Фрагмент днк, що кодує поліпептид, який володіє активністю хімотрипсинового ензиму рогівкового шару (scce), поліпептид, що володіє активністю scce, фрагмент днк, експресуюча система (варіанти), вектор експресії

1 Фрагмент ДНК, кодирующий полипептид, обладающий активностью химотрипсинового энзима роговичного слоя (SCCE), и характеризующийся последовательностью GAATTCCGCG GATTTCCGGG СТСС ATG GCA АОА ТСС СТТ СТС СТО ССС СТО Ыег Ala Arg 51 Ser ken Leu Leu ? s o Lea CAG АТС СТА CTG СТА TCC ТТЯ GIC TTG G A ACT GCb GGA GSA G A GCC A A Gin И в Leu Leu Leu S e r Leu Д і ї Leu Glu Thr A l l Gly G l a Glu Asa -го is s -JO CSG GGT GAC AbG ATT ATT GAT GGC GCC CCA TGT GCA АОД G3C TCC САС Gin Gly Rsp Lys H e И в Aip Gly A l a P r o Cye Ala Arg G l y S e r Hie AAT TCC ATQ CTG TGC GCT GGC АТС ССС ОДС TCC A G A A AfcC GCC TGC A A АЕП S e r ИЕС I * u eys t i l Gly l i t Pro Asp S e t Lys Lys Asn Ala Cys 1 6 0 16S 170 £27 АЬТ GST GAC TCi GGQ GGA CC3 TTG GTG TCC ADA SGI ACC CTG САН GOT A=n Gly Авр S»r G!y Gly P r o Leu Val Сув Ш 3 Gly THE Leu Gin Gly 1T S ISO 185 £55 СТО GT3 ТСС l*u t i l E d ISO GTC TAC ACT C ^ GTG TGC ASG TTC ACC SAG TOG ATA A!,T GAC BCC ETC Val Tyr ЇЧГ G'f J a l Cys Lyt Р і г ТЧг uys t - p H e A=n Asp ! f i Иге !05 2І0 !J5 2J0 ДАА AAG CAT ССС ТАДСЙССІСА Ly& L y a НьБ A r g 225 TGG CAG GTG GCC CTG CTC AST G3C M T CAG CTC CAC TGC GGA GGC T i p Gin Val Ala l e t . Leu S e r G l y Asn Gin Leu H i s Cys Gly G l y OTC Val CTG GTC SAT GAG CGC TGG GTS CTC ACT GCC GCC CACTCCA G ATG A Leu Val ДЕП Glu Arg T r p Val Leu T4r A l a AlK H i s Cys b y e Met CTG GOC GAG AOG AGA H i s Leu G\y S e t AEp Ttw l * u G l y Asp A:g Aig GCT CAS AGB АТС M S ПСС TCG ASG TCA TIC CGC C5C СГС GOC TAG A i a G i n Arg 1 1 * Lya Ala S a r Lys Set Pha Arg H I B P r o G l y т у т TCC Set Asn Glu Tyc Ti-.r Val АСА CAG ACC CAT OTT AAT GAC Tdr CTC ATG CTC GTG A G CTC AM AGC CAO A Gin T h : H i s Val Asn Asp Leu Ket Lac Val GCC AGG M l Are Lya Leu Asn S e r Gin CTtS TCA TCC AM GTG AAO AA1 C C U K CTG CCC TCC CGC KiC - e u S a : S a c Н г е V i l L/s Lys Val A=g Leu J m S s r Arg C > ! 85 100 105 GAA CCC CCT GGA ACC ACC TGT ACT GTC TCC GGC TGS G3C ACT tJX ACG Glu P r o P r o Gly ThE Thr Cys T h r Val S e r Gly T r p Gly TJlr Thr Thr 110 IIS 12D HGC CCA GAT GTg ACC Я Т CCC TCT GAC CTC ATG TGC GTG GAT GTC ABG Eer F r o Asp V»l ТИС РІ1В P r o S e r ABp Lau Нес Сув Val Авр Val Lyo us іао 1Э5 no CTC АТС TCC CCC CAG GAC TGC I O 3 A G GTT TAC АЫЗ GAC TTA CTC SAA A Leu П е £ = r P r o G i n Аьр Cys T h r Lys Val Тут Lye Asp lieu Leu Glu 115 ISO IS5 ТДАСТО CTTCCARCAG BS3 ТСААЛЕАТАТ АХ7ТАДДССТ CATGCCCTGT TGATAAACCA ATCAAATTGQ ТАААСАССТД 313 АААССААЙАС ЙААТАЦВЗАА ДСАСАГіДДСС CTCAACGGAA TTC SSS его аналог или вариант, гомологичный по меньшей мере на 90% указанной последовательности 2 Фрагмент ДНК по п 1, отличающийся тем, что содержит в основном последовательность, представленную в пункте 1 3 Полипептид, обладающий активностью SCCE, содержащий полную последовательность или субпоследовательность представленной ниже аминокислотной последовательности q Met Sla Arg Se: L E U leu Lau Pro Leu Gin lie Leu Leu Leu Ser Leu -2Э -25 -20 -IS LEV. Glu Th; Ala Gly Giu Glu Ale Gin Gly bap Lys lie lie Aap •10 -5 1 Gly Ala Pra Cys Ala Arg Gly Ser His Prn Trp Gin Val Ala Leu Leu 5 10 IS ВВІ 1 10 ДДТ GAG TAC ACC GTG CAC CIS GSC AGT GAT ACG CT5*e~TАЬТ ААААТОСДСА GGAOTGSSOA CGCCGATGAC СЇАТОДАСТС AAATTffiACT ТТДССПТСС Alt CCS Pro ТЭЗ G=S ACT TTC CCT TSC G3C CAS CCC AIT ЯЯС CCA S3i T^j Giy !>•: P » Pro Cys Gls Сіт P r o As~ Asp F=o Gly 195 200 Gly АЕП Gin їли His Сув Gly Gly Val Leu Val Asn Glu Arg Trp 23 30 35 Val Lau Thr Ala Ala Нін Сув Lye Мес Asn Glu Тух The Val 40 4S НІБ L=U 50 Gly Ser Asp Thr leu Gly Asp Arg Arg Ala olo Arg H e Lys JUa Ser CO Ю 45314 Lys Sec Phe Arg 70 HIE PCO Gly Tyr Ser Thr Gin Thr 45 KIE Vsl АЕП Leu Met Leu Val Lys Leo Asn Ser Gin Ala Arg Leu Sec Sec Met Val Й5 30 Э5 Lya Lys Val Arg Leu Pro Ser Arg Cys Glu Pro Pro Gly Thr Thr Сув 100 10S 110 US Thr Val Sec Gly Trp Gly Tir Tnr The Ser Pro Asp Val Thr Phe Pro 120 125 130 Ses Asp Leu Met Cys v a l Asp Val Lys Leu H e Ser S:o Gin Asp Cys 135 1*0 us Tnr Lys Val Tyc Lys Asp Leu Leb Glu 150 iss AST Ser мет; Leu Cys Ala Gly 160 H e Pro Asp Ser Lys Lys А Е П Ala Сув Asn Gly Asp Ser Gly M y Pro 165 170 175 Leu Val Cys urg Gly Thr Lau Gin Gly Leu Val Ser Trp Gly Thr Phe 180 IBS ISO 19S Pro Cys Gly Gin Pro Asn Asp Pro Gly Val Tyr Thr Gin Val Cys Lya 200 205 210 Phe Thr Lys Trp lie Asn Asp Thr Het Lys bye Kis Arg 213 220 его аналог или вариант, на 80% гомологичный приведенной аминокислотной последовательности 4 Полипептид по п 3, отличающийся тем, что содержит одну из следующих аминокислотных последовательностей Olu Slu M a Зів Gly Аїр ЬуВ lie lie Asp -s a Sly Ala. tea Cys A l * Arj Gly Ser His Pro Trp Sin Vsl Ala Itu. їли. S 10 IS Set Gly МП 30 Gin Іди Hi> Cys Gly Sly Vjl Lfu V»l Asn Slu Ars Trp 25 30 ЗЬ Val Lau Thar Ala Ala Ній Cys Іря Mst Asn Qlu Tyr Thr Wai Hia Leu 40 «5 6» Qlv Ser Лео Thr Leu Gly **j> Агя Arg *1» Gin teg l i e Lys Ala « as Ser « l y e S«r Ph* * * г Hie Pro СІ}- ЇУІ Ser №r Bin Thr His V*l Аса Asp 70 TS *° Leu Het їли V»l by» Lou A M S«r 01n Al» Arg Leu Ser Sir H « V»l BS 90 S3 by* W I0D v » * **« *•*« p r o s " r № 105 я ^ C i u P l D t 'ro C HO l y TliI llur C y t *1!> Thr Val Ser Gly T r p G l y T h r Thr Thr Sec Pro A s p Val T h r Phe P r o 1 2 5 120 " Se- JVsp Leu Het Cys Val Asp Val Lys Leu H e Ser Pco Gin Asp Cys 135 1*0 1*5 Tnr Lys Val Tyr Lys Asp Leu Leu Glu 150 165 ASK Ser Met Leu Cys Ala Cly 1 S O lie Pco ASP Ser Lys L y B Asn AX» Cye Asn Gly Asp Sec Gly Gly Pro 1 7 S 165 170 Leu Val C y E Arg Gly Thr Leu Gin Gly Leu v a l Ser Trp Gly Thr Phe 1 S O 1SS 180 IBS pro Cys Gly Gin Pro Asn Asp Pro Gly Val Tyr Tttr Gin Val Сув Lys 200 205 "О Phe Thr Lys Trp lie Asn Asp Thr Met Lys Lys His Arg 21S 220 или lie H E Asp 1 Asp BO Gly Ala Pro Cys Ala Arg Gly Sec Hie Pro Trp Gin Val Ala Leu Leu 10 15 Ser Gly Asn Gin Lsu Hie Cys Gly Gly Val Leu Val Asn Glu Arg Trp 20 2S 30 35 Val Leu Thr Ala Ale. His Cys Lys Met Asn Glu Tyr Thr Val His Leu 40 «S SO Gly Ser Asp ThE Leu Gly Asp Arg Arg Ala Gin Arg lie Lye Als Ser ss 60 SS Lya Б Е Г Phe Arg His Pro Gly Тут Ser & r Gin Thr His Val Asn Asp 70 75 flO Leu Het Leu Val Lys Leu Дня Ser Gin Ala Arg Leu Ser Ser Met Val 85 90 95 Lys lye Val Acg Leu Pro Ser Arg Сук Glu Pro Pro Cly Thr Thr Сув 100 105 lid us Thr Val Ser Gly Tip Gly Thr Thr Tnr Ser Pro Asp Val Thr Phe Pro 120 125 130 Ser Asp Leu Met Cys val Asp Val Lys Leu H e Ser Pro Gin Аєр Cys 13S 140 us Thr Lys Val Tyr Lys Asp Leu Leu Glu Asn Ser Мес Leu Cys Ala Gly 150 ISS 1Є0 H e Pro Asp Ser Lys Lys Asn Ala Cys Asn Gly Asp Ser Gly Gly Pro 165 1V0 175 Leu Val Cys Arg Gly Thr Lau Gin Gly Leu Val Ser Trp Gly Thr Phe 1ЙЄ 185 ISO ідs Pro Cys Gly Ola Pro Asn Asp Pro Gly Val Tyr Thr Gin Val Cys Lys 200 20S 210 Phe Thr Lys Trp lie Asn Asp Thr Mac Lys Lys His Arg 215 220 5 Полипептид по п 3, отличающийся тем, что включает аминокислотную последовательность, которая на 80% гомологична приведенной аминокислотной последовательности, или ее субпоследовательности 6 Полипептид по п 5, отличающийся тем, что представляет собой рекомбинантныи полипептид 7 Фрагмент ДНК, способный к гибридизации с фрагментом ДНК по п 1, или его частью в жестких условиях гибридизации 8 Фрагмент ДНК по п 1, отличающийся тем, что гомологичен по меньшей мере на 80% последовательности, представленной в п 1, который кодирует полипептид, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 80% гомологична аминокислотной последовательности, представленной в п 3 9 Фрагмент ДНК по п 1, который кодирует полипептид, обладающий активностью SCCE, и который способен связываться с моноклональным антителом, продуцируемым гибридомной клеточной линией ТЕ4Ь, которая имеет депозитный номер № 93061817 в ЕСАСС 10 Фрагмент ДНК по п 1, который кодирует полипептид, обладающий активностью SCCE, и который способен связываться с моноклональным антителом, продуцируемым гибридомной клеточной линией ТЕ9Ь, которая имеет депозитный номер № 93061816 в ЕСАСС. 11 Фрагмент ДНК по п 1, который кодирует полипептид, обладающий активностью SCCE, и который способен связываться с политональной антисывороткой, полученной против нативного SCCE, который был выделен из экстракта диссоциированных клеток рогового слоя пяточной поверхности (stratum comeum) 12 Экспрессирующая система, содержащая нуклеотидную последовательность по любому из пунктов 1-2 и 8-11 13 Экспрессирующая система, содержащая нук 45314 леотидную последовательность по п 7 мером DSM 8281 в Deutsche Sammlung von Microorgamsmen und Zeilkulturen GmbH (DSM) 14 Реплицируемый вектор экспрессии, экспрессирующий нуклеотидную последовательность, коди18 Плазмида, содержащая фрагмент ДНК по п 7 рующую полипептид по любому из пп 3-6 19 Способ получения полипептида, обладающего активностью SCCE, предусматривающий встраи15 Реплицируемый вектор экспрессии по п 14, вание фрагмента ДНК по любому из пунктов 1-2 и отличающийся тем, что представляет собой 8-11 в вектор экспрессии, трансформирование плазмиду подходящего организма-хозяина указанным век16 Реплицируемый вектор экспрессии по п 15, тором, полученным на предыдущей стадии, кульотличающийся тем, что представляет собой тивирование организма-хозяина в условиях, подps507, депонированную под регистрационным ноходящих для экспрессии полипептида мером DSM 8282 в Deutsche Sammlung von Microorgamsmen und Zeilkulturen GmbH (DSM) 20 Способ по п 19, предусматривающий осуществление посттрансляционной модификации пеп17 Реплицируемый вектор экспрессии по п 15, тида отличающийся тем, что представляет собой ps500, депонированную под регистрационным но Настоящее изобретение относится к рекомбинантному полипептиду и к нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, к системе экспрессии, способной экспрессировать этот полипептид, а также к фармацевтическим и косметическим композициям, содержащим этот полипептид, и к использованию полипептида для различных косметических или терапевтических целей Кожа, как орган, представляет интерес с биологической, медицинской и косметической точек зрения Существует множество кожных заболеваний, которые являются либо органоспецифическими, как например, псориаз и экземы, либо проявлениями таких общих заболеваний, как общие аллергические реакции Тот факт, что существует коже-специфические заболевания, можно рассматривать, как доказательство существования молекулярных механизмов, которые уникальны для кожи Аналогично, исследования коже-специфических молекулярных процессов имеют важное значение для понимания и лечения кожных заболеваний По-видимому, разумно предположить, что некоторые из этих процессов, так или иначе, связаны с наиболее специализированными функциями кожи, то есть, с созданием физико-химического барьера между организмом и внешним окружением Физико-химический кожный барьер локализован в самом верхнем слое кожи, роговичном слое (Stratum corneum) Роговичный слой является наиболее специализированной структурой кожи Он является конечным продуктом процессов дифференциации эпидермиса, то есть, расслоенной чешуйчатым эпителием, который представляет самую верхнюю часть кожи Большинство клеток эпидермиса состоит из кератиноцитов в различных стадиях дифференциации Наиболее глубоко расположенные кератиноциты, базальные клетки, находятся на базальной гембране в контакте с дермой /собственно кожей/, которая представляет соединительную ткань кожи, и являются единственными кератиноцитами, обладающими способностью к делению Часть базальных клеток непрерывно покидает базальную мембрану и претерпевает процесс дифференциации, в результате которого клетки становятся строительными блоками роговичного слоя В этом процессе кератиноциты претерпевают ряд адаптационных изменений Происходит увеличение содержания цитоскелета, состоящего из эпидермис-специфических цитокератинов Промежуточные нити соприкасающихся клеток соединены с функциональными фрагментами за счет возрастающего количества десмосом Наиболее резкие изменения происходят при переходе от самого верхнего слоя живых клеток, stratum granuhsum, к мертвому роговичному слою, stratum corneum, в процессе, который обычно носит название кератинизация Ковалентне связанные протеины расположены близко к внутренней части плазменной мембраны, образуя очень устойчивую клеточную оболочку Кроме того, богатое липидами вещество, образующееся в органеллах кератиноцитспецифических клеток, секретируется во внеклеточное пространство, и, образуя липидные пластинки, которые окружают клетки роговичного слоя,) составляет барьер, проницаемый для гидрофильных веществ И наконец, все межклеточные структуры, за исключением плотно упакованных цитокератиновых нитей, исчезают Клетки stratum corneum корнеоциты, являются, таким образом, мертвыми клетками Это означает, что регуляция различных процессов в роговичном слое должна быть результатом "программирования" на той стадии, когда кератиноциты все еще являются живыми клетками Превращения эпидермиса, которые обычно протекают в течение примерно четырех недель, причем клетки являются частью роговичного слоя примерно в течение двух недель, завершаются отпадением клеток с поверхности кожи в процессе шелушения /десквамации/ Этот процесс является примером "программирования" роговичного слоя Необходимым условием для функционирования роговичного слоя в качестве физико-химического барьера, является требование того, чтобы отдельные его клетки удерживались вместе за счет механически устойчивых структур, то есть десмосом Деградация десмосом, которая необходима для десквамации, должна регулироваться таким образом, чтобы обеспечить такое шелушение с поверхно сти кожи, которое уравновешивалось бы образованием нового роговичного слоя, без нарушения барьерных функций ткани Нарушения кератинизации В основе большого числа патологических состояний кожи различной степени тяжести лежит нарушение процесса кератинизации При псориазе наблюдается, помимо типичного хронического воспаления, избыточное продуцирование незрелых клеток роговичного слоя, что приводит к типичному для этого заболевания шелушению Существует группа врожденных заболеваний кожи, которые характеризуются утолщением роговичного слоя7 что приводит к обраованию "рыбьей чешуи так называемого ихтиоза У некоторых индивидуумов, страдающих ихтиозом, наблюдается пониженная скорость десквамации Хотя и менее серьезное нежели ихтиоз, заболевание "сухая кожа" /ксеродерма/ также характеризуется роговичным слоем, с которого отшелушиваются корнеоциты, не так, как в обычных условиях, в виде отдельных клеток или мелких агрегатов клеток, но в виде крупных, макроскопических чешуек, это заболевание весьма обычно для старческого возраста, а также среди атонических индивидуумов с пониженной устойчивостью к кожным поражениям и склонностью к развитию характерных форм эндогенной экземы В случае акне заболеваний наблюдается нарушенная кератинизация в протоках сальных желез, что приводит к образованию комедонов в закупорке желез Образование комедонов прогрессирует и как считают, приводит к образованию воспалительных угревых язвочек Протеолетические энзимы участвуют в кератинизации Существует несколько стадий в процессе кератинизации и во время превращении роговичного слоя, где протеолитические энзимы, по-видимому, играют важную роль Естественно, исчезновение всех внутриклеточных структур, за исключением цитокератиновых нитей, наблюдающееся в процессе перехода от живых до ороговевших эпидермальных слоев должно включать протеолиз Превращение профилаггрина в филаггрин, протеин, который, как считают, функционирует в специальном типе аггрегаций нитей цитокератина в процессе кератинизации, может катализироваться специфической протеиназой В роговичном слое филаггрин далее разлагается до низкомолекулярных компонентов, которые, вероятно, важны как "природные увлажнители" Кроме того, существуют протеолитические модификации цитокератиновых полипептидов в процессе кератинизации И наконец, протеолитические акты, по-видимому, играют решающую роль в деградации межклеточных когезивных структур в роговичном слое в процессах, которые обычно приводят к десквамации Когезия и десквамация клеток роговичного слоя /stratum corneum/ Роль десмосом Межклеточная когезия в роговичном слое, также как и в живых частях эпидермиса, в значительной степени осуществляется за счет десмосом Десмосома состоит из двух симметричных половинок, каждая из которых образована двумя соприкасающимися клетками Каждая половинка 8 45314 десмосомы имеет одну внутриклеточную часть, связанную с нитями цитокератина, и одну часть, состоящую из гликопротеинов, закрепленных внутриклеточно и с трансмембранной и внеклеточной частями Внеклеточные части этих протеинов, десмоглеины, представляют собой адгезионные молекулы, и за счет их взаимодействия друг с другом во внеклеточном пространстве образуется когезивная структура Деградация десмосом, повидимому, протекает несколько другими путями в роговичном слое ладоней и подоив /стоп/ по сравнению с роговичным слоем не относящимся к ладоням-подошвам В последних тканях около 85% десмосом исчезает вскоре после того, как клетки становятся полностью ороговевшими Оставшиеся десмосомы, которые расположены, предпочтительно, на ворсинчатых краях чрезвычайно уплощенных клеток, по-видимому, остаются интактными вплоть до того уровня, где происходит десквамация В роговичном слое, который не относится к ладоням и подошвам, корнеоциты гораздо менее уплощены, и не происходит деградации десмосом в более глубоких слоях ткани В обоих типах тканей десквамация связана с деградацией десмосом В случае ихтиозной кожи, также как и в случае "сухой кожи" число десмосом в поверхностных слоях роговичного слоя, как было показано, повышается Межклеточные липиды роговичного слоя Различия в деградации десмосом относящихся к ладоням и подошвам роговичных слоев и не относящихся к ним, могут быть связаны с различными количествами внеклеточных липидов в этих двух типах тканей Содержание липидов значительно выше в роговичных слоях не относящихся к ладоням-подошвам В результате эффективность этой ткани в качестве барьера, проницаемого для воды и других гидрофильных веществ, гораздо выше проницаемости роговичного слоя ладоней и стоп Так как десмосомы занимают значительный объем, и так как интактные десмосомы предотвращают расширение межклеточного пространства, именно деградация десмосом может быть тем механизмом, за счет которого большее внеклеточное пространство становится доступным для липидов Внеклеточные липиды роговичного слоя связаны с десквамацией также и некоторыми другими путями Так как они составляют основную часть внеклеточного пространства, можно ожидать, что они оказывают значительное влияние на активность энзимов, которые действуют в этом месте, например, энзимов, ответственных за деградацию десмосомТ Действительно, различные нарушения метаболизма липидов, как было показано, по-видимому, вызывают некоторые типы ихтиоза По-видимому, также, сами липиды в некоторой степени вносят вклад в клеточную когезию роговичного слоя Более того, секреция липидов в межклеточное пространство роговичного слоя,по-видимому, связана с секрецией также и ряда энзимов Предшественники липидов хранятся в верхних живых кератиноцитах в специфических органеллах Эти так называемые ламелларные /пластинчатые/ тела, как было показано, содержат ряд гидролитических энзимов Таким образом предполагается, что энзим, ответствен 45314 10 тивные формы Особый интерес в этом контексте ныи за деградацию десмосом в роговичном слое, представляет биологически неактивный просинтезируется, возможно в неактивной проинтерлейкин-1/р , который, как было показано, форме, кератиноцитами, хранится в ламелларных продуцируется кератиноцитами /Mizutametal, телах, и секретируется в межклеточное простран1991/ До сих пор не было обнаружено энзимов со ство роговичного слоя в процессе кератинизации, способностью превращать про-интерлейкин-1/р в где он может быть активирован, и его активность активный интерлейкиу-1/р Однако, так как химотдалее регулируется, наряду с другими факторами, рипсин и катепсин G- /химотрипсино-подобный составом внеклеточных липидов энзим/ облада/ст способностью катализировать Нарушений клеточной когезии в жизнеспособпревращение неактивного 31 кД рекомбинантного ном эпидермисе про-итерлейкина-1/р в полностью активную 17кД Существует ряд кожных заболеваний, при коформу, возможно, что и эпидермальные химотторых нарушается когезия между кератиноцитами рипсин-подобные энзимы могут катализировать в неороговевших жизнеспособных эпидермальных это превращение слоях Эти заболевания характеризуются феноменом, именуемым акантолизом, то есть разруПодробное описание изобретения шением десмосомных контактов между кератиноНастоящее изобретение относится к энзиму, цитами, которые в остальных проявлениях который был назван химотрипсиновым энзимом кажутся нормальными Этот процесс, поstratum corneum/роговичного слоя//ЭССЕ/, который видимому, осуществляется за счет протеиназ, рассматривается как энзим, ответственный за декоторые до сих пор не были идентифицированы градацию десмосом в роговичном слое ДоказаАкантолиз, в своих острых формах, приводит к тельство, представленное в примереї, демонстобразованию волдырей, и является характеристирирует, что отшелушивание клеток с поверхности кой автоиммунных заболеваний pemphigus valgaris ороговевших поверхностных слоев кожи включает и pemphigus fohaceus наследственного доброкачедеградацию протеинов десмосом, и что ответстственного familiar pemphigus /болезнь Hayleyвенным за это энзимом, по-видимому, является Hayley's/ и наследственного /болезнь Daner's/ химотрипсино-подобная сериновая протеиназа, которую можно ингибировать ионами цинка Эпидермис принимает активное участие в иммунологических и воспалительных реакциях В примере2 описывается открытие химотрипсинового энзима stratum corneum /SCCE/ протеиВ дополнении к своим функциям в качестве назы, которая удовлетворяет критериям ответстсоздателя физико-химического барьера между венности за деградацию внутриклеточных внутренностями организма и внешней средой, когезивных структур в роговичном слое ин витро, и эпидермис также функционирует в качестве аквозможно также ин виво ПримерЗ описывает частивного иммунологического барьера Кератиноцитичную характеризацию активности химотрипситы обладают способностью продуцировать, а такнового энзима stratum corneum /SCCE/ с помощью же реагировать на большое число цитокинов и хромогенных субстратов других медиаторов воспалений, за счет которых они коммутируют и взаимодействуют с клетками Полученные результаты демонстрируют, что иммунологической и воспалительной систем Это SCCE отличается энзимологически от остальных имеет огромное значение при защите хозяина от химотрипсиновых протеиназ Характер ингибиромикробной инфекции и в заживлении ран Совревания и способность разлагать два различных менные исследования показали также, что керасубстрата трипсиноподобных энзимов существентиноциты, по-видимому, принимают активное учано отличается для SCCE по сравнению с бычьим стие во многих воспалительных кожных химотрипсином и катепсином G-человека Позаболеваниях, таких, как псориаз и экземы видимому, SCCE также отличается от химазы тучных клеток человека Последний знзим катализиЭпидермальные протеиназы могут играть рует деградацию Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pna эффекважную роль в воспалительных процессах тивно /см Schwartz et al ,1987, и Schechter et al , Одним из цитокинов, продуцируемых керати1989/ - чего не делает SCCE - и не ингибируется ноцитами , является интерлейкин 1 / її -1/ її -1 суапротинином SBTJ /Schechter et al , 1983 и Wmществует в двух формах, II -1а и її -1/(3, причем обе troub et al , 1986/, тогда как SCCE ингибируется они присутствуют в эпидермисе Если II -1а после синтеза является полностью активным, її -1/(3 синВ примере4 описана частичная очистка SCCE тезируется в виде Неактивной 31 кД проформы из КСІ эестрактов корнеоцитов с помощью афинПро- її -1/р превращается в активную 17кД форму ной хроматографии на несолюбилизированном за счет специфической протеиназы, присутствуюингибиторе трипсина сои /SBTJ/ и определение пщей например, в моноцитах, но до сих пор не обтерминальной аминокислотной последовательнонаруженной в нормальном эпидермисе Ряд серисти SCCE Для невосстановленных образцов были новых протеиназ со специфичностью к получены хорошие выходы на стадиях 1-6, но снихимотрипсин-подобному субстрату /химотрипсин зились до 0 на стадиях 7 и 9, и выходы на послеподжелудочной железы и катепсин Gдующих стадиях были заметно снижены Для воснейтрофильных гранулоцитов/ может , однако, станоленных образцов на стадиях 7 и 9 не служить в качестве активаторов про- її -1/(3 детектировались производные аминокислот, но на последующих стадиях, на которых детектироваКак предложил Норрис /Norns, 1990/, протеолись производные, сильного падения выходов не литические энзимы, присутствующие в межкленаблюдалось Эти результаты дают возможность точном пространстве роговичного слоя могут в предположить, что в положениях 7 и 9 существуют определенных условиях оказаться способными цистеины Однако, не представилось возможности превращать неактивные формы цитокинов в ак 11 45314 12 определить карбоксиметилированныи цистеин на первичном скринировании Эти позитивные бляшстадиях 7 и 9 после восстановительной обработки ки были снова скринированы с использованием иодоуксусной кислотой /ЮОмМ/ Полученная потех же зонда и метода, которые были описаны следовательность /рис 13, послед Ю №3/ была ранее После процедуры повторного скринироваидентична как для восстановленного так и для ния были идентифицированы две позитивные невосстановленного образцов бляшки Эти две отобранные бляшки были еще раз очищены, а размер вставок был определен с Пример5 описывает получение SCCEпомощью PCR с использованием SYM1600 и специфических моноклональных антител и полиSYM1601, которые оказались комплементарны тональных SCCE-специфических антител цыпдвум плечам фага, в качестве праймеров, и выделенка и кролика, а также иммуногистохимические ленных фагов в качестве матриц Этот тонироисследования с моноклональными антителами ванный фрагмент был подвергнут частичному Примерб описывает клонирование и секвенианализу последовательности рование кДНК, кодирующей SCCE человека Вначале, кДНК библиотеку, полученную из мРНК, поТрансляция полученной ДНК последовательлученной из эпидермальных кератиноцитов ности привела к аминокислотной последовательвзрослого человека, скринируют анти-SCCE кроности, которая была гомологична эксперименличьими политональными антителами Одно из тально определенной протеиновой этих антител дает высокий фоновый сигнал, и его последовательности ОДнако, в этой последоваисключают из интенсивных исследований за счет телоности не было трансляционного стартового скринирования на ранней стадии Используя друкодона Для выделения полной длины кДНК, полугое политональное антитело /Д-5/, ряд иммуноченный ДНК фрагмент выделили на агарозном реактивных бляшек обогащают как превосхищаюгеле и использовали в качестве зонда, обеспечив щие истинно положительные бляшки Не гибридизацию в жестких условиях Для получения наблюдалось реакционноспособности с монотополной длины кДНК, библиотеку кДНК рескрининальными антителами моАо 4 и моАЬ 9, ни для ровали дважды с помощью этого зонда, используя одной бляшки Интенсивная характеристика рестте же методы, которые были описаны ранее, за рикционных энзимов и характеризация РСЯ одинисключением того, что гибридизацию вели в жестнадцати выделенных бляшек не выявила никакого ких условиях при 65°С Эти эксперименты привели сходства между различными бляшками На оснок идентификации и выделению 45 отдельных повании невозможноспЬ получить "отпечатки пальзитивных бляшек, которые были вначале скриницев" вероятной кДНК последовательности SCCE рованы в PCR анализе с использованием стратегию пришлось модифицировать SYM1600 или SYM1601 в сочетании с SYM3208 в качестве PCR праймеров для идентификации Несмотря на предпочтительное детектировабляшек, содержащих полную 5 открытую считыние SCCE иммунореактивного материала в суправающую рамку базальных кератиноцитах, для скринирования кДНК SCCE использовали кДНК библиотеку, полуПосле дальнейшего скринирования и секвениченную из культивируемых кератиноцитов человерования полученные PCR амплифицированные ка Можно ожидать, что такая библиотека должна фрагменты, полученные из этих фагов были т о содержать кДНК только из базальных кератиноцинированы, как было подробно описано в примере тов Эта попытка была основана на наблюдении 6, и полученные результаты указывают, что один слабого, но, вероятно, значительного иммунооиз фагов 205 2 1, содержит полной длины вставку крашивания с использованием SCCE монотоБыла определена полная нуклеотидная последональных антител также из базальных кератиноцивательность кДНК фрагмента Нуклеотидная потов следовательность /последовательность Ю №1/ содержит открытую считывающую рамку, достаБляшки были скринированы с использованием точную для кодирования полной аминокислотной синтетического 17-мерного олигонуклеотидного последовательности протеина SCCE предшестзонда, сконструированного на основании наибовенника, состоящего из 253 аминокислот, включая лее надежной части аминокислотной последовасигнальный пептид и преполипептид тельности, ile-ile-Aps-Gly-Ala-Pro /последовательность Ю №2/ /последовательность Ю №10 аа 1-аа 6/ экспериментально определенной аминотерминальной Пример7 описывает определение в эпидермипоследовательности нативного SCCE энзима, как се человека двух SCCE мРНК-видов, которые споописано в примере 4 Из-за неопределенности собны гибридизоваться с кДНК Зондами, полученвнутри экспериментально определенной аминоными на базе SCCE кДНК последовательности кислотной последовательности, этот гексапептид, Пример8 описывает экспрессию рекомбинанткак считают, представляет одну из наиболее наного SCCE в Е coli Полученный результат покадежных частей Кроме того, возможные кодоны, зывает, что представляется возможность продукодирующие этот гексапептид, приводят к наицировать рекомбинантный SCCE в бактериях меньшей из возможных дегенерации ДНК зонда ПримерЭ описывает экспрессию рекомбинантБолее длинная экспериментально определенная ного SCCE человека в тетки млекопитающих последовательность Gln-Val-Ala- Leu-Leu-Ser-ClyПолучают три протеина, которые демонстрируют Asn-GIn -Leu /последовательность Ю №3, аа 15реакцию со всеми жизнеспособными политоaa 24/ была исключена из-за высокой степени денальными антителами SCCE кролика и цыпленка, генерации последовательности, кодирующей эту также как и с депонированными монотональными пептидную последовательность Четырнадцать антителами Рекомбинантные протеины, которые позитивных бляшек были идентифицированы при реакционноспособны по отношению к антителам, 13 45314 14 выработанным против нативного SCCE, демонстколлекции клеточных культур животных, Porton рируют кажущийся молекулярный вес, который Down, Salisbury'? Wiltshire SP4 OJG, United Kingпримерно на 1кД больше чем у нативного очиdom, под регистрационными номерами ЕСАСС щенного SCCE человека Рекомбинантный проте93061817 и ЕС АСС 93061816, соответственно, в ин не демонстрирует какой-либо протеолитичесоответствии с требованиями Будапештского соской активности глашения Выделение, активация и дальнейшая характеКлонирование и секвенирование кДНК, кодиризация рекомбинантного SCCE описаны в прирующей, SCCE человека, описано в примере 6 мереЮ Неактивную проформу рекомбинантного Нуклеотидная последовательность, содержащая SCCE можно активировать протеолитическим открытую считывающую рамку, достаточную для расщеплением трипсином или эндопептидазой кодирования полной аминокислотной последоваLYS-C Предполагается, что ряд других протеаз тельности протеина предшественника SCCE, сокоторые расщепляют пептид после основной амистоящая из 253 аминокислот, включая сигнальный нокислоты, таких как эндопротеиназа LYS-C, папептид и преполипептид, была таким образом паин и плазмин, могут быть способны активиронайдена Нуклеотидная последовательное! предвать npo-SCCE в активный SCCE Было ставлена как последовательность Ю №1, а полуобнаружено, что сигнальный пептид состоит из 22 ченная аминокислотная последовательность "хиаминокислот и основан на n-терминальной аминомотрипсинового энзима роговичного слоя /SCCE/" кислотной последовательности нативного активпредставлена как последовательность Ю № 2 ного SCCE, пропептида , состоящего из семи амиПод термином "npo-SCCE или его аналог или нокислот Более того, было показано, что вариант его" подразумевают полипептид, содерполученный рекомбинантный SCCE существует в жащий аминокислотную последовательность Ю двух n-гликозилированных формах, и одной не№2 или его аналог или вариант указанной послегликозилированной форме, что аналогично редовательности, который получают , когда нуклеозультатам, полученным для активного нативного тидная последовательность изобретения экспресSCCE сируется в подходящую систему экспрессии, и который после протеолитической активации приПод термином «stratum corneum» химотрипсиводит к образованию сериновой протеиназы, коновый энзим /SCCE/" /химотрипсиновый энзим торую можно ингибировать теми же самыми ингироговичного слоя/ или "полипептид, обладающий биторами, что и спонтанную клеточную SCCE активностью" в широком смысле подразудиссоциацию, которую можно вызвать в модельмевают сериновую протеазу или ее проформу, ных системах с образцами ороговевшего слоя которую можно активировать за счет протеолитикожи, инкубируемыми при нейтральных или почти ческого расщепления, причем указанный энзим в нейтральных рН при физиологических температуего активной форме ингибируется теми же самырах, то есть, около 37°С Вообще, протеин будет ми ингибиторами, и точно таким же образом, что и реагировать с антителами, выработанными проспонтанная клеточная диссоциация, которую можтив очищенного нативного или рекомбинатного но вызвать в модельной системе с образцами SCCE ороговевшего слоя кожи, инкубируемыми при нейтральных или близких к нейтральным рН при фиПод термином "SCCE или его аналог или вазиологических температурах риант его" подразумевают полипептид, содержащий аминокислотную последовательность Ю №2 Более конкретно, термин "полипептид, облаили аналог или вариант указанной последовадающий SCCE активностью" определяет таким тельности, который продуцируется когда нуклеообразом полипептид, который отличается от хитидная последовательность настоящего изобремотрипсина и катепсина С-, и который, в его актения экспрессируется в подходящую систему тивной форме способен разлагать MeO-Suc-Argэкспрессии, и который является сериновой проРго-Туг-pnA /S - 2586/, причем это разложение теиназой, которую можно ингибировать теми же полипептидом ингибируется апротинином, химосамыми ингибиторами, что и спонтанную диссостатином и сульфатом цинка практически по споциацию клеток, которую можно индуцировать в собу примера 3 и 13, что проиллюстрировано на модельных системах с образцами ороговевших рис 9 и втаблице5 слоев кожи, инкубируемых при нейтральных или Еще более конкретно термин "полипептид, почти нейтральных значениях рН при физиологиобладающий SCCE активностью" включает полических температурах, т е около 37°С Вообще, пептид, который способен вызвать протеолитичепротеин должен реагировать с антителами, выраское расщепление протеина десмосом - десмогбатываемыми против нативного или рекомбинантлеина 1 во время ин витро инкубирования ного SCCE роговичного слоя пяточной части Такой полипептид обычно также реагирует с антителами, выработанными против нативного SCCE, который был выделен из экстракта диссоциированных клеток роговичного слоя пяточной поверхности Примеры таких антител представляют политональные антитела, полученные как указано в 5 2, и моноклональные антитела ТЕ4Ь и ТЕ9Ь, полученные как указано в примере 5 1 Моноклональные антитела получают за счет гибридом ТЕ4Ь и ТЕ9Ь, депонированных в Европейской Под термином "его аналог или вариант" подразумевают полипептид, последовательность которого в точности не соответствует аминокислотной последовательности Ю №2, но которая все еще сохраняет "ССЕ активность", как определено ранее Вообще, такие полипептиды представляют полипептиды, которые отличаются, например, до некоторой степени по составу аминокислот, или включают пост-трансляционные модификации например, гликозилирование или фосфорилиров 15 45314 16 ниє, по сравнению с SCCE протеином, описанным сказанная аминокислотная последовательность в примерах содержит консервативные активные участки сериновых протеаз, степень гомологичности очень Термин "аналог" или "вариант" используют в низка, около 33-38% В этом отношении кажется, настоящем контексте для того, чтобы обозначить что SCCE имеет только умеренное сходство с изпротеин или полипептид с аналогичным составом вестными ранее сериновыми протеиназами С аминокислот, или последовательностью такой, как другой стороны, SCCE является типичной серинохарактеристическая последовательность аминовой протеиназой в отношении гистидинового, аскислот Ю №2, полученная из SCCE протеина как парагинового и серинового остатков активных сайуказано в примере 6, позволяя небольшие вариатов и консервативных участков, расположенных ции, которые изменяют аминокислотную последовблизи от этих сайтов Это справедливо также для вательность, например, делеции, сайтбольшинства цистеиновых остатков и других вынаправленный мутагенез, вставки дополнительсоко консервативных участков сериновых протеиных аминокислот, или их сочетания, для создания наз В глубине "кармана" /proch/ первичной спеSCCE протеиновых аналогов Эти модификации цифичности /остаток 189 в химотрипсине/ могут привести к интересным и полезным новым расположен сериновый остаток химотрипсина чесвойствам аналога Аналоговые полипептиды или ловека, химаза тучной клетки, и простатопротеины можно получить из животных или челоспецифический антиген и аланиновый остаток века, или они могут быть частично или полностью катепсина G- человека В SCCE, с другой стороны, синтезированы Аналоги можно также получить за это положение занято аспарагиновым остатом счет использования методик рекомбинантных Это может объяснить тот обнаруженный факт, что ДНК хотя SCCE несомненно обладает химотрипсиноТаким образом, важный вариант настоящего вой активностью, его относительная активность по изобретения относится к полипептиду, в котором, отношению к различным хромогенным пептидным по крайней мере, один аминокислотный остаток субстратам отличается от химотрипсина и катепзамещен другим аминокислотным остатком и/или сина G-, также, как и ингибирующая эффективв котором , по крайней мере, один аминокислотность химостатина, низкомолекулярного ингибиный остаток был исключен или добавлен, так что в тора химотрипсин-подобных энзимов результате получен полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, отличную Сравнение последовательностей химотрипсиот аминокислотной последовательности, предна человека, катепсина G человека и химазы тучставленной в последовательности Ю №2 или субных клеток человека с последовательностью последовательность указанной аминокислотной SCCE представлено в последующем сравнительпоследовательности как определено далее, но ном анализе первичных структур этих последовапрактически обладающей SCCE активностью, как тельностей указано ранее SCCE I I D G ^ C A R G S »V