - 3 ' or S ' - S i - N - S ^ ' , 2 впливають на (але не запобігають) подовде Si - перша ПОСЛІДОВНІСТЬ нуклеотидів довження модифікованого праймеру, та жиною, приблизно, від 5 до 50 нуклеотидів, 3 дозволяють синтезування нитки, комплемеS2 - друга ПОСЛІДОВНІСТЬ довжиною від одного нтарної до продукту подовження модифікованого до трьох нуклеотидів, праймеру N - нуклеотид, до складу якого входить пуриМодифікаторна група стерично впливає на панова або піримідинова основа, до складу якої вхорування основ і, таким чином, на подовження дить екзоциклічний амін, праймеру Таким чином, фізичний об'єм модифікаR - модифікаторна група, де R ковалентне потору впливає на рівень втручання до гібридизації в'язана з N через екзоциклічний амін і де R має Коли модифікований аденозиновии або цитидиноструктуру, описану далі вий нуклеотид включається до двониткової нуклеїЯк показано у прикладах, ефект модифікації є нової кислоти, модифікаторна група виступає до максимальним у разі модифікування 3' кінцевого центрального простору головного жолобка Отже, нуклеотиду Таким чином, переважно, до складу навіть відносно великі модифікатори! групи здатні праймеру входить модифікований З'кшцевий нукспричинювати невеликі стеричні пертурбації дуплеотид лексної структури Однак, придатні модифікатори не дуже великі, завдяки чому запобігається утвоМодифікований нуклеотид вибирають зрення водневого зв'язку або ферментного подовпосеред тих, до основи яких входить екзоциклічження З'-пдроксилу праймеру Коли модифікований амін, залучений до парування основи нуклеоний гуазиновий нуклеотид включається до тиду з його комплементарним нуклеотидом У тидвониткової нуклеїнової кислоти, модифікаторна повому випадку, праймерами є ДНК, до складу група виступає до меншого жолобка, який надає якої входять тільки звичайні нуклеотиди 3 чотименше простору для розміщення об'єму модифікарьох звичайних нуклеотидних основ, які знахоторної групи Отже, перевага для приєднання гуадяться у ДНК, аденін, гуанін та цитозин включають нінової основи надається меншим модифікаторекзоциклічний первинний амін, який залучено до ним групам парування основ з комплементарною основою За переважним аспектом цього винаходу, праймер Продукти подовження праймеру, які викорисмодифікується приєднанням одиночної модифікатовують як матриці у наступних циклах ампліфікаторної групи до екзоциклічного аміну, з заміщенції, мають у своєму складі модифіковану основу, ням одного з двох атомів вуглецю аміногрупи, які, введену праймером Модифікаторну групу вибиу немодифікованій основі, здатні до залучення до рають таким чином, щоб присутність модифіковапарування основ Структури модифікованих нукної основи у матриці не спричинювала закінчення леотидів, до складу яких входить модифікована подовження праймеру або пригнічення його поаденшова, гуаншова та цитозинова основа, ВІДПОдовження У переважному випадку, природа моВІДНО, показані далі дифікаторної групи не повинна викликати мутагенR ,H N О в, ,н N • x Y S де S - цукрова складова, R - модифікаторна група Цей винахід не обмежується праймерами, до складу яких входять звичайні нуклеотиди Будьякий нуклеотидний аналог, до складу основної складової якого входить екзоциклічний первинний амін, який залучено до парування основ з комплементарною основою, піддається модифікації, як описано тут До прикладів незвичайних нуклеоти них подій, внаслідок яких ідентичність модифікованої основи губиться під час реплікації матриці, яка є похідної праймеру Вплив модифікованої основи у матриці на подовження праймеру може рутинно тестуватись ВІДПОВІДНО ДО настанов, які наведено у цьому описі, а також надаються цією галуззю (дивись, наприклад, Гняздовські (Gmazdowski) та Цера (Сега), 1996, Chem Rev 96 619-634) Модифікаторні групи, R, які задовольняють вищезгаданим властивостям, придатні для використання у способах за цим винаходом Переважні модифікаторні групи мають структуру 13 К, 4 49843 С Н де Ri та F?2, незалежно, - водень, Сі-Сю алкільна група, алкоксильна група, фенільна група, феноксильна група, заміщена фенільна група, нафтильна група або заміщена нафтильна група Алкільна група може бути розгалуженою або ЛІНІЙНОЮ Використовуватись можуть також більші алкільні групи, щонайменше, до С20 У переважному варіанті втілення, R - 2нафтилметильна група, бензильна група, або заміщена бензильна група Переважні заміщені бензильні групи мають структуру де R3 - С-і-Сб розгалужена або лінійна алкільна група, більш переважно, С1-С4 розгалужена або лінійна алкільна група, метоксильна група або нітрогрупа С1-С4 розгалуженою або ЛІНІЙНОЮ алкільною групою є метил, етил, пропіл, бутил, ізопропіл, ізо-бутил, трет-бутил та ІНШІ Метил та трет-бутил є переважними алкільними групами Переважно, R3 приєднується у пара-позицм Особливо переважні модифікаторні групи R показано далі "•О бензил р чстилбензил о' р-метоксибензил р-нітробензил 2нафти л метил Ряд певних модифікаторних груп описано у Прикладах Взагалі, емпіричний відбір особливо придатної модифікаторної групи з класу описаних сполук може повсякчасно проводитись фахівцем у цій галузі ВІДПОВІДНО до настанов, які надаються у цьому описі Переважно, придатність певної групи визначається емпірично за допомогою модифікованих праймерів у реакції ампліфікації Успішна ампліфікація свідчить як про те, що модифікована основа не повністю інгібує подовження праймеру, так і про те, що присутність модифікованої основи у матриці, що є похідною праймеру, не призводить до закінчення подовження праймеру Відновлення праймерного димеру визначають, як описано у Прикладах Праймери з фотолабільною модифікацією У альтернативному варіанті втілення винаходу, праймери модифікуються однією або більше фотолабільними групами, які можна видаляти шляхом піддавання їх дії світла після того, як реакція досягла високотемпературних реакційних умов, які забезпечують специфічність Оскільки модифікатор видаляється перед подовженням праймеру, відсутня необхідність у подовженні мо 14 дифікованого праймеру перед видаленням групи Приклади фотолабільних модифікаторів, які можуть бути використані у способах цього винаходу, описано у Пілаї (Filial), 1980, "Photoremovable Protecting Groups in Organic Synthesis", Synthesis 126 Переважно, фотолабільні праймери за цим винаходом модифікуються на 3' кінцевому нуклеотиді приєднанням однієї або двох онітробензильних груп У праймерів, модифікованих приєднанням однієї нітробензильної групи до екзоциклічного первинного аміну основної складової, одержаний вторинний амін все ще може приймати участь у паруванні основ, якщо змінна група обертається таким чином, що атом водню, що залишився, зорієнтовано у напрямку комплементарної основи Як описано у прикладах, ці праймери можна використовувати під час ампліфікації з/без видалення шляхом опромінення УФ світлом Праймери, модифіковані приєднанням двох нітробензильних груп до екзоциклічного аміну основи, не можуть бути подовжені Інгібування, як гадають, є наслідком нездатності модифікованої основи піддатися паруванню основ, що є виключеним, оскільки обидва атоми водню екзоциклічного аміну замінено об'ємними нітробензильними групами Використання праймерів, модифікованих двома нітробензильними групами під час ампліфікації, у якій реакційну суміш було піддано УФ опроміненню впродовж періоду часу, достатнього для видалення нітробензильних груп, що дозволило відбутись подовженню праймеру, описано у Прикладах У альтернативному варіанті втілення, модифікаторна група приєднується до азоту у КІЛЬЦІ Праймери, модифіковані приєднанням нітробензильної групи до азоту у КІЛЬЦІ ОСНОВИ, не можуть бути подовженими внаслідок нездатності модифікованої основи піддаватись паруванню основ, видалення нітробензильних груп шляхом опромінення УФ світлом надає змогу відбутись подовженню праймеру Використання фотолабільних праймерів, які не можуть бути подовженими, доки не видалено модифікаторну групу, по суті, забезпечує ампліфікацію способом "гарячого запуску" Подовження праймеру інгібується за неспецифічних умов, які попереджають реакцію Реакційна суміш опромінюється і праймери деблокуються лише після підвищення температури реакції до рівня, який забезпечує специфічність реакції Синтез модифікованих праймерів Синтез модифікованих праймерів здійснюють за допомогою стандартних ХІМІЧНИХ засобів, добре відомих у цій галузі техніки Способи введення цих модифікаторів можна поділити на чотири класи 1 Модифікатор може бути введено за допомогою модифікованого нуклеозиду, як підложку для синтезу ДНК 15 49843 2 Модифікатор може бути введено за допомогою модифікованого нуклеозиду, як фосфорамідит 3 Модифікатор може бути введено за допомогою реактиву під час синтезу ДНК (наприклад, обробкою бензиламіном перетворюваного амідиту після включення до ПОСЛІДОВНОСТІ ДНК) 4 Постсинтетична модифікація Модифікатор може бути введено, як реакційний реактив під час контакту з синтетичною ДНК Синтез певних модифікованих праимерів описано у Прикладах Додаткові модифіковані праймери можуть бути синтезовані за допомогою стандартних способів синтезування у аналогічний спосіб Модифіковані праймери, переважно, синтезують з використанням дериватизованої скляної підложки для синтезу з контрольованими порами (CPG) Загальну схему реакції для синтезування дериватизованої dA CPG показано на фігурі 6 Певні модифікаторні групи можна додати за допомогою ВІДПОВІДНОГО алкілгалогенідалкілувального, бензилгалогенідалкілувального, заміщеного бензилгалогенідалкілувального, метил нафтилгалогенідалкіліувального або заміщеного метилнафтилгалоген ід алкіл увал ьного агенту Синтез бензил-та р-третбутилбензил-аА CPG описано у Прикладах 1 та 2, ВІДПОВІДНО до схеми, показаної на фігурі 6 Алкілування екзоциклічної аміногрупи може бути здійснено за допомогою способів, аналогічних до метилування, які описано у Гріффіна (Griffin) та Різа (Reese), 1963, Biochim Acta 68 185-192 Додаткові способи синтезу описаного у Арітома (Antoma) та інших, 1995, J Chem Soc Perkm Trans 1 1837-1849 Ампліфікація за допомогою модифікованих праимерів Способи цього винаходу включають здійснення ампліфікації на основі праимерів з використанням модифікованих файмерів за цим винаходом Взагалі, модифіковані праймери можуть замінювати немодифіковані праймери, до складу яких входить така ж сама ПОСЛІДОВНІСТЬ нуклеотидів у ампліфікації на основі праимерів без змін умов реакції ампліфікації Звичайно, фахівцю у цій галузі техніки зрозуміло, що рутинне незначне поліпшення умов проведення реакції може бути вигідним для деяких реакцій У переважному варіанті втілення цього винаходу, модифіковані праймери за цим винаходом використовують у полімеразно-ланцюговій реакції (PCR) Однак, цей винахід не обмежується будьякою певною системою ампліфікації Модифіковані праймери за цим винаходом можна використовувати у будь-якій системі ампліфікації на основі праимерів, у якій може бути утворено праймердимер або неспецифічний продукт ампліфікації Приклади включають способи ампліфікації, описані у літературних джерелах, які було цитовано перед тим По мірі розвитку інших систем, вони можуть використовуватись у практичному втіленні цього винаходу Способи за цим винаходом придатні для ампліфікування як ДНК, так і РНК Наприклад, ампліфікація РНК за допомогою оборотної транскрипцм/полімеразно-ланцюгової реакції (RT-PCR) 16 добре відома у цій галузі техніки і описана у патентах США №№ 5322770 та 5310652 (Майєрс (Myers) та Гельфанд (Gelfand)), 1991, Biochemistry ЗО (31) 7661-7666, Янг (Young) та ІНШІ, 1993, j Clm Microbiol 31 (4) 882-886 та Малдер (Mulder) та ІНШІ, 1994, J Clm Microbiol 32(2) 292-300 Під час ампліфікації на основі праимерів, подовження праймеру здійснюється, звичайно, при підвищеній температурі з використанням термостабільного ферменту, наприклад, термостабільної ДНК-полімерази Фермент ІНІЦІЮЄ синтез на З' КІНЦІ праймеру і продовжує його у напрямку 5' кінця матриці до закінчення синтезу Очищені термостабільні ДНК-полімерази, придатні до реакцій ампліфікації, добре ВІДОМІ у цій галузі техніки і включають (але не обмежуються) ферменти, описані у патенті США № 4889818, патенті США № 5079352, патенті США № 5352600, патенті США № 5491086, публікаціях Міжнародних заявок №№ WO 91/09950, WO 92/03556, WO 92/06200, WO 92/06202, WO 92/09689, та патенті США № 5210036 Огляд термостабільних ДНК-полімераз надано у Абрамсона, 1995, у PCR Strategies (видавець М А Інніс та ІНШІ), стор 39-57, Academic Press, Сан Дієго У переважному варіанті втілення, зокрема, для ампліфікації ДНК, ампліфікацію здійснюють за допомогою оборотне шактивованою ферменту, як описано у "The use of a reversibly inactivated enzyme", який реактивується за умов високотемпературної реакції, далі, зменшує неспецифічну ампліфікацію шляхом інгібування подовження праймеру перед початком реакції Оборотно інактивовану термостабільну ДНК-полімеразу, розроблену і виготовлену компанією Hoffmann La Rцche (Натлі, шт Нью-Джерсі), яка продається компанією Perkm Elmer (Норфолк, шт Конектикут), описаному у Бірча (Birch) та інших, 1996, Nature, 381 (6581) 445-446 Вплив модифікаторної групи на здатність ферменту до подовження праймеру залежить, частково, від певного ферменту, який використовується, та частково, від вибраних умов проведення реакції Наприклад, ДНК-полімераза Tth дозволяє використання у більш широкому діапазоні у разі застосування Мп + 2 у ролі дівалентного катіону, наприклад, у деяких реакціях ампліфікації РНК, аніж у разі застосування Мд +2 Фахівцю зрозуміло, що ПІД час рутинного відбору придатної модифікаторної групи, до уваги слід приймати фермент та умови проведення реакції Способи приготування зразків, придатні для реакцій ампліфікації, добре ВІДОМІ у цій галузі техніки і повністю описані у літературі, цитованої у цьому описі Певний спосіб, який використовують, не є критичною частиною цього винаходу Фахівець у цій галузі техніки може оптимізувати умови проведення реакції для використання з відомими способами приготування зразків Способи аналізування ампліфікованої нуклеїнової кислоти добре ВІДОМІ у цій галузі техніки і повністю описані у літературі, цитованої у цьому описі Певний спосіб, який використовують, не є критичною частиною цього винаходу Фахівець у цій галузі техніки може підібрати ВІДПОВІДНИЙ спосіб аналізу у залежності від застосування 17 49843 Переважним способом аналізу реакції ампліфікації є контролювання зростання загальної КІЛЬКОСТІ ДВОНИТКОВОІ ДНК у реакційної суміші, як опи сано у Хігачі (Higuchi) та інших, 1992, Bio/Technology, 10 413-417, Хігачі та ІНШІ, 1993, Bio/Technology, 11 1026-1030, публікаціях ЄПВ №№ 512334 та 640828 У цьому способі, який у цьому описі називають "кінетичною PCR", виявлення двонитковоі ДНК залежить від посилення флуоресценції, яка з'являється внаслідок зв'язування з двонитковою ДНК етидія броміду (EtBr) та інших міток, які зв'язують ДНК Ампліфікацію здійснюють у присутності мітки Зростання КІЛЬКОСТІ ДВОНИТКОВОІ ДНК внаслідок синтезу цільових послідовностей веде до значного посилення флуоресценції, що контролюється під час ампліфікації Таким чином, ці способи дозволяють контролювати розвиток реакції ампліфікації У кінетичній PCR, рівень виміряної флуоресценції залежить від загальної КІЛЬКОСТІ присутньої двонитковоі ДНК, що є наслідком неспецифічної ампліфікації або ампліфікації цільової ПОСЛІДОВНОСТІ Контролювання флуоресценції дозволяє проводити виміри зростання загальної КІЛЬКОСТІ ДВОНИТКОВОІ ДНК, однак зростання внаслідок ампліфікації цільової ПОСЛІДОВНОСТІ вимірюється тільки разом зі зростанням внаслідок утворення продукту шляхом неспецифічної ампліфікації Модифіковані праймери за цим винаходом особливо придатні для кінетичної PCR, оскільки вони не тільки зменшують КІЛЬКІСТЬ утвореного праймерудимеру, але також затримують утворення праймеру-димеру у кількостях, які піддаються виявленню Затримка утворення праймеру-димеру доти, доки не досягнуто значного збільшення цільової ПОСЛІДОВНОСТІ, надає можливість незалежного контролювання ампліфікації цільових послідовностей та зводить до мінімуму втручання з боку праймерудимеру Набори Цей винахід також має відношення до наборів, багатопакункових комплектів, до складу яких входять компоненти, придатні для практичного здійснення цього способу До складу придатного набору входять праймери, щонайменше, один з яких модифіковано, як описано тут, для ампліфікації нуклеїнових кислот Іншими факультативними компонентами набору є, наприклад, агент, який каталізує синтез продуктів подовження праймеру, субстрат нуклеозидтрифосфати, ВІДПОВІДНІ реакційні буфери та інструкції по здійсненню цього способу Представлені далі приклади цього винаходу наведено тільки з ілюстративною метою, а не для обмеження обсягу цього винаходу Численні варіанти втілення цього винаходу у межах обсягу пунктів формули винаходу, яку наведено за прикладами, будуть очевидні для пересічних фахівців у цій галузі техніки з читання попереднього тексту та наступних прикладів Приклад 1 Синтез праймерів, модифікованих бензильною групою Праймери, модифіковані додаванням бензильної групи, було синтезовано одним з двох процесів, описаних далі Праймери, модифіковані на 18 З' кінцевій основі, було синтезовано за допомогою Н6-бензилдезоксиаденозин CPG для ініціювання синтезу ДНК Праймери, модифіковані на внутрішній основі, було синтезовано за допомогою N6бензилдезоксиаденозинфосфорамідиту У прикладі використано такі стандартні скорочення DMAP - 4-диметиламшопіридин DMF - N.N-диметилформамід TEA -триетиламш EDC 1-етил-3-(3диметиламшопропіл)карбодмміду гідрохлорид THF -тетрапдрофуран DMT - 4,4'-диметокситритил LCAA-CPG - скляна підложка з порами, контрольованими довголанцюговим алкіламіном І Синтез І\І6-бензилдезоксиаденозин CPG Етап 1 Синтез г\І6-бензоил,г\І6-бензил,5'-ООМТ-2'-дезоксиаденозину До г\І6-бензоіл-5'-О-(4,4'-диметокситритил)-2'дезоксиаденозину (657мг, 1,0ммоль, Aldnch Chemical Co , Мілуоки, шт Вісконсин), додавали піридин (Юмл) і суміш сушили випарювання під вакуумом Цю операцію було повторено Одержано піну розчиняли у безводному DMF (15мл, Aldnch Chemical Co , Мілуоки, шт Вісконсин) і охолоджували до 5°С У атмосфері аргону, додавали гідрид натрію (44мг, 1,1ммоль, 1,1еквів , 60% дисперсія у маслі) і перемішували при кімнатній температурі впродовж 45 хвилин Впродовж 2 хвилин додавали бензилбромід (143мкл, 206мг, 1,2еквів Aldnch Chemical Co , Мілуоки, шт Вісконсин) і суміш перемішували впродовж ночі при кімнатній температурі Суміш сушили випарюванням під вакуумом і залишок розподіляли між етилацетатом і водою (кожного по Юмл) та екстрагували Водну фазу реекстрагували етилацетатом (Юмл), об'єднані екстракти сушили над безводним сульфатом магнію, фільтрували і випарювали Неочищений продукт очищали хроматографуванням на силікагелевих колонках (75г) за допомогою метанолу, триетиламшу, метиленхлориду (3 0,5 96,5) Фракції з продуктом об'єднували і сушили випарюванням до одержання необхідного N6-6eH30in,N6бензил,5'-0-ОМТ-2'-дезоксиаденозину (410 мг, 54%) Структуру продукту було підтверджено NMR Етап 2 Сукцинілування До М6-бензоіл,М6-бензил,5'-0-ОМТ-2'дезоксиаденозину (295мг, 0,39ммоль) додавали піридин (Юмл) і суміш сушили випарюванням під високим вакуумом Цю операцію було повторено Разом зі свіжим безводним піридином (Юмл) додавали бурштиновий ангідрид (200мг, 2ммоль, 5,0еквів) та DMAP (24мг) і розчин у атмосфері аргону впродовж ночі при кімнатній температурі Об'єм розчинника видаляли під вакуумом, залишок розподіляли між метиленхлоридом (20мл) і розчином цитрату натрію (20мл, 0,1М, рН 5,0) та екстрагували Водну фазу екстрагували додатковою КІЛЬКІСТЮ метиленхлориду (20мл), об'єднані екстракти сушили над безводним сульфатом натрію, фільтрували і сушили випарюванням Продукт очищали хроматографуванням на силикагелевій колонці (4,5г) за допомогою етилацетату, триетиламшу, метиленхлориду (32 1 67) до оде 19 49843 ржання необхідного З'-бурштинового ефіру N6бензоіл-г\І6-бензил-3'-О-сукцинат-5'-О-0МТ-2'дезоксиаденозину (247мг, 74%) Етап 3 Дериватизація CPG Промиту кислотою CPG готували наступним чином LCAA-CPG (1,0г, LCA00500C, 500 А, 88,6 (моль/г), компанія CPG Іпс , Ферфілд, шт НьюДжерсі) промивали дихлороцтовою кислотою у дихлорметані (2%, 20мл) періодичним завихренням впродовж 20 хвилин при кімнатній температурі Промиту кислотою CPG фільтрували на скляному фриті і промивали дихлорметаном до повного видалення кислоти Порошок сушили на повітрі, потім впродовж ночі під вакуумом при кімнатній температурі Парування модифікованої нуклеозидної проміжної речовини з промитою кислотою CPG здійснювали наступним чином До розчину І\І6-бензоілМ6-бензил-3'-О-сукцинат-5'-О-0МТ-2'дезоксиаденозину (170мг, 0,2 ммоль), одержаного, як описано перед тим, у дихлорметані (Юмл) додавали TEA (ЮОмкл) і розчин концентрували, приблизно, 5мл у атмосфері аргону Послідовно додавали DMAP (12мг, 0,1ммоль, 0,5еквів), TEA (ЮОмкл), EDC (384мг, 2,0ммоль, Юеквів) та згадану перед тим CPG, промиту кислотою Додавали безводний піридин (5мл), суміш герметизували і струшували впродовж 3 днів при кімнатній температурі CPG відфільтровували під вакуумом і екстенсивно промивали ізопропанолом, потім дихлорметаном, сушили на повітрі, потім сушили під вакуумом впродовж 1 години "Кепування" дериватизованої CPG здійснювали наступним чином До сухої дериватизованої CPG додавали розчини Сар А та Сар В (кожного по 5мл, оцтовий анпдрид/2,6-лютидин/ТНР та 10% N-метилімідазолу у THF, компанія Glen Research DNA Synthesis reagents, Стерлінг, шт Вірджинія) і суміш струшували впродовж 4 годин при кімнатній температурі CPG відфільтровували під вакуумом і екстенсивно промивали ізопропанолом, потім дихлорметаном, сушили на повітрі, потім сушили під вакуумом впродовж ночі II Синтез N6бензилдезоксиаденозинфосфорамідиту N6-6eH3Oin,N -бензил,5'-O-DMT-2'дезоксиаденозин було синтезовано, як описано перед тим До N6-6eH3oin,N6-6eH3Hn,5'-O-DMT-2'дезоксиаденозину (196мг, 0,26ммоль) у сухому THF (8мл) додавали дмзопропілетиламін (350мкл, 270мг, 2,04ммоль, 7,8еквів) та 2-ціаноетил N,Nдмзопропілхлорфосфорамідит (161мг, 0,68ммоль, 2,6еквів , Aldnch Chemical Co , Мілуоки, шт Вісконсин) і суміш перемішували впродовж ЗО хвилин при кімнатній температурі у атмосфері аргону Розчинник видаляли під вакуумом, залишок розподіляли між розчином бікарбонату натрію (5%, 20мл) та етилацетатом (20мл) Органічну фазу послідовно промивали розчином бікарбонату, водою і насиченим розсолом (кожного по 20мл), сушили над сульфатом натрію, фільтрували і випарювали Залишок очищали хроматографуванням на силікагелевій колонці (4г) за допомогою ецетону/гексану/ТЕА (34 65 0,7) до одержання необхідного фосфорамідиту (248мг, 100%) III Синтез, очищення та аналіз ДНК 20 Бензил-дериватизовану аденозином CPG (25мг, 1,0моль) переносили до пустих колонок для синтезування (компанія Glen Research DNA Synthesis reagents, Стерлінг, шт Вірджинія) і використовували їх для одержання олігонуклеотидів на синтезаторі ДНК АВ 374 (компанія Perkm Elmer, Applied Biosystems Division, Фостер СІТІ, ШТ Каліфорнія) за звичайних умов синтезування та позбавлення захисту Неочищену DMT-ДНК очищали і перетворювали на 5-пдрокси-ДНК за допомогою стандартного однопрохідного хроматографування DMT засобами рідинної хроматографії (колонка Rainm-Pure-DNA, система рідинного хроматографування Ramin, компанія Raimn Instrument Co, Вобарн, шт Масачусетс) Олігонуклеотиди аналізували за допомогою капілярної електрофоретичної системи АВІ (компанія Perkm Elmer, Applied Biosystems Division, Фостер СІТІ, ШТ Каліфорнія) або денатуруючого аніонообмінного рідинного хроматографування на колонці Dionex Nucleopak (компанія Dionex Corp , Санівейл, шт Каліфорнія) Східним ЧИНОМ, синтез внутрішньо модифікованих праймерів здійснювали за допомогою немодифікованої CPG та модифікованої фосфорамідит-синтезованих, як описано перед тим Приклад 2 У цьому прикладі описано синтез праймерів, модифікованих на 3' кінцевому аденозині р-третбутилбензильною групою Модифіковані праймери було синтезовано, по суті, як описано у прикладі 1, однак, з використанням ІЧ6-(р-третбутилбензил)дезоксиаденозин CPG Синтез дериватизованої CPG описано далі Етап 1 Синтез г\І6-бензоіл-г\І6-(р-третбутилбензил)-5'-О-(4,4'-диметокситритил)-2'дезоксиаденозин До г\І6-бензоіл-5,-О-(4,4'-диметокситритил)-2'дезоксиаденозину (658мг, 1,0ммоль) додавали DMF (безводний, Юмл) і випарювали до сухості Цю операцію було повторено Свіжий DMF (Юмл) було додано у атмосфері аргону Додавали гідрид натрію (44мг, 60% у маслі, 1,1 ммоль) і суміш перемішували впродовж 0,5 години при кімнатній температурі прикраплювали 4-(третбутил)бензилбромід (272мг, 1,2ммоль) і перемішували при кімнатній температурі впродовж ночі Розчинник видаляли під вакуумом, залишок розподіляли між етилацетатом і водою (по 20мл кожного) Органічну фазу промивали водою (тричі, 20мл), сушили над безводним сульфатом магнію, фільтрували і випарювали до сухості Неочищений продукт очищали хроматографуванням на силікагелевій колонці (100г) за допомогою метиленхлориду метанолу триетиламшу 96,5 3 0,5 до одержання 4-(4-пдроксифеніл)-2-бутанону (229мг, 28,5%) Етап 2 Сукцинілування 4-(4-пдроксифеніл)-2-бутанон (217мг, 0,27ммоль) обробляли бурштиновим ангідридом (135мг, 5еквів ) та DMAP (17мг, 0,5еквів ) у піридині (Юмл) Внаслідок обробки та хроматографування, як описано у прикладі 1, наведеному перед тим, одержали 4-(4-пдроксифеніл)-2-бутаноиу 3'О-сукцинат (199мг, 82%) Етап 3 Дериватизація CPG Сукцинат (180мг, 0,2ммоль) з вищезгаданого 21 етапу 2, обробляли промитою кислотою LCAACPG, як описано у прикладі 1 CPG "кепували" і сушили під вакуумом до одержання 4-(4пдроксифеніл)-2-бутанону З'-Осукцинатдериватизованою CPG (1,065 г) Приклад З Синтез праймерів, модифікованих метальною групою Праймери, модифіковані на 3' кінцевому аденозині метальної групою, було синтезовано за допомогою Нб-метил dA CPG (22мг, Імкмоль, компанія Glen Research, Стерлінг, шт Вірджинія) N6метил dA CPG вносили до порожньої колонки для синтезу і праймери виготовляли за стандартних умов синтезування та позбавлення захисту Праймери очищали за допомогою стандартного однопрохідного хроматографування DMT засобами рідинної хроматографії, як описано у прикладі 1 Приклад 4 Синтез фотолабільних модифікованих праймерів У цьому прикладі описано синтез праймерів модифікованих на 3' кінцевому аденозині однією або двома нітробензильними групами Модифіковані праймери було синтезовано, по суті, як описано у прикладі 1, однак, з використанням або мононітробензил dA CPG, або біс-нітробензил dA CPG І- Мононітробензиловані праймери Загальний спосіб синтезу г\І6-бензоіл-І\І6бензил-2'-деоксиаденозин-дериватизованоі CPG (дивись приклад 1) було використано для синтезу N -бензоіл-М6-орто-нггробензил-2'деоксиаденозин-дериватизованої CPG шляхом заміщення орто-нітробензилброміду, як алкілувального агенту Наступні етапи для CPG були ідентичними тим, які було описано у прикладі 1, за виключенням того, що проміжні речовини захищали від довколишнього світла, загортаючи реакційні колби до алюмінієвої фольги ВІДПОВІДНО ДО схеми синтезу дериватизованої CPG, праймери було синтезовано, як описано у прикладі 1, однак, вони відокремлювались за допомогою твердофазного екстрагування з використанням разових колонок Nensorb Prep (компанія NEN Research Products Biotechnology Systems, Du Pont Co, Бостон, шт Масачусетс) ВІДПОВІДНО ДО протоколу, наданого виробником II Біс-нітробензиловані праймери Біс-нітробензилдезоксиаденозин CPG було синтезовано, як описано перед тим ВІДПОВІДНО ДО схеми синтезу дериватизованої CPG, праймери було синтезовано і очищено, як описано для мононітробензильних праймерів Етап 1 Синтез 5'-O-DMT-N6-6ic-opTOнітробензил-2'-дезоксиаденозину 2'-дезоксиаденозину моногідрат (538мг, 2,0ммоль, Aldnch Chemical Co , Мілуоки, шт Вісконсин) сушили випарюванням з безводним піридином (2 х Юмл) під вакуумом Залишок розчиняли у безводному DMF (Юмл, Aldnch Chemical Co, Miлуоки, шт Вісконсин) у атмосфері аргону, додавали гідрид натрію (88мг, 2,2ммоль, 1,1 еквів , 60% дисперсія у маслі) і перемішували впродовж 40 хвилин при кімнатній температурі Додавали 2нітробензилбромід (710мг, З.Зммоль, 1,5еквів) і 49843 22 розчин перемішували впродовж 4 годин при кімнатній температурі DMF видаляли випарюванням під вакуумом, залишок розподіляли між етилацетатом та водою (20мл кожного) Водну фазу екстрагували етилацетатом (20мл), об'єднані екстракти промивали водою (20мл), сушили над сульфатом магнію, фільтрували і випарювали Неочищений продукт очищали хроматографуванням на силікагелевіи колонці (50г, з використанням 3% МеОН у СН2СІ2) до одержання 2'-дезокси-ІЧ6біс-орто-нітробензиладенозину (320мг, 30%) До 2'-дезокси-І\І6-біс-ортонітробензиладенозину (200мг, 0,518ммоль) додавали безводний піридин (Юмл) і випарювали до сухості Після піридину (Юмл) додавали 4-4'диметокситритилу хлорид (900мг, 2,3ммоль, 4,5еквів) та триетиламш (280мг, 2,76ммоль, 4,0еквів) і перемішували при кімнатній температурі у атмосфері аргону впродовж 5 годин Додавали воду (0,5мл) і перемішували впродовж 20 хвилин Суміш розподіляли між ефіром та водою (20мл кожного) і водну фазу реекстрагували ефіром (20мл) Екстракти об'єднували, промивали водою (20мл), сушили над безводним сульфатом натрію, фільтрували і випарювали Матеріал очищали хроматографуванням на силікагелевіи колонці (4г, з використанням 0,7 - 2,5% метанолу у метиленхлориді) до одержання 5'-O-DMT-N6-6ic-opTOнітробензил-2'-дезоксиаденозину (121мг, 33%) Етап 2 Сукцинілування 5'-O-DMT-N -біс-орто-нітробензил-2'дезоксиаденозин (121мг, 0,145ммоль) сушили випарюванням з безводним піридином (2 х Змл) Додавали піридин (Змл), бурштиновий ангідрид (58мг, 0,58ммоль, 4еквів) та DMAP (11мг, каталітичний) і розчин перемішували при кімнатній температурі впродовж 3 днів Розчин випарювали m vacuo, залишок розподіляли між метиленхлоридом (Юмл) та цитратнонатрієвим буфером (0,1М, рН 5,0, Юмл) Органічну фазу сушили над безводним сульфатом натрію, фільтрували і випарювали до сухості Неочищений продукт очищали хроматографуванням на силікагелевіи колонці (2г, з використанням ЕЮАс СН2СІ2 TEA, 32 67 1 Юмл, потім МеОН СН2СІ2, 3 97, 25мл) до одержання піни блідо-жовтого кольору 5'-O-DMT-N6-6ic-opTOнітробензил-2'-дезоксиаденозин-3'-сукцинату (138мг, 99,5%) Етап 3 Дериватизація CPG Промиту кислотою LCAA-CPG готували, як у прикладі 1 Парування модифікованої нуклеозидноі проміжної речовини з промитою кислотою CPG здійснювали наступним чином 5'-O-DMT-N6-6icорто-иітробензил-2'-дезоксиаденозин-3'-О— сукцинат (37мг, 0,04ммоль) обробляли TEA (16л) у скляній колбі бурштинового кольору і випарювали До цього залишку додавали безводний піридин (1,5мл), TEA (2мкл), DMAP (2,4мг), EDC (76мг, 0,04ммоль) та промиту кислотою LCAA-CPG (200мг) і сушили струшуванням на роторній мішалці впродовж 3 днів при кімнатній температурі CPG відфільтровували під вакуумом і екстенсивно промивали ізопропанолом, потім метиленхлоридом, сушили на повітрі, потім сушили під вакуумом впродовж 1 години "Кепування" дериватизованої CPG здійснюва 23 ли, як описано у прикладі 1 Приклад 5 24 Матричні РНК В1Л-1 було синтезовано за допомогою транскрипційного вектору РНК В1Л-1, по суті, як описано у Малдера та інших, 1994, J СІїп Microbiol , 32 (2) 292-300 Праймери Ампліфікації здійснювали з використанням як немодифікованих, так і модифікованих праймерів ПОСЛІДОВНОСТІ нуклеотидів немодифікованих праймерів наведено далі, вони орієнтовані у 5'-3' напрямку Зворотний праймер RAR1032MB (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 1) та прямий праймер RAR1033MB (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 2) ампліфікують продукт у 175 пар основ (п о), який відповідає позиціям нуклеотидів з 2956 до 3130 ПОСЛІДОВНОСТІ ВІЛ-1 еталонного штаму НХВ 2 (GenBank, номер доступу КО3455) 49843 Ампліфікації за допомогою модифікованих праймерів — Ефект позиції модифікованого нуклеотиду Для демонстрації ефекту модифікованих праймерів на утворення праймеру-димеру, зробили порівняння ампліфікацій РНК ВІЛ-1 за допомогою як модифікованих, так і немодифікованих праймерів На додаток до цього, з метою оцінки ефекту позиції модифікованого нуклеотиду на зменшення КІЛЬКОСТІ праймеру-димеру, ампліфікації було здійснено з використанням 3 різних модифікованих у зворотному напрямку праймерів, які відрізнялись лише місцезнаходженням модифікованої основи Цільова нуклеїнова кислота Ампліфікаційні праймери ВІЛ-1 Праймер RAR1032МВ RAR1ОЗЗМВ ПОСЛІДОВНІСТЬ № ПОСЛІДОВНІСТЬ 1 2 CAATGAGACACCAGGAATTAGATATCAGTACAA CCCTAAATCAGATCCTACATATAAGTCATCCA Вищенаведені означення праймерів належать немодифікованим праймерам Немодифіковані праймери обробляли біотином на 5' КІНЦІ Модифіковані праймери було синтезовано, як описано у Прикладі І До їх складу входили такі ж самі ПОСЛІДОВНОСТІ нуклеотидів, що і у немодифікованих Праймер RAR1032MBA1 RAR1032MBA2 RAR1032MBA4 RAR1033MBA1 Модифіковані ампліфікаційні праймери ВІЛ-1 ПОСЛІДОВНІСТЬ № Позиція модифікованого нуклеотиду 1 3' кінець 1 1 2 Ампліфікація Ампліфікацію здійснювали у ЮОмкл реакційної суміші, до складу якої входили такі реактиви 100 копій матричної РНК ВІЛ-1 50мМтрицину (рН 8,33) 110мМ КОАс, по ЗООмкМ dATP (дезоксиаденозин-51трифосфагу), dCTP (дезоксицитидин-51трифосфату) та dGTP (дезоксигуанозин-51трифосфшу), 50мкМ dTTP (дезокситимідин-5-трифосфату), 500мкМ dUTP (дезоксиуридин-5-трифосфату), 50мкМ кожного праймеру, Передреакційне інкубування Оборотна транскрипція 46 циклів Кінцеве подовження Постреакційне витримування праймерів, однак, бензилований аденозин знаходився або у 3' кінцевій позиції, або займав місце через 1-3 нуклеотиди у напрямку 3'5' від 3' кінця Модифіковані форми праймерів означені тут наступним чином 1 ВІД 3' КІНЦЯ 3 від 3' кінця 3' кінець 3,5мМ Мп(ОАс)2, 13% гліцерину 20 одиниць ДНК-полімерази Z05*, та 2,0 одиниці UNG** * опис наведено у патенті США № 5455170 ** виготовлено та розроблено компанією Hoffmann-La Roche, продається компанією Perkm Elmer, Норфолк, шт Конектикут Тепловий цикл ампліфікації здійснювали у термоблоці для проведення реакцій ТС480 DNA (компанія Perkm Elmer, Норфолк, шт Конектикут) з використанням наступного температурного профілю 45°С впродовж 4 хвилин 60°С впродовж 20 хвилин денатурація при 94°С впродовж 45 секунд гібридизація/подовження при 60°С впродовж 45 секунд 60°С впродовж 7 хвилин 10°С до проведення аналізу (впродовж короткого періоду часу) Виявлення ампліфікованого продукту Присутність ампліфікованого продукту виявляли за допомогою гель-електрофорезу наступним чином Продукти реакції фракціонували за допомогою гемоагарози (ЮОмл 3% NuSieve та 0,5% SeaChem) та протокового буферу IX ТВЕ (0.089М тріс, 0.089М борної кислоти, 0.0025М динатрійетилендіамштетраоцтової кислоти) Етидію бромід (0,5мкг/мл) додавали для фарбування будь-якої присутньої ДНК Електрофорез здійснювали при 100 вольтах впродовж, приблизно, 1 години Зони ДНК, пофарбовані етидію бромідом,було візуалізовано за допомогою УФопромінювання Результати Результати гель-електрофоретичного аналізу 25 49843 наведено на фігурі 1 Номери смуг, які відповідають кожній ампліфікації з використанням комбінацій немодифікованих та модифікованих праимерів, наведено у наступній таблиці Пофарбовані зони, Зворотні RAR1032MB RAR1032MBA1 RAR1032MBA2 RAR1032MBA4 RAR1032MB RAR1032MBA1 RAR1032MBA2 RAR1032MBA4 26 які відповідають передбачуваному продукту ВІЛ, вказано на фігурі стрілкою Інші зони пофарбування у гелі відповідають неспецифічному продукту ампліфікації і, зокрема, праймеру-димеру Праймери Прямі RAR1033MB RAR1033MB RAR1033MB RAR1033MB RAR1033MBA1 RAR1033MBA1 RAR1033MBA1 RAR1033MBA1 Оскільки утворення праймеру-димеру конкурує з утворенням передбачуваного продукту ампліфікації, наслідком зменшення праймеру-димеру є одночасне підвищення КІЛЬКОСТІ утвореного передбачуваного продукту Таким чином, ефект модифікованих праимерів можна бачити при порівнянні КІЛЬКОСТІ утвореного праймеру-димеру відносно КІЛЬКОСТІ, утвореної з застосуванням немодифіковаиих праимерів, а також при порівнянні КІЛЬКОСТІ утвореного передбачуваного цільового продукту відносно КІЛЬКОСТІ, утвореної з застосуванням немодифікованих праимерів Порівняння результатів з використанням двох немодифікованих праимерів (смуга 1) з результатами з використанням одного З'-модифікованого праймеру (смуги 2 та 5) та з результатами з використанням двох З'модифікованих праимерів (смуга 6) свідчить, що зниження КІЛЬКОСТІ праймерудимеру було досягнуто з використанням одного або двох модифікованих праимерів) При ампліфікаціях з використанням одного З'-модифікованого праймеру, спостерігалась невелика різниця у зменшенні КІЛЬКОСТІ праймеру-димеру, яка залежала від того, який праймер було модифіковано Наслідком використання двох модифікованих праймерів (смуга 6) було найбільше зменшення КІЛЬКОСТІ праймеру-димеру і виявлене зростання КІЛЬКОСТІ ампліфікованої цільової ПОСЛІДОВНОСТІ Ефект позиції модифікованого нуклеотиду видно у разі порівняння смуг 6 - 8 Зменшення праймеру-димеру, одержане у разі використання праймеру, модифікованого у нуклеотиді, суміжному 3'кінцевому нуклеотиду (смуга 7), було еквівалентним зменшенню, одержаному у разі використання Смуга № 1 2 З 4 5 6 7 праймеру, модифікованому у З'-кінцевому нуклеотиді (смуга 6), у той час, як поліпшення, одержане з використанням праймеру, модифікованого у нуклеотиді, який знаходиться через три основи у 3'-5' напрямку від З'-кінцевого нуклеотиду (смуга 8), було дещо меншим Приклад 6 Додаткові ампліфікації з використанням модифікованих праимерів - Ефект позиції Модифікованого нуклеотиду Для додаткової демонстрації ефекту модифікованих праимерів на утворення праймеру-димеру було здійснено порівняння ампліфікацій РНК HCV з використанням як модифікованих, так і немодифікованих праимерів, по суті, як було описано перед тим Ампліфікації здійснювали з використанням трьох різних модифікованих прямих праимерів, які різнились тільки за місцезнаходженням модифікованої основи Цільова нуклеїнова кислота Матричні РНК HCV було синтезовано за допомогою транскрипційного вектору РНК В1Л-1, по суті, як описано у Янга та інших, 1993, J Сип Міcrobiol 31 (4) 882-886 Праймери Ампліфікації здійснювали з використанням як немодифікованих, так і модифікованих праимерів ПОСЛІДОВНОСТІ нуклеотидів немодифікованих праимерів наведено далі, вони орієнтовані у 5'-3' напрямку Зворотний праймер ST280A (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 3) та прямий праймер ST778AA (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 4) ампліфікують продукт у 240 п о з 5' нетрансльованої ділянки геному HCV Ампліфікаційні праймери HCV Нраймер ST280A ST778AA ПОСЛІДОВНІСТЬ № 1 2 Вищенаведені означення праимерів належать немодифікованим праймерам Модифіковані праймери було синтезовано, як описано у Прикладі 1 До їх складу входили такі ж самі ПОСЛІДОВНОСТІ нуклеотидів, що і немодифікованих праимерів, Праймер ST280ABA1 ST778AABA1 ПОСЛІДОВНІСТЬ нуклеотидів GCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA однак, бензилований аденозин знаходився або у З' кінцевій позиції, або займав місце через 1 - 3 нуклеотиди у напрямку 3'5' від 3' кінця Модифіковані форми праимерів означені тут наступним чином Модифіковані ампліфікаційні праймери HCV ПОСЛІДОВНІСТЬ № Позиція модифікованого нуклеотиду 3 3' кінець 4 3' кінець 27 49843 ST778AABA2 ST778AABA4 Ампліфікація та аналіз Ампліфікації здійснювали, по суті, як описано у прикладі 3, однак з використанням 100 копій матричної РНК HCV Аналіз у гелі ампліфікованого продукту було здійснено, як описано у прикладі З Результати Результати гель-електрофоретичного аналізу наведено на фігурі 2 Номери смуг, які відповіда3воротні ST280A ST280fl ST280A ST280ABA ST280ABA1 ST280ABA1 ST280ABA1 ST280ABA1 28 і від 3' кінця З від 3' кінця ють кожній ампліфікації з використанням комбінацій немодифікованих та модифікованих праймерів, наведено у наступній таблиці Пофарбовані зони, які відповідають передбачуваному продукту HCV, вказано на фігурі стрілкою Інші зони пофарбування у гелі відповідають неспецифічному продукту ампліфікації і, зокрема, праймеру-димеру Праймери Прямі ST778AA ST778AABA1 ST778AABA2 ST778AABA4 ST778AA ST778AABA1 ST778AABA2 ST778AABA4 Оскільки утворення праймеру-димеру конкурує з утворенням передбачуваного продукту ампліфікації, наслідком зменшення праймеру-димеру є одночасне підвищення КІЛЬКОСТІ утвореного передбачуваного продукту Таким чином, ефект модифікованих праймерів можна бачити при порівнянні КІЛЬКОСТІ утвореного праймеру-димеру відносно КІЛЬКОСТІ, утвореної з застосуванням немодифікованих праймерів, а також при порівнянні КІЛЬКОСТІ утвореного передбачуваного цільового продукту відносно КІЛЬКОСТІ, утвореної з застосуванням немодифікованих праймерів Одержані результати були подібні результатам, одержаним при ампліфікації ВІЛ, що було описано у попередньому прикладі, однак, при ампліфікаціях HCV зростання КІЛЬКОСТІ передбачуваного продукту було більш явним, аніж при ампліфікаціях ВІЛ Порівняння результатів з використанням двох немодифікованих праймерів (смуга 1) з результатами з використанням одного З'-модифікованого праймеру (смуги 2 та 5) та з результатами з використанням двох З'модифікованих праймерів (смуга 6) свідчить, що зниження КІЛЬКОСТІ праймеру-димеру було досягнуто з використанням одного або двох модифікованих праймерів) Наслідком використання двох модифікованих праймерів (смуга 6) було як найбільше зменшення КІЛЬКОСТІ праймеру-димеру, так і значне зростання КІЛЬКОСТІ ампліфікованої цільової ПОСЛІДОВНОСТІ Як і у попередньому прикладі, при ампліфікації з використанням одного 3'модифікованого праймеру, спостерігалась невелика різниця у зменшенні КІЛЬКОСТІ праймеру-димеру, яка залежала від того, який праймер було модифіковано Ефект позиції модифікованого нуклеотиду видно у разі порівняння смуг 6 - 8 Еквівалентні, по суті, результати було одержано у разі використання праймерів, модифікованих у З'-кінцевому нуклеотиді (смуга 6), у нуклеотиді, суміжному 3'кінцевому нуклеотиду (смуга 7) та у нуклеотиді, Смуга № 1 2 З 4 5 6 7 який знаходиться через три основи у 3'-5' напрямку від З'-кінцевого нуклеотиду (смуга 3) Ці результати свідчать про те, що модифікаторна група може приєднуватись до будь-якого з 4 нуклеотидів на З' КІНЦІ праймеру Приклад 7 Ампліфікації з використанням модифікованих праймерів — Ефект модифікаторної групи Для додаткової демонстрації ефекту модифікованих праймерів на утворення праймеру-димеру та для демонстрації альтернативних модифікацій праймерів було здійснено порівняння ампліфікацій РНК HCV з використанням як модифікованих, так і немодифікованих праймерів, де праймери було модифіковано додаванням однієї з 3 різних модифікаторних груп беюильної, нітробензильної та метальної груп Результати ампліфікації були аналізовані двома різними способами У одній групі порівнянь присутність праймеру-димеру визначали гельелектрофоретичним аналізом продуктів реакції У другій групі порівнянь, утворення праймерудимеру контролювалось впродовж ампліфікації за допомогою описаних перед тим способів кінетичної PCR Цільова нуклеїнова кислота Матричні РНК HCV було синтезовано за допомогою транскрипційного вектору РНК В1Л-1, по суті, як описано у Янга та інших, 1993, J СІїп Microbiol 31 (4) 882-886 Ампліфікащйні праймери Ампліфікації здійснювали з використанням як немодифікованих, так і модифікованих праймерів До складу модифікованих праймерів входили такі ж самі ПОСЛІДОВНОСТІ нуклеотидів, що і до складу немодифікованих праймерів, але їх було модифіковано у 3' кінцевому аденозині шляхом додавання метальної групи, бензильної групи або нітробензильної групи Праймери було синтезовано, як описано у попередніх прикладах Значення, використані для праймерів, наведено далі 29 Праймер ST280A ST280AMEA1 ST280ABA1 ST280ANBA1 ST778AA ST778AAMEA ST778AABA1 ST778AANBA1 49843 ПОСЛІДОВНІСТЬ № З З З З 4 4 4 4 Реакції ампліфікації Ампліфікації здійснювали у ЮОмкл реакційної суміші, до складу якої входили такі реактиви 0, 20, або 200 копій матричної РНК HCV 50мМ трицину, рН 8,3, 110мМ КОАс, 3,5мМ Мп(ОАс)2, по ЗООмкМ dATP, dCTP, dGTP, 50мкМ dTTP, 500мкМ dUTP, 250нМ кожного праймеру, Передреакційне інкубування Оборотна транскрипція 46 циклів Кінцеве подовження Постреакційне витримування ЗО Модифікація 3' основи немодифі кована метил бензил нітробензил немодифі кована метил бензил нітробензил 20 Од ДНК-полімерази rTth*, 2,0 одиниці UNG*, та 13% гліцерину *виготовлено та розроблено компанією Hoffmann-La Рцспе, продається компанією Perkm Elmer, Норфолк, шт Конектикут Тепловий цикл кожної реакційної суміші здійснювали у термоблоці для проведення реакцій GeneAmp® PCR System 9600 (компанія Perkm Elmer, Норфолк, шт Конектикут) з використанням наступного температурного профілю 45°С впродовж 4 хвилин 60°С впродовж 24 хвилини денатурація при 94°С впродовж 45 секунд ція/подовження при 60°С впродовж ЗО секунд 60°С впродовж 7 хвилин 4°С Виявлення ампліфікованого продукту А Гсль-електроФорез Присутність ампліфікованого продукту виявляли за допомогою гель-електрофорезу таким чином Продукти реакції фракціонували за допомогою гемоагарози (ЮОмл 3% NuSieye, 0,5% SeaChem та 0,5 мкг/мл етидію броміду) та протокового буферу IX ТВЕ (0.089М тріс, 0.089М борної кислоти, 0.0025М динатрійетилендіамштетраоцтової кислоти) Електрофорез здійснювали при 100 вольтах впродовж, приблизно, 1 години Зони ДНК, пофарбовані етидію бромідом, було візуалізовано за допомогою УФ-опромінювання В Виявлення за допомогою кінетичної PCR У способах кінетичної PCR, які було описано перед тим, до PCR додають барвник проникнення, наприклад, етидію бромід, який сильніше флуоресцує у разі проникнення до двониткової РНК Зростання КІЛЬКОСТІ двониткової ДНК під час ампліфікації контролюється шляхом вимірювання флуоресценції барвника впродовж реакції Оскільки способами кінетичної PCR вимірюють тільки зростання загальної КІЛЬКОСТІ двониткової ДНК, утворення неспецифічного продукту ампліфікації незалежно не визначається 3 метою визначення об'єму неспецифічної ампліфікації внаслідок праймеру-димеру незалежно від ампліфікації матриці, реакції здійснювались без матричної нуклеїнової кислоти У таких безматричних реакціях будь-яке зростання КІЛЬКОСТІ двониткової ДНК відносять на рахунок утворення незалежного від матриці неспецифічного продукту ампліфікації Умови проведення кінетичної PCR відповідали наведеним перед тим, за винятком того, що до реакційної суміші додавали етидію бромід у концентрації 1г/мл Хід реакції контролювали шляхом гібридиза вимірювання флуоресценції реакційної суміші, як описано у Європейській заявці № 640828 Виміри флуоресценції було нормалізовано шляхом поділу на вимір початкового рівня флуоресценції, визначений під час циклу на початку реакції, у той час, як виміри флуоресценції між циклами були відносно постійними КІЛЬКІСТЬ ЦИКЛІВ, обрана для виміру початкового рівня флуоресценції, була однаковою для всіх реакцій, які порівнювались, завдяки чому усі виміри демонстрували приріст відносно одного і того ж реакційного циклу Рівень флуоресценції у безматричних реакціях залишався відносно постійним до утворення праймеру-димеру У більшості реакцій, при умові проведення достатньої КІЛЬКОСТІ ЦИКЛІВ ампліфікації, КІЛЬКІСТЬ праймеру-димеру, кі нець-кінців, піддається виявленню Ефект модифікованих праймерів може спостерігатись у разі порівняння КІЛЬКОСТІ проведених циклів до утворення (якщо утворення взагалі має місце) праймеру-димеру Результати Результати гель-електрофоретичних аналізів наведено на фігурі 3 Номери смуг, які відповідають кожній з ампліфікацій з використанням немодифікованих і трьох типів модифікованих праймерів та 200 копій, 20 копій або 0 копій РНК HCV, наведено у наступній таблиці (номери смуг відраховують зліва-направо, смуги 1 - ЗО знаходяться у верхній половині гелю, смуги 31 - 60 знаходяться у нижній половині гелю) На додаток до цього, як у смугах 1 та 31 були присутні маркери молекулярної маси (ДНК PhiX174RF, розщеплена Hal III, компанія New England Biolabs, Беверли, шт Масачусетс), так і у смугах ЗО та 60 (суперледер незначна КІЛЬКІСТЬ, ледер 20 п о , компанія Gen 49843 32 31 Sura, Дель Map, шт Каліфорнія) Пофарбовані ампліфікацій, що є середнім, виведеним за умови зони, які відповідають передбачуваному специфіутворення праймеру-димеру Умовне середнє не чному продукту, вказані на фігурі стрілкою (~ 230 порівнюється до інших наведених значень внасліп о ) Інші зони у гелі відповідають неспецифічному док виключених даних продукту ампліфікації, зокрема, праймеру-димеру КІЛЬКІСТЬ ЦИКЛІВ ДО досягнення AFL Номери СМУГ результатів ампліфікацій покаТаблиця заних на фігурі З Матриці Праймери Смуги КІЛЬКІСТЬ КОПІЙ ЦІЛЬОВОЇ матоипі 200 немодифікований 2-5 200 метил ьований 6-9 0 20 200 200 бензилований 10-13 Праймер 200 н ітробензил ований 14-17 Немодифікований 35 36 34 20 немодифікований 18-21 Метил 39 38 36 20 метил ьований 22-25 Нітробензил 43 40 37 20 бензилований 26-29 Бензил (43*) 41 37 20 нітробензилований 32-35 *2/8 не показали утворення праймеру-димеру 0 иемодифікований 36-41 0 метилований 42-47 Дані свідчать про те, що модифіковані прай0 бензилований 48-53 мери явно затримують ампліфікацію цільової нук0 нітробензилований 54-59 леїнової кислоти, завдяки чому AFL досягається Результати показують, що наслідком ампліфідекількома циклами пізніше Затримка не відповікації з використанням модифікованих праймерів є дає зменшенню кінцевого виходу специфічного більша КІЛЬКІСТЬ ампліфікованої нуклеїнової кислопродукту ампліфікації За спостереженнями, усі ти HCV, аніж у ампліфікаціях з використанням неампліфікації цільової нуклеїнової кислоти досягали модифікованих праймерів На додаток до цього, плато впродовж 46 циклів, які було використано у наслідком ампліфікації з використанням модифіексперименті і, як свідчать ВІДПОВІДНІ дані гелькованих праймерів є зменшення КІЛЬКОСТІ праймеелектрофоретичного аналізу, кінцевий вихід підру-димеру, у порівнянні до ампліфікацій з викорисвищувався у разі використання модифікованих танням немодифікованих праймерів праймерів У разі кінетичної PCR, рівень флуоресценції Дані свідчать, що затримка утворення праймебув контрольований впродовж всієї реакції Швидру-димеру значно перевищувала затримку у ампкість посилення флуоресценції, після виявлення II ліфікації цільової матриці Позитивний ефект посилення, була, приблизно, однаковою у всіх репраймерів найкраще видно при порівнянні безматакціях, про що свідчить форма кривої, одержаної ричних ампліфікацій з ампліфікаціями 200 копій внаслідок нанесення даних рівня флуоресценції у матриці У разі використання не модифікованих залежності від КІЛЬКОСТІ ЦИКЛІВ (не показано) Це праймерів, посилення флуоресценції до AFL відзасвідчує, що модифіковані праймери суттєво бувається тільки на один цикл пізніше у ампліфіефективність кожного етапу ампліфікації, після каціях без цільової матриці Це є свіченням того, початкового и етапу, не інгибують Реакції значно що ампліфікацію цільової матриці було б важко розрізняються за КІЛЬКІСТЮ ЦИКЛІВ, проведених до відрізнити від утворення праймеру-димеру У протого, як почало виявлятись посилення флуоресцетилежність цьому, у разі використання модифіконції ваних праймерів, посилення флуоресценції внаслідок праймеру-димеру відбувалось, Для КІЛЬКІСНОГО визначення різниці між реакціщонайменше, на три цикли пізніше, а у разі викоями, результати виражають КІЛЬКІСТЮ ЦИКЛІВ ампристання бензильованих праймерів, щонайменше ліфікації, проведених до того, як флуоресценція на 6 циклів пізніше, якщо відбувалось взагалі Тапочала перевищувати умовний рівень флуоресцеким чином, ампліфікацію цільової матриці було б нції (AFL) AFL є близьким до базисного рівня можливо виявити та відрізнити від утворення флуоресценції, однак перевищує діапазон довільпраймеру-димеру них флуктуацій флуоресценції, яка вимірюється, завдяки чому кінетику реакції вимірювали у фазі При порівнянні безматричних ампліфікацій і геометричного росту ампліфікації Накопичення ампліфікацій 20 копій матриці, ефект модифіковаампліфікованого продукту впродовж ПІЗНІШИХ ЦИКних праймерів демонстрував таку ж схему більшої ЛІВ інгібує реакцію і його кінцевим наслідком є реазатримки появи праймеру-димеру, аніж затримка кційне плато ампліфікації цільової матриці У разі використання Результати кінетичної PCR підсумовано у нанемодифікованих праймерів, 20 копій матриці виведеній далі таблиці Кожне значення ампліфікацій явити було неможливо При використанні нітробе20 або 200 копій цільової матриці є середнім п'яти нзил ьних та бензильних праймерів, утворення повторних ампліфікацій, за виключенням ампліфіпраймеру-димеру затримувалось у достатній мірі кацій з використанням бензильованих праймерів для того, щоб ставало можливим виявлення 20 та 20 копій цільової матриці, яке є середнім чотикопій матриці у цій системі рьох повторів Кожне значення ампліфікацій без Дані моніторингу флуоресценції кожного циклу цільової матриці є середнім восьми повторів ампліфікації (дані не показані) свідчать про те, що У двох з 8 повторів ампліфікацій з використанвзагалі, затримка утворення праймеру-димеру ням бензилуваних праймерів без цільової матриці була достатньою для того, щоб запобігти тому, що утворення праймеру-димеру не відбувалось до утворення праймеру-димеру досягало рівня плато кінця 46 циклів Показано середнє останніх шести впродовж 46 циклів Таким чином, затримка утво 33 49843 рення праймеру-димеру модифікованими праймерами була достатньою для того, щоб могла бути завершена ампліфікація цільової матриці й реакція зупинилась до утворення значного рівня праймеру-димеру Приклад 8 Фотолабільні праймери Для демонстрації використання фотолабільних модифікованих праймерів, ампліфікації РНК Праймер ST280A 15239 15241 ST778AA 1524015242 Передреакційне інкубування Оборотна транскрипція Початкова денатурація 2 цикли 46 циклів Кінцеве подовження Модифікація 3' основи немодифі кована біс-нітробензил мононітробензил немодифі кована біс-нітробензил мононітробензил ПОСЛІДОВНІСТЬ № З З З 4 4 4 Реакції ампліфікації Реакції для кожної пари праймерів здійснювали з використанням серії розведень вихідної концентрації цільової матриці Було проведено дві серії реакцій, кожна з яких включала усі комбінації пари праймерів та вихідної концентрації цільової матриці У кожній серії реакцій, кожна реакція, яка включала дану пару праймерів та концентрацію цільової матриці, проводилось ДВІЧІ Ампліфікації здійснювали у реакційних сумішах об'ємом 100 мкл, до складу кожної з яких входили наступні реактиви 0, 10, 102, 103, 104 або 105 копій матричної РНК HCV, 55мМ трицину, 90мМ КОАс, 34 HCV здійснювали з застосуванням як модифікованих, так і немодифікованих праймерів Модифіковані праймери було модифіковано приєднанням однієї або двох нітробензильних груп до екзоциклічного аміну 3' кінцевого аденіну Ампліфікаційні праймери Праймери було синтезовано, як описано у прикладі 4 Використані означення праймерів наведено далі ЗмМ Мп(ОАс)2, по 200мкМ dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 200мкМ dUTP, 250нМ кожного праймеру, 10 Од rTth* 2 Од UNG*, та 8% гліцерину, *виготовлено та розроблено компанією Hoffmann-La Roche, продається компанією Perkm Elmer, Норфолк, шт Конектикут Тепловий цикл кожної реакційної суміші здійснювали у термоблоці для проведення реакцій GeneAmp® PCR System 9600 (компанія Perkm Elmer, Норфолк, шт Конектикут) з використанням наступного температурного профілю 50°С впродовж 5 хвилин 60°С впродовж ЗО хвилин 95°С впродовж 1 хвилини денатурація при 95°С впродовж 15 секунд, ція/подовження при 60°С впродовж 20 секунд денатурація при 90°С впродовж 15 секунд, ція/подовження при 60°С впродовж 20 секунд 72°С впродовж 10 хвилин У всіх експериментах було використано поліровані кришки для реакційних судин (компанія Perkm Elmer, Норфолк, шт Конектикут) Після підвищення температури реакції до 60°С для етапу оборотної транскрипції Нагріту кришку планшету для PCR у термоблоці для проведення реакцій знімали і половину реакційних судин (один повний набір серії) накривали алюмінієвою фольгою Другу половину освітлювали за допомогою ручної УФ лампи з 302 нм спектром випромінювання (УФспектр, модель UVM-57, компанія UVP Products, Сан Габріель, шт Каліфорнія) впродовж 10 хвилин Нагріту кришку повертали на місце і ампліфікацію продовжували Результати Результати ампліфікацій аналізували за допомогою гель-електрофорезу, як описано перед тим Результати показано на фігурі 4 На гелі показано КІЛЬКІСТЬ праймерів та копій матриці, яку було використано у кожній реакції (log показаної КІЛЬКОСТІ КОПІЙ) На фігурі показані пофарбовані зони, які відповідають передбачуваному продукту Інші по гібридизагібридиза фарбовані зони у гелі відповідають неспецифічному продукту ампліфікації і, зокрема, праймерудимеру Порівняння УФ-опромшеного набору реакційних сумішей показує, що наслідком використання модифікованих праймерів є значне зменшення КІЛЬКОСТІ праймеру-димеру, зокрема, при невеликій КІЛЬКОСТІ КОПІЙ Порівняння неопромшеного набору реакційних сумішей показує, що наслідком застосування біснітробензильних праймерів є повне інгібування ампліфікації, як і очікувалось Ампліфікації з використанням мононітробензильних праймерів не тільки давали продукт, але й демонстрували значне зменшення КІЛЬКОСТІ праймеру-димеру, що співпадає з результатами, одержаними у попередньому прикладі Приклад 9 Ампліфікація з використанням р-Третбутилбензилмодифікованих праймерів У цьому прикладі описано ампліфікацію РНК HCV з використанням праймерів, модифікованих 35 р-трет-бутилбензильними групами Цільова нуклеїнова кислота Матричні РНК HCV було синтезовано за допомогою транскрипційного вектору РНК В1Л-1, по суті, як описано у Янга та інших, 1993, J СІїп Microbiol 31 (4) 882-886 Праймери Ампліфікацію здійснювали за допомогою модифікованих праймерів, які було синтезовано, як Праймер ST280ATBU ST778AATBU Модифіковані ампліфікаційні праймери HCV ПОСЛІДОВНІСТЬ № Позиція модифікованого нуклеотиду 3 3' кінець 4 3' кінець Ампліфікація та аналіз Ампліфікації здійснювали у ЮОмкл реакційної суміші, до складу якої входили такі реактиви 20, 5, 2,5, 2 або 0 копій матричної РНК HCV 50мМтрицину (рН 8,33) 110мМ КОАс, по ЗООмкМ dATP (дезоксиаденозин-51трифосфату), dCTP (дезоксицитидин-51трифосфату) та dGTP (дезоксигуанозин-51трифосфату), 50мкМ dTTP, 500мкМ dUTP, Передреакційне інкубування Інактивація за допомогою UNG Оборотна транскрипція 47 циклів Кінцеве подовження Постреакційне витримування 49843 36 описано в прикладі 2, наведеному перед тим ПОСЛІДОВНОСТІ нуклеотидів немодифікованих праймерів показано далі, вони орієнтовані у 5'-3' напрямку Використані праймери були модифікованими версіями зворотного праймеру ST280A (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 3) та прямого праймеру ST778AA (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 4) Модифіковані форми праймерів позначені далі таким чином 50нМ кожного праймеру, 3,5мМ Мп(ОАс)2, 13% гліцерину, 20 одиниць ДНК-полімерази rTth, та 8,0 одиниць UNG* * виготовлено та розроблено компанією Hoffmann-La Рцспе, продається компанією Perkm Elmer, Норфолк, шт Конектикут Тепловий цикл ампліфікації здійснювали у термоблоці для проведення реакцій ТС480 DNA (компанія Perkm Elmer, Норфолк, шт Конектикут) з використанням такого температурного профілю 45°С впродовж 12 хвилин 90°С впродовж ЗО секунд, 60°С впродовж 20 хвилини денатурація при 94°С впродовж 45 секунд гібридизація/подовження при 60°С впродовж 70 секунд 60°С впродовж 7 хвилин 10°С до проведення аналізу (впродовж короткого періоду часу) Результати Ампліфікації, які було виконано з кожною цільовою матрицею, було повторено таким чином З ампліфікації було здійснено з 20 копіями цільової матриці, 3 ампліфікації було здійснено з 5 копіями цільової матриці, 2 ампліфікації було здійснено з 2,5 копіями цільової матриці, 1 ампліфікацію було здійснено з 2 копіями цільової матриці і 23 ампліфікації було здійснено без цільової матриці Наслідком всіх ампліфікацій з матрицями була одна пофарбована зона на гелі, яка належала передбачуваній ЦІЛЬОВІЙ матриці У жодній з ампліфікацій не було утворено праймеру-димеру або іншого неспецифічного продукту ампліфікації Результати можна порівняти з результатами прикладу 6, наведеного перед тим, де така ж сама матриця HCV ампліфікувалась з застосуванням тих же самих послідовностей праймеру Порівняння цих результатів з результатами прикладу 6 свідчить про те, що ампліфікації з використанням ртрет-бути л бензил модифікованих праймерів були значно кращими, ніж ВІДПОВІДНІ ампліфікації, проведені з немодифікованими праймерами Було проведено додаткові експерименти, під час яких РНК В1Л-1 було ампліфіковано за допомогою р-трет-бути л бензил модифікованих версій праймерів, описаних у наведеному перед тим прикладі 5 Ампліфікації було здійснено, по суті, як описано перед тим Як і у випадку описаної тут системи HCV, всі ампліфікації матриці ВІЛ-1 дали одну пофарбовану зону на гелі, яка відповідала передбачуваному розміру цільової матриці У жодній з ампліфікацій не було утворено праймерудимеру або іншого неспецифічного продукту ампліфікації Ці додаткові результати можна порівняти з результатами наведеного перед тим прикладу 5, де таку ж саму цільову матрицю ВІЛ було ампліфіковано з застосуванням тих же самих послідовностей праймеру Порівняння цих результатів з результатами наведеного перед тим Прикладу 5 свідчить про те, що ампліфікації з використанням р-трет-бутилбензилмодифікованих праймерів були значно кращими, ніж ВІДПОВІДНІ ампліфікації, проведені з немодифікованими праймерами Приклад 10 Ампліфікація ДНК мікобактерій У цьому прикладі описано порівняння ампліфікацій мікобактерійної ДНК, які було здійснено з використанням немодифікованих праймерів Було використано як праймери, модифіковані додаванням бензильної групи до 3' кінцевого нуклеотида, так і праймери, модифіковані додаванням р-третбутилбензильної групи до 3' кінцевого нуклеотиду Реакції з використанням немодифікованих праймерів відповідали, по суті, опису у Тевер (Tevere) та інших, 1996, J Clm Microbiol 34 (4) 918-923 Ампліфікації здійснювали з використанням зразків мокротиння, до яких додавали мікобактерійну ДНК у ВІДОМІЙ концентрації для імітування інфікованих 37 49843 КЛІНІЧНИХ зразків Додаткові ампліфікації було проведено з використанням очищеної мікобактеріальноі ДНК та негативних контрольних зразків без ДНК Одержання зразків Зразки мокротиння, які, за даними попередніх мікроскопічних та культуральних перевірок, виявились негативними на мікобактерії, було розріджено та обеззаражено за допомогою N-ацетил-цистешNaOH за рекомендацією Центру по боротьбі з хворобами (CDC) (Кент (Kent) та Кабіка (Kubica), 1985, Public Health Mycobactenology - a guide for the level III laboratory, Міністерство охорони здоров'я США, Центрпо боротьбі з хворобами, Атланта, включено до цього опису як посилання) Розріджене мокротиння (ЮОмкл) додавали до 500мкл реактиву для промивки респіраторних зразків (ЮмМ трис-НСІ, 1мМ етилендіамштетраоцтовоі кислоти, 1 % (у об'ємному відношенні) Тритону Х-100, 0,05% NaN 3 , pH 8,0) та центрифугували впродовж 10 хвилин при 12500 g Осад ресуспендували у ЮОмкл лізисного реактиву (0,05 N NaOH, 1% (у об'ємному відношенні) Тритону Х-100, 1мМ Праймери ПОСЛІДОВНІСТЬ KY436 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 6) KY75 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 7) У ампліфікаціях було використано такі пари праймерів, до складу яких входять означена модифікаторна група, приєднана до 3' кінцевої осноПОСЛІДОВНІСТЬ праймерів KY18 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 5) KY75 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 7) KY436 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 6) KY75 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 7) KY436 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 6) KY75 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 7) В С Ампліфікація Для кожного зразка, ампліфікації здійснювали з використанням пари немодифікованих праймерів KY18 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 5) та KY75 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 7), та пари праймерів у модифікованій формі, KY436 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 6) та KY75 (ПОСЛІДОВНІСТЬ №7) Ампліфікації здійснювали у 100 мют реакційних сумішах, до складу кожної з яких входило 50мкл одного з трьох зразків, описаних перед тим, та 50мкл реакційної суміші 2, яка включає наступні реактиви ЮОмМ трис-НСІ, рН 8,9, 500нМ кожного праймеру, Передреакційне інкубування 2 цикли 41 цикл Кінцеве подовження НОСТІ нуклеотидів 5'-CACATGCAAGTCGAACGGAAAGG-3' 5'-TAACACATGCAAGTCGAACGGAAA-3' 5'-GCCCGTATCGCCCGCACGCTCACA-3' KY18 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 5) Пара праймерів А 38 етилендіамштетраоцтової кислоти, 0,05% ІЧаІЧз) та шкубували впродовж 45 хвилин при 60°С Після цього лізати нейтралізували ЮОмкл нейтралізаційного реактиву (0,2М Тріс-НСІ, 8мМ МдСІ 2 , 0,05% NaN 3 , pH 7,5) Збірні лізати мокротиння одержували шляхом поєднання 80мкл кожного з двох окремих лізатів мокротиння До кожного з 8 збірних лізатів мокротиння (ЮОмкл кожного) додавали 15мкл вихідної ДНК (2 копм/мкл у суміші (1 1) лізисного та нейтралізаційного реактивів), очищеної з культивованих М Tuberculasis Зразки очищеної мікробактерійної ДНК (без мокротиння) у ВІДОМІЙ концентрації готували шляхом додавання Юмкл суміші (1 1) лізисного та нейтралізаційного реактивів Контрольні зразки (без ДНК) включали суміш ЮОмкл лізисного реактиву та ЮОмкл нейтралізаційного реактиву Ампліфікашйні праймери Ампліфікаційні здійснювали з використанням праймерів, до складу яких входили такі ПОСЛІДОВ ви Усі модифіковані праймери було синтезовано, як описано у попередніх прикладах Всі праймери піддавались обробці біотином на 5' КІНЦІ Модифікація немодифі кований немодифі кований бензил бензил р-трет-бути л бензил р-трет- бутилбензил 200мкМ (кожного) dNTP (дезоксинуклеозид-51трифосфат) (dATP, dCTP, dGTP, dUTP), 20% (у об'ємному відношенні) гліцерину, 10 одиниць AmpliTag*, 6 одиниць AmpErase* *виготовлено та розроблено компанією Hoffmann-La РцсЬіе, продається компанією Perkm Elmer, Норфолк, шт Конектикут Тепловий цикл кожної реакційної суміші здійснювали у термоблоці для проведення реакцій GeneAmp® PCR System 9600 (компанія Perkm Elmer, Норфолк, шт Конектикут) з використанням наступного температурного профілю 50°С впродовж 5 хвилин денатурація при 98°С впродовж 20 секунд, гібридизація при 62° С впродовж 20 секунд, подовження при 72°С впродовж 45 секунд денатурація при 94°С впродовж 20 секунд, гібридизація при 62°С впродовж 20 секунд, подовження при 72°С впродовж 45 секунд, 72°С, приблизно, впродовж 12 годин (на протязі ночі) Продукти ампліфікації було візуалізовано за допомогою електрофорезу з застосуванням 2% Nusievc®, 0,5% гелю агарози з подальшим фарбу ванням етидію бромідом Результати Результати електрофоретичного аналізу пока 39 49843 зано на фіг 5 Для кожного зразку, продукти ампліфікації, здійсненої з немодифікованими праймерами (означені "А") та з модифікованими праймерами (означеними "В" та "С"), проходили по суміжним смугам Пофарбовані зони, які відповідають передбачуваній мікобактерійній ЦІЛЬОВІЙ ПОСЛІДОВНОСТІ, позначені стрілками Інші пофарбовані зони відповідають неспецифічному продукту ампліфікації, найнижчі пофарбовані зони у гелі відповідають праймеру-димеру Смути з позначкою "М" вміщують маркер молекулярної маси (розщеплення Р1ІІХІ74 ДНК за допомогою Нас III) У разі використання немодифікованих праймерів, наслідком ампліфікації неочищеної мікобактерійної ДНК було утворення праймеру-димеру Використання будь-якої пари модифікованих праймерів підвищило КІЛЬКІСТЬ передбачуваної присутньої цільової матриці і, по суті, ліквідувало утворення праймеру-димеру у КІЛЬКОСТІ, яка піддавалась виявленню У протилежність ампліфікаціям очищеної ДНК, у разі використання немодифікованих праймерів, присутність лізату мокротиння у реакції ампліфікації погіршувало ефективність і посилювало утворення неспецифічного продукту ампліфікації, як показано присутністю пофарбованих зон стороннього продукту Підвищення КІЛЬКОСТІ неспецифічного продукту ампліфікації не викликає подиву, виходячи з того, що до складу лізатів мокротиння входить значна КІЛЬКІСТЬ людської ДНК, відсутньої під час ампліфікацій очищеної мікобактерійної ДНК Наслідком використання будь-якої з пар модифікованих праймерів у ампліфікаціях, здійснених у присутності мокротиння, є значне підвищення КІЛЬКОСТІ передбачуваного продукту, який утворюється, та зменшення неспецифічної ампліфікації Приклад 11 Додатковий синтез праймерів, модифікованих бензильною групою Праймери, модифіковані додаванням бензильної групи до кінцевого цитозину, було синтезовано, по суті, як описано у прикладі 1, але з використанням LCAA-CPG-зв'язаного М4-ацетил,І\І4бензил-5'-О—ОМТ-2'-дезоксицитидину, одержаного, як описано далі Етап 1 Синтез І\І4-бензил-2'-дезоксицитидину До 2'-дезоксицитидина пдрохлориду (5,28г, 20ммоль, компанія US Biochemical Corp , Клівленд, шт Огайо) додавали бензиламш (20мл) і суміш нагрівали при 150°С впродовж 3 годин у атмосфері аргону Розчин концентрували під вакуумом до одержання в'язкого масла жовтого кольору, яке розподіляли між водою (ЮОмл) та етилацетатом (ЮОмл) Водну фазу промивали етилацетатом (ЮОмл) і відокремлювали Водну фазу концентрували під вакуумом до одержання сиропу жовтого кольору (13г), який очищали хроматографуванням на силікагелевій колонці з використанням метиленхлориду метанолу (15 1), як елюенту, до одержання необхідного продукту (5,8г, 91,5%) у вигляді безбарвного сиропу Етап 2 Синтез г\І4-ацетил,г\І4-бензил-2'дезоксицитидину І\І4-бензил-2'-дезоксицитидин (2,5г, 7,9ммоль) розчиняли у 15мл сухого диметилформаміду 40 (15мл), додавали оцтовий ангідрид (8г, 79ммоль, Юеквів) і суміш перемішували впродовж ночі при кімнатній температурі Розчинник та надлишок оцтового ангідриду випарювали під вакуумом Продукт очищали хроматографуванням на силікагелевій колонці з використанням метиленхлориду метанолу (20 1), як елюенту, до одержання цільової сполуки (1,3г, 48%) Сполука була високопгроскопічною і її зберігали висушеною при -20°С Етап 3 Синтез М4-ацетил,г\І4-бензил-5'-0-ОМТ2'-дезоксицитидину г\І4-ацетил,г\І4-бензил-2'-дезоксицитидин (76мг, 0,2ммоль) розчиняли у 1мл сухого піридину і додавали DMT-CI (122мг, 0,2ммоль, 1,0еквів) Реакційну суміш перемішували впродовж 3 годин Аналіз засобами тонкошарової хроматографії (TLC) показав деякі залишки вихідного матеріалу, тому додавали додаткову аліквоту DMT-C1 (61 мг, 0,5еквів) і одержану суміш перемішували додатково впродовж 1 години Аналіз за допомогою TLC показав, що реакцію завершено Реакцію припиняли додаванням 15мл холодного розсолу і водну фазу екстрагували метиленхлоридом (3 х 15мл) Об'єднаний органічний шар промивали розсолом (2 х 15мл) і сушили над безводним сульфатом магнію Розчинник випарювали і суміш очищали хроматографуванням на силікагелевій колонці з використанням метиленхлориду метанолу (50 1) до одержання г\І4-ацетил,г\І4-бензил-5'-О—DMT-2'дезоксицитидину (96мг, 65% вихід) Етап 4 Сукцинілування І\І4-ацетил,І\І -бензил-5'-О—DMT-2'дезоксицитидин (96мг, 0,13ммоль) розчиняли у 2мл сухого піридину Додавали бурштиновий ангідрид (ЮОмг, 1,0ммоль) та диметиламшопіридин (20мг) і утворену суміш перемішували при кімнатній температурі при кімнатній температурі впродовж 3 днів Розчинник випарювали, залишок випарювали разом з толуолом (3 х Юмл) Додавали хлороформ (50мл) для розчинення залишку (для надання допомоги при розчиненні вдались до обробки ультразвуком) Шар хлороформу промивали розсолом (3 х 15мл) та водою (1 х 15мл) Органічний шар сушили безводним сульфатом магнію Розчинник випарювали до одержання 108мг чистого М4-ацетил,І\І4-бензил-5'-О—DMT-2'дезоксицитидин-З'-О-сукцинату (97% вихід) Етап 5 Одержання LCAA-CPG-зв'язаного N4ацетил,І\І4-бензил-5'-О—ОМТ-2'-дезоксицитидинЗ'-О-сукцинату Активовану CPG одержували наступним чином LCAA-CPG (1,0г, LCA00500C, компанія CPG Іпс , Ферфіланд, шт Нью-Джерсі) обробляли трихлороцтовою кислотою у метиленхлориді (3%, Юмл) і змішували на роторному випарювачі (гоtovapor, Buchi, Flawir, Швейцарія) (без вакууму) впродовж 4 годин Розчинник відфільтровували і CPG промивали, послідовно, триетиламіном етилдизопропіламіном (9 1) (3 х 5мл), метиленхлоридом (3 х Юмл) та ефіром (3 х Юмл), після чого сушили під вакуумом Парування модифікованої нуклеозидної проміжної речовини з промитою кислотою CPG здійснювали наступним чином До 1г активованої LCAACPG додавали М4-ацетил,М4-бензил-5'-0-ОМТ-2'дезоксицитидин-З'-О-сукцинат (108мг, 0,13ммоль), 49843 42 41 одержаний, як описано перед тим, диметиламшо(м) МОЛЕКУЛЯРНИЙ ТИП ДНК (геномна) піридин (20мг) та 5мл сухого піридину Реакційну (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ ПОСЛІДОВНІСТЬ № 1 суміш змішували на роторному випарювачі (без CAATGAGACA CCAGGAATTA GATATCAGTA САА вакууму) впродовж 3 днів Супернатант відфільт(2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ № 2 ровували, спаровану LCAA-CPG послідовно про(і) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ мивали піридином (3 х 5мл), метиленхлоридом (З (A) ДОВЖИНА 32 пари основ (п о ) х Юмл), ефіром (1 х Юмл), після чого сушили під (B) ТИП нуклеїнова кислота вакуумом (C) КІЛЬКІСТЬ НИТОК одна "Квітування" LCAA-CPG, зв'язаної з N4(D) ТОПОЛОГІЯ лінійна ацетил,г\І4-бензил-5'-О—ОМТ-2'-дезоксицитидинЗ'-О-сукцинатом здійснювали наступним чином До дериватизованої CPG додавали розчини СарА (ТНР/лютидин/АсгО 8 1 1 компанія Glen Research DNA Synthesis reagents, Стерлінг, шт Вірджинія) та СарВ (10% N-метилімідазолу у THF, компанія Glen Research) і реакційну суміш змішували на роторному випарювачі (без вакууму) впродовж ночі Розчин фільтрували, спаровану LCAA-CPG послідовно промивали піридином (3 х 5мл), метиленхлоридом (3 х Юмл), THF (3 х Юмл), ефіром (3 х Юмл), після чого сушили під вакуумом Здатність дериватизованої LCAA-CPG до парування визначали обробкою 5мг продукту 3% трихлороцтовою кислотою у метиленхлориді КІЛЬКІСТЬ виділення ІОНІВ диметокситритилкарбонію визначали за допомогою УФ-спектроскопм КІЛЬКІСТЬ нуклеозидної похідної, зв'язаної з LCAA-CPG, за визначенням, дорівнювала 19,5мкмоль/г ЛІСТИНГ ПОСЛІДОВНОСТІ (1) ЗАГАЛЬНА ІНФОРМАЦІЯ (і) ЗАЯВНИК (A) НАЗВА F HOFFMANN-LA RL4CHE AG (B) ВУЛИЦЯ Grenzacherstrasse 124 (C) МІСТО Базель (D) КАНТОН BS (E) КРАЇНА Швейцарія ПОШТОВИЙ КОД (ІНДЕКС) СН-4070 (F) ТЕЛЕФОН 061-6882511 (G) ТЕЛЕФАКС 061-6881395 (Н) ТЕЛЕКС 962292/965542 hlrch (м) НАЗВА ВИНАХОДУ Модифіковані праймери (їм) КІЛЬКІСТЬ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ 7 (iv) ФОРМА, ЯКА ЗЧИТУЄТЬСЯ КОМП'ЮТЕРОМ (A) ТИП НОСІЯ Гнучкий диск (B) КОМП'ЮТЕР Apple Macintosh (C) ОПЕРАЦІЙНА СИСТЕМА Система 7 1 (Macintosh) (D) ПРОГРАМА Word 5 1 (v) ДАНІ ПРО ПОПЕРЕДНІ ЗАЯВКИ ЗАЯВКАМ №60-041127 ДАТА ПОДАЧІ 20 03 97 (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ № 1 (і) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ (A) ДОВЖИНА 33 пари основ (п о ) (B) ТИП нуклеїнова кислота (C) КІЛЬКІСТЬ НИТОК одна (D) ТОПОЛОГІЯ лінійна 43 49843 44 45 49843 L метиловаш праимсри нітрооензиловаш праймери 46 47 49843 48 M be™ z І г) її в іемодифіковані ST778A\/ST280A ю-нігробензиловаиі 15239/15240 пононігробензильш 15241/15242 49 49843 50 Синтез дериватизованої dA CPG DMTO НО x ,NaH R2 D T MO X = галогенід H O Бурштиновий ангщрид, піридин ?1 DT MO LCAA-CPG, EDC, піридин 6 Ы -дериватизована dA CPG -< CO2H ФІГ. 6 О