Поліпептид з ксиланазною активністю

Реферат: Винахід стосується поліпептиду з ксиланазною активністю, який містить амінокислотну послідовність, яка має щонайменше 88 % ідентичність з послідовністю SEQ ID NO:1, де поліпептид містить амінокислотні заміни в положенні 110 для підвищення солюбілізуючої активності для висівок і/або ксиланазної активності. UA 103216 C2 (12) UA 103216 C2 UA 103216 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ОПИС Галузь техніки, до якої належить винахід Даний винахід стосується поліпептидів з ксиланазною активністю і їх застосувань. Також даний винахід стосується способу модифікації поліпептидів з ксиланазною активністю для зміни, переважно підвищення, ксиланазної активності і/або розчинності висівок. Рівень техніки Протягом багатьох років ендо-β-1,4-ксиланази (ЕС 3.2.1.8) (що в даному документі називаються ксиланазами) використовували для модифікації складних вуглеводів, отриманих з речовини стінки рослинних клітин. У даній галузі добре відомо, що функціональна активність різних ксиланаз (отриманих з різних мікроорганізмів або рослин) істотно розрізняється. Основуючись на структурних властивостях і генетичних характеристиках, ксиланази класифікували в різні сімейства глікозидгідролаз (GH) (Henrissat, 1991; Coutinho and Henrissat, 1999). Донедавна всі відомі і охарактеризовані ксиланази відносили до сімейств GH10 або GH11. У нещодавно опублікованій роботі були ідентифіковані численні інші типи ксиланаз, що належать до сімейств GH5, GH7, GH8 і GH43 (Coutinho and Henrissat, 1999; Collins et al., 2005). До даного часу сімейство GH11 відрізняється від всіх інших сімейств GH тим, що тільки воно є єдиним сімейством, яке складається з ксиланаз, специфічних для ксилану. Структуру ксиланаз сімейства GH11 можна описати як структуру «-рулета з желе» (див. фіг. 1, що обговорюється в даному документі). Патент США 6682923 стосується активності білків і нуклеїнових кислот ксиланаз. Були проведені всебічні дослідження за характеристикою функціональної активності ксиланаз з використанням добре охарактеризованих і чистих субстратів (Kormelink et al., 1992). Результати даних досліджень показали, що різні ксиланази мають різні специфічні вимоги відносно заміни скелета ксилози в арабіноксилані (AX). Для деяких ксиланаз необхідна наявність трьох незаміщених залишків ксилози для гідролізу скелета ксилози; для інших потрібен тільки один або два залишки. Вважають, що причини даних відмінностей в специфічності криються в тривимірних просторових структурах каталітичних центрів, які, в свою чергу, залежать від первинної структури ксиланази, тобто, амінокислотної послідовності. Однак трансляція даних відмінностей в амінокислотних послідовностях у відмінності в функціональній активності ксиланаз до даного часу не встановлена, оскільки ксиланази «працюють» в складному середовищі, такому як рослинний матеріал. Субстрати ксиланази, виявлені в пшениці (пшеничному борошні), традиційно розділяли на дві фракції: AX, що не екстрагується водою (WU-AX), і AX, що екстрагується водою (WE-AX). У пшеничному борошні співвідношення WU-AX:WE-AX становить приблизно 70:30. Є численні пояснення з приводу того, чому існують дві різні фракції AX. У більш ранній літературі (D'Appolonia and MacArthur (1976) і Montgomery and Smith (1955)) описані досить суттєві відмінності між WE-AX і WU-AX в ступені заміщення. Найвищий ступінь заміщення був виявлений в WE-AX. Даний факт використовували для пояснення того, чому деякі AX є екстрагованими. Високий ступінь заміщення робить полімер розчинним в порівнянні з низьким ступенем заміщення, що приводить до утворення водневих зв'язків між полімерами і в результаті до осадження. Вважають, що відмінності в функціональній активності різних ксиланаз є результатом відмінностей в специфічності ксиланаз і в результаті їх переваг для субстратів WU-AX і WE-AX. Однак в більш пізній літературі відсутні відомості про істотні відмінності в ступені заміщення WU-AX і WE-AX. Отже, можуть мати значення інші параметри, а не специфічність субстратів ксиланаз. Дані параметри можуть представляти перевагу ксиланаз для WE-AX в порівнянні з WU-AX, яке визначається іншими чинниками, ніж класична специфічність субстратів. Даний параметр можна знайти в літературі, як вибірковість субстрату. У деяких застосуваннях (наприклад, в хлібопекарському виробництві) бажано отримати високомолекулярні (HMW) розчинні полімери з фракції WU-AX. Такі полімери пов'язані із збільшенням об'єму при виробництві хліба (Rouau, 1993; Rouau et al., 1994 і Courtin et al., 1999). У інших застосуваннях бажано модифікувати обидві фракції WU-AX і WE-AX, солюбілізуючи WU-AX, зменшуючи молекулярну масу, знижуючи їх гідроколоїдний ефект, отримуючи арабіноксиланові олігосахариди, забезпечуючи можливість подальшої деградації інших компонентів клітинної стінки (наприклад, у виробництві крекерів, сортуванні борошна, застосуванні кормів, виробництві біоетанолу, пребіотиків і т. д.). Всі вказані вище характеристики ксиланаз, використані в різних застосуваннях, спрямовані на функціональні якості ксиланаз і мають велике значення для досягнення необхідних функціональних якостей. Однак вибір ксиланаз, що мають правильні характеристики для певного застосування, або модифікація відомих ксиланаз для досягнення цієї мети, часто 1 UA 103216 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 приводять до отримання менш ефективної молекули ксиланази, наприклад, молекули з низькою каталітичною активністю (тобто, питомою активністю, що виражається в одиницях молекул/мг білка ксиланази). Оскільки дані молекули використовуються в промислових застосуваннях, то, отже, має велике значення, щоб вони мали як можна вищу каталітичну активність. Вдосконалення даної характеристики набуває все більше і більше значення для забезпечення промислового застосування даних ферментів в майбутньому, за рахунок зростання використання сільськогосподарських побічних продуктів, таких як висівки зернових рослин, або застосування у виробництві біоетанолу з целюлози. Суть винаходу Даний винахід створений на основі встановлення дивного факту, що є можливим модифікувати поліпептид з ксиланазною активністю в положенні 110 в порівнянні з послідовністю поліпептиду ксиланази В. subtilis, представленої як SEQ ID NO:1, з підвищенням солюбілізуючої активності для висівок і/або ксиланазної активності ферменту. Таким чином, авторами даного винаходу було показано, що є можливим отримати поліпептиди ксиланази, що мають підвищену ксиланазну активність і/або солюбілізуючу активність для висівок. Це забезпечить можливість, наприклад, гідролізувати геміцелюлозну фракцію при обробці зернових у виробництві біоетанолу з целюлози або дозволить знизити кількість ксиланази, необхідної в ряді застосувань, таких як виробництво кормів для тварин, розрідження крохмалю, хлібопекарська промисловість, сортування борошна (мокре розмелювання), виробництво пребіотиків і виробництво паперу і деревної пульпи. У першому аспекті даний винахід стосується поліпептиду, що має ксиланазну активність і містить амінокислотну послідовність, яка має щонайменше 88% ідентичність з SEQ ID NO:1 або має щонайменше 75% ідентичність з амінокислотною послідовністю, вибраною з послідовностей SEQ ID NO:2-22, і даний поліпептид містить модифікацію амінокислоти в положенні 110, де вказане положення 110 визначається вирівнюванням як положення, що відповідає положенню 110 в послідовності ксиланази В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. У другому аспекті даний винахід стосується поліпептиду, що має ксиланазну активність і містить амінокислотну послідовність, яка має щонайменше 88% ідентичність з SEQ ID NO:1, і даний поліпептид містить модифікацію амінокислоти в положенні 110, де вказане положення 110 визначається вирівнюванням як положення, що відповідає положенню 110 в послідовності ксиланази В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. У третьому аспекті даний винахід стосується поліпептиду, що має ксиланазну активність і містить амінокислотну послідовність, яка має щонайменше 75% ідентичність з SEQ ID NO:2, і даний поліпептид містить модифікацію амінокислоти в положенні 110, де вказане положення 110 визначається вирівнюванням як положення, що відповідає положенню 110 в послідовності ксиланази В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. У додатковому аспекті даний винахід стосується поліпептиду, що має ксиланазну активність і містить амінокислотну послідовність, яка має щонайменше 75% ідентичність з SEQ ID NO:3, і даний поліпептид містить модифікацію амінокислоти в положенні 110, де вказане положення 110 визначається вирівнюванням як положення, що відповідає положенню 110 в послідовності ксиланази В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. У додатковому аспекті даний винахід стосується способу ідентифікації поліпептиду за винаходом, де вказаний спосіб включає: (i) отримання поліпептиду, що має щонайменше 88% ідентичність з SEQ ID NO:1 або має щонайменше 75% ідентичність з амінокислотною послідовністю, вибраною з SEQ ID NO:2-22, і даний поліпептид містить модифікацію амінокислоти в положенні 110, і де вказане положення 110 визначається вирівнюванням як положення, що відповідає положенню 110 в послідовності ксиланази В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1; (ii) порівняння солюбілізуючої активності для висівок і/або ксиланазної активності вказаного поліпептиду з солюбілізуючою активністю для висівок і/або ксиланазною активністю амінокислотної послідовності, вибраною з SEQ ID NO:1-22, з якою він має найвищий процент ідентичності; і (iii) вибір поліпептиду, що має підвищену солюбілізуючу активність для висівок і/або ксиланазну активність в порівнянні з амінокислотною послідовністю, вибраною з SEQ ID NO:122, з якою він має найвищий процент ідентичності. У додатковому аспекті даний винахід стосується способу отримання поліпептиду за винаходом, де вказаний спосіб включає експресію нуклеотидної послідовності, що кодує вказаний поліпептид; і необов'язкове виділення і/або очищення поліпептиду після експресії. У деяких варіантах здійснення поліпептид отримують модифікацією амінокислотної послідовності поліпептиду в положенні 110 або кодона, який кодує амінокислотний залишок в 2 UA 103216 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 положенні 110 в нуклеотидній послідовності, що кодує амінокислотну послідовність поліпептиду, де положення 110 визначається відносно послідовності ксиланази В. subtilis, представленої як SEQ ID NO:1. У додатковому аспекті даний винахід стосується нуклеотидної послідовності, що кодує поліпептид за винаходом. У додатковому аспекті даний винахід стосується вектора, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид за винаходом. У додатковому аспекті даний винахід стосується клітини, яка трансформована нуклеотидною послідовністю, що кодує поліпептид за винаходом, або вектором, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид за винаходом. У додатковому аспекті даний винахід стосується організму-хазяїна, який трансформований нуклеотидною послідовністю, що кодує поліпептид за винаходом, або вектором, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид за винаходом. У додатковому аспекті даний винахід стосується композиції, що містить поліпептид за винаходом. У додатковому аспекті даний винахід стосується композиції, що містить поліпептид, ідентифікований способами за винаходом. У додатковому аспекті даний винахід стосується композиції, що містить поліпептид, отриманий за винаходом. У додатковому аспекті даний винахід стосується композиції, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид за винаходом. У додатковому аспекті даний винахід стосується композиції, що містить вектор, який включає нуклеотидну послідовність, що кодує поліпептид за винаходом. У додатковому аспекті даний винахід стосується композиції, що містить клітину, яка трансформована нуклеотидною послідовністю, що кодує поліпептид за винаходом. У додатковому аспекті даний винахід стосується композиції, що містить вектор, який включає нуклеотидну послідовність, що кодує поліпептид за винаходом. У додатковому аспекті даний винахід стосується композиції, що містить організм, який трансформований нуклеотидною послідовністю, що кодує поліпептид за винаходом, або вектором, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид за винаходом, в суміші з нетоксичним компонентом. У додатковому аспекті даний винахід стосується тесту, що містить поліпептид за винаходом або поліпептид, ідентифікований за винаходом, або поліпептид, отриманий за винаходом, або нуклеотидну послідовність за винаходом, або вектор за винаходом, або клітину за винаходом, або організм за винаходом в суміші з нетоксичним компонентом, або композицію за винаходом. У додатковому аспекті даний винахід стосується продукту хлібопекарського виробництва, що містить поліпептид за винаходом, або поліпептид, ідентифікований за винаходом, або поліпептид, отриманий за винаходом, або нуклеотидну послідовність за винаходом, або вектор за винаходом, або клітину за винаходом, або організм за винаходом в суміші з нетоксичним компонентом, або композицію за винаходом, або тісто за винаходом. У додатковому аспекті даний винахід стосується корму для тварин, що містить поліпептид за винаходом, або поліпептид, ідентифікований за винаходом, або поліпептид, отриманий за винаходом, або нуклеотидну послідовність за винаходом, або вектор за винаходом, або клітину за винаходом, або організм за винаходом в суміші з нетоксичним компонентом, або композицію за винаходом. У додатковому аспекті винаходу даний винахід стосується композиції для очищення, що містить ксиланазу. У деяких варіантах здійснення композиції для очищення являють собою композиції детергенту для пральні, в той час як в інших варіантах здійснення композиції для очищення представляють композиції для миття посуду. У деяких інших варіантах здійснення детергенти для миття посуду представляють детергенти для автоматичного миття посуду. У деяких додаткових варіантах здійснення композиції для очищення, що містять ксиланазу, додатково містять один або більше додаткових ферментів. У деяких варіантах здійснення додаткові ферменти вибрані з геміцелюлаз, целюлаз, пероксидаз, протеаз, ксиланаз, ліпаз, фосфоліпаз, естераз, кутиназ, пектиназ, пектатліаз, мананаз, кератиназ, редуктаз, оксидаз, фенолоксидаз, ліпооксигеназ, лігніназ, пуланаз, таназ, пентозаназ, маланаз, β-глюканаз, арабінозидаз, гуалуронідази, хондроїтинази, лакази і амілаз, або їх сумішей. У деяких варіантах здійснення застосування знаходить комбінація ферментів (тобто, «суміш»). У додатковому аспекті даний винахід стосується способу деградації або модифікації стінки рослинної клітини, де даний спосіб включає контактування вказаної стінки рослинної клітини з поліпептидом за винаходом, або поліпептидом, ідентифікованим за винаходом, або 3 UA 103216 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 поліпептидом, отриманим за винаходом, або нуклеотидною послідовністю за винаходом, або вектором за винаходом, або клітиною за винаходом, або організмом за винаходом в суміші з нетоксичним компонентом, або композицією за винаходом. У додатковому аспекті даний винахід стосується способу обробки рослинного матеріалу, де даний спосіб включає контактування вказаного рослинного матеріалу з поліпептидом за винаходом, або поліпептидом, ідентифікованим за винаходом, або поліпептидом, отриманим за винаходом, або нуклеотидною послідовністю за винаходом, або вектором за винаходом, або клітиною за винаходом, або організмом за винаходом в суміші з нетоксичним компонентом, або композицією за винаходом. У додатковому аспекті даний винахід стосується застосування поліпептиду за винаходом, або поліпептиду, ідентифікованого за винаходом, або поліпептиду, отриманого за винаходом, або нуклеотидної послідовності за винаходом, або вектора за винаходом, або клітини за винаходом, або організму за винаходом в суміші з нетоксичним компонентом, або композиції за винаходом в способі модифікації рослинних матеріалів. У додатковому аспекті даний винахід стосується застосування поліпептиду за винаходом, або поліпептиду, ідентифікованого за винаходом, або поліпептиду, отриманого за винаходом, або нуклеотидної послідовності за винаходом, або вектора за винаходом, або клітини за винаходом, або організму за винаходом в суміші з нетоксичним компонентом, або композиції за винаходом в одному або більше з хлібопекарського виробництва, обробки зернових, розрідження крохмалю, виробництва біоетанолу з целюлозного матеріалу, корму для тварин, обробки деревини, посилення відбілювання деревної пульпи. У додатковому аспекті даний винахід стосується поліпептиду або його фрагменту, в основному описаному при зверненні до прикладів або фігур. У додатковому аспекті даний винахід стосується способу, в основному описаного вище при зверненні до прикладів або фігур. У додатковому аспекті даний винахід стосується композиції, в основному описаної при зверненні до прикладів або фігур. У додатковому аспекті даний винахід стосується застосування, в основному описаного при зверненні до прикладів або фігур. Короткий опис фігур У даному документі робляться посилання на наступні фігури. На фігурі 1 приведене накладання варіанту ксиланази XynA Bacillus subtilis (T110A) (чорний колір), варіанту ксиланази Xyn2 Trichoderma reesei (T120A) (темно-сірий колір) і варіанту ксиланази XynA Thermomyces lanuginosus subtilis (T120A) (яскраво-сірий колір). Жирним шрифтом виділені мутовані залишки відповідно Т110 і Т120. На фіг. 2 показано вирівнювання численних послідовностей SEQ ID NO:1-22 з використанням програми AlignX (з пакету vectorNTI) з параметрами дефолту для численного вирівнювання (штраф за відкриття гепа: 10 og, штраф за подовження гепа 0,05). Номери в лівій частині послідовностей представляють номери послідовностей SEQ ID NO. Докладний опис винаходу Є повідомлення про ферменти ксиланазах приблизно з 100 різних організмів, включаючи рослини, гриби і бактерії. Ферменти ксиланази поділяються в більше ніж 40 сімейства ферментів глікозилгідролаз. Класифікація ферментів глікозилгідролаз, які включають ксиланази, манази, амілази, -глюканази, целюлази і інші карбогідрази, основана на таких властивостях, як амінокислотна послідовність, тривимірна структура і геометрія каталітичного сайту (Gilkes et al., 1991, Microbiol. Reviews, 55:303-315). У одному аспекті даний винахід стосується поліпептиду, що має ксиланазну активність і містить щонайменше три, наприклад, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять або десять замін амінокислоти в порівнянні з будь-якою амінокислотною послідовністю SEQ ID NO:1-22, і даний пептид містить заміну амінокислоти в положенні 110, і де вказане положення 110 визначається вирівнюванням як положення, що відповідає положенню 110 в послідовності ксиланази В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. У одному аспекті даний винахід стосується поліпептиду, що має ксиланазну активність і містить амінокислотну послідовність, яка має щонайменше 88% ідентичність з SEQ ID NO:1 або має щонайменше 75% ідентичність з амінокислотною послідовністю, вибраною з SEQ ID NO:222, і даний поліпептид містить модифікацію амінокислоти в положенні 110, де вказане положення 110 визначається вирівнюванням як положення, що відповідає положенню 110 в послідовності ксиланази В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. Положення конкретної амінокислоти в поліпептиді за даним винаходом визначається вирівнюванням амінокислотної послідовності вказаного поліпептиду з SEQ ID NO:1 з 4 UA 103216 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 використанням стандартного методу вирівнювання послідовностей, такого як вирівнювання двох послідовностей з використанням алгоритму Сміта-Ватермана або алгоритмів CLUSTALW2, в яких послідовності, як указано, вирівнюють, коли бал вирівнювання є найвищим. Бали вирівнювання можна розрахувати з використанням методів, описаних Wilbur W.J. and Lipman D.J. (1983) Rapid similarity searches of nucleic acid and protein data banks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:726-730. Переважно використовують параметри дефолту в алгоритмі CLUSTALW2 (1.82): штраф за відкриття гепа білка = 10,0; штраф за подовження гепа білка = 0,2; білковий матрикс = Gonnet; білок/ДНК ENDGAP = -1; білок/ДНК GAPDIST = 4. Переважно положення конкретної амінокислоти в поліпептиді за даним винаходом визначають вирівнюванням амінокислотної послідовності поліпептиду з SEQ ID NO:1 з використанням програми AlignX (з пакету vectorNTI) з параметрами дефолту для численного вирівнювання (штраф за відкриття гепа: 10 og, штраф за подовження гепа 0,05). Для деяких варіантів здійснення за даним винаходом вирівнювання можна провести з використанням фіг. 2, як описано в даному документі. У додатковому аспекті даний винахід стосується поліпептиду, що має ксиланазну активність і щонайменше 88% ідентичність з SEQ ID NO:1, і даний поліпептид містить модифікацію амінокислоти в положенні 110, де вказане положення 110 визначається вирівнюванням як положення, що відповідає положенню 110 в послідовності ксиланази В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. У додатковому аспекті даний винахід стосується поліпептиду, що має ксиланазну активність і має щонайменше 75% ідентичність з SEQ ID NO:2, і даний поліпептид містить модифікацію амінокислоти в положенні 110, де вказане положення 110 визначається вирівнюванням як положення, що відповідає положенню 110 в послідовності ксиланази В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. У додатковому аспекті даний винахід стосується поліпептиду, що має ксиланазну активність і має щонайменше 75% ідентичність з SEQ ID NO:3, і даний поліпептид містить модифікацію амінокислоти в положенні 110, де вказане положення 110 визначається вирівнюванням як положення, що відповідає положенню 110 в послідовності ксиланази В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. У додатковому аспекті даний винахід стосується поліпептиду, що має ксиланазну активність і має щонайменше 75% ідентичність з SEQ ID NO:4, і даний поліпептид містить модифікацію амінокислоти в положенні 110, де вказане положення 110 визначається вирівнюванням як положення, що відповідає положенню 110 в послідовності ксиланази В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. У додатковому аспекті даний винахід стосується поліпептиду, що має ксиланазну активність і містить амінокислотну послідовність, яка має щонайменше 75% ідентичність з SEQ ID NO:1, і даний поліпептид містить заміну амінокислоти в положенні 110 на будь-який один інший амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з глутамінової кислоти, триптофану, аланіну і цистеїну, де вказане положення 110 визначається вирівнюванням як положення, що відповідає положенню 110 в послідовності ксиланази В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. Якщо не указано інакше, то в тому значенні, в якому в даному документі використовується термін «ідентичність послідовностей» для амінокислот, він стосується ідентичності послідовностей, розрахованої як (nref-ndif)100/nref, де ndif представляє загальне число неідентичних залишків в двох послідовностях при вирівнюванні і nref представляє число залишків в одній з послідовностей. Отже, амінокислотна послідовність ASTDYWQNWT буде мати 80% ідентичність послідовності з послідовністю ASTGYWQAWT (ndif=2 і nref=10). У деяких варіантах здійснення ідентичність послідовностей визначають звичайними методами, наприклад, Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math., 2:482, пошуком на схожість методом Pearson & Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, з використанням алгоритму CLUSTAL W, Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Res., 22:467380, з використанням комп'ютерних програм для даних алгоритмів (GAP, BESTFIT, FASTA і TFASTA в пакеті програм Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group). Також можна використовувати алгоритм BLAST (Altschul et al., 1990, Mol. Biol., 215:403-410), для якого програмне забезпечення можна отримати через Національний інформаційний центр в біотехнології www.ncbi.nlm.nih.gov/). При використанні вказаних вище алгоритмів застосовують параметри дефолту для довжини «вікна», штраф за геп і т. д. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін «модифікація», він означає будь-яку хімічну модифікацію будь-якої однієї амінокислоти або амінокислотної послідовності поліпептиду, вибраної з SEQ ID NO:1-22, а також генетичну маніпуляцію з ДНК, 5 UA 103216 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 що кодує даний поліпептид. Модифікація може являти собою заміни, делеції і/або інсерції однієї або більше амінокислот, а також перестановки одного або більше бічних ланцюгів амінокислот. У деяких варіантах здійснення поліпептиди мають ксиланазну активність тільки при наявності амінокислотних замін відносно SEQ ID NO:1-22. Очевидно, зрозуміло, що «модифікація» в даному поліпептиді визначається відносно поліпептиду, вибраного з SEQ ID NO:1-22, з найвищим процентом ідентичності послідовностей до даному конкретному поліпептиду. Позначення для амінокислотних замін, використані в даному документі, є наступними. Перша буква представляє амінокислоту, що знаходиться в природних умовах в положенні конкретної послідовності. Наступна цифра представляє положення відносно SEQ ID NO:1. Друга буква означає іншу амінокислоту, на яку замінена природна амінокислота. Прикладом є D11F/R122D/T110A, де аспарагінова кислота в положенні 11 SEQ ID NO:1 замінена на фенілаланін і аргінін в положенні 122 SEQ ID NO:1 замінений на аспарагінову кислоту, і треонін в положенні 110 замінений на аланін, всі три мутації знаходяться в одному і тому ж поліпептиді, що має ксиланазну активність. Крім амінокислотних модифікацій в поліпептидах з ксиланазною активністю за винаходом поліпептиди можуть містити додаткові амінокислотні модифікації мінорної природи, тобто, консервативні амінокислотні заміни або інсерції, які не впливають істотного чином на укладання і/або активність білка; невеликі делеції, як правило, від 1 до приблизно 30 амінокислот, невеликі амінокінцеві або карбоксикінцеві додавання, такі як амінокінцевий залишок метіоніну; невеликий пептидний лінкер приблизно із 20-25 залишків; або невелике додавання, що полегшує виділення пептиду в результаті зміни загального заряду, або іншу функціональну групу, таку як полігістидин, антигенний епітоп або зв'язувальний домен. Прикладами консервативних замін є заміни в групі основних амінокислот (аргінін, лізин і гістидин), кислих амінокислот (глутамінова кислота і аспарагінова кислота), полярних амінокислот (глутамін і аспарагін), гідрофобних амінокислот (лейцин, ізолейцин і валін), ароматичних амінокислот (фенілаланін, триптофан і тирозин) і невеликих амінокислот (гліцин, аланін, серин, треонін і метіонін). Заміни амінокислоти, які по суті не приводять до зміни специфічної активності, відомі в даній галузі і описані, наприклад, H. Neurath and R.L. Hill, 1979 в The Proteins, Academic Press, New York. Замінами, що найчастіше зустрічаються є Ala на Ser, Val на Ile, Asp на Glu, Thr на Ser, Ala на Gly, Ala на Thr, Ser на Asn, Ala на Val, Ser на Gly, Tyr на Phe, Ala на Pro, Lys на Arg, Asp на Asn, Leu на Ile, Leu на Val, Ala на Glu і Asp на Gly. У доповненні до 20 стандартних амінокислот амінокислотні залишки поліпептиду дикого типу можуть бути замінені на нестандартні амінокислоти (такі як 4-гідроксипролін, 6-Nметиллізин, 2-аміноізомасляна кислота, ізовалін і альфа-метилсерин). Амінокислотні залишки можна замінити на обмежену кількість неконсервативних амінокислот, амінокислот, які не кодуються генетичним кодом, і амінокислот, якім відрізняються від природних. «Неприродні амінокислоти» модифікуються після синтезу білка, і/або вони мають хімічну структуру в їх бічному ланцюзі(ах), що відрізняється від звичайних амінокислот. Неприродні амінокислоти можна синтезувати хімічним шляхом, і переважно вони є промислово доступними, і вони включають піпеколінову кислоту, тіазолідинкарбонову кислоту, дегідропролін, 3- і 4метилпролін і 3,3-диметилпролін. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін «організм-хазяїн», він включає будь-який тип клітин, чутливих до трансформації, трансфекції, трансдукції і тому подібне, нуклеїновокислотною конструкцією або експресуючим вектором, що містить полінуклеотид, який кодує поліпептид за даним винаходом. Для цілей даного винаходу ксиланаза означає білок або поліпептид, який має ксиланазну активність. У тому значенні, в якому в даному документі використовується вираз «поліпептид, який має ксиланазну активність», він стосується будь-якого білка або поліпептиду, що виявляє активність в тесті оцінки ксиланазної активності, описаного в даному документі. Ксиланазну активність можна визначити з використанням будь-якого тесту, в якому використовується субстрат, що містить ендо-1,4-бета-D-ксилозидинові зв'язки в ксиланах. Значення рН і температура, що використовуються в даному тесті, адаптовані до конкретної ксиланази. Прикладами прийнятних значень рН є 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 або 11. Прикладами прийнятних значень температури є 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 або 80ºС. Є різні типи субстратів для визначення ксиланазної активності, наприклад, таблетки ксилазиму (поперечнозшитий, забарвлений ксилановий субстрат, мегазим, Bray, Ірландія). Переважно активність ксиланази визначають з використанням наступного методу. Тест визначення активності ксиланази (активність ендо--1,4-ксиланази) 6 UA 103216 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У даному тесті зразки розводять в буфері лимонна кислота (0,1 М)-динатрій гідрофосфат (0,2 М), рН 5,0 з отриманням оптичної густини OD590, що дорівнює приблизно 0,7. Три різні розведення зразка попередньо інкубували протягом 5 хв при 40ºC. Через 5 хв додавали 1 таблетку ксилазиму (поперечнозшитий, забарвлений ксилановий субстрат, мегазим, Bray, Ірландія) до розчину ферменту в загальному об'ємі реакційної суміші, що дорівнює 1 мл. Через 15 хв реакцію зупиняли додаванням 10 мл 2% Тріс/NaOH, рН 12. Контрольні проби готували з використанням 1000 мкл буфера замість розчину ферменту. Реакційну суміш центрифугували (1500×g, 10 хв, 20ºС) і визначали оптичну густину OD супернатанту при довжині хвилі 590 нм. Одна ксиланазна одиниця (XU) виражається як активність ксиланази, що приводить до збільшення OD590 зі швидкістю 0,025 на хвилину. Субстрат (поперечнозшитий і забарвлений арабіноксилан, екстрагований з пшениці), використаний в описаному вище тесті, близький до відповідного субстрату в промислових застосуваннях. Додатково ферменти можна класифікувати на основі керівництва «Enzyme Nomenclature» NC-IUBMB, 1992), див. також інтернет-сайт ENZYME: http://www.expasy.ch/enzyme/. На сайті ENZYME знаходиться інформація по номенклатурі ферментів. У основному вона основана на рекомендаціях Комітету по номенклатурі Міжнародного союзу по біохімії і біотехнології (IUB-MB) і описує кожний тип ферменту, що характеризується, який має номер ЕС (Enzyme Commission) (Bairoch А. The ENZYME database, 2000, Nucleic Acids Res., 28:304-305). Дана номенклатура ферментів IUB-MB основана на специфічності субстратів і в деяких випадках на молекулярному механізмі каталізу; в даній класифікації не відбиваються структурні властивості даних ферментів. У одному аспекті винаходу ксиланаза представляє фермент, що має класифікаційний номер EC 3.2.1.8. Офіційна назва ферменту ендо-1,4-бета-ксиланаза. Системна назва - 1,4бета-D-ксиланксиланогідролаза. Можна використовувати інші назви, такі як ендо-(1-4)-бетаксиланаза; (1-4)-бета-ксилан-4-ксиланогідролаза; ендо-1,4-ксиланаза; ксиланаза; бета-1,4ксиланаза; ендо-1,4-ксиланаза; ендо-бета-1,4-ксиланаза; ендо-1,4-бета-D-ксиланаза; 1,4-бетаксиланксиланогідролаза; бета-ксиланаза; бета-1,4-ксиланксиланогідролаза; ендо-1,4-бетаксиланаза; бета-D-ксиланаза. Реакція, що каталізується, являє собою ендогідроліз 1,4-бета-Dксилозидинових зв'язків в ксиланах. Декілька років тому була запропонована інша класифікація деяких ферментів глікозидгідролаз, таких як ендоглюканаза, ксиланаза, галактаназа, маназа, декстраназа і альфа-галактозидаза, в сімейства, основана на схожості амінокислотних послідовностей. У даний час система охоплює 90 різних сімейств: див. інтернет-сайт CAZy (ModO) (Coutinho P.M. & Henrissat В. (1999) Carbohydrate Active Enzymes, сервер на http://afmb.cnrsmrs.fr/(cazy/CAZY/index.html (відповідає статтям Coutinho P.M. & Henrissat В. (1999) Carbohydrate-active enzymes: an integrated database approach. In «Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering», Gilbert H.J., Davies G., Henrissat B. and Svensson B. eds., The Royal Society of Chemistry, Cambridge, pp. 3-12; Coutinho P.M. & Henrissat В. (1999) The modular structure of cellulases and other carbohydrate-active enzymes: an integrate database approach. In «Genetics, Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation», Ohmiya K., Hayashi K., Sakka K., Kobayashi Y., Karita S. and Kimura T. eds., Uni Publishers Co., Tokyo, pp. 15-23). У одному аспекті винаходу ксиланаза за винаходом є ксиланазою, що стосується сімейства 11 глікозидгідролаз (GH). Термін «сімейство 11 глікозидгідролаз (GH)» означає, що дана ксиланаза є, або її можна віднести до сімейства 11 GH. Очевидно, зрозуміло, що результати пошукових програм по ідентичності білків (таких як ProteinBlast, наприклад, на сайті http://toolkit.tuenbingen.mpg.de/prot_blast) необов'язково зможуть визначити, наскільки невідома послідовність дійсно потрапляє під визначення члена сімейства ксиланаз GH11. Послідовності білків, знайдені з використанням пошуку Blast, можуть мати відносно високу ідентичність/гомологію, але необов'язково є фактичними ксиланазами, і більше того, не є ксиланазами, що належать до сімейства GH11. Альтернативно, білкові послідовності можуть мати відносно низьку ідентичність первинної амінокислотної послідовності, але є членом сімейства ксиланаз GH11. Для визначення того, наскільки невідома послідовність білка дійсно представляє білок ксиланазу з сімейства GH11, потрібно провести оцінку не тільки по ідентичності послідовностей, але також відносно ідентичності 3D-структур, оскільки класифікація в GH-сімействах основана на 3D-укладанні. Програмне забезпечення, за допомогою якого можна прогнозувати 3D-укладання невідомої послідовності білка, представляє HHpred (http://toolkit.tuebingen.mpg.de/hhpred). Ефективність даного програмного забезпечення для прогнозу структури білка основується на ідентифікації гомологічних послідовностей з відомою структурою, які використовуються як матриця. Воно працює так ефективно, оскільки 7 UA 103216 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 структури відрізняються значно повільніше, ніж первинні послідовності. Білки одного сімейства можуть мати дуже близькі структури, навіть коли їх послідовності розійшлися нижче рівеня розпізнавання. На практиці невідому послідовність можна ввести в програмне забезпечення (http://toolkit.tuebingen.mpg.de/hhpred) в форматі FASTA. Здійснивши це, можна провести пошук. Результатом пошуку буде перелік послідовностей з відомими 3D-структурами. Для підтвердження того, що невідома послідовність дійсно є ксиланазою GH11, ксиланази GH11 потрібно знайти в переліку гомологів, що мають імовірність >90. Не всі білки, ідентифіковані як гомологи, будуть охарактеризовані як ксиланази GH11, але деякі будуть. Останні білки є білками з відомою структурою і біохімічною характеристикою, підтверджуючою, що це ксиланази. Перші не охарактеризовані біохімічно як ксиланази GH11. У декількох джерелах описаний даний протокол, таких як Soding J. (2005) Protein homology detection by HMM-HMM comparison. Bioinformatics, 21, 951-960 (doi:10.1093/bioinformatics/bti125) і Soding J., Biegert A. and Lupas A.N. (2005) The HHpred interactive server for protein homology detection and structure prediction. Nucleic Acids Research, 33, W244-W248 (Web Server issue) (doi:10.1093/nar/gki40). Згідно з сайтом Cazy(ModO) сімейство глікозидгідролаз 11 можна охарактеризувати наступним чином: відома активність: ксиланаза (ЕС 3.2.1.8) механізм: утримування каталітичний нуклеофіл/основа: Glu (експериментальний) каталітичний донор протонів: Glu (експериментальний) 3D-структура: «-рулет з желе» група: GH-C. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін «група С», він стосується груп сімейств, що розділяють тривимірне укладання і ідентичний каталітичний механізм (див., наприклад, Henrissat B. and Bairoch А. (1996), Biochem. J., 316, 695-696). У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін «сімейство 11», він стосується сімейства ферментів, встановленого Henrissat and Bairoch (1993) Biochem. J., 293, 781-788 (див. також Henrissat and Davies (1997) Current Opinion in Structural Biol., 1997, &: 637644). Загальні ознаки членів сімейства 11 включають високу генетичну гомологію, розмір приблизно 20 kDa і каталітичний механізм подвійного заміщення (див. Tenkanen et al., 1992; Wakarchuk et al., 1994). Структура ксиланаз сімейства 11 включає дві більші -складки з ланцюгів і α-спіралей. Сімейство 11 ксиланаз включає, не обмежуючись цим, Aspergillus niger XynA, Aspergillus kawachii XynC, Aspergillus tubigensis XynA, Bacillus circulans XynA, Bacillus punzilus XynA, Bacillus subtilis XynA, Neocalliniastrix patriciarum XynA, Streptomyces lividans XynB, Streptomyces lividans XynC, Streptomyces therinoviolaceus XynII, Termomonospora fusca XynA, Trichoderma harzianum Xyn, Trichoderma reesei XynI, Trichoderma reesei XynII, Trichoderma viride Xyn. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін «дикий тип», він стосується послідовності або білка, який є нативним або зустрічається в природі. У ще одному конкретному варіанті здійснення ксиланаза за винаходом отримана з бактеріальних ксиланаз, наприклад, бактерії (i) типу Firmicutes; (ii) класу Bacilli; (iii) ряду Bacilliales; (iv) сімейства Paenibacillaceae або (v) роду Paenibacillus, наприклад, бактерії (vi) видів Paenibacillus pabuli, Paenibacillus polymyxa або Paenibacillus sp.; наприклад, (vii) штамів Paenibacillus pabuli або Paenibacillus polymyxa. У тому значенні, в якому в даному документі використовується вираз «ксиланаза, отримана з бактеріальних ксиланаз», він включає будь-яку ксиланазу дикого типу, виділену з даної бактерії, а також її варіанти або фрагменти, що зберігають ксиланазну активність. У додатковому варіанті здійснення ксиланаза за винаходом отримана з ксиланаз грибів. Приведене вище визначення «отримана з» (для бактеріальних ксиланаз) аналогічно також застосовно до ксиланази грибів. Прикладами грибкових ксиланаз сімейства 11 глікозидгідролаз є ксиланази, які можна отримати з наступних родів грибів: Aspergillus, Aureobasidium, Emericella, Fusarium, Gaeumannomyces, Humicola, Lentinula, Magnaporthe, Neocallimastix, Nocardiopsis, Oprinomyces, Paecilomyces, Penicillium, Pichia, Schizophyllum, Talaromyces, Thermomyces, Trichoderma. Грибкові ксиланази включають ксиланази дріжджів і нитчастих грибів. У деяких варіантах здійснення ксиланазу за винаходом отримують з гриба (i) типу Ascomycota; (ii) класу Pezizomycotina; (iii) ряду Eurotiomycetes; (iv) підряду Eurotiales; (v) сімейства Trichocomaceae, наприклад, мітоспорові Trichocomaceae; або гриба (vi) роду Aspergillus, наприклад, (vii) штама Aspergillus niger. Очевидно, зрозуміло, що визначення вказаних вище видів включає перфектні і 8 UA 103216 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 неперфектні стані і інші таксономічні еквівалентні варіанти, наприклад, анаморфи, незалежно від назви виду, за якою вони відомі. Фахівці в даній галузі, очевидно, розуміють ідентичність відповідних еквівалентних варіантів. Штами вказаних вище бактерій і грибів доступні з ряду культуральних колекцій, таких як Американська колекція типових культур (АТСС), Німецька колекція мікроорганізмів і клітинних культур GmbH (DSMZ), Центральна колекція грибів (CBS) і Патентна служба досліджень по культуральних колекціях в сільському господарстві, Північний регіональний дослідницький центр (NRRL). Консультації з питань по таксономії можна отримати при зверненні до бази даних по таксономії, такої як Браузер таксономії NCBI, який доступний на наступному інтернет-сайті: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/taxonomyhome.html). Однак переважно звернутися до наступних посібників: Dictionary of the Fungi, 9th edition, edited by Kirk P.M., Cannon P.F., David J.C. & Stalpers J.A., CAB Publishing, 2001; і Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Second edition (2005). Даний винахід стосується модифікації(й) в певному амінокислотному положенні(ях). Дані положення перераховані при зверненні до амінокислотної послідовності В. subtilis, представленої як SEQ ID NO:1. У даному винаході поліпептиди з ксиланазною активністю містять модифікацію щонайменше в положенні 110 в порівнянні з послідовністю В. subtilis, представленою як SEQ ID NO:1. Еквівалентні положення в інших ксиланазах сімейства 11 можна знайти вирівнюванням інших ксиланаз з SEQ ID NO:1 з сімейства 11 і визначенням того, яка амінокислота вирівнюється з конкретною амінокислотою SEQ ID NO:1 (наприклад, див. приклад 5). Таке вирівнювання і застосування однієї послідовності як стандарту є звичайною процедурою для фахівців в даній галузі. У одному аспекті варіантна ксиланаза за винаходом має підвищену солюбілізуючу активність для висівок, яка вища, ніж можна отримати при використанні відповідної ксиланази дикого типу, або будь-якої ксиланази, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з SEQ ID NO:2-22, за даними «тесту оцінки солюбілізації висівок». У одному аспекті ксиланаза за винаходом має підвищену солюбілізуючу активність для висівок в результаті модифікації в положенні 110. Відповідно солюбілізуючої активності ксиланази для висівок можна оцінити з використанням тесту оцінки солюбілізації висівок, описаного в даному документі. Таким чином, можна забезпечити поліпептиди, що мають підвищену ксиланазну активність і/або підвищену солюбілізуючу активність для висівок. Вимога для специфічності відносно WU-AX стає все більш і більш важливою, оскільки в багатьох застосуваннях використовуються високі концентрації висівок зернових рослин. У хлібопекарській промисловості в багатьох продуктах використовують підвищені концентрації висівок для розв'язання проблем зі здоров'ям і харчуванням, в харчовій промисловості є тенденція до включення підвищених кількостей висівок (волокно, висушена барда з розчинними речовинами (DDGS)), наприклад, за рахунок застосування зернових у виробництві біоетанолу. Отже, переважно забезпечити нові ксиланази з підвищеною специфічністю, і, отже, ефективністю в солюбілізації висівок. Тест оцінки солюбілізації висівок Переважно розчинність висівок визначають з використанням наступного тесту. Готують суспензію пшеничних висівок в буфері лимонна кислота (0,1 М)-динатрій гідрофосфат (0,2 М), рН 5,0 з концентрацією 1,33% висівок (мас./мас.). Аліквотні порції даної суспензії об'ємом 750 мкл переносять в пробірки Епендорфа при перемішуванні. Кожну пробірку з субстратом попередньо нагрівають протягом 5 хв при 40ºС. До вмісту пробірки додають 250 мкл розчину ферменту до кінцевої концентрації субстрату 1%. Готують три розведення (в двох паралелях) розчину кожної ксиланази із зростаючими концентраціями ферменту (0,33; 1,0 і 3,0 мкг ксиланази/г висівок) на кожний час визначення (0, 30, 60 і 240 хв). Як контроль використовують розчин денатурованої нагріванням ксиланази. Реакцію зупиняють на вказані часові точки перенесенням пробірок в термостат при 95ºС. Денатуровані нагріванням проби зберігають при 4ºС до закінчення всіх ферментативних реакцій. Коли всі ферментні реакції зупинені, пробірки Епендорфа центрифугують з отриманням прозорого супернатанту. Здатність ферментів солюбілізувати висівки виражають у вигляді збільшення числа редукуючих кінцевих груп з використанням PAHBAH (Lever, 1972). Оскільки побічна активність, така як амілазна активність, може приводити до спотворення результатів описаного вище тесту, то тест солюбілізації потрібно проводити тільки на зразках очищеної ксиланази (див. приклад 2). 9 UA 103216 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У одному аспекті ксиланаза за винаходом має знижену чутливість до інігібітору ксиланази в порівнянні з будь-якою іншою ксиланазою дикого типу або будь-якою іншою ксиланазою, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з SEQ ID NO:2-22. У додатковому аспекті поліпептид, який має ксиланазну активність, за винаходом має знижену чутливість до інгібітору ксиланази в результаті модифікації в положенні 110 в комбінації з однією або більше модифікаціями в одному або більше амінокислотних положень: 11, 12, 13, 34, 54, 77, 81, 99, 104, 113, 114, 118, 122, 141, 154, 159, 162, 164, 166 і 175. Інгібітор може представляти інгібітор, що зустрічається в рослинних тканинах в природі. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін «інгібітор ксиланази», він стосується сполуки, як правило білка, функція якого полягає в регуляції деполімеризації складних вуглеводів, таких як арабіноксилан, що знаходиться в стінках рослинних клітин. Такі інгібітори ксиланази можуть знижувати активність ферментів ксиланаз, що зустрічаються в природі, а також ксиланаз грибкового або рослинного походження. Хоча є повідомлення про наявність інгібіторів ксиланаз в насінні злакових (див., наприклад, McLauchlan et al., 1999a; Rouau and Suget, 1998). McLauchlan et al. (1999а) описали виділення і охарактеризували білок з пшениці, який зв'язується і інгібує дві ксиланази з сімейства 11. Аналогічно в WO 98/49278 показаний вплив екстракту пшеничного борошна на активність деяких мікробних ксиланаз, всі з яких належать до ксиланазам сімейства 11. Debyser et al. (1999) також описали, що ендоксиланази Aspergillus niger і Bacillus subtilis, які, обидві, є членами сімейства 11, інгібувались під дією пшеничного інгібітору ксиланази, названого TAXI. McLauchlan et al. (1999b) повідомляли, що екстракти зразків комерційно доступного борошна, такого як пшеничне, ячмінне, рисове і кукурудзяне, здатні інгібувати ксиланази, що належать до обох сімейств 10 і 11. Інгібітор ксиланази може являти собою будь-який прийнятний інгібітор ксиланази. Як приклад інгібітор ксиланази може представляти інгібітор, описаний в WO-A-98/49278, і/або інгібітор ксиланази, описаний Rouau X. and Surget А. (1998), McLauchlan R. et al. (1999), і/або інгібітор ксиланази, описаний в заявці на патент Великобританії № 9828599.2 (поданій 23 грудня 1998 року), в заявці на патент Великобританії № 9907805.7 (поданій 6 квітня 1999 року) і в заявці на патент Великобританії № 9908645.6 (поданій 15 квітня 1999 року). Також інгібітори, описані на попередньому рівні техніки, можна використовувати в тестах визначення чутливості варіантного поліпептиду за винаходом до інгібіторів ксиланази. Їх також можна використовувати, як описано нижче, для модуляції функціональної активності ксиланази. Тест з інгібітором ксиланази Переважно інгібування активності ксиланази визначають з використанням наступного тесту. Змішували 100 мкл препарату інгібітору (того, що містить різні концентрації інгібітору ксиланази (для кількісного аналізу кількісне визначення інгібітору ксиланази див. нижче)), 250 мкл розчину ксиланази (що містить 12 XU ксиланазних одиниць/мл) і 650 мкл буфера (0,1 М лимонна кислота-0,2М динатрій гідрофосфат, 1% BSA (Sigma-Aldrich, США), рН 5,0). Суміш інкубували протягом 5 хв при 40,0ºС. Через 5 хв додавали одну таблетку ксилазиму. Через 15 хв реакцію зупиняли додаванням 10 мл 2% Тріс/NaOH, рН 12. Реакційну суміш центрифугували (1500×g, 10 хв, 20ºС) і визначали оптичну густину OD супернатанту при довжині хвилі 590 нм. Інгібування ксиланази розраховували як залишкову активність у % від активності в контролі. Ендогенну ендо--1,4-ксиланазу, використану в тесті, отримують з пшеничного борошна. Інгібітор являє собою дипептид з молекулярною масою приблизно 40 kDa (по даних електрофорезуSDS-PAGE або мас-спектрометрії) і pI знаходиться в межах приблизно від 8 до приблизно 9,5. Аналіз послідовності виявив, що інгібітор має послідовність SEQ ID NO:24 або послідовність з високою гомологією до неї. Метод кількісної оцінки концентрації інгібітору в даному препараті інгібітору можна знайти в прикладі 3. Контрольні проби готували аналогічно, замінивши розчин інгібітору на воду. Також даний винахід стосується нуклеотидної послідовності, яка кодує поліпептид за винаходом, що включає нуклеотидну послідовність, операбельно пов'язану з однією або більше регуляторних послідовностей, які регулюють експресію кодуючої послідовності у прийнятній клітині-хазяїні в умовах, сумісних з регуляторними послідовностями. Полінуклеотид, що кодує поліпептид за даним винаходом, можна обробити різними шляхами для забезпечення експресії поліпептиду. Обробка полінуклеотидної послідовності перед її вбудовуванням у вектор може бути бажаною або необхідною залежно від експресуючого вектора. Способи модифікації полінуклеотидних послідовностей, в яких використовуються методи рекомбінантної ДНК, відомі в даній галузі. 10 UA 103216 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Регуляторна послідовність може являти собою придатну промоторну послідовність, нуклеотидну послідовність, яка розпізнається клітиною-хазяїном, для експресії полінуклеотиду, що кодує поліпептид за даним винаходом. Промотор містить послідовності, контролюючі транскрипцію, які опосередковують експресію поліпептиду. Промотор може представляти будьяку нуклеотидну послідовність, що виявляє транскрипційну активність в переважній для вибору клітині-хазяїні, включаючи мутантні, усічені і гібридні промотори, і її можна отримати з генів, що кодують позаклітинні або внутрішньоклітинні поліпептиди, гомологічні або гетерологічні для клітини-хазяїна. Приклади прийнятних промоторів для регуляції транскрипції нуклеїновокислотних конструкцій за даним винаходом, особливо в бактеріальній клітині-хазяїні, представляють промотори, отримані з lac-оперону Е. coli, гена агарази Streptomyces coelicolor (dagA), гена левансахарази Bacillus subtilis (sacD), гена альфа-амілази Bacillus licheniformis (amyL), гена мальтогенної амілази Bacillus stearothermophillus (amyM), гена альфа-амілази Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), гена пеніцилінази Bacillus licheniformis (penP), генів xyIA і xyIB Bacillus subtilis і гена бета-лактамази прокаріотів (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 75:3727-3731), а також tac-промотор (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 80:21-25). Додаткові промотори описані в «Useful proteins from recombinant bacteria» в Scientific American, 1980, 242:74-94; і Sambrook et al., 1989, вище. Прикладами прийнятних промоторів для регуляції транскрипції нуклеїновокислотних конструкцій за даним винаходом в клітинах-хазяїнах, що являють собою нитчасті гриби, є промотори, отримані з генів амілази TAKA Aspergillus oryzae, аспарагінової протеїнази Rhizomucor miehei, нейтральної альфа-амілази Aspergillus niger, стабільної до кислот альфаамілази Aspergillus niger, глюкоамілази Aspergillus niger або Aspergillus awamori (glaA), ліпази Rhizomucor miehei, лужної протеази Aspergillus oryzae, триозофосфатізомерази Aspergillus oryzae, ацетамідази Aspergillus nidulans, амілоглюкозидази Fusarium venenatum (WO 00/56900), Daria Fusarium venenatum (WO 00/56900), Quinn Fusarium venenatum (WO 00/56900), трипсиноподібної протеази Fusarium oxysporum (WO 96/00787), бета-глюкозидази Trichoderma reesei, целобіогідролази I Trichoderma reesei, целобіогідролази II Trichoderma reesei, ендоглюканази I Trichoderma reesei, ендоглюканази II Trichoderma reesei, ендоглюканази III Trichoderma reesei, ендоглюканази IV Trichoderma reesei, ендоглюканази V Trichoderma reesei, ксиланази I Trichoderma reesei, ксиланази II Trichoderma reesei, бета-ксилозидази Trichoderma reesei, а також промотор NA2-tri (гібрид промоторів з генів нейтральної альфа-амілази Aspergillus niger і триозофосфатізомерази Aspergillus oryzae) і їх мутантні, усічені і гібридні промотори. У дріжджових хазяїнах прийнятні промотори отримують з генів енолази Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), галактокінази Saccharomyces cerevisiae (GAL1), алкогольдегідрогенази/гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази Saccharomyces cerevisiae (ADH1, ADH2/GAP), фосфатизомерази Saccharomyces cerevisiae (TPI), металотіоніну Saccharomyces cerevisiae (CUP1) і 3-фосфогліцераткінази Saccharomyces cerevisiae. Інші придатні промотори для дріжджових клітин-хазяїнів описані Romanos et al., 1992, Yeast, 8:423-488. Також регуляторна послідовність може представляти послідовність прийнятного термінатора транскрипції, послідовність, що розпізнається клітиною-хазяїном для закінчення транскрипції. Послідовність термінатора операбельно пов'язана з 3'-кінцем нуклеотидної послідовності, що кодує поліпептид. Можна використовувати будь-який термінатор, який функціонує в переважній для вибору клітині-хазяїні. Термінатори для клітин-хазяїнів, що являють собою нитчасті гриби, можна отримати з генів амілази TAKA Aspergillus oryzae, глюкоамілази Aspergillus niger, антранілатсинтази Aspergillus nidulans, альфа-глюкозидази Aspergillus niger і трипсиноподібної протеази Fusarium oxysporum. Термінатори дріжджових клітин-хазяїнів можна отримати з генів енолази Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), цитохрому С Saccharomyces cerevisiae (CYC1) і гліцеральдегід-3фосфатдегідрогенази Saccharomyces cerevisiae. Інші придатні термінатори для дріжджових клітин-хазяїнів описані Romanos et al., 1992, вище. Регуляторна послідовність також може представляти прийнятну лідерну послідовність, нетрансльовану область мРНК, яка важлива для трансляції клітиною-хазяїном. Лідерна послідовність операбельно зв'язана з 5'-кінцем нуклеотидної послідовності, що кодує поліпептид. У даному винаході можна використовувати будь-яку лідерну послідовність, яка функціонує в переважній для вибору клітині-хазяїні. Лідери для клітин-хазяїнів, що являють собою нитчасті гриби, можна отримати з генів амілази TAKA Aspergillus oryzae і триозофосфатізомерази Aspergillus nidulans. 11 UA 103216 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Прийнятні лідери для дріжджових клітин-хазяїнів отримують з генів енолази Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), 3-фосфогліцераткінази Saccharomyces cerevisiae, альфа-чинника Saccharomyces cerevisiae і алкогольдегідрогенази/гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP). Регуляторна послідовність може являти собою послідовність для поліаденілування, послідовність операбельно зв'язану з 3'-кінцем нуклеотидної послідовності і яка при транскрипції розпізнається клітиною-хазяїном як сигнал для додавання залишків поліаденозину до транскрибованої мРНК. У даному винаході можна використовувати будь-яку послідовність для поліаденілування, яка функціонує в переважній для вибору клітині-хазяїні. Послідовності для поліаденілування для клітин-хазяїнів, що являють собою нитчасті гриби, можна отримати з генів амілази TAKA Aspergillus oryzae, глюкоамілази Aspergillus niger, антранілатсинтази Aspergillus nidulans, трипсиноподібної протеази Fusarium oxysporum і альфа-глюкозидази Aspergillus niger. Прийнятні послідовності для поліаденілування для дріжджових клітин-хазяїнів описані Guo and Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology, 15:5983-5990. Регуляторна послідовність може також представляти область, що кодує сигнальний пептид, яка кодує амінокислотну послідовність, зв'язану з амінокінцем поліпептиду і спрямовує кодований поліпептид по секреторному шляху клітини. 5'-кінець кодуючої послідовності нуклеотидної послідовності може спочатку містити область, що кодує сигнальний пептид, природним чином пов'язану в трансляційний рамці зчитування з сегментом кодуючої області, яка кодує поліпептид, що секретується. Альтернативно, 5'-кінець кодуючої послідовності може містити область, що кодує сигнальний пептид, яка є чужорідною для кодуючої послідовності. Чужорідна область, що кодує сигнальний пептид, може бути потрібною, коли кодуюча послідовність в природних умовах не містить області, що кодує сигнальний пептид. Альтернативно, чужорідна область, що кодує сигнальний пептид, може просто замінювати природну область, що кодує сигнальний пептид, для підвищення секреції поліпептиду. Однак в даному винаході можна використовувати будь-яку область, що кодує сигнальний пептид, яка спрямовує поліпептид, що експресується, по секреторному шляху переважної для вибору клітини-хазяїна, тобто, секретуватися в культуральне середовище. Ефективні області, що кодують сигнальний пептид, для бактеріальних клітин-хазяїнів являють собою області, що кодують сигнальний пептид, отримані з генів мальтогенної амілази Bacillus NCIB 11837, альфа-амілази Bacillus stearothermophillus, субтилізину Bacillus licheniformis, бета-лактамази Bacillus licheniformis, нейтральних протеаз Bacillus stearothermophillus (nprT, nprS, nprM) і prsA Bacillus subtilis. Додаткові сигнальні пептиди описані Simonen and Palva, 1993, Microbiological Reviews, 57:109-137. Ефективними областями, що кодують сигнальний пептид, для клітин-хазяїнів, що являють собою нитчасті гриби, є області, що кодують сигнальний пептид, отримані з генів амілази TAKA Aspergillus oryzae, нейтральної амілази Aspergillus niger, глюкоамілази Aspergillus niger, аспарагінової протеїнази Rhizomucor miehei, целюлази Humicola insolens, ендоглюканази V Humicola insolens і ліпази Humicola lanuginose. Прийнятні сигнальні пептиди для дріжджових клітин-хазяїнів отримують з генів альфачинника Saccharomyces cerevisiae і інвертази чинника Saccharomyces cerevisiae. Інші прийнятні кодуючі області сигнальних пептидів описані Romanos et al., 1992, вище. Регуляторна послідовність також може представляти кодуючу пропептид область, яка кодує амінокислотну послідовність, що знаходиться на амінокінці поліпептиду. Отриманий в результаті поліпептид відомий як проензим або прополіпептид (або в деяких випадках зимоген). Як правило, прополіпептид є неактивним і може перетворюватися в зрілий активний поліпептид в результаті каталітичного або аутокаталітичного відщеплення пропептиду від прополіпептиду. Кодуючу пропептид область можна отримати з генів лужної протеази Bacillus subtilis (aprE), нейтральної протеази Bacillus subtilis (nprf), альфа-чинника Saccharomyces cerevisiae, аспарагінової протеїнази Rhizomucor miehei і лакази Myceliophthora thermophila (WO 95/33836). У тому випадку, коли на амінокінці поліпептиду одночасно знаходяться області сигнального пептиду і пропептиду, то область пропептиду знаходиться за амінокінцем поліпептиду і область сигнального пептиду знаходиться за амінокінцем області пропептиду. Також може бути бажаним додати регуляторні послідовності, що забезпечують регуляцію експресії поліпептиду, пов'язану із ростом клітини-хазяїна. Прикладами регуляторних систем є системи, які приводять до «включення» або «виключання» експресії гена у відповідь на хімічний або фізичний стимул, включаючи присутність регулюючої сполуки. Регуляторні системи в прокаріотичних системах включають lac-, tec- і tip-оператори. У дріжджах можна 12 UA 103216 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 використовувати системи ADH2 або GAL1. У нитчастих грибах як регуляторні послідовності можна використовувати промотор альфа-амілази TAKA, промотор глюкоамілази Aspergillus niger і промотор глюкоамілази Aspergillus oryzae. Іншими прикладами регуляторних послідовностей є послідовності, що забезпечують ампліфікацію генів. У еукаріотичних системах дані послідовності включають ген дигідрофолатредуктази, який ампліфікується в присутності метотрексату, і гени металотіонеїну, які піддаються ампліфікації в присутності важких металів. У даних випадках нуклеотидна послідовність, що кодує поліпептид, буде операбельно пов'язана з регуляторною послідовністю. Даний винахід також стосується рекомбінантних експресуючих векторів, що містять полінуклеотид, який кодує поліпептид за даним винаходом, промотор і стоп-сигнали транскрипції і трансляції. Різні нуклеїнові кислоти і регуляторні послідовності, описані в даному документі, можна з'єднати разом з отриманням рекомбінантного експресуючого вектора, який може включати один або більше відповідних сайтів рестрикції для інсерції або заміни нуклеотидної послідовності, що кодує поліпептид в таких сайтах. Альтернативно, нуклеотидну послідовність, що кодує поліпептид за даним винаходом, можна експресувати за допомогою вбудовування нуклеотидної послідовності або нуклеїновокислотної конструкції, що містить послідовність, у відповідний вектор для експресії. При конструюванні експресуючого вектора кодуючу послідовність у векторі розташовують таким чином, щоб кодуюча послідовність була операбельно пов'язана з відповідними регуляторними послідовностями для контролю експресії. Рекомбінантний експресуючий вектор може являти собою будь-який вектор (наприклад, плазміду або вірус), який можна піддати відповідно методам рекомбінантної ДНК і який забезпечує експресію нуклеотидної послідовності. Як правило, вибір вектора буде залежати від сумісності вектора з клітиною-хазяїном, в яку вводять вектор. Вектори можуть бути лінійними або замкненими кільцевими плазмідами. Вектор може являти собою вектор, що автономно реплікується, тобто, вектор, який існує у вигляді екстрахромосомної структури, реплікація якої не залежить від реплікації хромосом, наприклад, він може являти собою плазміду, екстрахромосомний елемент, мініхромосому або штучну хромосому. Вектор може містити будь-які елементи для забезпечення аутореплікації. Альтернативно, вектор може являти собою вектор, який при введенні в клітину-хазяїна, вбудовується в геном і реплікується разом з хромосомою(ами), в яку він інтегрований. Крім того, можна використовувати один вектор або плазміду, або два або більше векторів або плазмід, які спільно містять всю ДНК для введення в геном клітини-хазяїна, або транспозон. Вектори за даним винаходом переважно містять один або більше селективних маркерів, які дозволяють легко відібрати трансформовані, трансфектовані, трансдуковані або тому подібні клітини. Селективний маркер представляє ген продукту, який забезпечує резистентність до біоциду або вірусу, резистентність до важких металів, прототрофію до ауксотрофів і тому подібне. Прикладами бактеріальних селективних маркерів є гени dal з Bacillus subtilis або Bacillus licheniformis, або маркери, що надають резистентності до антибіотиків, наприклад, резистентності до ампіциліну, канаміцину, хлорамфеніколу або тетрациклину. Прийнятними маркерами для дріжджових клітин-хазяїнів є ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 і URA3. Селективні маркери для застосування в клітинах-хазяїнах, що являють собою нитчасті гриби, включають, не обмежуючись цим, amdS (ацетамідаза), argB (орнітинкарбамоїлтрансфераза), bar (фосфінотрицинацетилтрансфераза), hph (гігроміцинфосфотрансфераза), niaD (нітратредуктаза), pyrG (оротидин-5'-фосфатдекарбоксилаза), sC (сульфатаденілтрансфераза) і trpC (антранілатсинтаза), а також їх еквівалентні варіанти. У деяких варіантах здійснення застосовують гени amdS і pyrG Aspergillus nidulans або Aspergillus oryzae, і ген bar Streptomyces hygroscopicus в клітині Aspergillus. Вектори за даним винаходом переважно містять елемент(и), який забезпечує вбудовування вектора в геном клітини-хазяїна або автономну реплікацію вектора в клітині, незалежно від генома. Для вбудовування в геном клітини-хазяїна основою вектора може бути полінуклеотидна послідовність, що кодує поліпептид, або будь-який інший елемент вектора для вбудовування в геном за допомогою гомологічної або негомологічної рекомбінації. Альтернативно, вектор може містити додаткові нуклеотидні послідовності для напряму інтеграції за допомогою гомологічної рекомбінації в геном клітини-хазяїна в точному положенні(ях) в хромосомі(ах). Для підвищення імовірності інтеграції в точне положення елементи, що вбудовуються, повинні містити достатню кількість пар основ нуклеїнових кислот, наприклад, в межах 100-10000 пар основ, переважно 400-10000 пар основ і найбільш переважно 800-10000 пар основ, що мають високий ступінь ідентичності з відповідною послідовністю-мішенню для підвищення імовірності гомологічної рекомбінації. Елементи, що 13 UA 103216 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вбудовуються, можуть представляти будь-яку послідовність, яка гомологічна послідовностімішені в геномі клітини-хазяїна. Крім того, елементи, що вбудовуються, можуть бути некодуючими або кодуючими нуклеотидними послідовностями. З іншого боку, вектор можна інтегрувати в геном клітини-хазяїна за допомогою негомологічної рекомбінації. Для автономної реплікації вектор може додатково містити оріджин реплікації, що сприяє автономній реплікації вектора в даній клітині-хазяїні. Оріджин реплікації може являти собою будь-який плазмідний репликатор, що опосередковує автономну реплікацію, який функціонує в клітині. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін «оріджин реплікації» або «плазмідний репликатор», він означає нуклеотидну послідовність, яка забезпечує реплікацію плазміди або вектора в умовах in vivo. Прикладами бактеріальних оріджинів реплікації є оріджини реплікації плазмід pBR322, pUC19, pACYC177 і pACYC184, що забезпечують реплікацію в Е. coli і pUB1 10, pE194, pTA1060 і pAMβi, що забезпечують реплікацію в Bacillus. Прикладами оріджинів реплікації для застосування в дріжджових клітинах-хазяїнах є 2-мкм оріджин реплікації ARS1, ARS4, комбінація ARS1 і CEN3 і комбінація ARS4 і CEN6. Прикладами оріджинів реплікації, прийнятних для застосування в клітині нитчастого гриба, є AMA1 і ANSI (Gems et al., Gene, 98:61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Research, 15:91639175; WO 00/24883). Виділення гена AMA1 і конструювання плазмід або векторів, що містять ген, можна провести, слідуючи способам, розкритим в WO 00/24883. Для підвищення продукції гена-продукту в клітину-хазяїна можна вставити більше ніж одну копію полінуклеотиду за даним винаходом. Підвищення числа копій можна досягнути вбудовуванням в геном клітини-хазяїна щонайменше однієї додаткової копії послідовності або включенням селективного гена-маркера, що ампліфікується, спільно з полінуклеотидом, де клітини, що містять ампліфіковані копії селективного гена-маркера і, таким чином, додаткові копії полінуклеотиду, можна відібрати культивуванням клітин в присутності відповідного селективного агента. Фахівцям в даній галузі добре відомі методи, що використовуються для лігована елементів, описаних вище, для конструювання рекомбінантних експресуючих векторів за даним винаходом (див., наприклад, Sambrook et al., 1989, вище). Даний винахід також стосується рекомбінантних клітин-хазяїнів, що містять полінуклеотид, що кодує поліпептид за даним винаходом, які переважно використовують при рекомбінантній продукції поліпептидів. Вектор, що містить полінуклеотид, який кодує поліпептид за даним винаходом, вводять в клітину-хазяїна таким чином, щоб вектор підтримувався як інтегрований в хромосому елемент або як екстрахромосомний вектор, що самореплікується, описаний вище. Термін «клітина-хазяїн» включає будь-яке потомство вихідної клітини, яке не ідентичне вихідній клітині внаслідок мутацій, що відбуваються під час реплікації. Вибір клітини-хазяїна у великій мірі залежить від гена, що кодує поліпептид, і його джерела. Клітина-хазяїн може представляти одноклітинний мікроорганізм, наприклад, прокаріот, або багатоклітинний мікроорганізм, наприклад, еукаріот. Прийнятними одноклітинними мікроорганізмами є бактеріальні клітини, такі як грампозитивні бактерії, включаючи, не обмежуючись цим, клітину Bacillus, наприклад, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis і Bacillus thuringiensis; або клітину Streptomyces, наприклад, Streptomyces lividans і Streptomyces murinus, або грамнегативні бактерії, такі як Е. coli і Pseudomonas sp. У одному аспекті бактеріальною клітиною-хазяїном є клітина Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus або Bacillus subtilis. У іншому аспекті клітина Bacillus представляє алкалофільну клітину Bacillus. Введення вектора в бактеріальну клітину-хазяїна можна провести, наприклад, за допомогою трансформації протопластів (див., наприклад, Chang and Cohen, 1979, Molecular General Genetics, 168:111-115) з використанням компетентних клітин (див., наприклад, Young and Spizizen, 1961, Journal of Bacteriology, 81:823-829 або Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology, 56:209-221), електропорації (див., наприклад, Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques, 6:742-751) або кон’югації (див., наприклад, Koehler and Thome, 1987, Journal of Bacteriology, 169:5771-5278). Клітина-хазяїн також може представляти еукаріотичну клітину, таку як клітина ссавця, комахи, рослини або гриба. У одному аспекті клітина-хазяїн є клітиною грибів. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін «гриби», він включає типи Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota і Zygomycota (що визначаються Hawksworth et al., In Ainsworth and Bisby's Dictionary of the Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK), а 14 UA 103216 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 також Oomycota (цитоване Hawksworth et al., 1995, вище, сторінка 171) і всі мітоспорові гриби (Hawksworth et al., 1995, вище). У іншому аспекті клітина-хазяїн, що стосується грибів, представляє дріжджову клітину. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін «дріжджі», він включає аскоспорогенні дріжджі (Endomycetales), базидіоспорогенні дріжджі і дріжджі, що належать до недосконалих грибів (Blastomycetes). Оскільки класифікація дріжджів може змінитися в майбутньому, то для цілей даного винаходу дріжджі потрібно визначати, як описано в «Biology and Activities of Yeast» (Skinner F.A., Passmore S.M. and Davenport R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series, No 9, 1980). У ще одному додатковому аспекті дріжджова клітина-хазяїн представляє клітину Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces або Yarrowia. У одному конкретному варіанті здійснення дріжджова клітина-хазяїн представляє клітину Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis або Saccharomyces oviformis. У ще одному аспекті дріжджова клітина-хазяїн є клітиною Kluyveromyces lactis. У ще одному аспекті дріжджова клітина-хазяїн представляє клітину Yarrowia lipolytica. У ще одному аспекті клітина-хазяїн, що стосується грибів, представляє клітину нитчастого гриба. «Нитчасті гриби» включають всі нитчасті форми грибів, що належать до підрядів Eumycota і Oomycota (певні Hawksworth et al., 1995, вище). Як правило, нитчасті гриби характеризуються стінкою міцелію, що складається з хітину, целюлози, глюкану, хітозану, манану і інших складні полісахаридів. Вегетативний ріст відбувається за рахунок подовження гіфів, і катаболізм вуглецю є облігативно аеробним. На противагу, вегетативний ріст дріжджів, таких як Saccharomyces cerevisiae, відбувається за рахунок брунькування одноклітинного талому, і катаболізм вуглецю може бути ферментативним. У ще одному аспекті клітина-хазяїн, що належать до нитчастих грибів, представляє клітину Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastrix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes і Trichoderma. У ще одному варіанті здійснення клітина-хазяїн, що стосується нитчастих грибів, представляє клітину Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger або Aspergillus oryzae. У ще одному варіанті здійснення клітина-хазяїн, що належить до нитчастих грибів, представляє клітину Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellence, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides або Fusarium venenatum. У ще одному варіанті здійснення клітина-хазяїн, що належать до нитчастих грибів, представляє клітину Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Coprinus cinereus, Ceriolus hirsutus, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei або Trichoderma viride. Клітини грибів можна трансформувати методом, що включає утворення протопластів, трансформацію протопластів і регенерацію клітинної стінки в основному відомим способом. Прийнятні способи трансформації клітин-хазяїнів Aspergillus і Trichoderma описані в ЕР 238023 і Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 81:1470-1474. Прийнятні методи трансформації видів Fusarium описані Maladier et al., 1989, Gene, 78:147-156 і в WO 96/00787. Дріжджі можна трансформувати з використанням методів, описаних Becker and Guarente, In Abelson J.N. and Simon M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp. 182-187, Academic Press, Inc. New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology, 153:163 і Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 75:1920. Даний винахід також стосується способів отримання поліпептиду за даним винаходом, що включають (а) культивування клітини, яка в своїй формі дикого типу здатна продукувати поліпептид в умовах, прийнятних для продукції поліпептиду і (b) виділення поліпептиду. Переважно клітина є клітиною роду Aspergillus і більш переважно Aspergillus fumigatus. 15 UA 103216 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід також стосується способів отримання поліпептиду за даним винаходом, що включають (а) культивування клітини в умовах, прийнятних для продукції поліпептиду, і (b) виділення поліпептиду. У способах отримання за даним винаходом клітини культивують в поживному середовищі, прийнятному для отримання поліпептиду, з використанням способів, добре відомих в даній галузі. Наприклад, клітину можна культивувати за допомогою культивування у колбі, що струшується, і низькомасштабною або крупномасштабною ферментацією (включаючи постійну, періодичну ферментацію, ферментацію з підживленням або твердофазну ферментацію) в лабораторних або промислових ферментерах у прийнятному середовищі і в умовах, що забезпечують експресію і/або виділення поліпептиду. Культивування проводять у прийнятному поживному середовищі, що містить джерела вуглецю і азоту, і неорганічні солі з використанням методів, відомих в даній галузі. Прийнятні середовища є промислово доступними, або їх можна приготувати згідно з опублікованими складами (наприклад, в каталогах Американської колекції типових культур). Якщо поліпептид секретується в поживне середовище, то поліпептид можна виділити безпосередньо з середовища. Якщо поліпептид не секретується в середовище, то поліпептид можна виділити з клітинних лізатів. Поліпептиди можна детектувати з використанням методів, відомих в даній галузі, які є специфічними для поліпептидів. Дані методи детектування можуть включати застосування специфічних антитіл, утворення продукту ферменту або зникнення субстрату ферменту. Наприклад, для визначення активності поліпептиду можна використовувати ферментний метод, описаний в даному документі. Отриманий поліпептид можна виділити з використанням способів, відомих в даній галузі. Наприклад, поліпептид можна виділити з поживного середовища звичайними методами, включаючи, не обмежуючись цим, центрифугування, фільтрацію, екстракцію, сушіння розпиленням, випаровування або осадження. Поліпептиди за даним винаходом можна очистити різними способами, відомими в даній галузі, включаючи, не обмежуючись цим, хроматографію (наприклад, іонообмінну, афінну, гідрофобну, хроматофокусування і гельфільтрацію), електрофоретичні методи (наприклад, препаративне ізоелектричне фокусування), диференціальну розчинність (наприклад, осадження сульфатом амонію), електрофорез SDSPAGE або екстракцію (див., наприклад, Protein Purification, Janson J.-C. and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989) з отриманням по суті чистих поліпептидів. У одному аспекті модифікація амінокислоти в положенні 110 представляє заміну амінокислоти. У одному аспекті модифікація амінокислоти в положенні 110 представляє делецію амінокислоти. У одному аспекті модифікація амінокислоти в положенні 110 представляє інсерцію амінокислоти. У деяких варіантах здійснення ідентичність послідовності визначають відносно SEQ ID NO:1, де амінокислотна послідовність SEQ ID NO:1 додатково містить послідовність сигнального пептиду, таку як послідовність її природного сигнального пептиду. У деяких варіантах здійснення поліпептид за винаходом має щонайменше 90, 92 або 95% ідентичність з SEQ ID NO:1. У деяких варіантах здійснення поліпептид за винаходом має щонайменше 76, 78, 80, 85, 90, 95, 98 або 95% ідентичність з послідовністю, з якою він має найвищий процент ідентичності, вибраної з SEQ ID NO:2-22. У деяких варіантах здійснення поліпептид за винаходом має щонайменше 76, 78, 80, 85, 90, 95, 98 або 95% ідентичність з SEQ ID NO:2. У деяких варіантах здійснення поліпептид за винаходом має щонайменше 76, 78, 80, 85, 90, 95, 98 або 95% ідентичність з SEQ ID NO:3. У деяких варіантах здійснення поліпептид за винаходом має укладку «β-рулет з желе». У деяких варіантах здійснення за винаходом модифікація амінокислоти в положенні 110 представляє заміну амінокислоти. У деяких варіантах здійснення за винаходом модифікація амінокислоти в положенні 110 представляє заміну на будь-який інший амінокислотний залишок в положенні 110, вибраний з групи, яка складається з аланіну, аргініну, аспарагіну, аспарагінової кислоти, цистеїну, глутамінової кислоти, глутаміну, гліцину, гістидину, ізолейцину, лейцину, лізину, метіоніну, фенілаланіну, проліну, серину, триптофану, тирозину і валіну. У деяких варіантах здійснення за винаходом модифікація амінокислоти в положенні 110 представляє заміну на будь-який інший амінокислотний залишок в положенні 110, вибраний з групи, яка складається з аланіну, аргініну, аспарагіну, цистеїну, глутамінової кислоти, 16 UA 103216 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 глутаміну, гліцину, гістидину, ізолейцину, лейцину, лізину, метіоніну, фенілаланіну, проліну, серину, триптофану, тирозину і валіну. У деяких варіантах здійснення за винаходом модифікація амінокислоти в положенні 110 представляє заміну на будь-який інший амінокислотний залишок в положенні 110, вибраний з групи, яка складається з глутамінової кислоти, триптофану, аланіну і цистеїну. У деяких варіантах здійснення за винаходом модифікація амінокислоти в положенні 110 представляє заміну на аланін. У деяких варіантах здійснення поліпептид за винаходом має загальне число амінокислот менше ніж 250, наприклад, менше ніж 240, менше ніж 230, менше ніж 220, менше ніж 210, менше ніж 200, в межах від 160 до 240, в межах від 160 до 220 амінокислот. У деяких варіантах здійснення поліпептид за винаходом містить одну або більше модифікацій в одному або більше амінокислотних положень: 11, 12, 13, 34, 54, 77, 81, 99, 104, 113, 114, 118, 122, 141, 154, 159, 162, 164, 166 і 175, де положення визначається як відповідне положення в амінокислотній послідовності В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. У деяких варіантах здійснення поліпептид за винаходом містить одну або більше амінокислотних замін, вибраних з групи, яка складається з 11F, 12F, 54Q, 54W, 122D, 113A, 13Y, 113D, 175L, 122F, 34K, 99Y, 104W, 141Q, 154R, 159D, 175K, 81I, 166F, 162E, 162D, 164F, 114D, 114Y, 114F, 118V, 175K, 77L, 77M, 77S, 77V і 77Y, де положення визначається як відповідне положення в амінокислотній послідовності В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. У деяких варіантах здійснення поліпептид за винаходом містить одну або більше амінокислотних замін, вибраних з групи, яка складається з D11F, G12F, N54Q, R122D, Y113A, G13Y, Y113D, N141Q, Q175L, R122F, G34K, K99Y, T104W, K154R, N159D, Q175K, V81I, Y166F, S162E, S162D, W164F, N114D, N114Y, N114F, I118V, I77L, I77M, I77S, I77V і I77Y, де положення визначається як відповідне положення в амінокислотній послідовності В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. У деяких варіантах здійснення поліпептид за винаходом містить одну або більше модифікацій в будь-якому одному або більше з амінокислотних положень 13, 99, 104, 113, 122, 154, 159 і 175, де положення визначається як відповідне положення в амінокислотній послідовності В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. У деяких варіантах здійснення поліпептид за винаходом містить одну або більше замін в амінокислотних положеннях 13, 99, 104, 113, 122, 154, 159 і 175, де положення визначається як відповідне положення в амінокислотній послідовності В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. У деяких варіантах здійснення поліпептид за винаходом додатково містить одну або більше модифікацій в будь-якому одному або більше з амінокислотних положень 114 і 166, де положення визначається як відповідне положення в амінокислотній послідовності В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. У деяких варіантах здійснення поліпептид за винаходом додатково містить одну або більше замін в будь-якому одному або більше з амінокислотних положень 114 і 166, де положення визначається як відповідне положення в амінокислотній послідовності В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. У деяких варіантах здійснення поліпептид за винаходом містить заміну(и) щонайменше в чотирьох з наступних амінокислотних положень 13, 99, 104, 113, 114, 122, 154, 159, 166 і 175, де положення визначається як відповідне положення в амінокислотній послідовності В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. У деяких варіантах здійснення поліпептид за винаходом містить заміну(и) в амінокислотних положеннях 13, 99, 104, 113, 114, 122, 154, 159 і 175, де положення визначається як відповідне положення в амінокислотній послідовності В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. У деяких варіантах здійснення поліпептид за винаходом містить заміну(и) в амінокислотних положеннях 13, 99, 104, 113, 122, 154, 159, 166 і 175, де положення визначається як відповідне положення в амінокислотній послідовності В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. У деяких варіантах здійснення поліпептид за винаходом містить заміну(и) в амінокислотних положеннях 13, 99, 104, 113, 122, 154, 159 і 175, де положення визначається як відповідне положення в амінокислотній послідовності В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. У деяких варіантах здійснення поліпептид за винаходом містить одну або більше амінокислотних замін, вибраних з групи, яка складається з 13Y, 99Y, 104W, 110A, 113D, 114D, 114F, 122F, 154R, 159D, 166F, 175K і 175L, де положення визначається як відповідне положення в амінокислотній послідовності В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. У деяких варіантах здійснення поліпептид за винаходом містить щонайменше п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять або десять амінокислотних замін в порівнянні з послідовністю, вибраною з послідовностей SEQ ID NO:1-22, з якою він має найвищий процент ідентичності. 17 UA 103216 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У деяких варіантах здійснення поліпептид за винаходом містить щонайменше дев'ять або десять амінокислотних замін. У деяких варіантах здійснення поліпептид за винаходом містить одну або більше амінокислотних замін, вибраних з групи, яка складається з a. D11F, R122D і T110A; b. D11F, R122D, T110A і Y113A; с. G13Y, T110A, Y113D, R122D і Q175L; d. G13Y, T110A, Y113D, R122F і Q175L; е. G13Y, G34K, T110A, Y113D, R122D і Q175L; f. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, N114D, R122F, K154R, N159D і Q175K; g. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, K154R, N159D, Q175 і V81I; h. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, K154R, N159D, Y166F і Q175L; i. G13Y, T110A, Y113D, R122D, K154R, N159D і Q175L; j. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, K154R, N159D і Q175L; k. G13Y, T110A, Y113D, R122D, S162E і Q175L; l. G13Y, T110A, Y113D, R122D, S162D і Q175L; m. G13Y, T110A, Y113D, R122D, W164F і Q175L; n. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, N114D, R122F, K154R, N159D і Q175L; о. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, N114Y, R122F, K154R, N159D і Q175L; р. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, N114F, R122F, K154R, N159D і Q175L; q. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, I118V, R122F, K154R, N159D і Q175L; r. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, N114Y, R122F, K154R, N159D і Q175K; s. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, N114D, R122F, K154R, N159D і Q175K; t. G13Y, I77L, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, K154R, N159D і Q175L; u. G13Y, I77M, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, K154R, N159D і Q175L; v. G13Y, I77S, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, K154R, N159D і Q175L; w. G13Y, I77V, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, K154R, N159D і Q175L; х. G13Y, I77Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, K154R, N159D і Q175L у. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, N141Q, K154R, N159D, Q175L; z. G13Y, N54Q, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, N141Q, K154R, N159D, Q175; aa. G13Y, N54W, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, 141Q, K154R, N159D, 175L; bb. G13Y, N54Q, K99Y, T104W, T110A, Y113D, N114F, R122F, K154R, N159D, Q175L; cc. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, N114F, R122F, 141Q, K154R, N159D, Q175L; і dd. G13Y, 54Q, K99Y, T104W, T110A, Y113D, N114F, R122F, 141Q, K154R, N159D, Q175L; де положення визначається як відповідне положення в амінокислотній послідовності В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. У деяких варіантах здійснення поліпептид за винаходом містить одну або більше амінокислотних замін, вибраних з групи, яка складається з a. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, N114D, R122F, K154R, N159D і Q175K; b. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, K154R, N159D, Y166F і Q175L; с. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, K154R, N159D і Q175L; d. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, N114D, R122F, K154R, N159D і Q175L; е. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, N114F, R122F, K154R, N159D і Q175L; де положення визначається як відповідне положення в амінокислотній послідовності В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. У деяких варіантах здійснення поліпептид за винаходом має солюбілізуючу активність для висівок. У деяких варіантах здійснення поліпептид за винаходом знаходиться у виділеній формі. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін «виділений», він означає, що поліпептид по суті не містить щонайменше один інший компонент, з яким послідовність знаходиться в природі. У деяких варіантах здійснення за винаходом модифікація амінокислоти в положенні 110 не є T110D. У деяких варіантах здійснення поліпептид, який має ксиланазну активність, не містить аспарагінову кислоту в положенні 110. У деяких варіантах здійснення поліпептид за винаходом має підвищену ксиланазну активність в порівнянні з амінокислотною послідовністю В. subtilis, представленою як SEQ ID NO:1, за даними тесту оцінки активності ксиланази. У деяких варіантах здійснення поліпептид за винаходом має підвищену ксиланазну активність внаслідок модифікації в положенні 110. 18 UA 103216 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У деяких варіантах здійснення поліпептид за винаходом має підвищену солюбілізуючу активність для висівок в порівнянні з амінокислотною послідовністю В. subtilis, представленою як SEQ ID NO:1, за даними тесту оцінки солюбілізуючої активності для висівок. У деяких варіантах здійснення поліпептид за винаходом має підвищену солюбілізуючу активність для висівок в результаті модифікації в положенні 110. У деяких варіантах здійснення поліпептид за винаходом має знижену чутливість до інгібітору ксиланази. У деяких варіантах здійснення поліпептид за винаходом має амінокислотну послідовність,що містить модифікації в положеннях, вибраних з переліку, що складається з a) 13/110/113/122/154/159/175; b) 13/99/104/110/113/122/154/159/166/175; c) 13/99/104/110/113/114/122/154/159/175; d) 13/110/113/122/175; e) 13/99/104/110/113/122/154/159/175; f) 13/99/104/110/113/122/154/159/175; g) 13/99/104/110/113/114/122/154/159/175; h) 13/99/104/110/113/114/122/154/159/175; i) 13/99/104/110/113/114/122/154/159/175; j) 13/99/104/110/113/114/122/154/159/175; k) 13/77/99/104/110/113/122/154/159/175; l) 13/81/99/104/110/113/122/154/159/175; m) 13/110/113/122/164/175; n) 13/110/113/122/162/175; o) 13/110/113/122/175; p) 11/122/110/113; q) 13/77/99/104/110/113/122/154/159/175; r) 11/122/110; s) 13/34/110/113/122/175; t) 13/77/99/104/110/113/122/154/159/175; u) 13/77/99/104/110/113/122/154/159/175; v) 13/99/104/110/113/118/122/154/159/175; w) 13/110/113/122/162/175; x) 13/77/99/104/110/113/122/154/159/175; y) 13/99/104/110/113/122/141/154/159/175; z) 13/54/99/104/110/113/122/141/154/159/175; aa) 13/54/99/104/110/113/122/141/154/159/175; bb) 13/54/99/104/110/113/114/122/154/159/175; cc) 13/99/104/110/113/114/122/141/154/159/175; і dd) 13/54/99/104/110/113/114/122/141/154/159/175; де положення визначається як відповідне положення в амінокислотній послідовності В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. У деяких варіантах здійснення поліпептид за винаходом має амінокислотну послідовність, що містить амінокислотні заміни, вибрані з переліку, що складається з a) 13Y/110A/113D/122D/154R/159D/175L; b) 13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/166F/175L; c) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/154R/159D/175L; d) 13Y/110A/113D/122F/175L; e) 13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; f) 13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175K; g) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114D/122F/154R/159D/175K; h) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114Y/122F/154R/159D/175L; i) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114D/122F/154R/159D/175L; j) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114Y/122F/154R/159D/175K; k) 13Y/77L/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; l) 13Y/81I/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; m) 13Y/110A/113D/122D/164F/175L; n) 13Y/110A/113D/122D/162D/175L; o) 13Y/110A/113D/122D/175L; p) 11F/122D/110A/113A; q) 13Y/77Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; 19 UA 103216 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 r) 11F/122D/110A; s) 13Y/34K/110A/113D/122D/175L; t) 13Y/77V/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; u) 13Y/77M/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; v) 13Y/99Y/104W/110A/113D/118V/122F/154R/159D/175L; w) 13Y/110A/113D/122D/162E/175L; x) 13Y/77S/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; y) 13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/141Q/154R/159D/175L; z) 13Y/54Q/99Y/104W/110A/113D/122F/141Q/154R/159D/175L; aa) 13Y/54W/99Y/104W/110A/113D/122F/141Q/154R/159D/175L; bb) 13Y/54Q/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/154R/159D/175L; cc) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/141Q/154R/159D/175L; і dd) 13Y/54Q/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/141Q/154R/159D/175L; де положення визначається як відповідне положення в амінокислотній послідовності В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. У деяких варіантах здійснення поліпептид за винаходом має амінокислотну послідовність SEQ ID NO:1, що містить амінокислотні заміни, вибрані з переліку, що складається з a) G13Y/T110A/Y113D/R122D/K154R/N159D/Q175L; b) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Y166F/Q175L; c) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/K154R/N159D/Q175L; d) G13Y/T110A/Y113D/R122F/Q175L; e) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L; f) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175K; g) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114D/R122F/K154R/N159D/Q175K; h) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114Y/R122F/K154R/N159D/Q175L; i) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114D/R122F/K154R/N159D/Q175L; j) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114Y/R122F/K154R/N159D/Q175K; k) G13Y/I771VK99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L; l) G13Y/V81I/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L; m) G13Y/T110A/Y113D/R122D/W164F/Q175L; n) G13Y/T110A/Y113D/R122D/S162D/Q175L; o) G13Y/T110A/Y113D/R122D/Q175L; p) D11F/R122D/T110A/Y113A; q) G13Y/I77Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L; r) D11F/R122D/T110A; S) G13Y/G34K/T110A/Y113D/R122D/Q175L; t) G13Y/I77V/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L; u) G13Y/I77M/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L; v) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/I118V/R122F/K154R/N159D/Q175L; w) G13Y/T110A/Y113D/R122D/S162E/Q175L; і x) G13Y/I77S/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L y) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/N141Q/K154R/N159D/Q175L; z) G13Y/N54Q/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/N141Q/K154R/N159D/Q175L; aa) G13Y/N54W/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/141Q/K154R/N159D/175L; bb) G13Y/N54Q/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/K154R/N159D/Q175L; cc) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/141Q/K154R/N159D/Q175L; і dd) G13Y/54Q/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/141Q/K154R/N159D/Q175L У деяких варіантах здійснення поліпептид за винаходом має амінокислотну послідовність, що містить амінокислотні заміни, вибрані з переліку, що складається з a) 13Y/110A/113D/122D/154R/159D/175L; b) 13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/166F/175L; c) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/154R/159D/175L; d) 13Y/110A/113D/122F/175L; e) 13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; f) 13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175K; g) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114D/122F/154R/159D/175K; h) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114Y/122F/154R/159D/175L; i) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114D/122F/154R/159D/175L; j) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114Y/122F/154R/159D/175K; k) 13Y/77L/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; 20 UA 103216 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 l) 13Y/81I/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; m) 13Y/110A/113D/122D/164F/175L; n) 13Y/110A/113D/122D/162D/175L; o) 13Y/110A/113D/122D/175L; p) 11F/122D/110A/113A; q) 13Y/77Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; r) 11F/122D/110A; s) 13Y/34K/110A/113D/122D/175L; t) 13Y/77V/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; u) 13Y/77M/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; v) 13Y/99Y/104W/110A/113D/118V/122F/154R/159D/175L; w) 13Y/110A/113D/122D/162E/175L; x) 13Y/77S/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; y) 13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/141Q/154R/159D/175L; z) 13Y/54Q/99Y/104W/110A/113D/122F/141Q/154R/159D/175L; aa) 13Y/54W/99Y/104W/110A/113D/122F/141Q/154R/159D/175L; bb) 13Y/54Q/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/154R/159D/175L; cc) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/141Q/154R/159D/175L; і dd) 13Y/54Q/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/141Q/154R/159D/175L; де положення визначається як відповідне положення в амінокислотній послідовності В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. У деяких варіантах здійснення поліпептид за винаходом має амінокислотну послідовність SEQ ID NO:1, що містить амінокислотні заміни, вибрані з переліку, що складається з a) G13Y/T110A/Y113D/R122D/K154R/N159D/Q175L; b) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Y166F/Q175L; c) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/K154R/N159D/Q175L; d) G13Y/T110A/Y113D/R122F/Q175L; e) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L; f) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175K; g) G13Y/K99Y/T104W/T110A/YH3D/N114D/R122F/K154R/N159D/Q175K; h) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114Y/R122F/K154R/N159D/Q175L; i) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114D/R122F/K154R/N159D/Q175L; j) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114Y/R122F/K154R/N159D/Q175K; k) G13Y/I77L/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L; l) G13Y/V81I/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L; m) G13Y/T110A/Y113D/R122D/W164F/Q175L; n) G13Y/T110A/Y113D/R122D/S162D/Q175L; o) G13Y/T110A/Y113D/R122D/Q175L; p) D11F/R122D/T110A/Y113A; q) G13Y/I77Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L; r) D11F/R122D/T110A; s) G13Y/G34K/T110A/Y113D/R122D/Q175L; t) G13Y/I77V/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L; u) G13Y/I77M/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L; v) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/I118V/R122F/K154R/N159D/Q175L; w) G13Y/T110A/Y113D/R122D/S162E/Q175L; і x) G13Y/I77S/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L y) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/N141Q/K154R/N159D/Q175L; z) G13Y/N54Q/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/N141Q/K154R/N159D/Q175L; aa) G13Y/N54W/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/141Q/K154R/N159D/175L; bb) G13Y/N54Q/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/K154R/N159D/Q175L; сс) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/141Q/K154R/N159D/Q175L; і dd) G13Y/54Q/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/141Q/K154R/N159D/Q175L У деяких варіантах здійснення поліпептид за винаходом не є послідовністю SEQ ID NO:25. У деяких варіантах здійснення поліпептид за винаходом не має послідовності, вибраної з переліку, що складається з: SEQ ID NO:57 в WO0238746; SEQ ID NO:62 в WO0238746; SEQ ID NO:59 в WO0238746; SEQ ID NO:53 в WO0238746; 21 UA 103216 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 SEQ ID NO:65 в WO0238746; SEQ ID NO:56 в WO0238746; SEQ ID NO:64 в WO0238746; SEQ ID NO:52 в WO0238746; SEQ ID NO:63 в WO0238746; SEQ ID NO:61 в WO0238746; SEQ ID NO:60 в WO0238746; SEQ ID NO:58 в WO0238746; SEQ ID NO:55 в WO0238746; SEQ ID NO:12 в WO0238746; SEQ ID NO:11 в WO0238746; SEQ ID NO:21 в WO0068396 і SEQ ID NO:22 в WO0068396. У деяких варіантах здійснення даного винаходу амінокислотну послідовність застосовують для крупномасштабних застосувань. Переважно амінокислотну послідовність отримують в кількості від 1 г на літр до приблизно 100 г на літр загального об'єму клітинної культури після культивування організму-хазяїна. Даний винахід також стосується композиції, що містить амінокислотні послідовності і/або нуклеотидні послідовності, що кодують ксиланазу, як описано в даному документі. Композиція за даним винаходом може забезпечувати поліпшений запах, смак, м'якість, консистенцію, текстуру, зовнішній вигляд, післясмак у роті, густину, в'язкість, гелеву фракцію, структуру і/або органолептичні властивості і поживність продуктів споживання, що містять вказану композицію. Крім того, композицію за даним винаходом можна використовувати в комбінації з іншими компонентами продуктів споживання для забезпечення вказаних удосконалень. Незважаючи на те, що переважно, щоб композицію за даним винаходом використали для поліпшення запаху, смаку, м'якості, консистенції, текстури, зовнішнього вигляду, післясмаку у роті, густини, в'язкості, гелевої фракції, структури і/або органолептичних властивостей і поживності продуктів споживання, що містять вказану композицію, в об'єм даного винаходу також входить застосування композиції за даним винаходом як компонента фармацевтичних комбінацій з іншими компонентами для забезпечення лікувального або фізіологічного позитивного ефекту для споживача. Отже, композицію за даним винаходом можна використовувати в комбінації з іншими компонентами. Приклади інших компонентів включають один або більше із загусників, желюючих агентів, емульгаторів, зв'язувальних речовин, модифікаторів кристалізації, підсолоджувачів (включаючи штучні підсолоджувачі), модифікаторів реології, стабілізаторів, антиоксидантів, барвників, ферментів, носіїв, розчинників, наповнювачів, розріджувачів, ковзних речовин, смакових речовин, забарвлюючої речовини, суспендуючих агентів, розріджувачів, зв'язувальних добавок для грануляції і т. п. Ці інші компоненти можуть представляти компоненти природного походження. Ці інші компоненти можна отримати за допомогою застосування хімічних і/або ферментативних методів. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін «загущувач або желюючий агент», він стосується продукту, який попереджує розділення композиції сповільненням або попередженням руху частинок, наприклад, капання рідин, які не змішуються, повітряних пухирців або нерозчинних твердих частинок. Загуснення має місце, коли окремі гідратовані молекули спричиняють підвищення в'язкості, сповільнюючи тим самим розділення композиції. Желювання має місце, коли гідратовані молекули зв'язуються з утворенням тривимірної мережі, яка захоплює частинки, тим самим іммобілізуючи їх. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін «стабілізатор», він визначається як інгредієнт або комбінація інгредієнтів, що оберігають продукт (наприклад, продукт харчування) від зміни з плином часу. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін «емульгатор», він стосується інгредієнту (наприклад, інгредієнту продукту харчування), який попереджує розділення емульсій. Емульсії являють собою систему з двох речовин, що не змішуються, одна в формі крапель, що знаходяться в іншій речовині. Емульсії можуть представляти емульсію масло-в-воді, в якій краплі або диспергована фаза є маслом, і безперервна фаза є водою; або емульсію вода-в-маслі, в якій вода стає диспергованою фазою, і безперервною фазою є масло. Піни, що представляють систему газ-в-рідини і суспензії, які, в свою чергу, є системою тверда рідина-в-рідини, також можна стабілізувати з використанням емульгаторів. Аерація може мати 22 UA 103216 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 місце в трифазній системі, в якій повітря захоплюється рідким маслом, потім стабілізується агломерованими жирними кристалами, стабілізованими емульгатором. Емульгатори містять полярну групу з афінністю до води (гідрофільну) і неполярну групу, що має спорідненість до масла (ліпофільну). Вони вбираються на поверхні розділення двох речовин, утворюючи міжфазну плівку, що стабілізує емульсію. Структура молекули визначає гідрофільні/ліпофільні властивості емульгаторів. Дані властивості виражаються в значенні гідрофільного/ліпофільного балансу (ГЛБ). Низькі значення ГЛБ вказують на більш виражені ліпофільні властивості, які використовують для стабілізації емульсій вода-в-маслі. Вищі значення ГЛБ характерні для гідрофільних емульгаторів, що звичайно використовуються в емульсіях масло-в-воді. Дані значення отримані для простих систем. Оскільки харчові продукти часто містять інші інгредієнти, що впливають на емульговані, то значення ГЛБ не завжди є надійним показником для вибору емульгатора. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін «зв’язувальна речовина», він стосується інгредієнту (наприклад, інгредієнту продукту харчування), який «зв'язує» продукт в єдине ціле за допомогою фізичної або хімічної взаємодії. Наприклад, під час «підйому» вода вбирається, забезпечуючи зв’язувальний ефект. Однак зв’язувальні речовини можуть абсорбувати інші рідини, такі як масла, утримуючи їх всередині продукту. У контексті даного винаходу зв’язувальні речовини звичайно використовують в твердих продуктах або продуктах з низьким вмістом вологи, наприклад, в продуктах хлібопекарського виробництва: борошняних кондитерських виробах, пончиках, хлібі і інших. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін «модифікатор кристалізації», він стосується інгредієнту (наприклад, інгредієнту продукту харчування), який впливає на кристалізацію жиру або води. Стабілізація крижаних кристалів важлива по двох причинах. Перша причина безпосередньо пов'язана зі стабільністю продукту з точки зору розділення. Чим більшій кількості циклів заморожування/відтавання піддається продукт, тим крупніші стають крижані кристали. Дані великі кристали можуть порушити структуру продукту природним шляхом, як це має місце у випадку руйнування клітинних стінок, або внаслідок «підйому». Оскільки вода більше не утримується на місці, то після відтавання може мати місце синерезис продукту, або просочення води. Друге, в тому випадку, коли продукт споживається в замороженому вигляді, то дані великі кристали приводять до небажаного «зернистого» післясмаку у роті. «Носії» або «розчинники» означають речовини, відповідні для введення сполук, і вони включають будь-які такі речовини, відомі в даній галузі, наприклад, будь-яку рідину, гель, розчинник, рідкий розріджувач, солюбілізатор або тому подібне, які є нетоксичними і не взаємодіють з компонентами композиції, призводячи до негативних наслідків. Приклади прийнятних з харчової точки зору носіїв включають, наприклад, воду, сольові розчини, спирт, силікон, віск, вазелін, рослинні олії, поліетиленгліколи, пропіленгліколь, ліпосоми, цукри, желатин, лактозу, амілозу, стеарат магнію, тальк, поверхнево-активні речовини, кремнієву кислоту, в'язкий парафін, ароматизоване масло, моногліцериди і дигліцериди жирних кислот, ефіри жирних кислот з нафтохімічної сировини, гідроксиметилцелюлозу, полівінілпіролідон і тому подібне. Приклади наповнювачів включають одне або більше з мікрокристалічної целюлози і іншої целюлози, лактози, цитрату натрію, карбонату кальцію, двоосновного фосфату кальцію, гліцину, крохмалю, молочного цукру і високомолекулярних поліетиленгліколів. Приклади розпушувачів включають одне або більше з крохмалю (переважно, кукурудзяного, картопляного або тапіокового крохмалю), натрію-крохмальгліколяту, кроскармелози натрію і деяких складних силікатів. Приклади зв’язувальних добавок для грануляції включають одне або більше з полівінілпіролідону, гідроксипропілметилцелюлози (HPMC), гідроксипропілцелюлози (HPC), сахарози, мальтози, желатину і аравійської камеді. Приклади ковзних речовин включають одне або більше з стеарату магнію, стеаринової кислоти, гліцерилбегенату і тальку. Приклади розріджувачів включають одне або більш з води, етанолу, пропіленгліколю і гліцерину, і їх комбінацій. Інші компоненти можна використовувати одночасно (наприклад, коли вони знаходяться в суміші один з одним або навіть коли вони вводяться різними шляхами) або послідовно (наприклад, їх можна вводити різними шляхами). У тому значенні, в якому в даному документі використовується вираз «компонент, прийнятний для споживання твариною або людиною», він означає сполуку, яку додають або можна додати в композицію за даним винаходом, як добавку, яка має харчову цінність, замінює 23 UA 103216 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 волокна або чинить загальну оздоровчу дію на організм споживача. Інгредієнти можна використовувати в широкому ряді продуктів, для яких потрібно желювання, текстурування, стабілізація, суспендування, утворення плівки і структуроутворення, збереження соковитості без непотрібного збільшення в'язкості. Переважно інгредієнти здатні збільшити термін зберігання і стабільність живої культури. Як приклад компоненти можуть представляти пребіотики, такі як альгінат, ксантан, пектин, камедь ріжкового дерева (LBG), інулін, гуарову камедь, галактоолігосахарид (GOS), фруктоолігосахарид (FOS), лактосахарозу, соєві олігосахариди, палатинозу, ізомальтоолігосахариди, глюкоолігосахариди і ксилоолігосахариди. Композицію за даним винаходом можна використовувати як продукт харчування або в процесі отримання продукту харчування. У даному документі термін «продукт харчування» використовується в широкому значенні і включає продукт харчування для людей, а також продукт харчування для тварин (тобто, корм). У переважному аспекті продукт харчування призначається для споживання людиною. Продукт харчування може знаходитися в формі розчину або у вигляді твердої речовини залежно від застосування, і/або способу застосування, і/або способу введення. При використанні як продукту харчування або в процесі отримання продукту харчування, такого як функціональний продукт харчування, композицію за даним винаходом можна використовувати в комбінації з одним або більше з прийнятного з харчової точки зору носія, прийнятного з харчової точки зору розріджувача, прийнятного з харчової точки зору наповнювача, прийнятного з харчової точки зору ад’юванта, прийнятного з харчової точки зору активного інгредієнта. Композицію за даним винаходом можна використовувати як інгредієнт продукту харчування. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін «інгредієнт продукту харчування», він включає композицію, яку додають або можна додати в функціональні продукти харчування або продукти харчування як харчову добавку і/або добавки волокна. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін «інгредієнт продукту харчування», він також стосується композицій, які можна використовувати в низьких концентраціях в широкому ряді продуктів, для яких потрібне желювання, текстурування, стабілізація, суспендування, утворення плівки і структуроутворення, збереження соковитості без непотрібного збільшення в'язкості. Інгредієнт продукту харчування може знаходитися у вигляді розчину або твердої речовини залежно від застосування, і/або способу застосування, і/або способу введення. Композиція за даним винаходом може сама представляти харчову добавку, або її можна додати до харчових добавок. Композиція за даним винаходом може сама представляти функціональний продукт харчування, або її можна додати до функціональних продуктів харчування. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін «функціональний продукт харчування», він означає продукт харчування, який здатний забезпечувати не тільки харчовий ефект і/або смакову насолоду, але також здатний забезпечувати додатковий оздоровчий ефект для споживача. Отже, функціональні продукти харчування звичайно представляють продукти харчування, що містять компоненти або інгредієнти (такі як описані в даному документі), включені в них, які надають продукту харчування певного функціонального, наприклад, лікувального або фізіологічного оздоровчого, ефекту, інший, ніж чисто харчовий ефект. Незважаючи на відсутність офіційного визначення функціонального продукту, більша частина зацікавлених в даному питанні сторін дійшли до згоди, що він представляє промислово доступні продукти харчування, що мають певні позитивні ефекти для здоров'я. Деякі функціональні продукти харчування є нутріцевтиками. У даному документі термін «нутріцевтики» означає продукт харчування, який здатний забезпечувати не тільки харчовий ефект і/або смакову насолоду, але також здатний забезпечувати терапевтичний (або інший позитивний) ефект для споживача. Нутріцевтики закреслюють традиційне розділення на продукти харчування і лікарські препарати. На основі результатів анкетування було передбачено, що споживачі виявляють найбільшу зацікавленість в функціональних продуктах, пов'язаних з лікуванням і профілактикою захворювань серця. Профілактика раку представляє інший аспект харчування, який викликає великий інтерес у споживачів, але цікаво зазначити, що це є галуззю, в якій споживачі відчувають, що вони можуть контролювати ситуацію. Дійсно, згідно з даними Всесвітньої Організації Охорони здоров'я щонайменше у 35% випадків розвиток раку пов'язаний з 24 UA 103216 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 харчуванням. Крім того, ключовими домаганнями є остеопороз, стан шлунково-кишкового тракту і ожиріння, які стимулюють купівлю функціональних продуктів і розвиток їх ринку. Композицію за даним винаходом можна використовувати у виробництві продуктів харчування, таких як джеми, мармелад, желе, молочні продукти (такі як молоко або сир), м'ясні продукти, продукти з птиці, рибні продукти і продукти хлібопекарського виробництва. У вигляді прикладу композицію за даним винаходом можна використовувати як інгредієнти в безалкогольних напоях, фруктових соках або напоях з білком молочної сироватки, лікувальному чаї, напоях з какао, молочних напоях і напоях з молочнокислими бактеріями, йогурті і питному йогурті, сирі, морозиві, шербеті і десертах, кондитерських виробах, бісквітах і сухих сумішах для приготування пирогів, легких закусках, зернових сніданках, локшини швидкого приготування і локшини в склянках, супах швидкого приготування і супах в склянках, продуктах і напоях для збалансованого харчування, підсолоджувачах, барних закусках з поліпшеною текстурою, барних закусках з волокнами, стійких фруктових начинках для борошняних виробів, глазурі, шоколадних начинках для борошняних виробів, начинках для пирогів зі смаком і запахом сиру, начинках для пирогів зі смаком і запахом фруктів, заморожених пирогах і пончиках, стійких до нагрівання начинках для борошняних виробів, кремових начинках для борошняних виробів швидкого приготування, начинках для печива, начинках для борошняних виробів, готових до вживання, низькокалорійних начинках, поживних напоях для дорослих, соєвих кисломолочних напоях/соках, асептичному/автоклавованому шоколадному напої, барних сумішах, порошках для приготування напоїв, соєвому/звичайному молоці і шоколадному молоці з підвищеним вмістом кальцію, кавових напоях з підвищеним вмістом кальцію. Композицію за даним винаходом також можна використовувати як інгредієнт в продуктах харчування, таких як американський сирний соус, засіб проти спікання для тертого і подрібненого сиру, соус для чіпсів, кремовий сир, сухий змішаний збитий сметанний крем для прикрашання з низьким вмістом жиру, збитий молочний крем для заморожування/відтавання, стійка до заморожування/відтавання збита оздоба, натуральний легкий сир чеддер з низьким вмістом жиру, йогурт для «шведського столу», аеровані заморожені десерти і нові барні закуски, морозиво в твердій упаковці, морозиво в економічній твердій упаковці з приємною етикеткою, морозиво з низьким вмістом жиру, ніжний соус, соус для барбекю, сирний соус, заправка з домашнім сиром, суха суміш для приготування соусу альфредо, змішаний сирний соус, суха суміш для приготування томатного соусу і інші. Для деяких аспектів переважним продуктом харчування є напій. У деяких аспектах переважно продукт харчування представляє продукт хлібопекарського виробництва, такий як хліб, датські булочки, бісквіт або печиво. Даний винахід також стосується способу отримання продукту харчування або інгредієнта продукту харчування, де спосіб включає змішування ксиланази, отриманої способом за даним винаходом, або композиції за даним винаходом з іншим інгредієнтом продукту. Спосіб отримання або інгредієнт продукту харчування також представляє інший аспект даного винаходу. У загальному значенні поліпептид, який має ксиланазну активність, за винаходом можна використовувати для солюбілізації і/або руйнування нерозчинної речовини стінки рослинної клітини, що містить арабіноксилан, для зміни, наприклад, зниження, в'язкості за рахунок присутності геміцелюлози або арабіноксилану в розчині або системі, що містить речовину стінки рослинної клітини. Як правило, вказану речовину стінки рослинної клітини буде містити один або більше інгібіторів ксиланази. Зокрема, поліпептид, який має ксиланазну активність, за винаходом можна використовувати при обробці рослинних матеріалів, призначених для застосування як харчових продуктів, таких як корма для тварин, у виробництві крохмалю, в хлібопекарській промисловості, у виробництві біоетанолу з целюлози і при обробці деревної пульпи у виробництві паперу. Поліпептид, який має ксиланазну активність, за винаходом можна використовувати для обробки рослинних матеріалів, таких як зернові культури, які застосовують в харчових продуктах, включаючи корм для тварин. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін «зернові культури», він означає будь-який вид зерна, що використовується для виробництва продуктів харчування, і/або будь-яку злакову траву, що продукує таке зерно, включаючи, не обмежуючись цим, пшеницю, мелену пшеницю, ячмінь, кукурудзу, сорго, жито, овес, тритикале і рис, або їх комбінації. У одному переважному варіанті здійснення зернова культура представляє пшеницю. Ксилан в продукті харчування і/або харчовій добавці модифікується при контактуванні ксилану з поліпептидом, що має ксиланазну активність, за даним винаходом. 25 UA 103216 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін «контактування», він включає, не обмежуючись цим, обприскування, покривання, імпрегнацію або нанесення шару поліпептиду, що має ксиланазну активність, за даним винаходом на продукт харчування і/або харчову добавку. У одному варіанті здійснення продукт харчування і/або харчову добавку за даним винаходом можна отримати змішуванням поліпептиду, що має ксиланазну активність, безпосередньо з продуктом харчування і/або харчовою добавкою. Як приклад, поліпептид, який має ксиланазну активність, можна піддати контактуванню (наприклад, при обприскуванні) з продуктом харчування і/або харчовою добавкою на основі зернових, таких як мелена пшениця, кукурудзяне або соєве борошно. Також можливо включити поліпептид, який має ксиланазну активність, у другий (і інший) продукт харчування і/або харчову добавку або питну воду, які потім додають в продукт харчування і/або харчову добавку за даним винаходом. Отже, не важливо, що поліпептид, який має ксиланазну активність, за даним винаходом включається в сам продукт харчування і/або харчову добавку на основі зернових, хоча таке включення представляє особливо переважний аспект даного винаходу. У одному варіанті здійснення даного винаходу продукт харчування і/або кормову добавку можна об'єднати з іншими компонентами продукту харчування і/або кормової добавки з отриманням продукту харчування і/або корму на основі зернових. Такі інші компоненти продукту харчування і/або кормової добавки можуть включати одну або більше інших (переважно термостабільних) ферментних добавок, вітамінних харчових і/або кормових добавок, мінеральних харчових і/або кормових добавок і амінокислотних харчових і/або кормових добавок. Отриману (комбіновану) харчову і/або кормову добавку, що містить дещо інші типи сполук, потім можна змішати у відповідних пропорціях з іншими компонентами харчової і/або кормової добавки, такими як зернові і білкові добавки з отриманням продукту харчування для людини і/або корму для тварин. У одному переважному варіанті здійснення харчову і/або кормову добавку за даним винаходом можна приготувати змішуванням різних ферментів з відповідними активностями з отриманням суміші ферментів. Як приклад, харчову і/або кормову добавку на основі зернових, отриманих, наприклад, з меленої пшениці або кукурудзи, можна піддати контактуванню (наприклад, при розпиленні) одночасно або послідовно з ферментом ксиланазою або іншими ферментами з відповідними активностями. Дані ферменти можуть включати, не обмежуючись цим, одне або більше з амілази, глюкоамілази, мананази, галактозидази, фітази, ліпази, фосфоліпази, галактоліпази, глюканази, арабінофуранозидази, феруліолестерази, пектинази, протеази, глюкозоксидази, гексозоксидази і ксиланази. Ферменти, що мають бажану активність, наприклад, можна змішати з ксиланазою за даним винаходом до контактування даних ферментів з харчовою і/або кормовою добавкою на основі зернових або, альтернативно, такі ферменти можна піддати контактуванню одночасно або послідовно на такій зерновій добавці. Потім харчову і/або кормову добавку по черзі змішують з харчовою і/або кормовою добавкою на основі зернових з отриманням кінцевої харчової і/або кормової добавки. Також можливо формулювати харчову і/або кормову добавку у вигляді розчину окремих ферментів з відповідними активностями і потім змішати даний розчин з речовиною харчової і/або кормової добавки до перетворення харчової і/або кормової добавки в гранули або комбікорм. Даний винахід стосується застосування поліпептиду, що має ксиланазну активність, за винаходом в способі отримання продукту харчування. Типові хлібобулочні (печені) продукти за даним винаходом включають хліб, такий як батони, рулети, здобні булочки, основи для піци і т. д., претцели, тортильї, пироги, печиво, бісквіти, крекери і т. д. Приготування харчових продуктів, таких як хлібобулочні вироби, добре відоме в даній галузі. Приготування тіста, наприклад, описане в прикладі 4. Застосування поліпептиду, що має ксиланазну активність, за винаходом для зміни хлібопекарських якостей, описано в прикладі 4. Поліпептид, який має ксиланазну активність, за винаходом також можна використовувати у виробництві крохмалю з рослинних матеріалів сировини, отриманого із зерен і бульб, таких як бульби картоплі. Поліпептид, який має ксиланазну активність, за винаходом також можна використовувати в обробці деревної пульпи, наприклад, у виробництві паперу. Обробка целюлозного матеріалу для виробництва біоетанолу Поліпептид, який має ксиланазну активність, за винаходом також можна використовувати для гідролізу рослинного целюлозного матеріалу у виробництві цукрів, ферментувати в біоетанол. 26 UA 103216 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У деяких конкретних варіантах здійснення поліпептид, який має ксиланазну активність, за винаходом виявляє ксиланазну активність при температурі приготування тіста, в межах від приблизно 20ºС до приблизно 40ºС. У деяких варіантах здійснення поліпептид, який має ксиланазну активність, за винаходом інактивується під час випікання продукту. У деяких альтернативних варіантах здійснення поліпептид, який має ксиланазну активність, за винаходом має підвищену термостабільність і/або температурний оптимум в порівнянні з відповідним ферментом дикого типу із збереженням активності після теплової обробки. Обидві характеристики відомі фахівцям в даній галузі. ПРИКЛАДИ Приклад 1 Сайт-направлений мутагенез ксиланаз і експресія Специфічні мутанти ксиланази Bacillus subtilis отримували з використанням конструкції, що містить сайт зв’язування рибосоми з pET24a (ctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacat), злитий з геном ксиланази дикого типу без сигнальної послідовності (atggctagcacagactactggcaa-----tggtaa), яку трансфектували у вектор pCRBlunt (InVitrogen, Carlbad, CA, США). Це приводило до конститутивної експресії ксиланази в клітинах TOP10 (InVitrogen) після трансформації сконструйованим вектором при умові, що орієнтація гена знаходилася в напрямку за «годинниковою» стрілкою. Потім отримували сайт-направлену мутацію в гені з використанням набору для мутагенезу «QuickChange» (Stratagene, La Jolla, CA, США), слідуючи протоколу виготовлювача. Мутанти підтверджували секвенуванням. Отримували достатню продукцію підтверджених мутантів культивуванням трансформованих клітин в об'ємі 1 л. Приклад 2 Дослідження солюбілізації висівок за участю мутантів ксиланази Заявники використовували пшеничні висівки як субстрат для оцінки питомої активності варіантів ксиланази, оскільки їх використовують в промислових застосуваннях. Субстрат висівок Як приклад висівки можуть представляти пшеничні висівки, отримані сухим помелом пшениці з використанням лабораторного млина Chopin CD Auto Mill (Chopin Technologies, Франція) в режимі і умовах, рекомендованих виготовлювачем, для розмелювання пшениці в пшеничне борошно і висівки. Отриману фракцію висівок можна використовувати як субстрат в тесті оцінки солюбілізації висівок. У даному прикладі пшеницю використовували як джерело зернових. Тест оцінки солюбілізації висівок Готують суспензію пшеничних висівок в буфері лимонна кислота (0,1 М)-динатрій гідрофосфат (0,2 М), рН 5,0 з концентрацією висівок 1,33% (мас./мас.). Аліквотні порції даної суспензії об'ємом 750 мкл переносять в пробірки Еппендорфа при перемішуванні. Кожну пробірку з субстратом попередньо нагрівають протягом 5 хв при 40ºС. До вмісту пробірки додають 250 мкл розчину ферменту до кінцевої концентрації субстрату 1%. Готують три розведення (в двох паралелях) для кожної ксиланази із зростаючими концентраціями ферменту (0,33; 1,0 і 3,0 мкг ксиланази/г висівок) на кожний час визначення (0, 30, 60 і 240 хв). Як контроль використовують розчин денатурованої нагріванням ксиланази. Реакцію зупиняють на вказані часові точки за допомогою перенесення пробірок в термостат при 95ºС. Денатуровані нагріванням проби зберігають при 4ºС, доки не закінчаться всі ферментативні реакції. Коли закінчуються всі ферментативні реакції, пробірки Еппендорфа центрифугують з отриманням прозорого супернатанту. Солюбілізуюча активність ферментів для висівок виражається в підвищенні OD410, яке детектують по збільшенню кількості редукуючих кінцевих груп з використанням реагентів PAHBAH (Lever, 1972). Коротко, редукуючі кінцеві груп взаємодіють з PAHBAH з утворенням забарвленого продукту реакції, який можна визначити по OD410. Описаний вище тест оцінки солюбілізації є чутливим до побічної активності ферментів, що виявляють активність на залишковому крохмалі в субстраті висівок. Протокол очищення ксиланази Bacillus subtilis Клітини E. coli TOP10 з експресованою ксиланазою збирали центрифугуванням (20 хв, 3500g, 20ºС) і ресуспендували в 50 мМ Тріс-буфері з 2 мМ ЕДТА, рН 7,4. Клітини робили проникними додаванням 1 мг/мл лізоциму (ICN Biomedicals, Costa Mesa, CA, US, номер по каталогу 100831), перемішуючи суспензію протягом 2 год. при кімнатній температурі, заморожуючи і розтоплюючи з подальшою обробкою ультразвуком. Значення рН доводили до 4,0 з використанням 1 М розчину HCl після центрифугування (20 хв, 3500g, 20С). Супернатант, що містить ксиланазу, знесолювали з використанням одноразових колонок для знесолювання PD-10 (Amersham Bioscience, Швеція), зрівноважених і елюйованих 50 мМ 27 UA 103216 C2 5 ацетатом натрію, рН 4,5. Знесолений зразок наносили на колонку SOURCE 15S місткістю 10 мл (Amersham Bioscience, Швеція), заздалегідь урівноважену 50 мМ ацетатом натрію, рН 4,5. Потім колонку промивали буфером для зрівноваження і елюювали в лінійному градієнті NaCl (50 мМ ацетати натрію, 0-0,35М NaCl, рН 4,5). Фракції з ксиланазною активністю об'єднували і використовували для подальшого аналізу. Аналогічні протоколи можна адаптувати для варіантів, отриманих з ксиланази, що відрізняється від XynA Bacillus subtilis, зі значеннями pI, що істотно відрізняється від XynA Bacillus subtilis. Таблиця 1 Солюбілізуюча активність ксиланаз для висівок, виражена у вигляді максимальної оптичної густини, нахилу показника мутантів ксиланази, відносної оптичної густини і відносного нахилу в порівнянні з ксиланазою BS1 (ферментом Bacillus subtilis з SEQ ID NO:1) і ксиланазою BS3 (варіантом ферменту Bacillus subtilis з SEQ ID NO:23) 28