Поліпептид з ксиланазною активністю

Реферат: Винахід стосується поліпептиду з ксиланазною активністю, амінокислотна послідовність якого має щонайменше 75 % ідентичність з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO:1, і його застосування. UA 103215 C2 (12) UA 103215 C2 UA 103215 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки, до якої належить винахід Даний винахід стосується поліпептидів з ксиланазною активністю і їх застосувань. Також даний винахід стосується способу модифікації поліпептидів з ксиланазною активністю для зміни, переважно підвищення, ксиланазної активності і/або розчинності висівок. Рівень техніки Протягом багатьох років ендо-β-1,4-ксиланази (ЕС 3.2.1.8) (що в даному документі називаються ксиланазами) використовували для модифікації складних вуглеводів, одержаних з речовини стінки рослинних клітин. У даній галузі добре відомо, що функціональна активність різних ксиланаз (одержаних з різних мікроорганізмів або рослин) істотно відрізняється. Основуючись на структурних властивостях і генетичних характеристиках, ксиланази класифікували в різні сімейства глікозидгідролаз (GH) (Henrissat, 1991; Coutinho and Henrissat, 1999). Донедавна всі відомі і охарактеризовані ксиланази відносили до сімейств GH10 або GH11. У нещодавно опублікованій роботі були ідентифіковані численні інші типи ксиланаз, що належать до сімейств GH5, GH7, GH8 і GH43 (Coutinho and Henrissat, 1999; Collins et al., 2005). До теперішнього часу сімейство GH11 відрізняється від всіх інших сімейств GH тим, що тільки воно є єдиним сімейством, що складається з ксиланаз, специфічних для ксилану. Структуру ксиланаз сімейства GH11 можна описати як структуру «β-рулету з желе" (див. фіг. 1, що обговорюється в даному документі). Патент США 6682923 стосується активності білків і нуклеїнових кислот ксиланаз. Були проведені всебічні дослідження за характеристикою функціональної активності ксиланаз з використанням добре охарактеризованих і чистих субстратів (Kormelink et al., 1992). Результати даних досліджень показали, що різні ксиланази мають різні специфічні вимоги відносно заміни скелета ксилози в арабіноксилані (AX). Для деяких ксиланаз необхідна наявність трьох незаміщених залишків ксилози для гідролізу скелета ксилози; для інших потрібний тільки один або два залишки. Вважають, що причини даних відмінностей в специфічності криються в тривимірних просторових структурах каталітичних центрів, які, в свою чергу, залежать від первинної структури ксиланази, тобто амінокислотної послідовності. Однак трансляція даних відмінностей в амінокислотних послідовностях у відмінності в функціональній активності ксиланаз до цього часу не встановлена, оскільки ксиланази "працюють" в складному середовищі, такому як рослинний матеріал. Субстрати ксиланази, виявлені в пшениці (пшеничному борошні), традиційно розділяли на дві фракції: АХ, що не екстрагується водою, (WU-AX) і AX, що екстрагується водою (WE-AX). У пшеничному борошні співвідношення WU-AX:WE-AX становить приблизно 70:30. Є численні пояснення з приводу того, чому існують дві різні фракції AX. У більш ранній літературі (D'Appolonia and MacArthur (1976) і Montgomery and Smith (1955)) описані досить істотні відмінності між WE-AX і WU-AX в мірі заміщення. Найбільш висока міра заміщення була виявлена в WE-AX. Даний факт використовували для пояснення того, чому деякі AX є такими, що екстрагуються. Висока міра заміщення робить полімер розчинним в порівнянні з низькою мірою заміщення, яка приводить до утворення водневих зв'язків між полімерами і в результаті до осадження. Вважають, що відмінності в функціональній активності різних ксиланаз є результатом відмінностей в специфічності ксиланаз і в результаті їх переваг для субстратів WU-AX і WE-AX. Однак в більш пізній літературі відсутні відомості про істотні відмінності в мірі заміщення WU-AX і WE-AX. Отже, можуть мати значення інші параметри, а не специфічність субстратів ксиланаз. Дані параметри можуть представляти перевагу ксиланаз для WE-AX в порівнянні з WU-AX, яка визначається іншими чинниками, ніж класична специфічність субстратів. Даний параметр можна знайти в літературі як вибірковість субстрату. У деяких застосуваннях (наприклад, в хлібопекарському виробництві) бажано одержувати високомолекулярні (HMW) розчинні полімери з фракції WU-AX. Такі полімери пов'язані із збільшенням об'єму при виробництві хліба (Rouau, 1993; Rouau et al., 1994 і Courtin et al., 1999). У інших застосуваннях бажано модифікувати обидві фракції WU-AX і WE-AX, солюбілізуючи WU-AX, зменшуючи молекулярну масу, знижуючи їх гідроколоїдний ефект, одержуючи арабіноксиланові олігосахариди, забезпечуючи можливість подальшої деградації інших компонентів клітинної стінки (наприклад, у виробництві крекерів, сортуванні борошна, застосуванні кормів, виробництві біоетанолу, пребіотиків і т. д.). Всі вказані вище характеристики ксиланаз, використані в різних застосуваннях, спрямовані на функціональні якості ксиланаз і мають велике значення для досягнення необхідних функціональних якостей. Однак, вибір ксиланаз, що мають правильні характеристики для визначеного застосування, або модифікація відомих ксиланаз для досягнення цієї мети, часто приводять до одержання менш ефективної молекули ксиланази, наприклад, молекули з 1 UA 103215 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 низькою каталітичною активністю (тобто питомою активністю, що виражається в одиницях молекул/мг білка ксиланази). Оскільки дані молекули використовуються в промислових застосуваннях, то, отже, має велике значення, щоб вони мали як можна більш високу каталітичну активність. Вдосконалення даної характеристики набуває все більше і більше значення для забезпечення промислового застосування даних ферментів в майбутньому, за рахунок росту використання сільськогосподарських побічних продуктів, таких як висівки зернових рослин, або застосування у виробництві біоетанолу з целюлози. Суть винаходу Даний винахід створений на основі встановлення дивного факту, що є можливим модифікувати поліпептид з ксиланазною активністю однією або двома модифікаціями амінокислоти в положенні, вибраному з положень 12 і 13; в комбінації з однією або більше модифікаціями амінокислоти в положенні, вибраному з положень 15, 34, 54, 77, 81, 82, 99, 104, 110, 113, 114, 118, 122, 141, 154, 159, 162, 164, 166, 175 і 179, в порівнянні з послідовністю поліпептиду ксиланази В. subtilis, представленою як SEQ ID NO:1, з підвищенням солюбілізуючої активності для висівок і/або ксиланазної активності ферменту. Таким чином, авторами даного винаходу було показано, що є можливим одержати поліпептиди ксиланази, що мають підвищену ксиланазну активність і/або солюбілізуючу активність для висівок. Це забезпечить можливість, наприклад, гідролізувати геміцелюлозну фракцію при обробці зернових у виробництві біоетанолу з целюлози або дозволить знизити кількість ксиланази, необхідної в ряді застосувань, таких як виробництво кормів для тварин, розрідження крохмалю, хлібопекарська промисловість, сортування борошна (мокрий помел), виробництво пребіотиків і виробництво паперу і деревної пульпи. У першому аспекті даний винахід стосується поліпептиду, що має ксиланазну активність і містить амінокислотну послідовність, де вказана амінокислотна послідовність має щонайменше 75 % ідентичність з амінокислотною послідовністю, вибраною з SEQ ID NO:1-22, і даний поліпептид містить: i) одну або дві модифікації амінокислоти в положенні, вибраному з положень 12 і 13; і ii) одну або більше додаткових модифікацій амінокислоти в положенні, вибраному з положень 15, 34, 54, 77, 81, 82, 99, 104, 110, 113, 114, 118, 122, 141, 154, 159, 162, 164, 166, 175 і 179, де вказані положення визначаються вирівнюванням як положення, що відповідають положенням в послідовності ксиланази В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. У другому аспекті даний винахід стосується способу ідентифікації поліпептиду за винаходом, де вказаний спосіб включає: (i) одержання поліпептиду, що має щонайменше 75 % ідентичність з амінокислотною послідовністю, вибраною з SEQ ID NO:1-22, і даний поліпептид містить одну або дві модифікації амінокислоти в положенні, вибраному з положень 12 і 13; і одну або більше додаткових модифікацій амінокислоти в положенні, вибраному з положень 15, 34, 54, 77, 81, 82, 99, 104, 110, 113, 114, 118, 122, 141, 154, 159, 162, 164, 166, 175 і 179, де вказані положення визначаються вирівнюванням як положення, що відповідають положенням в послідовності ксиланази В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1; (ii) порівняння солюбілізуючої активності для висівок і/або ксиланазної активності вказаного поліпептиду з солюбілізуючою активністю для висівок і/або ксиланазною активністю амінокислотної послідовності, вибраною з SEQ ID NO:1-22, з якою він має найвищий процент ідентичності; і (iii) вибір поліпептиду, що має підвищену солюбілізуючу активність для висівок і/або ксиланазну активність в порівнянні з амінокислотною послідовністю, вибраною з SEQ ID NO:122, з якою він має найвищий процент ідентичності. У третьому аспекті даний винахід стосується способу одержання поліпептиду за винаходом, де вказаний спосіб включає експресію нуклеотидної послідовності, що кодує вказаний поліпептид; і, необов'язково, виділення і/або очищення поліпептиду після експресії. У деяких варіантах здійснення поліпептид одержують модифікацією амінокислотної послідовності поліпептиду у вказаному положенні або кодона, який кодує амінокислотний залишок у вказаному положенні, в нуклеотидній послідовності, що кодує амінокислотну послідовність поліпептиду, де вказане положення визначається відносно послідовності ксиланази В. subtilis, представленої як SEQ ID NO:1. У додатковому аспекті даний винахід стосується поліпептиду, що має ксиланазну активність і містить амінокислотну послідовність, де вказана амінокислотна послідовність має щонайменше 75 % ідентичність з амінокислотною послідовністю, вибраною з SEQ ID NO:1-22, і даний поліпептид містить: 2 UA 103215 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 i) одну або дві модифікації амінокислоти в положенні, вибраному з положень 12 і 13; і ii) одну або більше додаткових модифікацій амінокислоти в положенні, вибраному з положень 15, 34, 54, 77, 81, 82, 99, 104, 113, 114, 118, 122, 141, 154, 159, 162, 164, 166, 175 і 179, де вказані положення визначаються вирівнюванням як положення, що відповідають положенням в послідовності ксиланази В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. У додатковому аспекті даний винахід стосується нуклеотидної послідовності, що кодує поліпептид за винаходом. У додатковому аспекті даний винахід стосується вектора, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид за винаходом. У додатковому аспекті даний винахід стосується клітини, яка трансформована нуклеотидною послідовністю, що кодує поліпептид за винаходом, або вектором, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид за винаходом. У додатковому аспекті даний винахід стосується організму-хазяїна, який трансформований нуклеотидною послідовністю, що кодує поліпептид за винаходом, або вектором, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид за винаходом. У додатковому аспекті даний винахід стосується композиції, що містить поліпептид за винаходом. У додатковому аспекті даний винахід стосується композиції, що містить поліпептид, ідентифікований способами за винаходом. У додатковому аспекті даний винахід стосується композиції, що містить поліпептид, одержаний за винаходом. У додатковому аспекті даний винахід стосується композиції, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид за винаходом. У додатковому аспекті даний винахід стосується композиції, що містить вектор, який включає нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид за винаходом. У додатковому аспекті даний винахід стосується композиції, що містить клітину, яка трансформована нуклеотидною послідовністю, що кодує поліпептид за винаходом. У додатковому аспекті даний винахід стосується композиції, що містить вектор, який включає нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид за винаходом. У додатковому аспекті даний винахід стосується композиції, що містить організм, який трансформований нуклеотидною послідовністю, що кодує поліпептид за винаходом, або вектором, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид за винаходом, в суміші з нетоксичним компонентом. У додатковому аспекті даний винахід стосується тіста, що містить поліпептид за винаходом, або поліпептид, ідентифікований за винаходом, або поліпептид, одержаний за винаходом, або нуклеотидну послідовність за винаходом, або вектор за винаходом, або клітину за винаходом або організм за винаходом в суміші з нетоксичним компонентом, або композицію за винаходом. У додатковому аспекті даний винахід стосується продукту хлібопекарського виробництва, що містить поліпептид за винаходом, або поліпептид, ідентифікований за винаходом, або поліпептид, одержаний за винаходом, або нуклеотидну послідовність за винаходом, або вектор за винаходом, або клітину за винаходом, або організм за винаходом в суміші з нетоксичним компонентом, або композицію за винаходом, або тісто за винаходом. У додатковому аспекті даний винахід стосується корму для тварин, який містить поліпептид за винаходом, або поліпептид, ідентифікований за винаходом, або поліпептид, одержаний за винаходом, або нуклеотидну послідовність за винаходом, або вектор за винаходом, або клітину за винаходом або організм за винаходом в суміші з нетоксичним компонентом, або композицію за винаходом. У додатковому аспекті винаходу даний винахід стосується композиції для очищення, що містить ксиланазу. У деяких варіантах здійснення композиції для очищення являють собою композиції детергента для пральні, в той час як в інших варіантах здійснення композиції для очищення представляють композиції для миття посуду. У деяких інших варіантах здійснення детергенти для миття посуду представляють детергенти для автоматичного миття посуду. У деяких додаткових варіантах здійснення композиції для очищення, що містять ксиланазу, додатково містять один або більше додаткових ферментів. У деяких варіантах здійснення додаткові ферменти вибрані з геміцелюлаз, целюлаз, пероксидаз, протеаз, ксиланаз, ліпаз, фосфоліпаз, естераз, кутиназ, пектиназ, пектатліаз, мананаз, кератиназ, редуктаз, оксидаз, фенолоксидаз, ліпооксигеназ, лігніназ, пуланаз, таназ, пентозаназ, маланаз, β-глюканаз, арабінозидаз, гуалуронідази, хондроітінази, лакази і амілаз, або їх сумішей. У деяких варіантах здійснення застосування знаходить комбінація ферментів (тобто "суміш"). 3 UA 103215 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У додатковому аспекті даний винахід стосується способу деградації або модифікації стінки рослинної клітини, де даний спосіб включає контактування вказаної стінки рослинної клітини з поліпептидом за винаходом, або поліпептидом, ідентифікованим за винаходом, або поліпептидом, одержаним за винаходом, або нуклеотидною послідовністю за винаходом, або вектором за винаходом, або клітиною за винаходом, або організмом за винаходом в суміші з нетоксичним компонентом, або композицією за винаходом. У додатковому аспекті даний винахід стосується способу обробки рослинного матеріалу, де даний спосіб включає контактування вказаного рослинного матеріалу з поліпептидом за винаходом, або поліпептидом, ідентифікованим за винаходом, або поліпептидом, одержаним за винаходом, або нуклеотидною послідовністю за винаходом, або вектором за винаходом, або клітиною за винаходом, або організмом за винаходом в суміші з нетоксичним компонентом, або композицією за винаходом. У додатковому аспекті даний винахід стосується застосування поліпептиду за винаходом, або поліпептиду, ідентифікованого за винаходом, або поліпептиду, одержаного за винаходом, або нуклеотидної послідовності за винаходом, або вектора за винаходом, або клітини за винаходом, або організму за винаходом в суміші з нетоксичним компонентом, або композиції за винаходом в способі модифікації рослинних матеріалів. У додатковому аспекті даний винахід стосується застосування поліпептиду за винаходом, або поліпептиду, ідентифікованого за винаходом, або поліпептиду, одержаного за винаходом, або нуклеотидної послідовності за винаходом, або вектора за винаходом, або клітини за винаходом, або організму за винаходом в суміші з нетоксичним компонентом, або композиції за винаходом в одному або більше з хлібопекарського виробництва, обробки зернових, розрідження крохмалю, виробництва біоетанолу з целюлозного матеріалу, корму для тварин, обробки деревини, посилення відбілювання деревної пульпи. У додатковому аспекті даний винахід стосується поліпептиду або його фрагменту, в основному описаному при зверненні до прикладів і фігур. У додатковому аспекті даний винахід стосується способу, в основному описаному при зверненні до прикладів і фігур. У додатковому аспекті даний винахід стосується композиції, в основному описаної при зверненні до прикладів і фігур. У додатковому аспекті даний винахід стосується застосування, в основному описаного при зверненні до прикладів і фігур. Короткий опис фігур У даному документі робляться посилання на наступні фігури. На фіг. 1 наведене накладання варіанту ксиланази XynA Bacillus subtilis (T110A) (чорний колір), варіанту ксиланази Xyn2 Trichoderma resеei (T120A) (темно-сірий колір) і варіанту ксиланази XynA Thermomyces lanuginosus (T120A) (яскраво-сірий колір). Жирним шрифтом виділені мутовані залишки відповідно Т110 і Т120. На фіг. 2 показане вирівнювання численних послідовностей SEQ ID NO:1-22 з використанням програми AlignX (з пакету vectorNTI) з параметрами дефолту для численного вирівнювання (штраф за відкриття гепа: 10 og, штраф за подовження гепа 0,05). Номери в лівій частині послідовностей представляють номери послідовностей SEQ ID NO. Докладний опис винаходу Є повідомлення про ферменти ксиланази приблизно з 100 різних організмів, включаючи рослини, гриби і бактерії. Ферменти ксиланази поділяються на більше ніж 40 сімейств ферментів глікозилгідролаз. Класифікація ферментів глікозилгідролаз, які включають ксиланази, манази, амілази, β-глюканази, целюлази і інші карбогідрази, основана на таких властивостях, як амінокислотна послідовність, тривимірна структура і геометрія каталітичного сайту (Gilkes et al., 1991, Microbiol. Reviews, 55:303-315). У одному аспекті даний винахід стосується поліпептиду, що має ксиланазну активність і містить щонайменше три, наприклад, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять або десять амінокислотних замін в порівнянні з будь-якою амінокислотною послідовністю SEQ ID NO:1-22, і даний пептид містить: i) одну або дві модифікації амінокислоти в положенні, вибраному з положень 12 і 13; і ii) одну або більше додаткових модифікацій амінокислоти в положенні, вибраному з положень 15, 34, 54, 77, 81, 82, 99, 104, 110, 113, 114, 118, 122, 141, 154, 159, 162, 164, 166, 175 і 179, де вказані положення визначаються вирівнюванням як положення, що відповідають положенням в послідовності ксиланази В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. 4 UA 103215 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Положення конкретної амінокислоти в поліпептиді за даним винаходом визначається вирівнюванням амінокислотної послідовності вказаного поліпептиду з SEQ ID NO:1 з використанням стандартного методу вирівнювання послідовностей, такого як вирівнювання двох послідовностей з використанням алгоритму Сміта-Ватермана або алгоритмів CLUSTALW2, в яких послідовності, як указано, вирівнюють, коли бал вирівнювання є найбільш високим. Бали вирівнювання можна розрахувати з використанням методів, описаних Wilbur W.J. and Lipman D.J. (1983) Rapid similarity searches of nucleic acid and protein data banks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:726-730. Переважно, використовують параметри дефолту в алгоритмі ClustalW2 (1.82): штраф за відкриття гепа білка = 10,0; штраф за подовження гепа білка = 0,2; білковий матрикс = Gonnet; білок/ДНК ENDGAP = -1; білок/ДНК GAPDIST=4. Переважно положення конкретної амінокислоти в поліпептиді за даним винаходом визначають вирівнюванням амінокислотної послідовності поліпептиду з SEQ ID NO:1 з використанням програми AlignX (з пакету vectorNTI) з параметрами дефолту для численного вирівнювання (штраф за відкриття гепа: 10 og, штраф за подовження гепа 0,05). Для деяких варіантів здійснення за даним винаходом вирівнювання можна провести з використанням фіг. 2, як описано в даному документі. Якщо не вказане інше, то в тому значенні, в якому в даному документі використовується термін "ідентичність послідовностей" для амінокислот, він стосується ідентичності послідовностей, розрахованої як (nref-ndif)100/nref, де ndif представляє загальне число неідентичних залишків в двох послідовностях при вирівнюванні і nref представляє число залишків в одній з послідовностей. Отже, амінокислотна послідовність ASTDYWQNWT буде мати 80 % ідентичність послідовності з послідовністю ASTGYWQAWT (ndif=2 і nref=10). У деяких варіантах здійснення ідентичність послідовностей визначають звичайними методами, наприклад, Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math., 2:482, пошуком на схожість методом Pearson & Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, з використанням алгоритму CLUSTALW, Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Res., 22:467380, з використанням комп'ютерних програм для даних алгоритмів (GAP, BESTFIT, FASTA і TFASTA в пакеті програм Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group). Також можна використовувати алгоритм BLAST (Altschul et al., 1990, Mol. Biol., 215:403-410), для якого програмне забезпечення можна одержати через Національний інформаційний центр в біотехнології www.ncbi.nlm.nih.gov/). При використанні вказаних вище алгоритмів застосовують параметри дефолту для довжини "вікна", штраф за геп і т. д. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін "модифікація", він означає будь-яку хімічну модифікацію будь-якої однієї амінокислоти або амінокислотної послідовності поліпептиду, вибраної з SEQ ID NO:1-22, а також генетичну маніпуляцію з ДНК, що кодує даний поліпептид. Модифікація може являти собою заміни, делеції і/або інсерції однієї або більше амінокислот, а також перестановку одного або більше бічних ланцюгів амінокислот. Очевидно, зрозуміло, що "модифікація" в даному поліпептиді визначається відносно поліпептиду, вибраного з SEQ ID NO:1-22, з найбільш високим процентом ідентичності послідовностей до даного конкретного поліпептиду. Позначення для амінокислотних замін, використані в даному документі, є наступними. Перша буква представляє амінокислоту, що знаходиться в природних умовах в положенні конкретної послідовності. Наступна цифра представляє положення відносно SEQ ID NO:1. Друга буква означає іншу амінокислоту, на яку замінена природна амінокислота. Прикладом є G13F/Y113D/R122D/Q175L, де гліцин в положенні 13 SEQ ID NO:1 замінений на фенілаланін і тирозин в положенні 113 SEQ ID NO:1 замінений на аспарагінову кислоту, і аргінін в положенні 122 замінений на аспарагінову кислоту, глутамін в положенні 175 замінений на лейцин, всі чотири мутації знаходяться в одному і тому ж поліпептиді, що має ксиланазну активність. Крім амінокислотних модифікацій в поліпептидах з ксиланазною активністю за винаходом поліпептиди за винаходом можуть містити амінокислотні модифікації мінорної природи, тобто консервативні амінокислотні заміни або інсерції, які не впливають істотним чином на укладання і/або активність білка; невеликі делеції, як правило, від 1 до приблизно 30 амінокислот, невеликі амінокінцеві або карбоксикінцеві додання, такі як амінокінцевий залишок метіоніну; невеликий пептидний лінкер приблизно із 20-25 залишків; або невелике додання, що полегшує виділення пептиду внаслідок зміни загального заряду, або іншу функціональну групу, таку як полігістидин, антигенний епітоп або зв'язувальний домен. Прикладами консервативних замін є заміни в групі основних амінокислот (аргінін, лізин і гістидин), кислих амінокислот (глутамінова кислота і аспарагінова кислота), полярних амінокислот (глутамін і аспарагін), гідрофобних амінокислот (лейцин, ізолейцин і валін), ароматичних амінокислот (фенілаланін, триптофан і тирозин) і невеликих амінокислот (гліцин, 5 UA 103215 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 аланін, серин, треонін і метіонін). Заміни амінокислоти, які по суті не приводять до зміни специфічної активності, відомі в даній галузі і описані, наприклад, H. Neurath and R.L. Hill, 1979 в The Proteins, Academic Press, New York. Що найчастіше зустрічаються замінами є Ala на Ser, Val на Ile, Asp на Glu, Thr на Ser, Ala на Gly, Ala на Thr, Ser на Asn, Ala на Val, Ser на Gly, Tyr на Phe, Ala на Pro, Lys на Arg, Asp на Asn, Leu на Ile, Leu на Val, Ala на Glu і Asp на Gly. У доповненні до 20 стандартних амінокислот амінокислотні залишки поліпептиду дикого типу можуть бути замінені на нестандартні амінокислоти (такі як 4-гідроксипролін, 6-Nметиллізин, 2-аміноізомасляна кислота, ізовалін і альфа-метилсерин). Амінокислотні залишки можна замінити на обмежену кількість неконсервативних амінокислот, амінокислот, які не кодуються генетичним кодом, і амінокислот, відмінних від природних. "Неприродні амінокислоти" модифікуються після синтезу білка, і/або вони мають хімічну структуру в їх бічному ланцюгу(ах), відмінну від звичайних амінокислот. Неприродні амінокислоти можна синтезувати хімічним шляхом, і переважно вони є промислово доступними, і вони включають піпеколінову кислоту, тіазолідинкарбонову кислоту, дегідропролін, 3- і 4-метилпролін і 3,3диметилпролін. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін "організм-хазяїн", він включає будь-який тип клітин, чутливих до трансформації, трансфекції, трансдукції і тому подібне, нуклеїновокислотною конструкцією або експресуючим вектором, що містить полінуклеотид, який кодує поліпептид за даним винаходом. Для цілей даного винаходу ксиланаза означає білок або поліпептид, що має ксиланазну активність. У тому значенні, в якому в даному документі використовується вираз "поліпептид, що має ксиланазну активність", він стосується будь-якого білка або поліпептиду, що виявляє активність в тесті оцінки ксиланазної активності, описаному в даному документі. Ксиланазну активність можна визначити з використанням будь-якого тесту, в якому використовується субстрат, що містить ендо-1,4-бета-D-ксилозидинові зв'язки в ксиланах. Значення рН і температура, що використовується в даному тесті, адаптовані до конкретної ксиланази. Прикладами придатних значень рН є 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 або 11. Прикладами придатних значень температури є 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 або 80ºС. Є різні типи субстрату для визначення ксиланазної активності, наприклад, таблетки ксилазиму (поперечнозшитий, забарвлений ксилановий субстрат, мегазим, Bray, Ірландія). Переважно активність ксиланази визначають з використанням наступного методу. Тест визначення активності ксиланази (активність ендо-β-1,4-ксиланази) У даному тесті зразки розводять в буфері лимонна кислота (0,1 М)-динатрій гідрофосфат (0,2 М), рН 5,0 з одержанням оптичної густини OD590, що дорівнює приблизно 0,7. Три різні розведення зразка попередньо інкубували протягом 5 хв. при 40С. Через 5 хв. додавали 1 таблетку ксилазиму (поперечнозшитий, забарвлений ксилановий субстрат, мегазим, Bray, Ірландія) до розчину ферменту в загальному об'ємі реакційної суміші, що дорівнює 1 мл. Через 15 хв. реакцію зупиняли доданням 10 мл 2 % Тріс/NaOH, рН 12. Контрольні проби готували з використанням 1000 мкл буфера замість розчину ферменту. Реакційну суміш центрифугували (1500g, 10 хв., 20С) і визначали оптичну густину OD супернатанта при довжині хвилі 590 нм. Одна ксиланазна одиниця (XU) виражається як активність ксиланази, що приводить до збільшення OD590 зі швидкістю 0,025 на хвилину. Субстрат (поперечнозшитий і забарвлений арабіноксилан, екстрагований з пшениці), використаний в описаному вище тесті, близький до відповідного субстрату в промислових застосуваннях. Додатково, ферменти можна класифікувати на основі посібника "Enzyme Nomenclature" NCIUBMB, 1992), див. також інтернет-сайт ENZYME: http://www.expasy.ch/enzyme/. На сайті ENZYME знаходиться інформація по номенклатурі ферментів. У основному вона основана на рекомендаціях Комітету по номенклатурі Міжнародного союзу по біохімії і біотехнології (IUB-MB) і описує кожний тип характеризованого ферменту, що має номер ЕС (Enzyme Commission) (Bairoch А. The ENZYME database, 2000, Nucleic Acids Res., 28:304-305). Дана номенклатура ферментів IUB-MB основана на специфічності субстрату і в деяких випадках на молекулярному механізмі каталізу; в даній класифікації не відбиваються структурні властивості даних ферментів. У одному аспекті винаходу ксиланаза представляє фермент, що має класифікаційний номер EC 3.2.1.8. Офіційна назва ферменту ендо-1,4-бета-ксиланаза. Системна назва - 1,4-бета-Dксиланксиланогідролаза. Можна використовувати інші назви, такі як ендо-(1-4)-бета-ксиланаза; (1-4)- бета-ксилан-4-ксиланогідролаза; ендо-1,4-ксиланаза; ксиланаза; бета-1,4-ксиланаза; ендо-1,4-ксиланаза; ендо-бета-1,4-ксиланаза; ендо-1,4-бета-D-ксиланаза; 1,4-бета 6 UA 103215 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ксиланксиланогідролаза; бета-ксиланаза; бета-1,4-ксиланксиланогідролаза; ендо-1,4-бетаксиланаза; бета-D-ксиланаза. Каталізована реакція являє собою ендогідроліз 1,4-бета-Dксилозидинових зв'язків в ксиланах. Декілька років тому була запропонована інша класифікація деяких ферментів глікозидгідролаз, таких як ендоглюканаза, ксиланаза, галактаназа, маназа, декстраназа і альфагалактозидаза, в сімейства, основана на схожості амінокислотних послідовностей. У цей час система охоплює 90 різних сімейств: див. інтернет-сайт CAZy (ModO) (Coutinho P.M. & Henrissat В. (1999) Carbohydrate Active Enzymes, сервер на: http://afmb.cnrs-mrs.fr/(cazy/CAZY/index.html (відповідає статтям: Coutinho P.M. & Henrissat В. (1999) Carbohydrate-active enzymes: an integrated database approach. In "Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering", Gilbert H.J., Davies G., Henrissat B. and Svensson B. eds., The Royal Society of Chemistry, Cambridge, pp. 3-12; Coutinho P.M. & Henrissat В. (1999) The modular structure of celluloses and other carbohydrateactive enzymes: an integrated database approach. In "Genetics, Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation", Ohmiya K., Hayashi K., Sakka K., Kobayashi Y., Karita S. and Kimura T. eds., Uni Publishers Co., Tokyo, pp. 15-23). У одному аспекті винаходу ксиланаза за винаходом є ксиланазою, що належить до сімейства 11 глікозидгідролаз (GH). Термін "сімейство 11 глікозидгідролаз (GH)» означає, що дана ксиланаза є, або її можна віднести до сімейства 11 GH. Очевидно, зрозуміло, що результати пошукових програм по ідентичності білків (таких як ProteinBlast, наприклад, на сайті http://toolkit.tuenbingen.mpg.de/prot_blast) необов'язково зможуть визначити, наскільки невідома послідовність дійсно потрапляє під визначення члена сімейства ксиланаз GH11. Послідовності білків, знайдені з використанням пошуку Blast, можуть мати відносно високу ідентичність/гомологію, але необов'язково є фактичними ксиланазами, і, більше того, не є ксиланазами, що належать до сімейства GH11. Альтернативно, білкові послідовності можуть мати відносно низьку ідентичність первинної амінокислотної послідовності, але є членом сімейства ксиланаз GH11. Для визначення того, наскільки невідома послідовність білка дійсно представляє білок ксиланазу з сімейства GH11, потрібно провести оцінку не тільки по ідентичності послідовностей, але також відносно ідентичності 3D-структур, оскільки класифікація в GH-сімействах основана на 3D-укладанні. Програмне забезпечення, за допомогою якого можна прогнозувати 3D-укладання невідомої послідовності білка, представляє HHpred (http://toolkit.tuebingen.mpg.de/hhpred). Ефективність даного програмного забезпечення для прогнозу структури білка основується на ідентифікації гомологічних послідовностей з відомою структурою, які використовуються як матриця. Воно працює так ефективно, оскільки структури відрізняються значно повільніше, ніж первинні послідовності. Білки одного сімейства можуть мати дуже близькі структури, навіть коли їх послідовності розійшлися нижче рівня розпізнавання. На практиці невідому послідовність можна ввести в програмне забезпечення (http://toolkit.tuebingen.mpg.de/hhpred) в форматі FASTA. Здійснивши це, можна провести пошук. Результатом пошуку буде перелік послідовностей з відомими 3D-структурами. Для підтвердження того, що невідома послідовність дійсно є ксиланазою GH11, ксиланази GH11 потрібно знайти в переліку гомологів, що мають імовірність >90. Не всі білки, ідентифіковані як гомологи, будуть охарактеризовані як ксиланази GH11, але деякі будуть. Останні білки є білками з відомою структурою і біохімічною характеристикою, яка підтверджує, що це ксиланази. Перші не охарактеризовані біохімічно як ксиланази GH11. У декількох джерелах описаний даний протокол, таких як Soding J. (2005) Protein homology detection by HMM-HMM comparison. Bioinformatics, 21, 951-960 (doi:10.1093/bioinformatics/bti125) і Soding J., Biegert A. and Lupas A.N. (2005) The HHpred interactive server for protein homology detection and structure prediction. Nucleic Acids Research, 33, W244-W248 (Web Server issue) (doi:10.1093/nar/gki40). Згідно сайту Cazy(ModO) сімейство глікозидгідролаз 11 можна охарактеризувати таким чином: відомі активності: ксиланаза (ЕС 3.2.1.8) механізм: утримування каталітичний нуклеофіл/основа: Glu (експериментальний) каталітичний донор протонів: Glu (експериментальний) 3D-структура: "β-рулет з желе" група: GH-C. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін "група С", він стосується груп сімейств, що розділяють тривимірне укладання і ідентичний каталітичний механізм (див., наприклад, Henrissat B. and Bairoch А. (1996), Biochem. J., 316, 695-696). 7 UA 103215 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін "сімейство 11", він стосується сімейства ферментів, встановленого Henrissat and Bairoch (1993) Biochem. J., 293, 781-788 (див. також Henrissat and Davies (1997) Current Opinion in Structural Biol., 1997, &:637644). Загальні ознаки членів сімейства 11 включають високу генетичну гомологію, розмір приблизно 20 kDa і каталітичний механізм подвійного заміщення (див. Tenkanen et al., 1992; Wakarchuk et al., 1994). Структура ксиланаз сімейства 11 включає дві великі β-складки з βланцюгів і α-спіралей. Сімейство 11 ксиланаз включає, не обмежуючись цим, Aspergillus niger XynA, Aspergillus kawachii XynC, Aspergillus tubigensis XynA, Bacillus circulans XynA, Bacillus punzilus XynA, Bacillus subtilis XynA, Neocalliniastrix patriciarum XynA, Streptomyces lividans XynB, Streptomyces lividans XynC, Streptomyces therinoviolaceus XynII, Termomonospora fusca XynA, Trichoderma harzianum Xyn, Trichoderma reesei XynI, Trichoderma reesei XynII, Trichoderma viride Xyn. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін "дикий тип", він стосується послідовності або білка, який є нативним або таким, що зустрічається в природі. У ще одному конкретному варіанті здійснення ксиланаза за винаходом одержана з бактеріальних ксиланаз, наприклад, бактерії (i) типу Firmicutes; (ii) класу Bacilli; (iii) загону Bacilliales; (iv) сімейства Paenibacillaceae; або (v) роду Paenibacillus, ще більш переважно, з бактерії (vi) видів Paenibacillus pabuli, Paenibacillus polymyxa або Paenibacillus sp.; найбільш переважно з (vii) штамів Paenibacillus pabuli або Paenibacillus polymyxa. У тому значенні, в якому в даному документі використовується вираз "ксиланаза, одержана з бактеріальних ксиланаз", він включає будь-яку ксиланазу дикого типу, виділену з даної бактерії, а також її варіанти або фрагменти, що зберігають ксиланазну активність. У додатковому варіанті здійснення ксиланаза за винаходом одержана з ксиланаз грибів. Наведене вище визначення "одержана з" (для бактеріальних ксиланаз) аналогічно також застосовно до ксиланази грибів. Прикладами грибкових ксиланаз сімейства 11 глікозидгідролаз є ксиланази, які можна одержати з наступних родів грибів: Aspergillus, Aureobasidium, Emericella, Fusarium, Gaeumannomyces, Humicola, Lentinula, Magnaporthe, Neocallimastix, Nocardiopsis, Oprinomyces, Paecilomyces, Penicillium, Pichia, Schizophyllum, Talaromyces, Thermomyces, Trichoderma. Грибкові ксиланази включають ксиланази дріжджів і нитчастих грибів. У переважних варіантах здійснення ксиланазу за винаходом одержують з гриба (i) типу Ascomycota; (ii) класу Pezizomycotina; (iii) загону Eurotiomycetes; (iv) подотряда Eurotiales; (v) сімейства Trichocomaceae, переважно, мітоспорових Trichocomaceae; ще більш переважно з гриба (vi) роду Aspergillus; найбільш переважно (vii) штамів Aspergillus niger. Очевидно зрозуміло, що визначення вказаних вище видів включає перфектні і неперфектні стани і інші таксономічні еквівалентні варіанти, наприклад, анаморфи, незалежно від назви виду, за яким вони відомі. Фахівці в даній галузі, очевидно, розуміють ідентичність відповідних еквівалентних варіантів. Штами вказаних вище бактерій і грибів доступні з ряду культуральних колекцій, таких як Американська колекція типових культур (АТСС), Німецька колекція мікроорганізмів і клітинних культур GmbH (DSMZ), Центральна колекція грибів (CBS) і Патентна служба досліджень по культуральних колекціях в сільському господарстві, Північний регіональний дослідницький центр (NRRL). Консультації з питань по таксономії можна одержати при зверненні до бази даних по таксономії, такої як Браузер таксономії NCBI, який доступний на наступному інтернет-сайті: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/taxonomyhome.html). Однак переважно звернутися до наступного посібника: Dictionary of the Fungi, 9th edition, edited by Kirk P.M., Cannon P.F., David J.C. & Stalpers J.A., CAB Publishing, 2001; і Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Second edition (2005). Даний винахід стосується модифікації(ій) в визначеному амінокислотному положенні(ях). Дані положення перераховані при зверненні до амінокислотної послідовності В. subtilis, представленої як SEQ ID NO:1. У даному винаході поліпептиди з ксиланазною активністю містять модифікацію, щонайменше одну або дві модифікації амінокислоти в положенні, вибраному з положень 12 і 13; і одну або більше додаткових модифікацій амінокислоти в положенні, вибраному з положень 15, 34, 54, 77, 81, 82, 99, 104, 110, 113, 114, 118, 122, 141, 154, 159, 162, 164, 166, 175 і 179, в порівнянні з послідовністю В. subtilis, представленою як SEQ ID NO:1. Еквівалентні положення в інших ксиланазах сімейства 11 можна знайти вирівнюванням інших ксиланаз з SEQ ID NO:1 з сімейства 11 і визначенням того, яка амінокислота вирівнюється з конкретною амінокислотою SEQ ID NO:1. Таке вирівнювання і застосування однієї послідовності як стандарт є звичайною процедурою для фахівців в даній галузі. 8 UA 103215 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У одному аспекті варіантна ксиланаза за винаходом має підвищену солюбілізуючу активність для висівок, яка вище, ніж можна одержати при використанні відповідної ксиланази дикого типу, або будь-якої ксиланази, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з SEQ ID NO:1-22, за даними "тесту оцінки солюбілізації висівок". У одному аспекті ксиланаза за винаходом має підвищену солюбілізуючу активність для висівок в результаті модифікації в положенні, вибраному з положень 12 і 13; в комбінації з однією або більше модифікаціями амінокислоти в положенні, вибраному з положень 15, 34, 54, 77, 81, 82, 99, 104, 110, 113, 114, 118, 122, 141, 154, 159, 162, 164, 166, 175 і 179. Відповідно, солюбілізуючу активність ксиланази для висівок можна оцінити з використанням тесту оцінки солюбілізації висівок, описаного в даному документі. Таким чином, можна забезпечити поліпептиди, що мають підвищену ксиланазну активність і/або підвищену солюбілізуючу активність для висівок. Вимога для специфічності відносно WU-AX стає все більш і більш важливою, оскільки в багатьох застосуваннях використовуються високі концентрації висівок зернових рослин. У хлібопекарській промисловості в багатьох продуктах використовують підвищені концентрації висівок для розв'язання проблем зі здоров'ям і харчуванням, в харчовій промисловості є тенденція до включення підвищених кількостей висівок (волокно, висушена барда з розчинними речовинами (DDGS)), наприклад, за рахунок застосування зернових у виробництві біоетанолу. Отже, переважно забезпечити нові ксиланази з підвищеною специфічністю, і, отже, ефективністю в солюбілізації висівок. Тест оцінки солюбілізації висівок Переважно, розчинність висівок визначають з використанням наступного тесту. Готують суспензію пшеничних висівок в буфері лимонна кислота (0,1 М)-динатрій гідрофосфат (0,2 М), рН 5,0 з концентрацією 1,33 % висівок (мас./мас.). Аліквотні порції даної суспензії об'ємом 750 мкл переносять в пробірки Епендорфа при перемішуванні. Кожну пробірку з субстратом попередньо нагрівають протягом 5 хв. при 40С. До вмісту пробірки додають 250 мкл розчину ферменту до кінцевої концентрації субстрату 1 %. Готують три розведення (в двох паралелях) розчину кожної ксиланази із зростаючими концентраціями ферменту (0,33; 1,0 і 3,0 мкг ксиланази/г висівок) на кожний час визначення (0, 30, 60 і 240 хв.). Як контроль використовують розчин денатурованої нагріванням ксиланази. Реакцію зупиняють на вказані часові точки перенесенням пробірок в термостат при 95С. Денатуровані нагріванням проби зберігають при 4С до закінчення всіх ферментативних реакцій. Коли всі ферментні реакції зупинені, пробірки Епендорфа центрифугують з одержанням прозорого супернатанта. Здатність ферментів солюбілізувати висівки виражають у вигляді збільшення числа редукуючих кінцевих груп з використанням PAHBAH (Lever, 1972). Оскільки побічна активність, така як амілазна активність, може приводити до спотворення результатів описаного вище тесту, то тест солюбілізації потрібно провести тільки на зразках очищеної ксиланази (див. приклад 2). У одному аспекті ксиланаза за винаходом має знижену чутливість до інгібітору ксиланази в порівнянні з будь-якою ксиланазою дикого типу або будь-якою ксиланазою, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з SEQ ID NO:1-22. У додатковому аспекті, ксиланаза за винаходом має знижену чутливість до інгібітору ксиланази в результаті модифікації в положенні, вибраному з положень 12 і 13; в комбінації з однією або більше модифікаціями амінокислоти в положенні, вибраному з положень 15, 34, 54, 77, 81, 82, 99, 104, 110, 113, 114, 118, 122, 141, 154, 159, 162, 164, 166, 175 і 179. Інгібітор може представляти інгібітор, що зустрічається в рослинних тканинах в природі. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін "інгібітор ксиланази", він стосується сполуки, як правило білка, функція якого полягає в регуляції деполімеризації складних вуглеводів, таких як арабіноксилан, що знаходиться в стінках рослинних клітин. Такі інгібітори ксиланази можуть знижувати активність ферментів ксиланаз, що зустрічаються в природі, а також ксиланаз грибкового або рослинного походження. Є повідомлення про наявність інгібіторів ксиланаз в насінні злакових (див., наприклад, McLauchlan et al., 1999a; Rouau and Suget, 1998). McLauchlan et al. (1999а) описали виділення і охарактеризували білок з пшениці, який зв'язується і інігбує дві ксиланази з сімейства 11. Аналогічно в WO 98/49278 показаний вплив екстракту пшеничного борошна на активність деяких мікробних ксиланаз, всі з яких належать до ксиланаз сімейства 11. Debyser et al. (1999) також описали, що ендоксиланази Aspergillus niger і Bacillus subtilis, які, обидві, є членами сімейства 11, інгібувалися під дією пшеничного інгібітору ксиланази, названого TAXI. McLauchlan et al. (1999b) повідомляли, що екстракти зразків комерційно доступного борошна, такого як пшеничне, ячмінне, рисове і кукурудзяне, здатні інгібувати ксиланази, що належать до обох сімейств 10 і 11. 9 UA 103215 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Інгібітор ксиланази може являти собою будь-який придатний інгібітор ксиланази. Як приклад, інгібітор ксиланази може представляти інгібітор, описаний в WO-A-98/49278, і/або інгібітор ксиланази, описаний Rouau X. and Surget А. (1998), McLauchlan R. et al. (1999), і/або інгібітор ксиланази, описаний в заявці на патент Великобританії № 9828599.2 (поданої 23 грудня 1998 року), в заявці на патент Великобританії № 9907805.7 (поданої 6 квітня 1999 року) і в заявці на патент Великобританії № 9908645.6 (поданої 15 квітня 1999 року). Також інгібітори, описані на попередньому рівні техніки, можна використовувати в тестах визначення чутливості варіантного поліпептиду за винаходом до інгібіторів ксиланази. Їх також можна використовувати, як описано нижче, для модуляції функціональної активності ксиланази. Тест з інгібітором ксиланази Переважно, інгібування активності ксиланази визначають з використанням наступного тесту. Змішували 100 мкл препарату інгібітору (того, що містить різні концентрації інгібітору ксиланази (для кількісного аналізу кількісне визначення інгібітору ксиланази див. нижче)), 250 мкл розчину ксиланази (що містить 12 XU ксиланазних одиниць/мл) і 650 мкл буферу (0,1 М лимонна кислота-0,2М динатрій гідрофосфат, 1 % BSA (Sigma-Aldrich, США), рН 5,0). Суміш інкубували протягом 5 хв. при 40,0С. Через 5 хв. додавали одну таблетку ксилазиму. Через 15 хв. реакцію зупиняли доданням 10 мл 2 % Тріс/NaOH, рН 12. Реакційну суміш центрифугували (1500g, 10 хв., 20С) і визначали оптичну густину OD супернатанта при довжині хвилі 590 нм. Інгібування ксиланази розраховували як залишкову активність у % від активності в контролі. Ендогенну ендо-β-1,4-ксиланазу, використану в тесті, одержують з пшеничного борошна. інгібітор являє собою дипептид з молекулярною масою приблизно 40 kDa (за даними електрофорезу SDS-PAGE або мас-спектрометрії) і pI знаходиться в межах приблизно від 8 до приблизно 9,5. Аналіз послідовності виявив, що інгібітор має послідовність SEQ ID NO:24 або послідовність з високою гомологією до неї. Метод кількісної оцінки концентрації інгібітору в даному препараті інгібітору можна знайти в прикладі 3. Контрольні проби готували аналогічно, замінивши розчин інгібітору на воду. Також даний винахід стосується нуклеотидної послідовності, яка кодує поліпептид за винаходом, включаючої нуклеотидну послідовність, операбельно пов'язану з однією або більше регуляторними послідовностями, які регулюють експресію кодуючої послідовності у відповідній клітині-хазяїні в умовах, сумісних з регуляторними послідовностями. Полінуклеотид, який кодує поліпептид за даним винаходом, можна обробити різними шляхами для забезпечення експресії поліпептиду. Обробка полінуклеотидної послідовності перед її вбудовуванням у вектор може бути бажаною або необхідною в залежності від експресуючого вектора. Способи модифікації полінуклеотидних послідовностей, в яких використовуються методи рекомбінантної ДНК, відомі в даній галузі. Регуляторна послідовність може являти собою придатну промоторну послідовність, нуклеотидну послідовність, яка розпізнається клітиною-хазяїном, для експресії полінуклеотиду, що кодує поліпептид за даним винаходом. Промотор містить послідовності, контролюючі транскрипцію, які опосередковують експресію поліпептиду. Промотор може представляти будьяку нуклеотидну послідовність, що виявляє транскрипційну активність в переважній для вибору клітині-хазяїні, включаючи мутантні, зрізані і гібридні промотори, і її можна одержувати з генів, що кодують позаклітинні або внутрішньоклітинні поліпептиди, гомологічні або гетерологічні для клітини-хазяїна. Приклади придатних промоторів для регуляції транскрипції нуклеїновокислотних конструкцій за даним винаходом, особливо в бактеріальній клітині-хазяїні, представляють промотори, одержані з lac-оперона Е. coli, гена агарази Streptomyces coelicolor (dagA), гена левансахарази Bacillus subtilis (sacD), генаальфа-амілази Bacillus licheniformis (amyL), гена мальтогенної амілази Bacillus stearothermophillus (amyM), гена альфа-амілази Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), гена пеніцилінази Bacillus licheniformis (penP), генів xyIA і xyIB Bacillus subtilis і гена бета-лактамази прокаріотів (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 75:3727-3731), а також tac-промотор (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 80:21-25). Додаткові промотори описані в "Useful proteins from recombinant bacteria" в Scientific American, 1980, 242:74-94; і Sambrook et al., 1989, вище. Прикладами придатних промоторів для регуляції транскрипції нуклеїновокислотних конструкцій за даним винаходом в клітинах-хазяїнах, що являють собою нитчасті гриби, є промотори, одержані з генів амілази TAKA Aspergillus oryzae, аспарагінової протеїнази Rhizomucor miehei, нейтральної альфа-амілази Aspergillus niger, стабільної до кислот альфаамілази Aspergillus niger, глюкоамілази Aspergillus niger або Aspergillus awamori (glaA), ліпази Rhizomucor miehei, лужної протеази Aspergillus oryzae, триозофосфатізомерази Aspergillus 10 UA 103215 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 oryzae, ацетамідази Aspergillus nidulans, амілоглюкозидази Fusarium venenatum (WO 00/56900), Daria Fusarium venenatum (WO 00/56900), Quinn Fusarium venenatum (WO 00/56900), трипсиноподібної протеази Fusarium oxysporum (міжнародна заявка WO 96/00787), бетаглюкозидази Trichoderma reesei, цілобіогідролази I Trichoderma reesei, цілобіогідролази II Trichoderma reesei, ендоглюканази I Trichoderma reesei, ендоглюканази II Trichoderma reesei, ендоглюканази III Trichoderma reesei, ендоглюканази IV Trichoderma reesei, ендоглюканази V Trichoderma reesei, ксиланази I Trichoderma reesei, ксиланази II Trichoderma reesei, бетаксилозидази Trichoderma reesei, а також промотор NA2-tri (гібрид промоторів з генів нейтральної альфа-амілази Aspergillus niger і триозофосфатізомерази Aspergillus oryzae) і їх мутантні, зрізані і гібридні промотори. У дріжджових хазяїнах прийнятні промотори одержують з генів енолази Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), галактокінази Saccharomyces cerevisiae (GAL1), алкогольдегідрогенази/гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази Saccharomyces cerevisiae (ADH1, ADH2/GAP), фосфатізомерази Saccharomyces cerevisiae (TPI), металотіоніну Saccharomyces cerevisiae (CUP1) і 3-фосфогліцераткінази Saccharomyces cerevisiae. Інші прийнятні промотори для дріжджових клітин-хазяїнів описані Romanos et al., 1992, Yeast, 8:423-488. Також регуляторна послідовність може представляти послідовність прийнятного термінатора транскрипції, послідовність, що розпізнається клітиною-хазяїном для закінчення транскрипції. Послідовність термінатора операбельно пов'язана з 3'-кінцем нуклеотидної послідовності, що кодує поліпептид. Можна використовувати будь-який термінатор, який функціонує в переважній для вибору клітині-хазяїні. Термінатори для клітин-хазяїнів, що являють собою нитчасті гриби, можна одержати з генів амілази TAKA Aspergillus oryzae, глюкоамілази Aspergillus niger, антранілатсинтази Aspergillus nidulans, альфа-глюкозидази Aspergillus niger і трипсиноподібної протеази Fusarium oxysporum. Термінатори дріжджових клітин-хазяїнів можна одержати з генів енолази Saccharomyces cerevisiae, цитохрому С Saccharomyces cerevisiae (CYC1) і гліцеральдегід-3фосфатдегідрогенази Saccharomyces cerevisiae. Інші придатні термінатори для дріжджових клітин-хазяїнів описані Romanos et al., 1992, вище. Регуляторна послідовність також може представляти придатну лідерну послідовність, нетрансльовану область мРНК, яка важлива для трансляції клітиною-хазяїном. Лідерна послідовність операбельно пов'язана з 5'-кінцем нуклеотидної послідовності, що кодує поліпептид. У даному винаході можна використовувати будь-яку лідерну послідовність, яка функціонує в переважній для вибору клітині-хазяїні. Лідери для клітин-хазяїнів, що являють собою нитчасті гриби, можна одержати з генів амілази TAKA Aspergillus oryzae і триозофосфатізомерази Aspergillus nidulans. Придатні лідери для дріжджових клітин-хазяїнів одержують з генів енолази Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), 3-фосфогліцераткінази Saccharomyces cerevisiae, альфа-чинника Saccharomyces cerevisiae і алкогольдегідрогенази/гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP). Регуляторна послідовність може являти собою послідовність для поліаденілування, послідовність операбельно пов'язану з 3'-кінцем нуклеотидної послідовності і яка при транскрипції розпізнається клітиною-хазяїном як сигнал для додання залишків поліаденозину до транскрибованої мРНК. У даному винаході можна використовувати будь-яку послідовність для поліаденілування, яка функціонує в переважній для вибору клітині-хазяїні. Послідовності для поліаденілування для клітин-хазяїнів, що являють собою нитчасті гриби, можна одержати з генів амілази TAKA Aspergillus oryzae, глюкоамілази Aspergillus niger, антранілатсинтази Aspergillus nidulans, трипсиноподібної протеази Fusarium oxysporum і альфаглюкозидази Aspergillus niger. Прийнятні послідовності для поліаденілування для дріжджових клітин-хазяїнів описані Guo and Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology, 15:5983-5990. Регуляторна послідовність може також представляти область, яка кодує сигнальний пептид, що кодує амінокислотну послідовність, пов'язану з амінокінцем поліпептиду і спрямовує кодований поліпептид по секреторному шляху клітини. 5'- кінець кодуючої послідовності нуклеотидної послідовності може спочатку містити область, що кодує сигнальний пептид, природним способом пов'язану в трансляційній рамці зчитування з сегментом кодуючої області, яка кодує поліпептид, що секретується. Альтернативно, 5'-кінець кодуючої послідовності може містити область, що кодує сигнальний пептид, яка є чужорідною для кодуючої послідовності. Чужорідна область, що кодує сигнальний пептид, може стати необхідною, коли кодуюча послідовність в природних умовах не містить області, що кодує сигнальний пептид. Альтернативно, чужорідна область, що кодує сигнальний пептид, може просто замінювати 11 UA 103215 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 природну область, що кодує сигнальний пептид, для підвищення секреції поліпептиду. Однак в даному винаході можна використовувати будь-яку область, що кодує сигнальний пептид, яка спрямовує експресований поліпептид по секреторному шляху переважної для вибору клітинихазяїна, тобто секретуватися в культуральне середовище. Ефективні області, що кодують сигнальний пептид, для бактеріальних клітин-хазяїнів являють собою області, що кодують сигнальний пептид, одержані з генів мальтогенної амілази Bacillus NCIB 11837, альфа-амілази Bacillus stearothermophillus, субтилізину Bacillus licheniformis, бета-лактамази Bacillus licheniformis, нейтральних протеаз Bacillus stearothermophillus (nprT, nprS, nprM) і prsA Bacillus subtilis. Додаткові сигнальні пептиди описані Simonen and Palva, 1993, Microbiological Reviews, 57:109-137. Ефективними областями, що кодують сигнальний пептид, для клітин-хазяїнів, що являють собою нитчасті гриби, є області, що кодують сигнальний пептид, одержані з генів амілази TAKA Aspergillus oryzae, нейтральної амілази Aspergillus niger, глюкоамілази Aspergillus niger, аспарагінової протеїнази Rhizomucor miehei, целюлази Humicola insolens, ендоглюканази V Humicola insolens і ліпази Humicola lanuginose. Придатні сигнальні пептиди для дріжджових клітин-хазяїнів одержують з генів альфачинника Saccharomyces cerevisiae і інвертази чинника Saccharomyces cerevisiae. Інші придатні кодуючі області сигнальних пептидів описані Romanos et al., 1992, вище. Регуляторна послідовність також може представляти кодуючу пропептид область, яка кодує амінокислотну послідовність, що знаходиться в амінокінці поліпептиду. Одержаний в результаті поліпептид відомий як проензим або прополіпептид (або в деяких випадках зимоген). Як правило, прополіпептид є неактивним і може перетворюватися в зрілий активний поліпептид в результаті каталітичного або аутокаталітичного відщеплювання пропептиду від прополіпептиду. Кодуючу пропептид область можна одержати з генів лужної протеази Bacillus subtilis (aprE), нейтральної протеази Bacillus subtilis (nprf), альфа-чинника Saccharomyces cerevisiae, аспарагінової протеїнази Rhizomucor miehei і лакази Myceliophthora thermophila (WO 95/33836). У тому випадку, коли в амінокінці поліпептиду одночасно знаходяться області сигнального пептиду і пропептиду, то область пропептиду знаходиться за амінокінцем поліпептиду і область сигнального пептиду знаходиться за амінокінцем області пропептиду. Також може бути бажаним додати регуляторні послідовності, що забезпечують регуляцію експресії поліпептиду, пов'язану із ростом клітини-хазяїна. Прикладами регуляторних систем є системи, які приводять до "включення" або "виключення" експресії гена у відповідь на хімічний або фізичний стимул, включаючи присутність регулюючої сполуки. Регуляторні системи в прокаріотичних системах включають lac-, tec- і tip-оператори. У дріжджах можна використовувати системи ADH2 або GAL1. У нитчастих грибах як регуляторні послідовності можна використовувати промотор альфа-амілази TAKA, промотор глюкоамілази Aspergillus niger і промотор глюкоамілази Aspergillus oryzae. Іншими прикладами регуляторних послідовностей є послідовності, що забезпечують ампліфікацію генів. У еукаріотичних системах дані послідовності включають ген дигідрофолатредуктази, який ампліфікується в присутності метотрексату, і гени металотіонеїну, які піддаються ампліфікації в присутності важких металів. У даних випадках нуклеотидна послідовність, що кодує поліпептид, буде операбельно пов'язана з регуляторною послідовністю. Даний винахід також стосується рекомбінантних експресуючих векторів, що містять полінуклеотид, який кодує поліпептид за даним винаходом, промотор і стоп-сигнали транскрипції і трансляції. Різні нуклеїнові кислоти і регуляторні послідовності, описані в даному документі, можна з'єднати разом з одержанням рекомбінантного експресуючого вектора, який може включати один або більше придатних сайтів рестрикції для інсерції або заміни нуклеотидної послідовності, що кодує поліпептид в таких сайтах. Альтернативно, нуклеотидну послідовність, що кодує поліпептид за даним винаходом, можна експресувати за допомогою вбудовування нуклеотидної послідовності або нуклеїновокислотної конструкції, що містить послідовність, у придатний вектор для експресії. При конструюванні експресуючого вектора кодуючу послідовність у векторі розташовують таким чином, щоб кодуюча послідовність була операбельно пов'язана з придатними регуляторними послідовностями для контролю експресії. Рекомбінантний експресуючий вектор може являти собою будь-який вектор (наприклад, плазміду або вірус), який можна піддати відповідно методам рекомбінантної ДНК і який забезпечує експресію нуклеотидної послідовності. Як правило, вибір вектора буде залежати від сумісності вектора з клітиною-хазяїном, в яку вводять вектор. Вектори можуть бути лінійними або замкненими кільцевими плазмідами. Вектор може являти собою вектор, який автономно реплікується, тобто вектор, який існує у вигляді екстрахромосомної структури, реплікація якої не залежить від реплікації хромосом, 12 UA 103215 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 наприклад, він може являти собою плазміду, екстрахромосомний елемент, мініхромосому або штучну хромосому. Вектор може містити будь-які елементи для забезпечення ауторепликації. Альтернативно, вектор може являти собою вектор, який при введенні в клітину-хазяїна, вбудовується в геном і реплікується разом з хромосомою(ами), в яку він інтегрований. Крім того, можна використовувати один вектор або плазміду, або два або більше векторів або плазмід, які спільно містять всю ДНК для введення в геном клітини-хазяїна, або транспозон. Вектори за даним винаходом переважно містять один або більше селективних маркерів, які дозволяють легко відібрати трансформовані, трансфектовані, трансдуковані або тому подібні клітини. Селективний маркер представляє ген продукту, який забезпечує резистентність до біоциду або вірусу, резистентність до важких металів, прототрофію до ауксотрофам і тому подібне. Прикладами бактеріальних селективних маркерів є гени dal з Bacillus subtilis або Bacillus licheniformis, або маркери, що додають резистентність до антибіотиків, наприклад, резистентність до ампіциліну, канаміцину, хлорамфеніколу або тетрацикліну. Придатними маркерами для дріжджових клітин-хазяїнів є ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 і URA3. Селективні маркери для застосування в клітинах-хазяїнах, що являють собою нитчасті гриби, включають, не обмежуючись цим, amdS (ацетамідаза), argB (орнітинкарбамоїлтрансфераза), bar (фосфінотрицинацетилтрансфераза), hph (гігроміцинфосфотрансфераза), niaD (нітратредуктаза), pyrG (оротидин-5'-фосфатдекарбоксилаза), sC (сульфатаденілтрансфераза) і trpC (антранілатсинтаза), а також їх еквівалентні варіанти. У деяких варіантах здійснення застосовують гени amdS і pyrG Aspergillus nidulans або Aspergillus oryzae, і ген bar Streptomyces hygroscopicus в клітині Aspergillus. Вектори за даним винаходом переважно містять елемент(и), який забезпечує вбудовування вектора в геном клітини-хазяїна або автономну реплікацію вектора в клітині, незалежно від генома. Для вбудовування в геном клітини-хазяїна основою вектора може бути полінуклеотидна послідовність, що кодує поліпептид, або будь-який інший елемент вектора для вбудовування в геном за допомогою гомологічної або негомологічної рекомбінації. Альтернативно, вектор може містити додаткові нуклеотидні послідовності для спрямовування інтеграції за допомогою гомологічної рекомбінації в геном клітини-хазяїна в точному положенні(ях) в хромосомі(ах). Для підвищення імовірності інтеграції в точне положення елементи, що вбудовуються, повинні містити достатню кількість пар основ нуклеїнових кислот, наприклад, в межах 100-10000 пар основ, переважно 400-10000 пар основ і, найбільш переважно, 800-10000 пар основ, що мають високу міру ідентичності з відповідною послідовністю-мішенню для підвищення імовірності гомологічної рекомбінації. Елементи, що вбудовуються, можуть представляти будь-яку послідовність, яка гомологічна послідовності-мішені в геномі клітини-хазяїна. Крім того, елементи, що вбудовуються, можуть бути некодуючими або кодуючими нуклеотидними послідовностями. З іншого боку, вектор можна інтегрувати в геном клітини-хазяїна за допомогою негомологічної рекомбінації. Для автономної реплікації вектор може додатково містити оріджин реплікації, сприяючий автономній реплікації вектора в даній клітині-хазяїні. Оріджин реплікації може являти собою будь-який плазмідний репликатор, що опосередковує автономну реплікацію, яка функціонує в клітині. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін "оріджин реплікації" або "плазмідний репликатор", він означає нуклеотидну послідовність, яка забезпечує реплікацію плазміди або вектора в умовах in vivo. Прикладами бактеріальних оріджинів реплікації є оріджини реплікації плазмід pBR322, pUC19, pACYC177 і pACYC184, що забезпечують реплікацію в Е. coli і pUB110, pE194, pTA1060 і pAM, i, що забезпечують реплікацію в Bacillus. Прикладами оріджинів реплікації для застосування в дріжджових клітинах-хазяїнах є 2-мкм оріджин реплікації ARS1, ARS4, комбінація ARS1 і CEN3, і комбінація ARS4 і CEN6. Прикладами оріджинів реплікації, придатних для застосування в клітині нитчастого гриба, є AMA1 і ANSI (Gems et al., Gene, 1991, 98:61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Research, 15:9163-9175; WO 00/24883). Виділення гена AMA1 і конструювання плазмід або векторів, що містять ген, можна провести, слідуючи способам, розкритим в WO 00/24883. Для підвищення продукції гена-продукту в клітині-хазяїні можна вставити більше ніж одну копію полінуклеотиду за даним винаходом. Підвищення числа піків можна досягнути вбудовуванням в геном клітини-хазяїна щонайменше однієї додаткової копії послідовності або включенням селективного гена-маркера, що ампліфікується, спільно з полінуклеотидом, де клітини, що містять ампліфіковані копії селективного гена-маркера і, таким чином, додаткові копії полінуклеотиду, можна відібрати культивуванням клітин в присутності відповідного селективного агента. 13 UA 103215 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фахівцям в даній галузі добре відомі методи, що використовуються для лігування елементів, описаних вище, для конструювання рекомбінантних експресуючих векторів за даним винаходом (див., наприклад, Sambrook et al., 1989, вище). Даний винахід також стосується рекомбінантних клітин-хазяїнів, що містять полінуклеотид, який кодує поліпептид за даним винаходом, які переважно використовують при рекомбінантній продукції поліпептидів. Вектор, що містить полінуклеотид, який кодує поліпептид за даним винаходом, вводять в клітину-хазяїна таким чином, щоб вектор підтримувався як інтегрований в хромосому елемент або як самореплікований екстрахромосомний вектор, описаний вище. Термін "клітина-хазяїн" включає будь-яке потомство вихідної клітини, яке не ідентичне вихідній клітині внаслідок мутацій, що відбуваються під час реплікації. Вибір клітини-хазяїна у великій мірі залежить від гена, що кодує поліпептид, і його джерела. Клітина-хазяїн може представляти одноклітинний мікроорганізм, наприклад, прокаріот, або багатоклітинний мікроорганізм, наприклад, еукаріот. Придатними одноклітинними мікроорганізмами є бактеріальні клітини, такі як грампозитивні бактерії, включаючи, не обмежуючись цим, клітину Bacillus, наприклад, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis і Bacillus thuringiensis; або клітину Streptomyces, наприклад, Streptomyces lividans і Streptomyces murinus, або грамнегативні бактерії, такі як Е. coli і Pseudomonas sp. У одному аспекті бактеріальною клітиною-хазяїном є клітина Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus або Bacillus subtilis. У іншому аспекті клітина Bacillus представляє алкалофільну клітину Bacillus. Введення вектора в бактеріальну клітина-хазяїна можна провести, наприклад, за допомогою трансформації протопластів (див., наприклад, Chang and Cohen, 1979, Molecular General Genetics, 168:111-115) з використанням компетентних клітин (див., наприклад, Young and Spizizen, 1961, Journal of Bacteriology, 81:823-829 або Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology, 56:209-221), електропорації (див., наприклад, Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques, 6:742-751) або кон'югації (див., наприклад, Koehler and Thome, 1987, Journal of Bacteriology, 169:5771-5278). Клітина-хазяїн також може представляти еукаріотичну клітину, таку як клітина ссавця, комахи, рослини або гриба. У одному аспекті клітина-хазяїн є клітиною грибів. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін "гриби", він включає типи Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota і Zygomycota (Hawksworth et al., що визначаються, In Ainsworth and Bisby's th Dictionary of the Fungi, 8 edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK), а також Oomycota (цитоване Hawksworth et al., 1995, вище, сторінка 171) і всі мітоспорові гриби (Hawksworth et al., 1995, вище). У іншому аспекті, що стосується грибів, клітина-хазяїн представляє дріжджову клітину. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін "дріжджі", він включає аскоспорогенні дріжджі (Endomycetales), базидіоспорогенні дріжджі і дріжджі, що належать до незавершених грибів (Blastomycetes). Оскільки класифікація дріжджів може змінитися в майбутньому, то для цілей даного винаходу дріжджі потрібно визначати, як описано в "Biology and Activities of Yeast" (Skinner F.A., Passmore S.M. and Davenport R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series, No 9, 1980). У ще одному додатковому аспекті дріжджова клітина-хазяїн представляє клітину Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces або Yarrowia. У одному конкретному варіанті здійснення дріжджова клітина-хазяїн представляє клітину Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis або Saccharomyces oviformis. У ще одному аспекті дріжджова клітина-хазяїн є клітиною Kluyveromyces lactis. У ще одному аспекті дріжджова клітина-хазяїн представляє клітину Yarrowia lipolytica. У ще одному аспекті клітина-хазяїн, що належить до грибів, представляє клітину нитчастого гриба. "Нитчасті гриби" включають всі нитчасті форми грибів, що належать до підрядів Eumycota і Oomycota (визначені Hawksworth et al., 1995, вище). Як правило, нитчасті гриби характеризуються стінкою міцелію, що складається з хітину, целюлози, глюкану, хітозану, манану і інших складних полісахаридів. Вегетативний ріст відбувається за рахунок подовження гіфів, і катаболізм вуглецю є облігативно аеробний. Протилежно, вегетативний ріст дріжджів, таких як Saccharomyces cerevisiae відбувається за рахунок брунькування одноклітинного талому, і катаболізм вуглецю може бути ферментативним. У ще одному аспекті клітина-хазяїн, що стосується нитчастих грибів, представляє клітину Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, 14 UA 103215 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Neocallimastrix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes і Trichoderma. У ще одному варіанті здійснення клітина-хазяїн, що належить до нитчастих грибів, представляє клітину Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger або Aspergillus oryzae. У ще одному варіанті здійснення клітина-хазяїн, що належить до нитчастих грибів, представляє клітину Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellence, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides або Fusarium venenatum. У ще одному варіанті здійснення клітина-хазяїн, що належить до нитчастих грибів, представляє клітину Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Coprinus cinereus, Ceriolus hirsutus, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei або Trichoderma viride. Клітини грибів можна трансформувати методом, що включає утворення протопластів, трансформацію протопластів і регенерацію клітинної стінки в основному відомим способом. Придатні способи трансформації клітин-хазяїнів Aspergillus і Trichoderma описані в ЕР 238023 і Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 81:1470-1474. Придатні методи трансформації видів Fusarium описані Maladier et al., 1989, Gene, 78:147-156 і в WO 96/00787. Дріжджі можна трансформувати з використанням методів, описаних Becker and Guarente, In Abelson J.N. and Simon M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp. 182-187, Academic Press, Inc. New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology, 153:163 і Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 75:1920. Даний винахід також стосується способів одержання поліпептиду за даним винаходом, що включають: (а) культивування клітини, яка в своїй формі дикого типу здатна продукувати поліпептид в умовах, придатних для продукції поліпептиду і (b) виділення поліпептиду. Переважно, клітина є клітиною роду Aspergillus і, більш переважно, Aspergillus fumigatus. Даний винахід також стосується способів одержання поліпептиду за даним винаходом, що включають (а) культивування клітини в умовах, придатних для продукції поліпептиду і (b) виділення поліпептиду. У способах одержання за даним винаходом клітини культивують в поживному середовищі, придатному для одержання поліпептиду, з використанням способів, добре відомих в даній галузі. Наприклад, клітину можна культивувати за допомогою культивування у колбі, що струшується, і низькомасштабної або крупномасштабної ферментації (включаючи постійну, періодичну ферментацію, ферментацію з підживлюванням або твердофазну ферментацію) в лабораторних або промислових ферментерах у прийнятному середовищі і в умовах, що забезпечують експресію і/або виділення поліпептиду. Культивування проводять у придатному поживному середовищі, що містить джерела вуглецю і азоту, і неорганічні солі з використанням методів, відомих в даній галузі. Придатні середовища єпромислово доступними, або їх можна приготувати згідно з опублікованими складами (наприклад, в каталогах Американської колекції типових культур). Якщо поліпептид секретується в поживне середовище, то поліпептид можна виділити безпосередньо з середовища. Якщо поліпептид не секретується в середовище, то поліпептид можна виділити з клітинних лізатів. Поліпептиди можна детектувати з використанням методів, відомих в даній галузі, які є специфічними для поліпептидів. Дані методи детектування можуть включати застосування специфічних антитіл, утворення продукту ферменту або зникнення субстрату ферменту. Наприклад, для визначення активності поліпептиду можна використовувати ферментний метод, описаний в даному документі. Одержаний поліпептид можна виділити з використанням способів, відомих в даній галузі. Наприклад, поліпептид можна виділити з поживного середовища звичайними методами, включаючи, не обмежуючись цим, центрифугування, фільтрацію, екстракцію, сушіння розпилюванням, випарювання або осадження. Поліпептиди за даним винаходом можна очистити різними способами, відомими в даній галузі, включаючи, не обмежуючись цим, хроматографію (наприклад, іонообмінну, афінну, гідрофобну, хроматофокусування і гель 15 UA 103215 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 фільтрацію), електрофоретичні методи (наприклад, препаративне ізоелектричне фокусування), диференціальну розчинність (наприклад, осадження сульфатом амонію), електрофорез SDSPAGE або екстракцію (див., наприклад, Protein Purification, Janson J.-C. and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989) з одержанням по суті чистих поліпептидів. У одному аспекті щонайменше одна, наприклад дві, наприклад три, наприклад, чотири модифікації амінокислоти представляють заміну амінокислоти. У одному аспекті всі модифікації амінокислоти в поліпептиді представляють заміну амінокислоти. У одному аспекті щонайменше одна, наприклад дві, наприклад три, наприклад, чотири модифікації амінокислоти представляють делецію амінокислоти. У одному аспекті всі модифікації амінокислоти в поліпептиді представляють делецію амінокислоти. У одному аспекті щонайменше одна, наприклад дві, наприклад три, наприклад, чотири модифікації амінокислоти представляють інсерцію амінокислоти. У одному аспекті всі модифікації амінокислоти в поліпептиді представляють інсерцію амінокислоти. У деяких варіантах здійснення ідентичність послідовності поліпептиду, що має ксиланазну активність, за винаходом, визначають відносно SEQ ID NO:1, де амінокислотна послідовність SEQ ID NO:1 додатково містить послідовність сигнального пептиду, таку як послідовність її природного сигнального пептиду. У деяких варіантах здійснення поліпептид, що має ксиланазну активність, за винаходом містить одну або більше амінокислотних замін, вибраних з групи, що складається з 12, 13, 15, 34, 54, 77, 81, 82, 99, 104, 110, 113, 114, 118, 122, 141, 154, 159, 162, 164, 166, 175 і 179, де положення визначається(ються) як придатне(і) положення в амінокислотній послідовності В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. У деяких варіантах здійснення поліпептид, що має ксиланазну активність, за винаходом містить одну або більше амінокислотних замін, вибраних з групи, що складається з 12F, 13Y, 15Y, 34K, 54Q, 54W, 77V, 77M, 77Y, 77L, 77S, 81I, 82I, 99Y, 104W, 110A, 113D, 113A, 114F, 114D, 114Y, 118V, 122F, 122D, 141Q, 154R, 159D, 162E, 162D, 164F, 166F, 175L, 175K, 175E, 175Y і 179Y, де положення визначається(ються) як придатне(і) положення в амінокислотній послідовності В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. У деяких варіантах здійснення поліпептид, що має ксиланазну активність, за винаходом містить одну або більше амінокислотних замін, вибраних з групи, що складається з G12F, G13Y, I15Y, G34K, N54Q, I77V, I77M, I77Y, I77L, I77S, V81I, V82I, K99Y, T104W, T110A, Y113D, Y113A, N113F, N114D, N114Y, I118V, R122F, R122D, N141Q, K154R, N159D, S162E, S162D, 164F, Y166F, Q175L, Q175K, Q175E, Q175Y і S179Y, де положення визначається(ються) як придатне(і) положення в амінокислотній послідовності В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. У деяких варіантах здійснення поліпептид, що має ксиланазну активність, за винаходом має щонайменше 76, 78, 80, 85, 90, 95, 98 або 95 % ідентичність з послідовністю, з якою він має найвищий процент ідентичності, вибраною з послідовностей SEQ ID NO:1-22. У деяких варіантах здійснення поліпептид, що має ксиланазну активність, за винаходом має укладання "β-рулет з желе". У деяких варіантах здійснення поліпептид, що має ксиланазну активність, за винаходом представляє поліпептид, в якому одна або дві модифікації амінокислоти в положенні, вибраному з положень 12 і 13, представляють амінокислотні заміни. У деяких варіантах здійснення поліпептид, що має ксиланазну активність, за винаходом представляє поліпептид, в якому модифікація амінокислоти в положенні 12 представляє амінокислотну заміну на будь-який інший амінокислотний залишок, вибраний з групи, що складається з ізолейцину, аланіну, лейцину, аспарагіну, лізину, аспарагінової кислоти, метіоніну, цистеїну, фенілаланіну, глутамінової кислоти, треоніну, глутаміну, триптофану, валіну, проліну, серину, тирозину, аргініну і гістидину. У деяких варіантах здійснення поліпептид, що має ксиланазну активність, за винаходом представляє поліпептид, в якому модифікація амінокислоти в положенні 13 представляє амінокислотну заміну на будь-який інший амінокислотний залишок, вибраний з групи, що складається з ізолейцину, аланіну, лейцину, аспарагіну, лізину, аспарагінової кислоти, метіоніну, цистеїну, фенілаланіну, глутамінової кислоти, треоніну, глутаміну, триптофану, валіну, проліну, серину, тирозину, аргініну і гістидину. У деяких варіантах здійснення поліпептид, що має ксиланазну активність, за винаходом представляє поліпептид, в якому модифікація амінокислоти в положенні 12 представляє заміну 16 UA 103215 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 на будь-який інший амінокислотний залишок, вибраний з групи, що складається з фенілаланіну і тирозину. У деяких варіантах здійснення поліпептид, що має ксиланазну активність, за винаходом представляє поліпептид, в якому модифікація амінокислоти в положенні 13 представляє заміну на будь-який інший амінокислотний залишок, вибраний з групи, що складається з фенілаланіну і тирозину. У деяких варіантах здійснення поліпептид, що має ксиланазну активність, за винаходом має загальне число амінокислот менше, ніж 250, наприклад, менше, ніж 240, менше, ніж 230, менше, ніж 220, менше, ніж 210, менше, ніж 200, в межах від 160 до 240, в межах від 160 до 220 амінокислот. У деяких варіантах здійснення поліпептид, що має ксиланазну активність, за винаходом містить одну або більше модифікацій в будь-якому одному або більше амінокислотних положеннях: 12, 13, 34, 77, 81, 99, 104, 110, 113, 114, 118, 122, 141, 154, 159, 162, 164, 166 і 175, де положення визначається(ються) як придатне(і) положення в амінокислотній послідовності В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. У деяких варіантах здійснення поліпептид, що має ксиланазну активність, за винаходом містить одну або більше амінокислотних замін, вибраних з групи, що складається з 12F, 13Y, 13F, 110A, 122D, 113А, 13Y, 54Q, 54W, 113D, 175L, 122F, 34K, 99Y, 104W, 141Q, 154R, 159D, 175K, 81I, 166F, 162E, 162D, 164F, 114D, 114Y, 114F, 118V, 175K, 77L, 77M, 77V і 77Y, де положення визначається(ються) як придатне(і) положення в амінокислотній послідовності В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. У деяких варіантах здійснення поліпептид, що має ксиланазну активність, за винаходом містить одну або більше амінокислотних замін, вибраних з групи, що складається з G12F, G13Y, G13F, N54Q, T110A, R122D, Y113A, G13Y, Y113D, Q175L, R122F, G34K, K99Y, T104W, N141Q, K154R, N159D, Q175K, V81I, Y166F, S162E, S162D, W164F, N114D, N114Y, N114F, I118V, I77L, I77M, I77S, I77V і I77Y, де положення визначається(ються) як придатне(і) положення в амінокислотній послідовності В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. У деяких варіантах здійснення поліпептид, що має ксиланазну активність, за винаходом містить одну або більше модифікацій в будь-якому одному або більше з амінокислотних положень 12, 13, 99, 104, 110, 113, 122, 141, 154, 159 і 175, де положення визначається(ються) як придатне(і) положення в амінокислотній послідовності В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. У деяких варіантах здійснення поліпептид, що має ксиланазну активність, за винаходом містить заміну(и) в амінокислотних положеннях 13 і 122, де положення визначається(ються) як придатне(і) положення в амінокислотній послідовності В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. У деяких варіантах здійснення поліпептид, що має ксиланазну активність, за винаходом додатково містить одну або більше модифікацій в будь-якому одному або більше з амінокислотних положень 114 і 166, де положення визначається(ються) як придатне(і) положення в амінокислотній послідовності В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. У деяких варіантах здійснення поліпептид, що має ксиланазну активність, за винаходом додатково містить одну або більше заміни в будь-якому одному або більше з амінокислотних положень 114 і 166, де положення визначається(ються) як придатне(і) положення в амінокислотній послідовності В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. У деяких варіантах здійснення поліпептид, що має ксиланазну активність, за винаходом містить заміни щонайменше в чотирьох з наступних амінокислотних положень 12, 13, 99, 104, 110, 113, 114, 122, 141, 154, 159, 166 і 175, де положення визначається(ються) як придатне(і) положення в амінокислотній послідовності В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. У деяких варіантах здійснення поліпептид, що має ксиланазну активність, за винаходом містить заміну(и) в амінокислотних положеннях 13, 113 і 122, де положення визначається(ються) як придатне(і) положення в амінокислотній послідовності В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. У деяких варіантах здійснення поліпептид, що має ксиланазну активність, за винаходом містить заміну(и) в амінокислотних положеннях 12, 113 і 122, де положення визначається(ються) як придатне(і) положення в амінокислотній послідовності В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. У деяких варіантах здійснення поліпептид, що має ксиланазну активність, за винаходом містить заміну(и) в амінокислотних положеннях 13, 113, 122 і 175, де положення визначається(ються) як придатне(і) положення в амінокислотній послідовності В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. 17 UA 103215 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У деяких варіантах здійснення поліпептид, що має ксиланазну активність, за винаходом містить одну або більше амінокислотних замін, вибраних з групи, що складається з 12F, 13Y, 99Y, 104W, 110A, 113D, 114D, 114F, 122F, 154R, 159D, 166F, 175K і 175L, де положення визначається(ються) як придатне(і) положення в амінокислотній послідовності В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. У деяких варіантах здійснення поліпептид, що має ксиланазну активність, за винаходом представляє поліпептид, в якому амінокислотна послідовність вказаного поліпептиду містить щонайменше п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять або десять амінокислотних замін в порівнянні з послідовністю, вибраною з SEQ ID NO:1-22, з якою він має найбільш високу ідентичність. У деяких варіантах здійснення поліпептид, що має ксиланазну активність, за винаходом представляє поліпептид, в якому амінокислотна послідовність вказаного поліпептиду містить щонайменше дев'ять або десять амінокислотних замін. У деяких варіантах здійснення поліпептид, що має ксиланазну активність, за винаходом має солюбілізуючу активність для висівок. У деяких варіантах здійснення поліпептид, що має ксиланазну активність, за винаходом знаходиться у виділеній формі. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін "виділений", він означає, що поліпептид, по суті, не містить щонайменше один інший компонент, з яким послідовність знаходиться в природі. У деяких варіантах здійснення поліпептид, що має ксиланазну активність, за винаходом має підвищену ксиланазну активність в порівнянні з амінокислотною послідовністю В. subtilis, представленою як SEQ ID NO:1, за даними тесту оцінки активності ксиланази. У деяких варіантах здійснення поліпептид, що має ксиланазну активність, за винаходом має підвищену ксиланазну активність в результаті модифікації в положенні, вибраному з положень 12, 13, 15, 34, 54, 77, 81, 82, 99, 104, 110, 113, 114, 118, 122, 141, 154, 159, 162, 164, 166 і 175, де положення визначається(ються) як придатне(і) положення в амінокислотній послідовності В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. У деяких варіантах здійснення поліпептид, що має ксиланазну активність, за винаходом має підвищену солюбілізуючу активність для висівок в порівнянні з амінокислотною послідовністю В. subtilis, представленою як SEQ ID NO:1, за даними тесту оцінки солюбілізуючої активності для висівок. У деяких варіантах здійснення поліпептид, що має ксиланазну активність, за винаходом має підвищену солюбілізуючу активність для висівок в результаті модифікації в положенні, вибраному з положень 12, 13, 15, 34, 54, 77, 81, 82, 99, 104, 110, 113, 114, 118, 122, 141, 154, 159, 162, 164, 166, 175 і 179, де положення визначається(ються) як придатне(і) положення в амінокислотній послідовності В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. У деяких варіантах здійснення поліпептид, що має ксиланазну активність, за винаходом має знижену чутливість до інгібітору ксиланази. У деяких варіантах здійснення поліпептид, що має ксиланазну активність, за винаходом має амінокислотну послідовність, що містить модифікації в положеннях, вибраних з переліку, що складається з: a) 13/110/113/122/154/159/175; b) 13/99/104/110/113/122/154/159/166/175; c) 13/99/104/110/113/114/122/154/159/175; d) 13/110/113/122/175; e) 13/99/104/110/113/122/154/159/175; f) 13/99/104/110/113/122/154/159/175; g) 13/99/104/110/113/114/122/154/159/175; h) 13/99/104/110/113/114/122/154/159/175; i) 13/99/104/110/113/114/122/154/159/175; j) 13/99/104/110/113/114/122/154/159/175; k) 13/77/99/104/110/113/122/154/159/175; l) 13/113/122/175; m) 13/81/99/104/110/113/122/154/159/175; n) 13/110/113/122/164/175; o) 13/110/113/122/162/175; p) 13/110/113/122/175; q) 13/77/99/104/110/113/122/154/159/175; r) 13/113/122/175; s) 12/113/122/175; 18 UA 103215 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 t) 13/113/122/175; u) 13/34/110/113/122/175; v) 13/77/99/104/110/113/122/154/159/175; w) 13/99/104/113/122/175; x) 13/77/99/104/110/113/122/154/159/175; y) 13/99/104/110/113/118/122/154/159/175; z) 13/15/113/122/175; aa) 13/110/113/122/162/175; bb) 13/77/99/104/110/113/122/154/159/175; cc) 13/99/104/110/113/122/141/154/159/175; dd) 13/54/99/104/110/113/122/141/154/159/175; ee) 13/54/99/104/110/113/122/141/154/159/175; ff) 13/54/99/104/110/113/114/122/141/154/159/175; gg) 13/99/104/110/113/114/122/141/154/159/175; і hh) 13/54/99/104/110/113/114/122/141/154/159/175; де положення визначається(ються) як придатне(і) положення в амінокислотній послідовності В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. У деяких варіантах здійснення поліпептид, що має ксиланазну активність, за винаходом має амінокислотну послідовність, що містить амінокислотні заміни, вибрані з переліку, що складається з: a) 13Y/110A/113D/122D/154R/159D/175L; b) 13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/166F/175L; c) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/154R/159D/175L; d) 13Y/110A/113D/122F/175L; e) 13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; f) 13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175K; g) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114D/122F/154R/159D/175K; h) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114Y/122F/154R/159D/175L; i) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114D/122F/154R/159D/175L; j) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114Y/122F/154R/159D/175K; k) 13Y/77L/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; l) 13Y/113D/122D/175L; m) 13Y/81I/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; n) 13Y/110A/113D/122D/164F/175L; o) 13Y/110A/113D/122D/162D/175L; p) 13Y/110А/113D/122D/175L; q) 13Y/77Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; r) 13F/113D/122D/175L; s) 12F/113D/122D/175L; t) 13Y/113D/122F/175L; u) 13Y/34K/110A/113D/122D/175L; v) 13Y/77V/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; w) 13Y/99Y/104W/113D/122D/175L; x) 13Y/77M/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; y) 13Y/99Y/104W/110A/113D/118V/122F/154R/159D/175L; z) 13Y/15Y/113D/122D/175L; aa) 13Y/110A/113D/122D/162E/175L; bb) 13Y/77S/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; cc) 13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/141Q/154R/159D/175L; dd) 13Y/54Q/99Y/104W/110A/113D/122F/141Q/154R/159D/175L; ee) 13Y/54W/99Y/104W/110A/113D/122F/141Q/154R/159D/175L; ff) 13Y/54Q/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/154R/159D/175L; gg) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/141Q/154R/159D/175L; і hh) 13Y/54Q/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/141Q/154R/159D/175L; де положення визначається(ються) як придатне(і) положення в амінокислотній послідовності В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. У деяких варіантах здійснення поліпептид, що має ксиланазну активність, за винаходом має амінокислотну послідовність, що містить амінокислотні заміни, вибрані з переліку, що складається з: a) 13Y/110A/113D/122D/154R/159D/175L; 19 UA 103215 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 b) 13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/166F/175L; c) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/154R/159D/175L; d) 13Y/110A/113D/122F/175L; e) 13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; f) 13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175K; g) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114D/122F/154R/159D/175K; h) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114Y/122F/154R/159D/175L; i) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114D/122F/154R/159D/175L; j) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114Y/122F/154R/159D/175K; k) 13Y/77L/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; l) 13Y/113D/122D/175L; m) 13Y/81I/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; n) 13Y/110A/113D/122D/164F/175L; o) 13Y/110A/113D/122D/162D/175L; p) 13Y/110A/113D/122D/175L; q) 13Y/77Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; r) 13F/113D/122D/175L; s) 12F/113D/122D/175L; t) 13Y/113D/122F/175L; u) 13Y/34K/110A/113D/122D/175L; v) 13Y/77V/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; w) 13Y/99Y/104W/113D/122D/175L; x) 13Y/77M/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; y) 13Y/99Y/104W/110A/113D/118V/122F/154R/159D/175L; z) 13Y/15Y/113D/122D/175L; aa) 13Y/110A/113D/122D/162E/175L; bb) 13Y/77S/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; cc) 13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/141Q/154R/159D/175L; dd) 13Y/54Q/99Y/104W/110A/113D/122F/141Q/154R/159D/175L; ee) 13Y/54W/99Y/104W/110A/113D/122F/141Q/154R/159D/175L; ff) 13Y/54Q/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/154R/159D/175L; gg) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/141Q/154R/159D/175L; і hh) 13Y/54Q/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/141Q/154R/159D/175L; де положення визначається(ються) як придатне(і) положення в амінокислотній послідовності В. subtilis, представленій як SEQ ID NO:1. У деяких варіантах здійснення поліпептид, що має ксиланазну активність, за винаходом, має амінокислотну послідовність SEQ ID NO:1, що містить амінокислотні заміни, вибрані з переліку, що складається з: a) G13Y/T110A/Y113D/R122D/K154R/N159D/Q175L; b) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Y166F/Q175L; c) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/K154R/N159D/Q175L; d) G13Y/T110A/Y113D/R122F/Q175L; e) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L; f) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175K; g) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114D/R122F/K154R/N159D/Q175K; h) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114Y/R122F/K154R/N159D/Q175L; i) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114D/R122F/K154R/N159D/Q175L; j) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114Y/R122F/K154R/N159D/Q175K; k) G13Y/I77L/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L; l) G13Y/Y113D/R122D/Q175L; m) G13Y/V81I/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L; n) G13Y/T110A/Y113D/R122D/W164F/Q175L; o) G13Y/T110A/Y113D/R122D/S162D/Q175L; p) G13Y/T110A/Y113D/R122D/Q175L; q) G13Y/I77Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L; r) D13F/Y113D/R122D/Q175L; s) G12F/Y113D/R122D/Q175L; t) G13Y/Y113D/R122F/Q175L; u) G13Y/G34K/T110A/Y113D/R122D/Q175L; v) G13Y/I77V/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L; 20 UA 103215 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 w) G13Y/K99Y/T104W/Y113D/R122D/Q175L; x) G13Y/I77M/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L; y) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/I118V/R122F/K154R/N159D/Q175L; z) G13Y/I15Y/Y113D/R122D/Q175L; aa) G13Y/T110A/Y113D/R122D/S162E/Q175L; bb) G13Y/I177S/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L; cc) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/N141Q/K154R/N159D/Q175L; dd) G13Y/N54Q/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/N141Q/K154R/N159D/Q175L; ee) G13Y/N54W/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/N141Q/K154R/N159D/Q175L; ff) G13Y/N54Q/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/K154R/N159D/Q175L; gg) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/N141Q/K154R/N159D/Q175L; і hh) G13Y/N54Q/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/N141Q/K154R/N159D/Q175L. У деяких варіантах здійснення поліпептид, що має ксиланазну активність, за винаходом, має амінокислотну послідовність SEQ ID NO:1, що містить амінокислотні заміни, вибрані з переліку, що складається з: a) G13Y/T110A/Y113D/R122D/K154R/N159D/Q175L; b) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Y166F/Q175L; c) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/K154R/N159D/Q175L; d) G13Y/T110A/Y113D/R122F/Q175L; e) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L; f) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175K; g) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114D/R122F/K154R/N159D/Q175K; h) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114Y/R122F/K154R/N159D/Q175L; i) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114D/R122F/K154R/N159D/Q175L; j) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114Y/R122F/K154R/N159D/Q175K; k) G13Y/I77L/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L; l) G13Y/Y113D/R122D/Q175L; m) G13Y/V81I/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L; n) G13Y/T110A/Y113D/R122D/W164F/Q175L; o) G13Y/T110A/Y113D/R122D/S162D/Q175L; p) G13Y/T110A/Y113D/R122D/Q175L; q) G13Y/I77Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L; r) G13F/Y113D/R122D/Q175L; s) G12F/Y113D/R122D/Q175L; t) G13Y/Y113D/R122F/Q175L; u) G13Y/G34K/T110A/Y113D/R122D/Q175L; v) G13Y/I77V/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L; w) G13Y/K99Y/T104W/Y113D/R122D/Q175L; x) G13Y/I77S/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L; y) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/I118V/R122F/K154R/N159D/Q175L; z) G13Y/I15Y/Y113D/R122D/Q175L; aa) G13Y/T110A/Y113D/R122D/D162E/Q175L; bb) G13Y/I77S/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L; cc) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/N141Q/K154R/N159D/Q175L; dd) G13Y/N54Q/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/N141Q/K154R/N159D/Q175L; ee) G13Y/N54W/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/N141Q/K154R/N159D/Q175L; ff) G13Y/N54Q/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/K154R/N159D/Q175L; gg) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/N141Q/N159D/Q175L; і hh) G13Y/N54Q/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N144F/R122F/N141Q/K154R/N159D/Q175L. У деяких варіантах здійснення даного винаходу поліпептид, що має ксиланазну активність, застосовують для крупномасштабних застосувань. Переважно, поліпептид, що має ксиланазну активність, одержують в кількості від 1 г на літр приблизно до 100 г на літр загального об'єму клітинної культури після культивування організмухазяїна. Даний винахід також стосується композиції, що містить поліпептид, що має ксиланазну активність, і/або нуклеотидні послідовності, що кодують поліпептид, що має ксиланазну активність, як описано в даному документі. Композиція за даним винаходом може забезпечувати поліпшений запах, смак, м'якість, консистенцію, текстуру, зовнішній вигляд, післясмак у роті, густину, в'язкість, гелеву фракцію, структуру і/або органолептичні властивості і поживність продуктів споживання, що містять 21 UA 103215 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вказану композицію. Крім того, композицію за даним винаходом можна використовувати в комбінації з іншими компонентами продуктів споживання для забезпечення вказаних удосконалень. Незважаючи на те, що переважно, щоб композицію за даним винаходом використовували для поліпшення запаху, смаку, м'якості, консистенції, текстури, зовнішнього вигляду, післясмаку у роті, густини, в'язкості, гелевої фракції, структури і/або органолептичних властивостей і поживності продуктів споживання, що містять вказану композицію, в об'єм даного винаходу також входить застосування композиції за даним винаходом як компонента фармацевтичних комбінацій з іншими компонентами для забезпечення лікувального або фізіологічного позитивного ефекту для споживача. Отже, композицію за даним винаходом можна використовувати в комбінації з іншими компонентами. Приклади інших компонентів включають один або більше із загусників, желюючих агентів, емульгаторів, зв'язвальних речовин, модифікаторів кристалізації, підсолоджувачів (включаючи штучні підсолоджувачі), модифікаторів реології, стабілізаторів, антиоксидантів, барвників, ферментів, носіїв, розчинників, наповнювачів, розріджувачів, ковзних речовин, смакових речовин, забарвлюючої речовини, суспендуючих агентів, розпушувачів, зв'язувальних добавок для грануляції і т. п. Ці інші компоненти можуть представляти компоненти природного походження. Ці інші компоненти можна одержати за допомогою застосування хімічних і/або ферментативних методів. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін "загусник або желюючий агент", він стосується продукту, який попереджує розділення композиції сповільненням або попередженням руху частинок, наприклад, крапель незмішуваних рідин, повітряних пухирців або нерозчинних твердих частинок. Загуснення має місце, коли окремі гідратовані молекули спричиняють підвищення в'язкості, сповільнюючи тим самим розділення композиції. Желювання має місце, коли гідратовані молекули зв'язуються з утворенням тривимірної мережі, яка захоплює частинки, тим самим імобілізуючи їх. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін "стабілізатор", він визначається як інгредієнт або комбінація інгредієнтів, що оберігають продукт (наприклад, продукт харчування) від зміни з плином часу. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін "емульгатор", він стосується інгредієнта (наприклад, інгредієнта продукту харчування), який попереджає розділення емульсій. Емульсії являють собою систему з двох незмішуваних речовин, одна в формі крапель, що знаходяться в іншій речовині. Емульсії можуть представляти емульсію масло-в-воді, в якій краплі або диспергована фаза є маслом, і безперервна фаза є водою; або емульсію вода-в-маслі, в якій вода стає диспергованою фазою, і безперервною фазою є масло. Піни, які представляють систему газ-в-рідині і суспензії, які, в свою чергу, є системою тверда речовина-в-рідині, також можна стабілізувати з використанням емульгаторів. Аерація може мати місце в трифазній системі, в якій повітря захоплюється рідким маслом, потім стабілізується агломеруванням жирними кристалами, стабілізованими емульгатором. Емульгатори містять полярну групу з афінністю до води (гідрофільну) і неполярну групу, що має спорідненість до масла (ліпофільну). Вони вбираються на поверхні розділення двох речовин, утворюючи міжфазову плівку, що стабілізує емульсію. Структура молекули визначає гідрофільні/ліпофільні властивості емульгаторів. Дані властивості виражаються в значенні гідрофільного/ліпофільного балансу (ГЛБ). Низькі значення ГЛБ вказують на більш виражені ліпофільні властивості, які використовують для стабілізації емульсій вода-в-маслі. Більш високі значення ГЛБ характерні для гідрофільних емульгаторів, що звичайно використовуються в емульсіях масло-в-воді. Дані значення одержані для простих систем. Оскільки харчові продукти часто містять інші інгредієнти, що впливають на емульгування, то значення ГЛБ не завжди є надійним показником для вибору емульгатора. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін "зв'язувальна речовина", він стосується інгредієнта (наприклад, інгредієнта продукту харчування), який "зв'язує" продукт в єдине ціле за допомогою фізичної або хімічної взаємодії. Наприклад, під час "підйому" вода вбирається, забезпечуючи зв'язувальний ефект. Однак зв'язувальні речовини можуть абсорбувати інші рідини, такі як масла, утримуючи їх всередині продукту. У контексті даного винаходу зв'язувальні речовини звичайно використовують в твердих продуктах або продуктах з низьким вмістом вологи, наприклад, в продуктах хлібопекарського виробництва: борошняних кондитерських виробах, пончиках, хлібі і інших. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін "модифікатор кристалізації", він стосується інгредієнта (наприклад, інгредієнта продукту харчування), який 22 UA 103215 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 впливає на кристалізацію жиру або води. Стабілізація крижаних кристалів важлива з двох причин. Перша причина безпосередньо пов'язана зі стабільністю продукту з точки зору розділення. Чим більшій кількості циклів заморожування/танення піддається продукт, тим крупнішими стають крижані кристали. Дані великі кристали можуть порушити структуру продукту природним шляхом, як це має місце у випадку руйнування клітинних стінок, або внаслідок "підйому". Оскільки вода більше не утримується на місці, то після відтавання може мати місце синерезис продукту, або просочування води. Друге, в тому випадку, коли продукт споживається в замороженому вигляді, то дані великі кристали приводять до небажаного "зернистого" післясмаку у роті. "Носії" або "розчинники" означають речовини, придатні для введення сполук, і вони включають будь-які такі речовини, відомі в даній галузі, наприклад, будь-яку рідину, гель, розчинник, рідкий розріджувач, солюбілізатор або тому подібне, які є нетоксичними і які не взаємодіють з компонентами композиції, призводячи до негативних наслідків. Приклади прийнятних з харчової точки зору носіїв включають, наприклад, воду, сольові розчини, спирт, силікон, віск, вазелін, рослинні масла, поліетиленгліколі, пропіленгліколь, ліпосоми, цукри, желатин, лактозу, амілозу, стеарат магнію, тальк, поверхнево-активні речовини, кремнієву кислоту, в'язкий парафін, ароматизоване масло, моногліцериди і дигліцериди жирних кислот, ефір жирних кислот з нафтохімічної сировини, гідроксиметилцелюлозу, полівінілпіролідон і тому подібне. Приклади наповнювачів включають одне або більше з мікрокристалічної целюлози і іншої целюлози, лактози, цитрату натрію, карбонату кальцію, двоосновного фосфату кальцію, гліцину, крохмалю, молочного цукру і високомолекулярних поліетиленгліколей. Приклади розпушувачів включають одне або більше з крохмалю (переважно кукурудзяного, картопляного або тапіокового крохмалю), натрію-крахмалгліколяту, кроскармелози натрію і деяких складних силікатів. Приклади зв'язувальних добавок для грануляції включають одне або більше з полівінілпіролідону, гідроксипропілметилцелюлози (HPMC), гідроксипропілцелюлози (HPC), сахарози, мальтози, желатину і аравійської камеді. Приклади ковзних речовин включають одне або більше з стеарату магнію, стеаринової кислоти, гліцерилбегенату і тальку. Приклади розріджувачів включають одне або більше з води, етанолу, пропіленгліколю і гліцерину, і їх комбінацій. Інші компоненти можна використовувати одночасно (наприклад, коли вони знаходяться в суміші один з одним або навіть коли вони вводяться різними шляхами) або послідовно (наприклад, їх можна вводити різними шляхами). У тому значенні, в якому в даному документі використовується вираз "компонент, придатний для споживання твариною або людиною", він означає сполуку, яку додають або можна додавати в композицію за даним винаходом, як добавку, яка має харчову цінність, замінює волокна або надає загальну оздоровчу дію на організм споживача. Інгредієнти можна використовувати в широкому ряді продуктів, для яких потрібно желювання, текстурування, стабілізація, суспендування, утворення плівки і структуроутворення, збереження соковитості без непотрібного збільшення в'язкості. Переважно інгредієнти здатні збільшити термін зберігання і стабільність живої культури. Як приклад компоненти можуть представляти пребіотики, такі як альгінат, ксантан, пектин, камедь ріжкового дерева (LBG), інулін, гуарову камедь, галактоолігосахарид (GOS), фруктоолігосахарид (FOS), лактосахарозу, соєві олігосахариди, палатинозу, ізомальтоолігосахариди, глюкоолігосахариди і ксилоолігосахариди. Композицію за даним винаходом можна використовувати як продукт харчування або в процесі одержання продукту харчування. У даному документі термін "продукт харчування" використовується в широкому значенні і включає продукт харчування для людей, а також продукт харчування для тварин (тобто корм). У переважному аспекті продукт харчування призначається для споживання людиною. Продукт харчування може знаходитися в формі розчину або у вигляді твердої речовини в залежності від застосування, і/або способу застосування, і/або способу введення. При використанні як продукт харчування або в процесі одержання продукту харчування, такого як функціональний продукт харчування, композицію за даним винаходом можна використовувати в комбінації з одним або більше з прийнятного з харчової точки зору носія, прийнятного з харчової точки зору розріджувача, прийнятного з харчової точки зору наповнювача, прийнятного з харчової точки зору ад'юванта, прийнятного з харчової точки зору активного інгредієнта. 23 UA 103215 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Композицію за даним винаходом можна використовувати як інгредієнт продукту харчування. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін "інгредієнт продукту харчування", він включає композицію, яку додають або можна додати в функціональні продукти харчування або продукти харчування як харчову добавку і/або добавки волокна. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін "інгредієнт продукту харчування", він також стосується композицій, які можна використовувати в низьких концентраціях в широкому ряді продуктів, для яких потрібне желювання, текстурування, стабілізація, суспендування, утворення плівки і структуроутворення, збереження соковитості без непотрібного збільшення в'язкості. Інгредієнт продукту харчування може знаходитися у вигляді розчину або твердої речовини залежно від застосування, і/або способу застосування, і/або способу введення. Композиція за даним винаходом може сама представляти харчову добавку, або її можна додати до харчових добавок. Композиція за даним винаходом може сама представляти функціональний продукт харчування, або її можна додати до функціональних продуктів харчування. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін "функціональний продукт харчування", він означає продукт харчування, який здатний забезпечувати не тільки харчовий ефект і/або смакову насолоду, але також здатний забезпечувати додатковий оздоровчий ефект для споживача. Отже, функціональні продукти харчування звичайно представляють продукти харчування, що містять компоненти або інгредієнти (такі як описані в даному документі), включені в них, які додають продукту харчування певний функціональний, наприклад лікувальний або фізіологічний оздоровчий, ефект, інший, ніж чисто харчовий ефект. Незважаючи на відсутність офіційного визначення функціонального продукту, велика частина зацікавлених в даному питанні сторін прийшли до угоди, що він представляє промислово доступні продукти харчування, що мають певні позитивні ефекти для здоров'я. Деякі функціональні продукти харчування є нутріцевтиками. У даному документі термін "нутріцевтики" означає продукт харчування, який здатний забезпечувати не тільки харчовий ефект і/або смакову насолоду, але також здатний забезпечувати терапевтичний (або інший позитивний) ефект для споживача. Нутріцевтики закреслюють традиційне розділення на продукти харчування і лікарські препарати. На основі результатів анкетування було передбачено, що споживачі виявляють найбільшу зацікавленість в функціональних продуктах, пов'язаних з лікуванням і профілактикою захворювань серця. Профілактика раку представляє інший аспект харчування, який викликає великий інтерес у споживачів, але цікаво зазначити, що це є областю, в якій споживачі відчувають, що вони можуть контролювати ситуацію. Дійсно, згідно з даними Всесвітньої Організації Охорони здоров'я щонайменше у 35 % випадків розвиток раку пов'язаний з харчуванням. Крім того, ключовими домаганнями є остеопороз, стан шлунково-кишкового тракту і ожиріння, які стимулюють купівлю функціональних продуктів і розвиток їх ринку. Композицію за даним винаходом можна використовувати у виробництві продуктів харчування, таких як джеми, мармелад, желе, молочні продукти (такі як молоко або сир), м'ясні продукти, продукти з птахів, рибні продукти і продукти хлібопекарського виробництва. У вигляді прикладу композицію за даним винаходом можна використовувати як інгредієнт в безалкогольних напоях, фруктових соках або напоях з білком молочної сироватки, лікувальному чаї, напоях з какао, молочних напоях і напоях з молочнокислими бактеріями, йогурті і питному йогурті, сирі, морозиві, шербеті і десертах, кондитерських виробах, бісквітах і сухих сумішах для приготування пирогів, легких закусках, зернових сніданках, локшини швидкого приготування і локшини в склянках, супах швидкого приготування і супах в склянках, продуктах і напоях для збалансованого харчування, підсолоджувачах, барних закусках з поліпшеною текстурою, барних закусках з волокнами, стійких фруктових начинках для борошняних виробів, глазурі, шоколадних начинках для борошняних виробів, начинках для пирогів зі смаком і запахом сиру, начинках для пирогів зі смаком і запахом фруктів, заморожених пирогах і пончиках, стійких до нагрівання начинках для борошняних виробів, кремових начинках для борошняних виробів швидкого приготування, начинках для печива, начинках для борошняних виробів, готових до вживання, низькокалорийних начинках, поживних напоях для дорослих, соєвих кисломолочних напоях/соках, асептичному/автоклавованому шоколадному напої, барних сумішах, порошках для приготування напоїв, соєвому/звичайному молоці і шоколадному молоці з підвищеним вмістом кальцію, кавових напоях з підвищеним вмістом кальцію. Композицію за даним винаходом також можна використовувати як інгредієнт в продуктах харчування таких, як американський сирний соус, засіб проти запікання для тертого і 24 UA 103215 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 подрібненого сиру, соус для чіпсів, кремовий сир, сухий змішаний збитий сметанний крем для прикраси з низьким вмістом жиру, збитий молочний крем для заморожування/танення, стійка до заморожування/танення збита прикраса, натуральний легкий сир чеддер з низьким вмістом жиру, йогурт для "шведського стола", аеровані заморожені десерти і нові барні закуски, морозиво в твердій упаковці, морозиво в економічній твердій упаковці з приємною етикеткою, морозиво з низьким вмістом жиру, ніжний соус, соус для барбекю, сирний соус, заправка з домашнім сиром, суха суміш для приготування соусу альфредо, змішаний сирний соус, суха суміш для приготування томатного соусу і інші. Для деяких аспектів переважним продуктом харчування є напій. У деяких аспектах переважно продукт харчування представляє продукт хлібопекарського виробництва, такий як хліб, датські булочки, бісквіт або печиво. Даний винахід також стосується способу одержання продукту харчування або інгредієнта продукту харчування, де спосіб включає змішення ксиланази, одержаної способом за даним винаходом, або композиції за даним винаходом з іншим інгредієнтом продукту. Спосіб одержання або інгредієнт продукту харчування також представляє інший аспект даного винаходу. У загальному значенні поліпептид, що має ксиланазну активність, за винаходом можна використовувати для солюбілізації і/або руйнування нерозчинної речовини стінки рослинної клітини, що містить арабіноксилан, для зміни, наприклад, зниження в'язкості за рахунок присутності геміцелюлози або арабіноксилану в розчині або системі, що містить речовину стінки рослинної клітини. Як правило, вказана речовина стінки рослинної клітини буде містити один або більше інгібіторів ксиланази. Зокрема, поліпептид, що має ксиланазну активність, за винаходом можна використовувати при обробці рослинних матеріалів, призначених для застосування як харчові продукти, такі як корма для тварин, у виробництві крохмалю, в хлібопекарській промисловості, у виробництві біоетанолу з целюлози і при обробці деревної пульпи у виробництві паперу. Поліпептид, що має ксиланазну активність, за винаходом можна використовувати для обробки рослинних матеріалів, таких як зернові культури, які застосовують в харчових продуктах, включаючи корм для тварин. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін "зернові культури", він означає будь-який вид зерна, що використовується для виробництва продуктів харчування і/або будь-яку злакову траву, яка продукує таке зерно, включаючи, не обмежуючись цим, пшеницю, мелену пшеницю, ячмінь, кукурудзу, сорго, жито, овес, тритикале і рис, або їх комбінації. У одному переважному варіанті здійснення зернова культура представляє пшеницю. Ксилан в продукті харчування і/або харчовій добавці модифікується при контактуванні ксилану з поліпептидом, що має ксиланазну активність, за даним винаходом. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін "контактування", він включає, не обмежуючись цим, обприскування, покриття, імпрегнацію або нанесення шару поліпептиду, що має ксиланазну активність, за даним винаходом на продукт харчування і/або харчову добавку. У одному варіанті здійснення продукт харчування і/або харчову добавку за даним винаходом можна одержати змішенням поліпептиду, що має ксиланазну активність, безпосередньо з продуктом харчування і/або харчовою добавкою. Як приклад, поліпептид, що має ксиланазну активність, можна піддати контактуванню (наприклад, при обприскуванні) з продуктом харчування і/або харчовою добавкою на основі зернових, таких як мелена пшениця, кукурудзяне або соєве борошно. Також можливо включити поліпептид, що має ксиланазну активність, у другий (і інший) продукт харчування і/або харчову добавку або питну воду, які потім додають в продукт харчування і/або харчову добавку за даним винаходом. Отже, не важливо, що поліпептид, що має ксиланазну активність, за даним винаходом включається в сам продукт харчування і/або харчову добавку на основі зернових, хоча таке включення представляє особливо переважний аспект даного винаходу. У одному варіанті здійснення даного винаходу продукт харчування і/або кормову добавку можна об'єднати з іншими компонентами продукту харчування і/або кормової добавки з одержанням продукту харчування і/або корму на основі зернових. Такі інші компоненти продукту харчування і/або кормової добавки можуть включати одну або більше інших (переважно термостабільних) ферментних добавки, вітамінних харчових і/або кормових добавки, мінеральних харчових і/або кормових добавки і амінокислотних харчових і/або кормових добавки. Одержану (комбіновану) харчову і/або кормову добавку, що містить декілька інших типів сполук, потім можна змішати у відповідних пропорціях з іншими компонентами харчової 25 UA 103215 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 і/або кормової добавки, такими як зернові і білкові добавки з одержанням продукту харчування для людини і/або корму для тварин. У одному переважному варіанті здійснення харчову і/або кормову добавку за даним винаходом можна приготувати змішуванням різних ферментів з придатною активністю з одержанням суміші ферментів. Як приклад, харчову і/або кормову добавку на основі зернових, одержаних, наприклад, з меленої пшениці або кукурудзи, можна піддати контактуванню (наприклад, при розпиленні) одночасно або послідовно з ферментом ксиланазою або іншими ферментами з відповідною активністю. Дані ферменти можуть включати, не обмежуючись цим, одне або більше з амілази, глюкоамілази, мананази, галактозидази, фітази, ліпази, фосфоліпази, галактоліпази, глюканази, арабінофуранозидази, феруліолестерази, пектинази, протеази, глюкозоксидази, гексозоксидази і ксиланази. Ферменти, що мають бажану активність, наприклад, можна змішувати з ксиланазою за даним винаходом до контактування даних ферментів з харчовою і/або кормовою добавкою на основі зернових або, альтернативно, такі ферменти можна піддати контактуванню одночасно або послідовно на такій зерновій добавці. Потім харчову і/або кормову добавку по черзі змішують з харчовою і/або кормовою добавкою на основі зернових з одержанням кінцевої харчової і/або кормової добавки. Також можливо формувати харчову і/або кормову добавку у вигляді розчину окремих ферментів з відповідною активністю і потім змішувати даний розчин з речовиною харчової і/або кормової добавки до перетворення харчової і/або кормової добавки в гранули або комбікорм. Даний винахід стосується застосування поліпептиду, що має ксиланазну активність, за винаходом в способі одержання продукту харчування. Типові хлібобулочні (печені) продукти за даним винаходом включають хліб, такий як батони, рулети, здобні булочки, основи для піцци і т. д., претцели, тортильї, пироги, печиво, бісквіти, крекери і т. д. Приготування харчових продуктів, таких як хлібобулочні вироби, добре відоме в даній галузі. Приготування тіста, наприклад, описане в прикладі 4. Застосування поліпептиду, що має ксиланазну активність, за винаходом для зміни хлібопекарських якостей, описане в прикладі 4. Поліпептид, що має ксиланазну активність, за винаходом також можна використовувати у виробництві крохмалю з рослинного матеріалу, одержаного із зерен і бульб, таких як бульби картоплі. Поліпептид, що має ксиланазну активність, за винаходом також можна використовувати в обробці деревної пульпи, наприклад, у виробництві паперу. Обробка целюлозного матеріалу для виробництва біоетанолу Поліпептид, що має ксиланазну активність, за винаходом також можна використовувати для гідролізу рослинного целюлозного матеріалу у виробництві цукру, ферментувати в біоетанол. У деяких конкретних варіантах здійснення поліпептид, що має ксиланазну активність, за винаходом виявляє ксиланазну активність при температурі приготування тіста, в межах від приблизно 20С до приблизно 40С. У деяких варіантах здійснення поліпептид, що має ксиланазну активність, за винаходом інактивується під час випікання продукту. У деяких альтернативних варіантах здійснення поліпептид, що має ксиланазну активність, за винаходом має підвищену термостабільність і/або температурний оптимум в порівнянні з придатним ферментом дикого типу із збереженням активності після теплової обробки. Обидві характеристики відомі фахівцям в даній галузі. ПРИКЛАДИ Приклад 1 Сайт-спрямований мутагенез ксиланаз і експресія Специфічні мутанти ксиланази Bacillus subtilis одержували з використанням конструкції, що містить сайт скріплення рибосоми з pET24a (ctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacat), злитий з геном ксиланази дикого типу без сигнальної послідовності (atggctagcacagactactggcaa------tggtaa), яку трансфектували у вектор pCRBlunt (InVitrogen, Carlbad, CA, США). Це приводило до конститутивної експресії ксиланази в клітинах TOP10 (InVitrogen) після трансформації сконструйованим вектором при умові, що орієнтація гена знаходилася в напрямі за "годинниковою" стрілкою. Потім одержували сайт-спрямовану мутацію в гені з використанням набору для мутагенезу "QuickChange" (Stratagene, Lа Jolla, CA, США), слідуючи протоколу виробника. Мутанти підтверджували секвенуванням. Одержували достатню продукцію підтверджених мутантів культивуванням трансформованих клітин в об'ємі 1 л. Приклад 2 Дослідження солюбілізації висівок з участю мутантів ксиланази Заявники використовували пшеничні висівки як субстрат для оцінки питомої активності варіантів ксиланази, оскільки їх використовують в промислових застосуваннях. Субстрат висівок 26 UA 103215 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 Як приклад, висівки можуть представляти пшеничні висівки, одержані сухим помелом пшениці з використанням лабораторного млина Chopin CD Auto Mill (Chopin Technologies, Франція) в режимі і умовах, рекомендованих виробником, для помелу пшениці в пшеничне борошно і висівки. Одержану фракцію висівок можна використовувати як субстрат в тесті оцінки солюбілізації висівок. У даному прикладі пшеницю використовували як джерело зернових. Тест оцінки солюбілізації висівок Готують суспензію пшеничних висівок в буфері лимонна кислота (0,1 М)-динатрій гідрофосфат (0,2 М), рН 5,0 з концентрацією висівок 1,33 % (мас./мас.). Аліквотні порції даної суспензії об'ємом 750 мкл переносять в пробірки Епендорфа при перемішуванні. Кожну пробірку з субстратом попередньо нагрівають протягом 5 хв при 40С. До вмісту пробірки додають 250 мкл розчину ферменту до кінцевої концентрації субстрату 1 %. Готують три розведення (в двох паралелях) для кожної ксиланази із зростаючими концентраціями ферменту (0,33; 1,0 і 3,0 мкг ксиланази/г висівок) на кожний час визначення (0, 30, 60 і 240 хв). Як контроль використовують розчин денатурованої нагріванням ксиланази. Реакцію зупиняють на вказані часові точки за допомогою перенесення пробірок в термостат при 95С. Денатуровані нагріванням проби зберігають при 4С, поки не закінчаться всі ферментативні реакції. Коли закінчуються всі ферментативні реакції, пробірки Епендорфа центрифугують з одержанням прозорого супернатанта. Солюбілізуюча активність ферментів для висівок виражається в підвищенні OD410, яке детектують по збільшенню кількості редукуючих кінцевих груп з використанням реагентів PAHBAH (Lever, 1972). Коротко, редукуючі кінцеві групи взаємодіють з PAHBAH з утворенням забарвленого продукту реакції, який можна визначити по OD410. Описаний вище тест оцінки солюбілізації є чутливим до побічної активності ферментів, що виявляють активність на залишковому крохмалі в субстраті висівок. Протокол очищення ксиланази Bacillus subtilis Клітини E. coli TOP10 з експресованою ксиланазою, збирали центирифугуванням (20 хв, 3500g, 20С) і ресуспендували в 50 мМ Трис-буфері з 2 мМ ЕДТА, рН 7,4. Клітини робили проникними доданням 1 мг/мл лізоциму (ICN Biomedicals, Costa Mesa, CA, US, номер по каталогу 100831), перемішуючи суспензію протягом 2 год. при кімнатній температурі, заморожуючи і відтаюючи з подальшою обробкою ультразвуком. Значення рН доводили до 4,0 з використанням 1 М розчину HCl після центрифугування (20 хв, 3500g, 20С). Супернатант, що містить ксиланазу, знесолювати з використанням одноразових колонок для знесолювання PD10 (Amersham Bioscience, Швеція), урівноважених і елюйованих 50 мМ ацетатом натрію, рН 4,5. Знесолений зразок наносили на колонку SOURCE 15S місткістю 10 мл (Amersham Bioscience, Швеція), попередньо урівноважену 50 мМ ацетатом натрію, рН 4,5. Потім колонку промивали буфером для урівноваження і елюювали в лінійному градієнті NaCl (50 мМ ацетату натрію, 00,35М NaCl, рН 4,5). Фракції з ксиланазною активністю об'єднували і використовували для подальшого аналізу. Аналогічні протоколи можна адаптувати для варіантів, одержаних з ксиланази, відмінної від XynA Bacillus subtilis, зі значеннями pI істотно відмінними від XynA Bacillus subtilis. Таблиця 1 Солюбілізуюча активність ксиланаз для висівок, виражена у вигляді максимальної оптичної густини, нахилу показника мутантів ксиланази, відносної оптичної густини і відносного нахилу в порівнянні з ксиланазою BS1 (ферментом Bacillus subtilis з SEQ ID NO:1) і ксиланазою BS3 (варіантом ферменту Bacillus subtilis з SEQ ID NO:23) Модифікації в послідовності SEQ ID NO:1 Без модифікацій (BS1) D11F/R122D(BS3) G13Y/T110А/Y113D/R122D/K154R/N 159D/Q175L МаксиВідносмальне Нахил ний оптичне OD/год нахил поглинання до BS1 OD 0,68 0,16 0,40 0,68 0,49 1,19 27 100 72 173 Відносне Відносне максимаксиВідносмальне мальне ний поглипоглинахил нання нання до BS3 OD до OD до BS1 BS3 100 140 140 72 100 100 173 242 242 UA 103215 C2 G13Y/K99Y/T104W /T110A/Y113D/R12 2F/K154R/N159D/Y 166F/Q175L G13Y/K99Y/T104W /T110A/Y113D/N11 4F/R122F/K154R/N 159D/Q175L G13Y/T110A/Y113 D/R122F/Q175L G13Y/K99Y/T104W /T110A/Y113D/R12 2F/K154R/N159D/Q175L G13Y/K99Y/T104W /T110A/Y113D/R12 2F/K154R/N159D/Q175K G13Y/K99Y/T104W /T110A/Y113D/N11 4D/R122F/K154R/ N159D/L175K G13Y/K99Y/T104W /T110A/Y113D/N11 4Y/R122F/K154R/N 159D/Q175L G13Y/K99Y/T104W /T110A/Y113D/N11 4D/R122F/K154R/ N159D/Q175L G13Y/K99Y/T104W /T110A/Y113D/N11 4Y/R122F/K154R/N 159D/L175K G13Y/I77L/K99Y/T 104W/T110A/Y113 D/R122F/K154R/N 159D/Q175L G13Y/Y113D/R122 D/Q175L G13Y/V81I/K99Y/T 104W/T110A/Y113 D/R122F/K154R/N 159D/Q175L G13Y/T110A/Y113 D/R122D/W164F/Q175L G13Y/T110A/Y113 D/R122D/S162D/Q175L G13Y/T110A/Y113 D/R122D/Q175L G13Y/I77Y/K99Y/T 104W/T110A/Y113 D/R122F/K154R/N 159D/Q175L G13F/Y113D/R122 D/Q175L G12F/Y113D/R122 D/Q175L G13Y/Y113D/R122 F/Q175L G13Y/G34K/T110A /Y113D/R122D/Q175L G13Y/I77V/K99Y/T 104W/T110A/Y113 D/R122F/K154R/N 159D/Q175L G13Y/K99Y/T104W /Y113D/R122D/Q175L G13Y/I77M/K99Y/T 104W/T110A/Y113 D/R122F/K154R/N 159D/Q175L G13Y/K99Y/T104W /T110A/Y113D/I11 8V/R122F/K154R/N 159D/Q175L G13Y/I15Y/Y113D/ R122D/Q175L G13Y/T110A/Y113 D/R122D/S162E/Q175L 0,39 1,18 172 172 241 241 0,38 1,15 169 169 235 235 0,37 0,37 1,12 1,11 164 162 164 162 229 226 229 226 0,37 1,11 162 162 226 226 0,35 1,05 153 153 214 214 0,35 1,04 152 152 212 212 0,34 1,02 149 149 208 208 0,33 0,98 144 144 201 201 0,31 0,93 136 136 190 190 0,30 0,29 0,91 0,87 133 128 133 128 186 178 186 178 0,28 0,83 121 121 169 169 0,28 0,83 121 121 169 169 0,27 0,27 0,82 0,80 119 117 119 117 167 163 167 163 0,26 0,26 0,25 0,25 0,78 0,78 0,74 0,74 114 114 109 108 114 114 109 108 160 160 152 150 160 160 152 150 0,23 0,69 101 101 141 141 0,22 0,67 98 98 138 138 0,22 0,67 98 98 137 137 0,21 0,63 92 92 128 128 0,20 0Д8 0,60 0,53 87 78 87 78 122 109 122 109 28