Спосіб прогнозування відповіді на лікування

1. Спосіб прогнозування відповіді пацієнта на лікування інгібітором димеризації HER, що полягає в тому, що а) оцінюють у біологічному зразку, узятому з організму пацієнта, де біологічним зразком є сироватка крові, рівень експресії - маркерного білка, закодованого маркерним геном трансформуючого фактора росту альфа або - комбінації маркерних білків, закодованих маркерними генами, де комбінація маркерних білків, закодованих маркерними генами складається з маркерних білків, закодованих - маркерним геном трансформуючого фактора росту альфа та HER2, - маркерним геном трансформуючого фактора росту альфа та епідермального фактора росту, - маркерним геном амфірегуліну та трансформуючого фактора росту альфа, - маркерним геном трансформуючого фактора росту альфа, епідермального фактора росту та HER2, - маркерним геном амфірегуліну, епідермального фактора росту та трансформуючого фактора росту альфа, - маркерним геном амфірегуліну, трансформуючого фактора росту та HER2, - маркерним геном епідермального фактора росту, трансформуючого фактора росту та HER2, маркерним геном амфірегуліну, епідермального фактора росту, трансформуючого фактора росту та HER2, та б) прогнозують відповідь пацієнта на лікування інгібітором димеризації HER на основі оцінки результатів, отриманих на стадії а). 2. Спосіб за п. 1, у якому стадія а) оцінки маркерного білка, закодованого маркерним геном, або комбінації маркерних білків, закодованих маркерними генами, полягає в тому, що а1) оцінюють рівень експресії маркерного протеїну, закодованого маркерним геном, або комбінації маркерних білків, закодованих маркерними генами, а2) визначають, чи перебуває рівень експресії, оцінений на стадії а1), вище або нижче граничного значення. 3. Спосіб за п. 2, у якому визначення граничного значення, що виконують до здійснення стадії а1) способу за п. 2, полягає в тому, що 93989 4 1) оцінюють рівень експресії маркерного білка, закодованого маркерним геном, або комбінації маркерних білків, закодованих маркерними генами, у декількох біологічних зразках, де біологічними зразками є сироватка крові, узятих з організму пацієнтів до лікування інгібітором димеризації HER, 2) установлюють кореляцію відповіді в пацієнтів, що піддавалися лікуванню інгібітором димеризації HER, з рівнем експресії маркерного білка, закодованого маркерним геном, або комбінації маркерних білків, закодованих маркерними генами, зазначеними на стадії а), на основі чого визначають граничне значення. 4. Спосіб за одним з пп. 1-3, у якому інгібітор димеризації HER інгібує гетеродимеризацію HER2 з EGFR або HER3. 5. Спосіб за п. 4, у якому інгібітор димеризації HER являє собою антитіло, краще антитіло 2С4. 6. Спосіб за одним з пп. 1-5, у якому пацієнт являє собою пацієнта, що страждає на рак, переважно пацієнта, що страждає на рак молочної залози, на рак яєчника, на рак легені або на рак передміхурової залози. 7. Спосіб за одним з пп. 2-6, у якому рівень експресії маркерного білка, закодованого маркерним геном, або комбінації маркерних білків, закодованих маркерними генами, у зразку оцінюють шляхом визначення рівня експресії фрагмента маркерного білка або фрагментів комбінації маркерних білків, закодованих маркерними генами. 8. Спосіб за одним з пп. 2-7, у якому рівень експресії маркерного білка або його фрагмента або комбінації маркерних білків або їхніх фрагментів визначають за допомогою реагенту, що специфічно зв'язується з маркерним білком або його фрагментом або комбінацією маркерних білків або їхніх фрагментів. 9. Спосіб за п. 8, у якому реагент вибирають із групи, що включає антитіло, фрагмент антитіла або похідне антитіла. 10. Спосіб за одним з пп. 2-9, у якому рівень експресії визначають за допомогою методу, обраного із групи, що включає аналіз білка, проточну цитометрію, імуноцитохімію, імуногістохімію, твердофазний імуноферментний аналіз, багатоканальний твердофазний імуноферментний аналіз і варіанти цих методів. 11. Спосіб за одним з пп. 5-10, у якому фрагмент маркерного білка являє собою позаклітинний домен маркерного білка Her 2. 12. Спосіб за п. 11, у якому позаклітинний домен маркерного білка Неr2 має молекулярну масу приблизно 105000 Да. 13. Спосіб за одним з пп. 1-12, у якому амінокислотною послідовністю маркерного білка, що являє собою амфірегулін, є амінокислотна послідовність, представлена в SEQ ID NO:1, у якому амінокислотною послідовністю маркерного білка, що являє собою епідермальний фактор росту, є амінокислотна послідовність, представлена в SEQ ID NO:2, у якому амінокислотною послідовністю маркерного білка, що являє собою трансформуючий фактор 5 93989 6 росту альфа, є амінокислотна послідовність, представлена в SEQ ID NO:3, або у якому амінокислотною послідовністю маркерного білка, що являє собою HER2, є амінокислотна послідовність, представлена в SEQ ID NO:4. 14. Спосіб за одним з пп. 2-13, у якому граничне значення рівня в сироватці - маркерного білка, що являє собою трансформуючий фактор росту альфа, становить від 2,0 до 5,0пг/мол, переважно приблизно 3,5 пг/мол, - маркерного білка, що являє собою епідермальний фактор росту, становить від 100 до 250 пг/мол, переважно приблизно 150 пг/мол, або - маркерного білка, що являє собою амфірегулін, становить від 6 до 15 пг/мол, переважно приблизно 12 пг/мол. 15. Спосіб за одним з пп. 2-13, у якому граничне значення рівня позаклітинного домена маркерного білка, що являє собою Неr2, у сироватці становить від 12 до 22 нг/мол, переважно приблизно 18нг/мол. 16. Застосування антитіла, що зв'язується з маркерним білком, що являє собою трансформуючий фактор росту альфа або HER2, для прогнозування відповіді в пацієнта на лікування антитілом 2С4. Галузь техніки, до якої відноситься винахід Даний винахід відноситься до способу прогнозування відповіді в пацієнта на лікування інгібітором димеризації HER, що полягає в тому, що здійснюють оцінку маркерного гена або комбінації маркерних генів, вибраних із групи, що включає маркерні гени епідермального фактора росту, трансформуючого фактора росту альфа й HER2, або комбінації маркерних генів, що включає маркерний ген амфірегуліну й маркерний ген, вибраний із групи, що включає маркерні гени епідермального фактора росту, що трансформує фактори росту альфа й HER2, у біологічному зразку, узятому з організму пацієнта, і прогнозують відповідь на лікування пацієнта інгібітором димеризації HER на основі оцінки результатів, отриманих на першій стадії. В описі викладені також інші застосування й способи, у яких застосовують зазначені маркери. Передумови створення винаходу Сімейство рецепторів людського епідермального фактора росту (Erb або HER) складається із чотирьох представників (HER 1-4), які завдяки їхній здатності активувати каскад складних сигналів є важливими медіаторами клітинного росту, виживання й диференціації. Щонайменше 11 різних продуктів генів суперсімейства епідермального фактора росту (EGF) мають здатність зв'язуватися із трьома із цих рецепторів, EGFR (який позначають також як Erbl або HER1), HER3 (Еrb3) і HER4 (Еrb4). Хоча не було ідентифіковано жодного ліганда, що зв'язується з HER2 (Еrb2 або neu) і активує його, переважає думка, що HER2 є корецептором, що здійснює свою дію разом з іншими рецепторами HER, викликаючи ампліфікацію й у деяких випадках ініціацію шляхом передачі сигналу рецептор-ліганд. Для їхньої активності важливу роль грає димеризація з рецептором того ж типу (гомодимеризація) або іншим представником сімейства HER (гетеродимеризація). HER2 є кращим партнером для димеризації з іншими представниками сімейства HER. Добре вивчена роль, що грають представники сімейства HER у багатьох типах епітеліальних пухлин, і це привело до раціональної розробки нових протиракових агентів, специфічною мішенню яких є HER-рецептори. Рекомбінантне гуманізоване моноклональне антитіло (Мат) до HER2 трастузумаб являє собою стандартний лікарський засіб для лікування пацієнтів, що страждають HER2-позитивним метастатичним раком молочної залози (МВС). Надекспресія/ампліфікація білка/гена HER2, що має місце в 20-30% випадків раку молочної залози, є передумовою для лікування трастузумабом. Пертузумаб (Omnitarg™; більше рання назва 2С4) є першим представником нового класу агентів, відомих як інгібітори димеризації HER (HDI). Пертузумаб зв'язується з HER2 у його домені димеризації, інгібуючи тим самим його здатність утворювати активні димерні рецепторні комплекси й, блокуючи каскад наступних сигналів, що в остаточному підсумку приведе до росту й розподілу клітин . Пертузумаб являє собою повністю гуманізоване рекомбінантне моноклональне антитіло до позаклітинного домену HER2. Зв'язування пертузумабу з HER2 на людських епітеліальних клітинах не дозволяє HER2 утворювати комплекси з іншими представниками сімейства HER (включаючи EGFR, HER3, HER4) і, очевидно, перешкоджає також гомодимеризації HER2. Блокуючи утворення комплексу, пертузумаб попереджає стимулюючий ріст впливу й сигнали клітинного виживання, активовані лігандами HER1, HER3 і HER4 (наприклад, EGF, TGF, амфірегуліном і херегулінами). Пертузумаб має також інші назви, 2С4 або Omnitarg™. Пертузумаб являє собою повністю гуманізоване рекомбінантне моноклональне антитіло, засноване на послідовностях каркасної ділянки людського Ig1(к). Структура пертузумабу включає два важкі ланцюги (449 залишків) і дві легені ланцюга (214 залишків). Від трастузумаба (Herceptin®) пертузумаб відрізняється 12 амінокислотами в легкому ланцюзі й 29 амінокислотами у важкому ланцюзі Ig1. В WO 2004/092353 і WO 2004/091384 описані дослідження, у яких установлене, що ефективність або застосовність пертузумабу повинна бути пов'язана з утворенням гетеродимерів Неr2 з іншими рецепторами. В Zabrecky J.R. і ін., J. Biol. Chem. 266, 1991, сс. 1716-1720 описане, що вивільнення позаклітинного домена Неr2 може брати участь в онкогенезі і його виявлення може знайти застосування при діагностиці раку. В Colomer R. і ін., Clin. Cancer Res. 6, 2000, сс. 2356-2362 описаний присутній у кровотоці позаклітинний домен Неr2 і стійкість до хіміотерапії розвиненого раку молочної залози. 7 Можливість використання позаклітинного домена Неr2 для цілей прогнозу й прогнозування описана в огляді Hait W.N., Clin. Cancer Res. 7, 2001, сс. 2601-2604. Короткий виклад сутності винаходу Існує необхідність у розробці нових методів визначення прогресування захворювання в пацієнтів, які страджають на рак, що піддаються лікуванню інгібітором димеризації HER. Таким чином, одним з варіантів здійснення винаходу є спосіб прогнозування відповіді на лікування інгібітором димеризації HER у пацієнта, що полягає в тому, що а) оцінюють у біологічному зразку, узятому з організму пацієнта, - маркерний ген або комбінацію маркерних генів, вибраних із групи, яка включає маркерні гени епідермального фактора росту, що трансформує фактори росту альфа й HER2, або - комбінацію маркерних генів, що включає маркерний ген амфірегуліну й маркерний ген, вибраний із групи, що включає маркерний ген епідермального фактора росту, що трансформує фактори росту альфа й HER2, і б) прогнозують відповідь на лікування інгібітором димеризації HER у пацієнта на основі оцінки результатів, отриманих на стадії а). Іншим варіантом здійснення винаходу є застосування зонда, що гібридизується в строгих умовах з маркерним полінуклеотидом епідермального фактора росту, що трансформує фактори росту альфа або HER2, або антитіла, що зв'язується з маркерним білком, що представляє собою епідермальний фактор росту, що трансформує фактором росту альфа або HER2, для прогнозування відповіді на лікування пацієнта інгібітором димеризації HER, або застосування зонда, що гібридизується в строгих умовах з маркерним полінуклеотидом амфірегуліну, епідермального фактора росту, трансформуючий фактор росту альфа або HER2, або антитіла, що зв'язується з маркерним білком, що представляє собою амфірегулін, епідермальний фактор росту, трансформуючий фактор росту альфа або HER2, для відбору композиції, призначеної для інгібування прогресування захворювання в пацієнта. Наступним варіантом здійснення винаходу є набір, що включає зонд, що гібридизується в строгих умовах з маркерним полінуклеотидом амфірегуліну, епідермального фактора росту, що трансформує фактори росту альфа або HER2, або антитіло, що зв'язується з маркерним білком, що представляє собою амфірегулін, епідермальний фактор росту, трансформуючий фактор росту альфа або HER2. Ще одним варіантом здійснення винаходу є спосіб відбору композиції, призначеної для інгібування прогресування захворювання в пацієнта, що полягає в тому, що: а) аліквоти біологічного зразка, отриманого з організму страждаючим раком пацієнта, окремо піддають впливу декількох тестованих композицій; б) порівнюють рівень експресії маркерного гена або комбінації маркерних генів, вибраних із групи, що включає маркерний ген амфірегуліну, епідермального фактора росту, трансформуючого 93989 8 фактора росту альфа й HER2, в аліквотах біологічного зразка, наведених у контакт із тестованими композиціями, і рівень експресії маркерного гена або комбінації маркерних генів, вибраних із групи, що включає маркерний ген амфірегуліну, епідермального фактора росту, трансформуючий фактор росту альфа й HER2, в аліквоті біологічного зразка, не введеної в контакт із тестованими композиціями, в) відбирають одну з тестованих композицій, що змінює рівень експресії маркерного гена або комбінації маркерних генів в аліквоті, що містить цю тестовану композицію, у порівнянні з аліквотою, не введеної в контакт із тестованої композицією, де критерієм відбору тестованої композиції є наявність щонайменше 10%-ного розходження між рівнем експресії маркерного гена або комбінації маркерних генів в аліквоті біологічного зразка, введеної в контакт із тестованої композицією, і рівнем експресії відповідного маркерного гена або комбінації маркерних генів в аліквоті біологічного зразка, не введеної в контакт із тестованої композицією. Іншим варіантом здійснення винаходу є спосіб виявлення агента-кандидата, що полягає в тому, що: а) приводять у контакт аліквоту біологічного зразка, отриманого з організму пацієнта, що страждає на рак, з агентом-кандидатом і визначають рівень експресії маркерного гена або комбінації маркерних генів, вибраних із групи, що включає маркерні гени амфірегуліну, епідермального фактора росту, трансформуючого фактора росту альфа й HER2, в аліквоті, б) визначають рівень експресії відповідного маркерного гена або відповідної комбінації маркерних генів в аліквоті біологічного зразка, не наведеного в контакт із агентом-кандидатом, в) виявляють дію агента-кандидата шляхом порівняння рівня експресії маркерного гена або комбінації маркерних генів в аліквоті біологічного зразка, наведеного в контакт із агентомкандидатом, з рівнем експресії відповідного маркерного гена або відповідної комбінації маркерних генів в аліквоті біологічного зразка, не наведеного в контакт із агентом-кандидатом, г) відбирають агент на основі виявленої дії, де критерієм відбору агента-кандидата є наявність щонайменше 10%-ного розходження між рівнем експресії маркерного гена або комбінації маркерних генів в аліквоті біологічного зразка, введеної в контакт із агентом-кандидатом, і рівнем експресії відповідного маркерного гена або комбінації маркерних генів в аліквоті біологічного зразка, не введеної в контакт із агентом-кандидатом. Ще одним варіантом здійснення винаходу є агент-кандидат, вибраний відповідно до способу, пропонованому у винаході, або фармацевтичний препарат, що містить агент, пропонований у винаході. Наступним варіантом здійснення винаходу є агент, пропонований у винаході, що застосовують для готування композиції, призначеної для лікування раку. 9 Ще одним варіантом здійснення винаходу є спосіб готування лікарського засобу, що полягає в тому, що здійснюють стадії способу, пропонованого у винаході, і І) синтезують агент-кандидат, ідентифікований на стадії в), або його аналог або похідне в кількості, достатній для введення лікарського засобу в терапевтично ефективній кількості індивідуумові; і/або II) поєднують призначений для лікарського засобу-кандидата агент-кандидат, ідентифікований на стадії в) або його аналог або похідне з фармацевтично прийнятним носієм. Наступним варіантом здійснення винаходу є застосування маркерного білка або маркерного полінуклеотиду, обраного із групи, що включають маркерні білки або маркерні полінуклеотиди амфірегуліну, епідермального фактора росту, трансформуючий фактор росту альфа й HER2, для виявлення агента-кандидата або для відбору композиції, призначених для інгібування прогресування захворювання в пацієнта. Іншим варіантом здійснення винаходу є застосування інгібітору димеризації HER для готування лікарського засобу, призначеного для лікування хворої раком людини, у якому зазначена обробка або лікування включає оцінку в біологічному зразку, узятому з організму пацієнта, маркерного гена або комбінації маркерних генів, вибраних із групи, що включає маркерні гени епідермального фактора росту, що трансформує фактори росту альфа й HER2, або комбінації маркерних генів, що включає маркерний ген амфірегуліну й маркерний ген, вибраний з маркерних генів епідермального фактора росту, що трансформує фактори росту альфа й HER2. У контексті даного опису єдине й множина відносяться відносяться до одного (тобто щонайменше одного) об'єктів, описуваним розглянутим граматичним поняттям. Наприклад, поняття «елемент» означає один або кілька елементів. Поняття «біологічний зразок», як правило, позначає будь-який біологічний зразок, отриманий з організму індивідуума, рідини організму, клітинної лінії, тихорєцької культури або іншого джерела. До рідин організму відносяться, наприклад, лімфа, сироватка, плазма, сеча, рідина сімені, синовіальна рідина й цереброспинальна рідина. Методи узяття біопсій тканини й рідин організму в ссавців добре відомі в даній області. Якщо поняття «зразок» уживається індивідуально (тобто без прикметника), то однаково варто розуміти, що «зразок» являє собою «біологічний зразок», тобто ці поняття використовують ся взаємозамінно. Поняття «відповідь на лікування інгібітором димеризації HER» або «відповідь у пацієнта на лікування інгібітором димеризації HER» відносяться до клінічної сприятливої дії на пацієнта, що страждає захворюванням або станом (таким як рак), що обумовлений або є наслідком лікування інгібітором димеризації HER. Клінічна сприятлива дія включає повну ремісію, часткову ремісію, стабільний стан захворювання (без прогресування), тривалість існування без прогресування, трива 93989 10 лість існування без захворювання, збільшення періоду часу до прогресування (захворювання), збільшення періоду часу до настання смерті або збільшення загальної тривалості існування пацієнта, обумовлені або лікування, що є результатом, інгібітором димеризації HER. Існують критерії оцінки відповіді на терапію, і ці критерії дозволяють порівнювати ефективність різних методів лікування (Slapak і Kufe, Principles of Cancer Therapy, в Harrisons 's Principles of Internal Medicine, 13-і изд., під ред. Isselbacher і ін., з McGraw-Hill, Inc., 1994). Наприклад, повна відповідь або повна ремісія рака являє собою зникнення всіх ознак злоякісного захворювання, що виявляють. Часткова відповідь або часткова ремісія рака може полягати, наприклад, у приблизно 50%-ному зменшенні добутку найбільших взаємно перпендикулярних діаметрів одного або декількох ушкоджень, або у відсутності збільшення розміру будь-якого ушкодження або нових ушкоджень. У контексті даного опису поняття «прогресування рака» включає й може відноситися до метастазів; рецидиву раку або до щонайменше приблизно 25%-ному збільшенню добутку найбільших взаємно перпендикулярних діаметрів одного ушкодження або появі нових ушкоджень. Прогресування раку, переважно рака молочної залози, «інгібується», якщо зменшується, уповільнюється, затримується або запобігається рецидив або метастазування рака. Поняття «період часу до початку прогресування/настання смерті (ТТР)» є синонімом «тривалості існування без прогресування (PFS)». Воно відноситься до клінічного кінцевого результату, часто використовуваному в онкологічних дослідженнях. У цьому випадку оцінка для кожного пацієнта являє собою проміжок часу від початку лікування пацієнта в розглянутому дослідженні (що зазначено в протоколі дослідження) до виявлення прогресування злоякісного захворювання (що зазначено в протоколі дослідження) або до настання будьякого нещасного випадку з летальним результатом (залежно від того, що відбулося першим). Якщо спостереження за пацієнтом було припинено (наприклад, по закінченні дослідження) після закінчення певного періоду часу й не було виявлено таких подій, то цей період спостереження t називають «проконтрольованим». Поняття «період часу до настання смерті (TTD)» є синонімом поняття «загальна тривалість існування (OS)». Воно відноситься до клінічного кінцевого результату, часто використовуваному в онкологічних дослідженнях. У цьому випадку оцінка для кожного пацієнта являє собою проміжок часу від початку лікування пацієнта в розглянутому дослідженні (що зазначено в протоколі дослідження) до настання будь-якого нещасного випадку з летальним результатом. Якщо спостереження за пацієнтом було припинено (наприклад, по закінченні дослідження) після закінчення певного періоду часу t і пацієнт вижив до цього моменту часу, то цей період спостереження t називають «проконтрольованим». Поняття «коваріанта» має наступне значення. Клінічні кінцеві результати часто аналізують за 11 допомогою регресійних моделей, у яких кінцевий результат являє собою залежну змінну, а біомаркери являють собою основні або незалежні цільові змінні (регрессори). Якщо розглядають додаткові змінні з пула клінічних даних, то їх називають (клінічними) коваріантами. У контексті даного опису поняття «клінічна коваріанта» використовують для позначення будь-якої клінічної інформації про пацієнта, що, як правило, одержують на вихідному рівні. Ці клінічні коваріанти являють собою демографічну інформацію, таку як пол, вік і т.д., іншу анамнестичну інформацію, що супроводжують захворювання, що супроводжують методи лікування, результат об'єктивного обстеження, загальні отримані в лабораторних умовах параметри, відомі властивості пухлини-мішені, інформацію про кількісну оцінку ступеня злоякісного захворювання, клінічні бали оцінки працездатності типу ECOG (Західна кооперована онкологічна науководослідна група) або індексу Карновскі (Karnofsky index), клінічну стадію захворювання, графік і результат попередніх обробок, і історію хвороби, а також будь-яку аналогічну інформацію, що може мати відношення до клінічного прогнозу. У контексті даного опису поняття «вихідний або нескорегований аналіз» відноситься до регресійних аналізів, у яких у регресійній моделі крім розглянутих біомаркерів не використовують додаткові клінічні коваріанти ні як незалежних факторів, ні в якості стратифікованої коваріанти. Поняття «адаптований за допомогою коваріант» відноситься до регресійних аналізів, у яких у регресійній моделі крім розглянутих біомаркерів використовують додаткові клінічні коваріанти або як незалежних факторів, або в якості стратіфікованої коваріанти. У контексті даного опису поняття «одноваріантний» відноситься до регресійних моделей або графічних подань, у яких у якості незалежної змінної в моделі використовують тільки один із цільових біомаркерів. Такі одноваріантні моделі можна застосовувати як з урахуванням додаткових клінічних коваріант, так і без них. У контексті даного опису поняття «різноманітний» відноситься до регресійних моделей або графічних подань, у яких у якості незалежної змінної в моделі використовують більше одного цільового біомаркера. Такі різноманітні моделі можна застосовувати як з урахуванням додаткових клінічних коваріант, так і без них. «Нуклеотиди» являють собою «нуклеозиди», які додатково містять фосфатну групу, ковалентно пов'язану із цукровим фрагментом нуклеозиду. В «нуклеозидах», які містять пентофуранозильний цукровий фрагмент, фосфатна група може бути пов'язана з 2'-, 3'- або 5'-гідроксильною групою цукрового фрагмента. «Нуклеотид» являє собою «мономерну ланку» «олігонуклеотиду», що у даному описі позначають більше загальним поняттям «олігомерна сполука», або «полінуклеотид», що у даному описі позначають більше загальним поняттям «полімерна сполука». Іншими загальними поняттями є дезоксирибонуклеїнова кислота (ДНК) і рибонуклеїнова кислота (РНК). У контексті 93989 12 даного опису поняття «полінуклеотид» є синонімом поняття «нуклеїнова кислота». Поняття «зонд» відноситься до отриманим синтетичним або біологічним шляхом нуклеїновим кислотам (ДНК або РНК), які в результаті конструювання або селекції містять специфічні нуклеотидні послідовності, що дозволяють їм специфічно (тобто переважно) гібридизуватися в умовах заздалегідь певної строгості з «нуклеїновими кислотами». «Зонд» можна називати «захоплюючим зондом», це означає, що він «захоплює» нуклеїнову кислоту, так що її можна відокремлювати від небажаних матеріалів, які можуть утрудняти її виявлення. Після здійснення відділення захоплену «нуклеїнову кислота-мішень» можна виявляти за допомогою придатної процедури. «Захоплюючі зонди» часто є вже приєднаними до твердої фази (іммобілізованими на твердій фазі). У контексті даного винаходу поняття гібридизація в «строгих умовах» має таке ж значення, що їй дане в Sam brook і ін., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, з Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, у параграфах 1.101-1.104. Переважно «гібридизація в строгих умовах» відноситься до випадку, коли сигнал гібридизації усе ще можна виявляти після відмивання протягом 1 год за допомогою 1xSSC і 0,1% ДСН при 50°С, переважно при 55°С, більш переважно при 62°С і найбільше переважно при 68°С, і найбільше переважно протягом 1 год за допомогою 0,2xSSC і 0,1% ДСН при 50°С, переважно при 55°С, більш переважно при 62°С, і найбільше переважно при 68°С. Склад буферу SSC описаний в Sambrook і ін., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, з Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. «Транскрибований полінуклеотид» являє собою полінуклеотид (наприклад, РНК, кДНК, або аналог РНК або кДНК), що є комплементарним або гомологічним всієї або частини зрілої РНК, отриманий шляхом транскрипції гена, такого як маркерний ген, пропонований у винаході, і звичайного посттранскрипційного процесінгу транскрипта (наприклад, сплайсинга), якщо він має місце. Поняття «кДНК» являє собою скорочену назва комплементарної ДНК, одноланцюгової або двохланцюгової ДНК-копії мРНК. Поняття «мРНК» являє собою скорочену назву РНК у вигляді мРНК, що служить як матриця для синтезу білка. Поняття «маркерний ген» включає ген, якому можна застосовувати згідно із даним винаходом для оцінки прогресування рака в пацієнта, насамперед у пацієнта, що страждає на рак молочної залози. Його можна називати також маркерним геном раку, переважно раку молочної залози. Мається на увазі, що поняття «маркерний полінуклеотид» включає нуклеотидний транскрипт (hnPHK або мРНК), кодований й маркерним геном, пропонованим у винаході, або кДНК, виведену з нуклеотидного транскрипта, або сегмент зазначеного транскрипта або кДНК. Поняття «маркерний білок» або «маркерний поліпептид» включає білок або поліпептид, кодований маркерним геном, пропонованим у винаході, або фрагмент поліпептиду або білка, що містить зазначений маркерний білок. 13 Поняття «продукт гена (генний продукт)» включає маркерний полінуклеотид і маркернийбілок, кодований розглянутим геном. Уважається, що рівень експресії маркерного гена «істотно» відрізняється від рівня експресії маркерного гена в зразку, з яким виробляється порівняння, якщо рівень експресії в зразку, узятому з організму пацієнта, відрізняється від рівня експресії в зразку, узятому з організму індивідуума, з яким виробляється порівняння, на величину, що перевищує стандартну погрішність методу аналізу, застосовуваного для оцінки рівня експресії, і переважно перевищуючу щонайменше на 10%, і більш переважно на 25%, 50%, 75%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 300%, 400%, 500% або 1000% цю величину. В альтернативному варіанті можна вважати, що рівень експресії маркерного гена в пацієнта «істотно» нижче рівня експресії в контрольного індивідуума, якщо рівень експресії в зразку, узятому з організму пацієнта, менше рівня експресії в зразку, узятому з організму контрольного індивідуума, на величину, що перевищує стандартну помилку методу аналізу, застосовуваного для оцінки рівня експресії, і переважно перевищуючу щонайменше на 10%, і більш переважно на 25%, 50%, 75%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 300%, 400%, 500% або 1000% цю величину. Маркерний полінуклеотид або маркерний білок «відповідає» іншому маркерному полінуклеотиду або маркерному білку, якщо він є родинним йому, найбільше переважно ідентичним йому. Поняття «рівень експресії» і «експресійний рівень» у контексті даного опису використовуються взаємозамінне й, як правило, відносяться до кількості продукту, що представляє собою полінуклеотид або амінокислоту, або білка в зразку. «Експресія», як правило, відноситься до процесу, у якому кодована геном інформація перетворюється в структури, що є присутнім і функціонують у клітці, таким чином, у контексті винаходу поняття «експресія» (маркерного) гена включає транскрипцію з одержанням полінуклеотиду, трансляцію з одержанням білка й навіть посттрансляційну модифікацію білка. Фрагменти транскрибованого полінуклеотиду, трансльованого білка або посттрансляційного білка, що модифікує, також варто розглядати як експресовані, якщо вони відбуваються, наприклад, із транскрипта, отриманого шляхом альтернативного сплайсинга, розщепленого транскрипта або шляхом посттрансляційного процессинга білка, наприклад, шляхом протеолізу. У контексті даного опису поняття «експресовані гени» включає гени, траснкрибовані з одержанням полінуклеотиду у вигляді мРНК і потім трансльовані з одержанням білка. Це поняття повинне включати також експресовані гени, траснкрибовані з одержанням РНК, але не трансльовані з одержанням білка (наприклад, транспортна й рибосомальна РНК). Поняття «надекспресія» і «зменшена експресія» відносяться до відхилень рівнів експресії у верхню або в нижню сторону в порівнянні з вихідними рівнями експресії в зразку, використовуваному як контроль. Таким чином, «надекспресія» являє собою також «підвищену 93989 14 експресію», а «зменшена експресія» являє собою «знижену експресію». Поняття «амфірегулін» відноситься до гена, що кодує білок, і до самого білка, що є представником сімейства епідермальних факторів росту. Він являє собою аутокрінний фактор росту, а також виконує функцію мітогену для астроцитів, шванновських клітин і фібробластів. Він є родинним епідермальному факторові росту (EGF) і факторові, що трансформує, росту альфа (TGFальфа). Цей білок взаємодіє з рецептором EGF/TGF-альфа, стимулюючи ріст здорових епітеліальних клітин, і інгібує ріст певних агресивних клітинних ліній карциноми. Відповідно до винаходу амінокислотною послідовністю амфірегуліну є амінокислотна послідовність, представлена в SEQ ID NО:1. Відповідно до винаходу нуклеотидною послідовністю кДНК «амфірегуліну» є нуклеотидна послідовність, представлена в SEQ ID NО:5, яку можна одержати в GenBank під реєстраційним номером NM_001657. Поняття «трансформуючий фактор росту альфа» відноситься до гена, що кодує білок, і до самого білка, що є представником сімейства факторів росту, що трансформують (TGF). Вони являють собою біологічно активні поліпептиди, які оборотно передають трансформований фенотип культивованим кліткам. Послідовність «фактора росту альфа, що трансформує,» гомологічна приблизно на 40% послідовності епідермального фактора росту й вона конкурує з EGF за зв'язування з рецептором EGF, стимулюючи його фосфорилювання й одержання мітогенної відповіді. Відповідно до винаходу амінокислотною послідовністю «фактора росту альфа, що трансформує» є амінокислотна послідовність, представлена в SEQ ID NО:3. Відповідно до винаходу нуклеотидною послідовністю кДНК «фактора росту альфа,що трансформує» є нуклеотидна послідовність, представлена в SEQ ID NО:7, яку можна одержати в GenBank під реєстраційним номером NM_003236. Поняття «епідермальний фактор росту» відноситься до гена, що кодує білок, і до самого білка, що є представником сімейства факторів росту. «Епідермальний фактор росту (EGF)» робить значна дію на дифференціацію певних типів клітин in vivo і є сильним мітогенним фактором для різноманітних культивованих клітин як ектодермального, так і мезодермального походження. Передбачається, що попередником EGF є пов'язана з мембраною молекула, що у результаті протеолізу розщеплюється з утворенням складається з 53 амінокислот пептидного гормону, що має здатність стимулювати розподіл клітин. Відповідно до винаходу амінокислотною послідовністю «епідермального фактора росту» є амінокислотна послідовність, представлена в SEQ ID NО:2. Відповідно до винаходу нуклеотидною послідовністю кДНК «епідермального фактора росту (EGF)» є нуклеотидна послідовність, представлена в SEQ ID NО:6, яку можна одержати в GenBank під реєстраційним номером NM_001963. «Рецептор епідермального фактора росту», що скорочено позначають як EGFR, являє собою глікопротеїн з молекулярною масою 170 кДа, що має N-кінцевий позаклітинний 15 домен, гідрофобний трансмембранний домен і Скінцеву внутрішньоклітинну область, що містить кіназний домен. Існують різні варіанти мРНК, які транслюються з утворенням різних рецепторних білків. Відповідно до винаходу амінокислотною послідовністю «рецептора епідермального фактора росту» є амінокислотна послідовність, представлена в SEQ ID NО:11 (варіант транскрипта 1; реєстраційний номер в GenBank NM_005228), SEQ ID NО:12 (варіант транскрипта 2; реєстраційний номер в GenBank NM_201282), SEQ ID NO: 13 (варіант транскрипта 3; реєстраційний номер в GenBank NM_201283) або SEQ ID NO: 14 (варіант транскрипта 4; реєстраційний номер в GenBank NM_201284). EGFR, кодований й геном erbl, як правило, є однією із причин розвитку злоякісних утворень у людини. Зокрема, установлено, що підвищена експресія EGFR має місце при раку молочної залози, сечового міхура, легені, голови, шиї й шлунка, а також у гліобластомах. Індукована лігандом EGFR димеризація активує внутрішній домен RTK (домен 1, гомологічний Src, SH1), приводячи до аутофосфорилюванню на шести специфічних залишках тирозину EGFR у некаталітичному «хвості» цитоплазматичного домена. Клітинні впливи активації EGFR у раковій клітці включають підвищення проліферації, стимулювання клітинної рухливості, адгезії, інвазії, ангіогенезу й підвищення виживаності клітин у результаті інгібування апоптозу. Активований EGFR індукує проліферацію пухлинних клітин за допомогою стимуляції каскаду активованої мітогеном протеїн кінази (МАРК). У даному описі поняття «human neu», «c-erbB2», «erb2», «erbB-2», «HER-2/neu», «Неr2» і «HER2» використовуються взаємозамінно. Поняття «Неr2» відноситься до гена, що кодує білок, і до самого білка, що є представником сімейства рецепторів епідермального фактора росту (EGF) тирозинкіназних рецепторів. Цей білок не має власного лігандзв'язуючого домена й тому не може зв'язуватися з факторами росту. Однак, він міцно зв'язується з іншими представниками сімейства зв'язуються з лігандом рецепторів EGF з утворенням гетеродимера, стабілізуючи зв'язування з лігандом і підвищуючи опосередковану кіназою активацію наступних шляхів передачі сигналу, таких, у яких беруть участь активовані мітогеном протеїн кіназа й фосфатидилінозитол-3-кіназа. Описані алельні варіації амінокислот у положеннях 654 і 655 ізоформи а (положення 624 і 625 ізоформи b), причому відповідно до винаходу кращим є найпоширеніший аллель Іlе654/Іlе655. Опубліковано дані про ампліфікації й/або надекспресії цього гена в багатьох типах ракових пухлин, включаючи пухлини молочної залози і яєчника. Шляхом альтернативного сплайсинга одержують кілька додаткових варіантів транскриптів, деякі з яких кодують різні ізоформи, а інші ще не повністю охарактеризовані. Відповідно до винаходу амінокислотною послідовністю Неr2 є амінокислотна послідовність, представлена в SEQ ID NO:4. Відповідно до винаходу нуклеотидною послідовністю кДНК «Неr2» є нуклеотидна послідовність, представлена в SEQ ID 93989 16 NO:8, яку можна одержати від GenBank під реєстраційним номером NM_004448.2. «Позаклітинний домен Неr2» або «виділений позаклітинний домен Неr2» являє собою глікопротеїн з молекулярною масою від 97 до 115 кДа, що практично відповідає позаклітинному домену продукту гена людського Неr2. Його можна позначати також як p105 (Zabrecky J.R. і ін., J. Biol. Chem. 266, 1991, сс. 1716-1720; US 5401638; US 5604107). Кількісне визначення й виявлення позаклітинного домена Her 2 описано в US 5401638 і US 5604107. Поняття «Неr3» відноситься до іншого представника сімейства рецепторів епідермального фактора росту (EGFR) тирозинкіназних рецепторів. Цей пов'язаний з мембраною білок не має активного кіназного домена. Білок може зв'язуватися з лігандом, але він не передає сигнал у клітину. Він утворить гетеродимери з іншими представниками сімейства рецепторів EGF, що володіють кіназною активністю, що приведе до проліферації й диференціюванню клітин. У численних типах ракових пухлин була виявлена ампліфікація цього гена й/або надекспресія відповідного білка. Відповідно до винаходу амінокислотною послідовністю кДНК «Неr3» є амінокислотна послідовність, представлена в SEQ ID NO:9, яку можна одержувати від GenBank шляхом трансляції нуклеотидної послідовності Неr3, що має реєстраційний номер NM_001005915. Відповідно до винаходу нуклеотидною послідовністю кДНК «Неr3» є нуклеотидна послідовність, представлена в SEQ ID NO:10, яку можна одержати від GenBank під реєстраційним номером NM_001005915. У контексті даного опису поняття «антитіло» використовують у його найбільш широкому змісті й воно конкретно відноситься до моноклональних антитіл, поліклональних антитіл, мультиспецифічних антитіл (наприклад, біспецифічних антитіл), утвореним щонайменше із двох інтактних антитіл, і фрагментам антитіл, якщо вони мають необхідну біологічну активність. У контексті даного опису поняття «моноклональне антитіло» відноситься до антитіла, отриманому з популяції практично гомогенних антитіл, тобто, з популяції антитіл, які є ідентичними за винятком мутацій, що зустрічаються в природних умовах, які можуть бути присутніми у невеликих кількостях. Моноклональні антитіла мають високу специфічність, оскільки їхньою мішенню є ділянка однієї детермінанти. Крім того, на відміну від препаратів поліклональних антитіл, які включають різні антитіла до різних детермінантів (епітопам), мішенню кожного моноклонального антитіла є одна детермінанта антигену. Крім своєї специфічності моноклональні антитіла володіють тою перевагою, що їх можна синтезувати без забруднення іншими антитілами. Прикметник «моноклональний» указує на ту відмітну ознаку, що антитіло отримане із практично гомогенної популяції антитіл, і не містить вимоги, що антитіло повинне бути отримане яким-небудь конкретним методом. Наприклад, моноклональні антитіла, призначені для застосування згідно із даним винаходом, можна створювати за допомогою методу гібридом, упер 17 ше описаним в Kohler G. і ін., Nature 256, 1975, сс. 495-497, або їх можна створювати методами рекомбінантної ДНК (див., наприклад, US 4816567). «Фрагменти антитіла» містять частину інтактного антитіла. Антитілом, пропонованим у винаході, «яке зв'язується» з антигеном, що представляє інтерес, є антитіло, що має здатність до зв'язування із зазначеним антигеном з афінністю, достатньою для того, щоб антитіло можна було застосовувати для виявлення присутності антигену. Антитіло, пропоноване у винаході, являє собою антитіло, що зв'язується з людським Неr2 і не володіє (вираженою) здатністю вступати в перехресну реакцію з іншими білками. У таких варіантах здійснення винаходу рівень зв'язування антитіла з іншими білками повинен становити менш 10% за даними аналізу з використанням клітинного сортера з порушенням флуоресценції (FACS) або радіоімунопреципітації (RIA). Димеризація, тобто спарювання рецепторів, має велике значення для активності всіх рецепторів HER відносно передачі сигналу. У контексті винаходу поняття «інгібітор димеризації Her» або переважно «інгібітор гетеродимеризації Неr2» відноситься до терапевтичного агента, що зв'язується з Нег2 і інгібує гетеродимеризацію Неr2. Такими агентами переважно є антитіла, переважно моноклональні антитіла, більш переважно гуманізовані антитіла, які зв'язуються з Неr2 і інгібують гетеродимеризацію Неr2. Прикладами антитіл, які зв'язуються з HER2, є 4D5, 7С2, 7F3 або 2С4, а також їх гуманізовані варіанти, включаючи huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 і huMAb4D5-8, які зазначені в таблиці 3 U.S. 5821337; і мутанти гуманізованого 2С4 під номерами 560, 561, 562, 568, 569, 570, 571, 574 або 56869, описані в WO 01/00245. Антитіла 7С2 і 7F3 і їх гуманізовані варіанти описані в WO 98/17797. Це поняття не слід застосовувати до таких моноклональних антитіл, як тратузумаб, що надходить у продаж під товарним знаком HerceptinTM, оскільки воно має інший механізм дії й це антитіло не інгібує димеризацію Her. Кращим для застосування є «антитіло 2С4», зокрема, його гуманізований варіант (WO 01/00245; продукується лінією клітин гібридоми, депонованої в Американській колекції типових культур (American Type Culture Collection), Манассас, шт. Вірджинія, США, під реєстраційним номером АТСС НВ-12697), що зв'язується з ділянкою позаклітинного домена Неr2 (наприклад, з одним або декількома залишками, локалізованими в області приблизно від залишку 22 до приблизно залишку 584 Неr2 включно). «Епітоп 2С4» являє собою область у позаклітинному домені Еrb2, з якої зв'язується антитіло 2С4. Поняття «моноклональне антитіло 2С4» відноситься до антитіла, що має антигензв'язуючі залишки мишачого антитіла 2С4, описаного в розділі «Приклади» WO 01/00245, або отримано з нього. Наприклад, моноклональне антитіло 2С4 може являти собою мишаче моноклональне антитіло 2С4 або його варіант, такий як гуманізоване антитіло 2С4, що має антигензв'язу 93989 18 ючі амінокислотні залишки мишачого моноклонального антитіла 2С4. Приклади гуманізованих антитіл 2С4 наведені в Прикладі 3 WO 01/00245. У контексті даного опису, якщо не зазначене інше, поняття «rhuMAb 2C4» відноситься до антитіла, яке має послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга (VL) і варіабельної ділянки важкого ланцюга (VH), які представлені в SEQ ID NO:3 і SEQ ID NO:4 в WO 01/00245 відповідно, злиті з послідовностями константних ділянок людського легкого й важкого ланцюгів Igl (аллотип не-А), які необов'язково можуть експресуватися в клітинах яєчника китайського хом'ячка (СНО). Кращі варіанти здійснення винаходу, зазначені в WO 01/00245, є кращими також і в цьому випадку. Гуманізоване антитіло 2С4 має також назва пертузумаб (OmnitargTM). «Набір» являє собою виріб (наприклад, упакування або контейнер), що містить щонайменше один реагент, наприклад, зонд, призначений для специфічного виявлення маркерного гена або білка, пропонованого у винаході. Виріб переважно рекламують, поширюють або продають у вигляді елемента, призначеного для здійснення способів, пропонованих у даному винаході. Дієслова «визначати» і «оцінювати» мають однакове значення й у даному описі їх використовують взаємозамінно. Докладний опис винаходу Загальноприйняті методи молекулярної біології й хімії нуклеїнових кислот, які відомі в даній області, описані в літературі, див., наприклад, Sambrook J. і ін., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, з Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; Oligonucleotide synthesis - a practical approach, під ред. Gait M.J., з IRL Press Limited, 1984; Nucleic acid hybridisation a practical approach, під ред. Hames B.D. і Higgins S.J., з IRL Press Limited, 1985; і серії Methods in Enzymology, з Academic Press, Inc., які всі включені в даний опис як посилання. Всі патенти, заявки на патент і публікації, згадані як вище, так і нижче в даному описі, включені в даний опис як посилання. Одним з варіантів здійснення винаходу є спосіб прогнозування відповіді в пацієнта на лікування інгібітором димеризації HER, що полягає в тому, що а) оцінюють у біологічному зразку, узятому з організму пацієнта, - маркерний ген або комбінацію маркерних генів, вибраних із групи, яка включає маркерні гени епідермального фактора росту, трансформуючого фактора росту альфа й HER2, або - комбінацію маркерних генів, що включає маркерний ген амфірегуліну й маркерні гени, обрані із групи, що включає маркерні гени епідермального фактора росту, трансформуючого фактора росту альфа й HER2, і б) прогнозують відповідь на лікування пацієнта інгібітором димеризації HER на основі оцінки результатів, отриманих на стадії а). Переважно в способі, пропонованому у винаході, стадія а), на якій оцінюють маркерний ген або комбінацію маркерних генів, полягає в тому, що 19 а1) оцінюють рівень експресії маркерного гена або комбінацію маркерних генів, а2) визначають, чи перевершує рівень експресії, оцінений на стадії а1), граничне значення, або перебуває нижче його. Граничне значення переважно являє собою величину, виражену у вигляді співвідношення маса/об'єм для сироватки крові або плазми крові, або маса/маса для пухлинної тканини. Його можна вимірювати методами, відомими фахівцям у даній області, а також методами, описаними в даному винаході. У кращому варіанті здійснення винаходу, якщо граничне значення вище або нижче певного граничного значення, то можна визначати відповідь на лікування. У випадку пацієнтів з метастатичним раком молочної залози при використанні одного маркерного гена, пропонованого у винаході, процедура полягає в наступному. Хоча вона може залежати від показань, але її можна здійснювати на основі опису даного винаходу. Відносно тільки одного маркерного гена трансформуючого фактора росту альфа низькі рівні експресії кращі з погляду тривалості існування без прогресування (період часу до настання смерті або початку прогресування захворювання) і загальної тривалості існування (період часу до настання смерті), коли розглядають можливість лікування інгібітором димеризації HER для пацієнтів з метастатичним раком молочної залози з низьким рівнем експресії Неr2, тобто низький рівень експресії маркерного гена трансформуючого фактора росту дозволяє прогнозувати гарну відповідь у таких пацієнтів на лікування інгібітором димеризації HER (див. фіг. 7). Це має місце як у випадку вихідних (нескоректованих) даних, так і скоректованих даних, що враховують клінічні коваріанти. Таким чином, для прогнозування гарної відповіді на лікування інгібітором димеризації HER пацієнтів, що страждають метастатичним раком молочної залози з низьким рівнем експресії Неr2, переважно, щоб рівень експресії маркерного гена трансформуючого фактора росту альфа, оцінений на стадії а1) був нижче граничного значення. Це має місце у випадку використання маркерного гена HER2 індивідуально для цих пацієнтів, насамперед позаклітинного домена розчинного Неr2, і маркерного гена епідермального фактора росту індивідуально для цих пацієнтів. Відносно тільки одного маркерного гена амфірегуліну низькі рівні експресії, що виявляють при аналізі неопрацьованих даних, кращі з погляду тривалості існування без прогресування (період часу до настання смерті або прогресування захворювання) і загальної тривалості існування (період часу до настання смерті), коли розглядають можливість лікування інгібітором димеризації HER для пацієнтів з метастатичним раком молочної залози з низьким рівнем експресії Неr2, тобто низький рівень експресії маркерного гена амфірегуліну дозволяє прогнозувати гарну відповідь у таких пацієнтів на лікування інгібітором димеризації HER. Це має місце, як у випадку вихідних даних, так і скоректованих даних, що враховують клінічні коваріанти. Аналізи з урахуванням клінічних коваріант свідчать про те, що з погляду тривалості іс 93989 20 нування без прогресування (період часу до настання смерті або прогресування захворювання) і загальної тривалості існування (період часу до настання смерті) після лікування інгібітором димеризації HER таких пацієнтів кращі високі рівні експресії. Оскільки маркерні гени, насамперед у сироватці, можна застосовувати в прогностичних моделях з використанням декількох маркерів, які можуть включати інші клінічні коваріанти, той напрямок сприятливого впливу одного маркерного гена в таких моделях не можна визначати простим шляхом і воно може суперечити напрямку, виявленому в одноваріантному аналізі, тобто в ситуації, описаної для випадку, коли використовують тільки один маркерний ген. Більш переважно в способі, пропонованому у винаході, граничне значення визначають перед здійсненням стадії а1) способу, пропонованого у винаході, для чого 1) оцінюють рівень експресії маркерного гена або комбінації маркерних генів у декількох біологічних зразках, узятих з організму пацієнтів до обробки інгібітором димеризації HER, 2) обробляють пацієнтів інгібітором димеризації HER, 3) установлюють кореляцію відповіді в пацієнтів, оброблених інгібітором димеризації HER, з рівнем експресії маркерного гена або комбінації маркерних генів, зазначених для стадії а), на основі чого визначають граничне значення. Граничне значення переважно являє собою величину, виражену у вигляді співвідношення маса/об'єм для сироватки крові або плазми крові, або маса/маса для пухлинної тканини. Даний винахід відноситься також до мутантів або варіантів маркерних генів, пропонованих у даному винаході, і їхньому застосуванню в способах, пропонованих у винаході. У таких мутантах або варіантах нативну послідовність маркерного гена змінюють шляхом замін, делецій або інсерцій. «Нативна послідовність» позначає амінокислотну або нуклеотидну послідовність, ідентичну послідовності дикого типу або нативної форми маркерного гена або білка. Даний винахід відноситься також до мутантів або варіантів білків, пропонованих у даному винаході, і їхньому застосуванню в способах, пропонованих у винаході. Поняття «мутантна амінокислотна послідовність», «мутантний білок» або «мутантний поліпептид» відносяться до поліпептиду, що має амінокислотну послідовність, що відрізняється від нативної послідовності або кодується нуклеотидною послідовністю, що представляє собою спеціально створений варіант нативної послідовності. Поняття «мутантний білок», «варіант білка» або «мутеін» позначають білок, що має мутантну амінокислотну послідовність, і включають поліпептиди, амінокислотні послідовності яких відрізняються від амінокислотної послідовності нативного білка, пропонованого у винаході, амінокислотними делеціями, замінами або ними обома. Даний винахід відноситься також до способу прогнозування відповіді на лікування комбінацією, що включає інгібітор димеризації HER і іншу субс 21 танцію або агент, такий як хіміотерапевтичний агент або терапевтичне антитіло, застосовуване для лікування раку. Хіміотерапевтичний агент може являти собою, наприклад, гемцитабин (Gemzar®; хімічну назву: 2',2'дифтордезоксицитидин (dFd)), карбоплатин (діамін(циклобутан-1,1-дикарбоксилато(2-)О,О')платина) або паклитаксел (Тахоl®, хімічна назва: -(бензоїламіно)-гідрокси-,6,12bбіс(ацетилокси)-12-(бензоїлокси)2а,3,4,4а,5,6,9,10,11,12,12а,12b-додекагідро-4,11дигідрокси-4а,8,13,13-тетраметил-5-оксо-7,11метано-1H-циклодека(3,4)бенз(1,2-b)оксет-9іловий ефір (2aR-(2a-,4-,4a-,6-, 9-(-R*,S*),11-,12-,12a-, 2b-))-бензолпропанової кислоти). У кращому варіанті здійснення винаходу біологічний зразок являє собою сироватку крові, плазму крові або пухлинну тканину. Зразок пухлинної тканини може являти собою фіксовану формаліном занурену в парафін пухлинну тканину або свіжозаморожену пухлинну тканину. В іншому кращому варіанті здійснення винаходу інгібітор димеризації HER інгібує гетеродимеризацію HER2 з EGFR або HER3, або Неr4. Переважно, інгібітор димеризації HER являє собою антитіло, краще антитіло 2С4. Кращим для застосування відповідно до винаходу є «антитіло 2С4», зокрема, його гуманізований варіант (WO 01/00245; продукується лінією клітин гібридоми, депонованої в Американській колекції типових культур (American Type Culture Collection), Манассас, шт. Вірджинія, США, під реєстраційним номером АТСС НВ-12697), що зв'язується з ділянкою позаклітинного домена Неr2 (наприклад, з одним або декількома залишками, локалізованими в області приблизно від залишку 22 до приблизно залишку 584 Неr2 включно). Приклади гуманізованих антитіл 2С4 наведені в Прикладі 3 WO 01/00245. Гуманізоване антитіло 2С4 має також назва Omnitarg™ або пертузумаб. Ще в одному кращому варіанті здійснення винаходу пацієнт являє собою пацієнта, що страждає на рак, переважно пацієнта, що страждає на рак молочної залози, раком яєчника, раком легені або раком передміхурової залози. Пацієнт, що страждає на рак молочної залози, переважно являє собою пацієнта, що страждає метастатичним раком молочної залози, або пацієнта, що страждає на рак молочної залози з низьким рівнем експресії HER2 або метастатичним раком молочної залози, або пацієнта, що страждає на рак молочної залози з високим рівнем експресії Неr2 або метастатичним раком молочної залози. Пацієнт, що страждає на рак яєчника, переважно являє собою пацієнта, що страждає метастатичним раком яєчника. Пацієнт, що страждає на рак легені, переважно являє собою пацієнта, що страждає недрібноклітинним раком легені (НМКЛР). Переважно, щоб у комбінації використали два, три або всі чотири маркерних гени, маркерних полінуклеотиду або маркерних білка, тобто застосовували у всіх описаних варіантах здійснення винаходу або способах, застосуваннях або наборах, 93989 22 пропонованих у винаході. Переважно оцінюють рівень експресії - комбінації маркерних генів, маркерних білків або маркерних полінуклеотидів епідермального фактора росту, трансформуючого фактора росту альфа або HER2, - комбінації маркерних генів, що включає маркерний ген амфірегуліну й маркерний ген, вибраний із групи, що включає маркерні гени епідермального фактора росту, трансформуючого фактора росту альфа й HER2, - комбінації маркерних генів, маркерних білків або маркерних полінуклеотидів епідермального фактора росту й трансформуючого фактора росту альфа або HER2, або - комбінації маркерних генів, маркерних білків або маркерних полінуклеотидів трансформуючого фактора росту альфа й HER2. У найбільш кращому варіанті здійснення винаходу комбінація маркерних генів включає: - маркерні гени трансформуючого фактора росту альфа й HER2, - маркерні гени трансформуючого фактора росту альфа й епідермального фактора росту, або - маркерні гени амфірегуліну, епідермального фактора росту, трансформуючого фактора росту альфа й HER2. В іншому найбільш кращому варіанті здійснення винаходу комбінація маркерних генів включає: - маркерні гени епідермального фактора росту й HER2, - маркерні гени амфірегуліну й епідермального фактора росту, - маркерні гени амфірегуліну й трансформуючого фактора росту альфа, - маркерні гени амфірегуліну й HER2, - маркерні гени амфірегуліну, епідермального фактора росту й трансформуючого фактора росту альфа, - маркерні гени амфірегуліну, епідермального фактора росту й HER2, - маркерні гени амфірегуліну, трансформуючого фактора росту альфа й HER2, або - маркерні гени епідермального фактора росту, трансформуючого фактора росту альфа й Her 2. У кращому варіанті здійснення винаходу рівень експресії маркерного гена або комбінації маркерних генів у зразку оцінюють шляхом визначення рівня експресії маркерного білка або його фрагмента, або комбінації маркерних білків або їхніх фрагментів, кодований х маркерним геном або комбінацією маркерних генів. Переважно рівень експресії маркерного білка або його фрагмента, або комбінації маркерних білків або їхніх фрагментів визначають за допомогою реагенту, що специфічно зв'язується з маркерним білком або його фрагментом, або комбінацією маркерних білків або їхніх фрагментів. Переважно реагент вибирають із групи, що включає антитіло, фрагмент антитіла або похідне антитіла. Існує багато різних типів імуноаналізів, які можна застосовувати в способі, пропонованому в даному винаході, наприклад, твердофазний іму 23 ноферментний аналіз (ELISA), імунофлуоресцентний аналіз (FIA), твердофазний імунохімічний аналіз (CLIA), радіоімунний аналіз (RIA) і імуноблоттинг. Огляд різних імуноаналізів, які можна застосовувати для розглянутої мети, наведений в: Bioanalytik, під ред. Lottspeich і Zorbas, 1-і изд., з Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, Germany, 1998. Крім того, ще в одному кращому варіанті здійснення винаходу рівень експресії визначають за допомогою методу, обраного із групи, що включає аналіз білка, проточну цитометрію, імуноцитохімію, імуногістохімію, твердофазний імуноферментний аналіз, багатоканальний твердофазний імуноферментний аналіз і варіанти цих методів. Більш переважно рівень експресії визначають за допомогою методу, обраного із групи, що включає аналіз білка, проточну цитометрію, імуноцитохімію, імуногістохімію, твердофазний імуноферментний аналіз, багатоканальний твердофазний імуноферментний аналіз і варіанти цих методів. В іншому кращому варіанті здійснення винаходу фрагмент маркерного білка являє собою позаклітинний домен маркерного білка Неr2. Переважно позаклітинний домен маркерного білка Неr2 має молекулярну масу приблизно 105000 Так. «Дальтон (Так)» позначає одиницю маси, рівну масі атома водню, що дорівнює 1,657х10-24 р. У наступному кращому варіанті здійснення винаходу - амінокислотною послідовністю маркерного білка, що представляє собою амфірегулін, є амінокислотна послідовність, представлена в SEQ ID NO:1, - амінокислотною послідовністю маркерного білка, що представляє собою епідермальний фактор росту, є амінокислотна послідовність, представлена в SEQ ID NO:2, - амінокислотною послідовністю маркерного білка, що представляє собою трансформуючий фактор росту альфа, є амінокислотна послідовність, представлена в SEQ ID NO:3, або - амінокислотною послідовністю маркерного білка, що представляє собою HER2, є амінокислотна послідовність, представлена в SEQ ID NO:4. В іншому кращому варіанті здійснення винаходу граничне значення в сироватці крові для - маркерного білка, що представляє собою трансформуючий фактор росту альфа, становить від 2,0 до 10,0, переважно від 2,0 до 5,0 пг/мол, більш переважно приблизно 3,5 пг/мол, - маркерного білка, що представляє собою епідермальний фактор росту, становить від 100 до 250 пг/мол, переважно приблизно 150 пг/мол, або - маркерного білка, що представляє собою амфірегулін, становить від 6 до 15 пг/мол, переважно приблизно 12 пг/мол. Ще в одному кращому варіанті здійснення винаходу граничне значення в сироватці крові для позаклітинного домена маркерного білка, що представляє собою Неr2, становить від 12 до 22нг/мол, переважно приблизно 18 нг/мол. У наступному кращому варіанті здійснення винаходу рівень експресії маркерного гена або комбінації маркерних генів у біологічному зразку оці 93989 24 нюють шляхом визначення рівня експресії транскрибованого маркерного полінуклеотиду, кодованого маркерним геном, або фрагмента транскрибованого маркерного полінуклеотиду, або транскрибованих маркерних полінуклеотидів, кодований х комбінацією маркерних генів, або фрагментів транскрибованих маркерного полінуклеотиду. Переважно транскрибований маркерний полінуклеотид являє собою кДНК, мРНК або hnPHK або траснкрибовані маркерні полінуклеотиди являють собою кДНК, мРНК або hnPHK. Переважно стадія виявлення додатково включає ампліфікацію транскрибованого полінуклеотиду. Ампліфікацію переважно здійснюють за допомогою полімеразної ланцюгової реакції, що дозволяє специфічно ампліфікувати нуклеїнові кислоти до кількостей, що виявляють. Іншими можливими реакціями ампліфікації є лігазна ланцюгова реакція (ЛЦР;Wu D. Y. і Wallace R.B., Genomics 4, 1989, сс. 560-569; і Barany F., Proc. Nail. Acad. Sci. USA 88, 1991, сс. 189-193); полімеразно-лігазна ланцюгова реакція (Barany F., PCR Methods і Applic. I, 1991, сс. 5-16); Gap-лцр (WO 90/01069); репаративная ланцюгова реакція (ЕР 0439182 А2), 3SR (Kwoh D.Y. і ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1989, сс. 1173-1177; Guatelli J.C. і ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1990, cc. 1874-1878; WO 92/08808), і NASBA (US 5130238). Крім того, можна застосовувати ампліфікацію із заміщенням ланцюга (SDA), опосередковувану транскрипцією ампліфікацію (ТМА), і Q-ампліфікацію (див., наприклад, огляд Whelen А.С. і Persing D.H., Annu. Rev. Microbiol. 50, 1996, сс. 349-373; Abramson R.D. і Myers T.W., Curr. Opin. Biotechnol. 4, 1993, cc. 4147). Більш переважно стадію виявлення здійснюють із використанням методу кількісної полімеразної ланцюгової реакції зі зворотною транскриптазою. Фахівцям у даній області відомі інші придатні методи виявлення полінуклеотидів, які описані в стандартних руководствах, таких як Sambrook J. і ін., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, з Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; і Ausubel F. і ін., Current Protocols in Molecular Biology, з J. Wiley and Sons, NY, 1987. Можна також застосовувати додаткові стадії очищення перед здійсненням стадії виявлення полінуклеотиду, такі, наприклад, як стадія осадження. Методи виявлення можуть включати (але, не обмежуючись ними) зв'язування зі специфічними барвниками (або їх інтеркаляцію), такими як етидію бромід, що інтеркалюють у двохланцюгові полінуклеотиди, що після цього приводить до зміни їхньої флуоресценції. Очищений полінуклеотид можна виділяти також електрофоретичними методами необов'язково після розщеплення рестриктазами й наступної візуалізації. Існують також засновані на застосуванні зондів методи аналізу, у яких використовується гібридизація олигонуклеотидів зі специфічними послідовностями й наступне виявлення гібрида. Після здійснення додаткових стадій, відомих фахівцеві в даній області, можна також секвенувати ДНК. Переважно в якості залежної від матриці ДНК-полімерази застосовують полімеразу Taq. 25 Ще в одному кращому варіанті здійснення винаходу рівень експресії маркерного гена оцінюють шляхом виявлення присутності в зразку транскрибованого маркерного полінуклеотиду або його фрагмента за допомогою зонда, що гібридизується із транскрибованим маркерним полінуклеотидом або його фрагментом у строгих умовах гібридизації, або рівень експресії комбінації маркерних генів у зразках оцінюють шляхом виявлення присутності в зразку транскрибованих маркерних полінуклеотидів або їхніх фрагментів за допомогою зондів, які гибридизуются із транскрибованими маркерними полінуклеотидами або їхніми фрагментами в строгих умовах гібридизації. Цей метод можна здійснювати в гомогенній системі аналізу. «Гомогенна» система аналізу являє собою, наприклад, систему TaqMan®, що докладно описана в US 5210015, US 5804375 і US 5487972. У цілому метод заснований на використанні зонда з подвійною міткою й 5'>3'-ендонуклеазною активності ДНК-полімерази Taq. Зонд є комплементарним послідовності-мішені, призначеної для ампліфікації за допомогою ПЦР, і розташовується між двома ПЦР-праймерами під час кожного циклу стадії полімеризації. Зонд несе дві пов'язані з ним флуоресцентні мітки. Одна з них являє собою репортерний барвник, такий як 6-карбоксифлуоресцеїн (FAM), спектр випущення якого гаситься в результаті переносу енергії, обумовленого просторовою близькістю до другого флуоресцентного барвника, 6-карбокситетраметилродаміну (TAMRA). На кожному циклі ампліфікації ДНК-полімераза Taq у процесі подовження приміюваним ланцюгом ДНК заміщає й розщеплює ренатурований зонд, останнє відбувається внаслідок властивої полімеразі 5'>3'-ендонуклеазної активності. Цей механізм приводить також до звільнення репортерного барвника від дії активності, що гасить, TAMRA. У результаті цього флуоресцентна активність зростає в міру збільшення ступеня розщеплення зонда, що пропорційна кількості ПЦР-продукта, що утворився. Таким чином, ампліфіковану послідовністьмішень оцінюють шляхом виявлення інтенсивності флуоресцентної мітки, що вивільняє. Іншим прикладом «гомогенних» систем аналізу є формати, використовувані в пристрої типу LightCycler (див., наприклад, US 6174670), деякі з яких іноді називають форматами «зонда, що цілує». І в цьому випадку також принцип дії заснований на використанні двох взаємодіючих барвників, які, однак, відрізняються тим, що емісія світла з довжиною хвилі барвника-донора збуджує барвник-акцептор у результаті резонансного переносу флуоресцентної енергії. Останнім часом почали застосовувати пристрій типу COBAS® AmpliPrep (фірма Roche Diagnostics Gmb, D-68305 Маннгейм, Німеччина) для підвищення автоматизації шляхом виділення послідовностей-мішеней з використанням біотинильованих захоплюючих зондів, специфічних відносно послідовності, поряд із сенсибілізованими стрептавидином магнітними частками (Jungkind D., J. Clin. Virol. 20, 2001, сс. 1-6; Stelzl Е. і ін., J. Clin. Microbiol. 40, 2002, сс. 1447-1450). Пізніше він був об'єднаний з додатковим багатофункціональним інструментом, а саме, з набором для виділення 93989 26 всієї нуклеїнової кислоти (TNAI) (фірма Roche Diagnostics). Цей призначений для лабораторного застосування реагент дозволяє здійснювати загальне неспецифічне відносно послідовності виділення всіх нуклеїнових кислот із плазми й сироватки за допомогою пристрою COBAS® AmpliPrep на основі практично такого ж методу, що був розроблений Boom R. і ін., J. Clin. Microbiol. 28, 1990, сс. 495-503. В іншому кращому варіанті здійснення винаходу нуклеотидною послідовністю маркерного полінуклеотиду амфірегуліну є нуклеотидна послідовність, представлена в SEQ ID NO:5, - нуклеотидною послідовністю маркерного полінуклеотиду епідермального фактора росту є нуклеотидна послідовність, представлена в SEQ ID NО:6, - нуклеотидною послідовністю маркерного полінуклеотиду трансформуючого фактора росту альфа є нуклеотидна послідовність, представлена в SEQ ID NО:7, або - нуклеотидною послідовністю маркерного полінуклеотиду HER2 є нуклеотидна послідовність, представлена в SEQ ID NО:8. В іншому варіанті здійснення винаходу зонд, що гібридизується в строгих умовах з маркерним полінуклеотидом епідермального фактора росту, трансформуючого фактора росту альфа або HER2, або антитіло, що зв'язується з маркерним білком, що представляє собою епідермальний фактор росту, трансформуючий фактор росту альфа або HER2, застосовують для прогнозування відповіді на лікування інгібітором димеризації HER у пацієнта, або зонд, що гібридизується в строгих умовах з маркерним полінуклеотидом амфірегуліну, епідермального фактора росту, трансформуючого фактора росту альфа або HER2, або антитіло, що зв'язується з маркерним білком, що представляє собою амфірегулін, епідермальний фактор росту, трансформуючий фактор росту альфа або HER2, застосовують для відбору композиції, призначеної для інгібування прогресування захворювання в пацієнта. Захворювання переважно являє собою рак, і пацієнт переважно являє собою страждаючим раком пацієнта, як описано вище. Іншим варіантом здійснення винаходу є набір, що містить зонд, що гібридизується в строгих умовах з маркерним полінуклеотидом амфірегуліну, епідермального фактора росту, трансформуючого фактора росту альфа або HER2, або антитіло, що зв'язується з маркерним білком, що представляє собою амфірегулін, епідермальний фактор росту, трансформуючий фактор росту альфа або HER2. Такі набори, відомі в даній області, включають також пластмасові пристрої, які можна застосовувати в процесі процедури ампліфікації, такі, наприклад, як титраційні мікропланшети 96- або 384ямкового формату або навіть звичайні лабораторні пробірки, вироблені, наприклад, фірмою Eppendorf, Гамбург, Німеччина, і всі інші реагенти для здійснення способу, пропонованого у винаході, переважно імуноаналізу, наприклад, твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA), імунофлуоресцентного аналізу (FIA), твердофазного 27 імунохимического аналізу (CLIA), радіоімунного аналізу (RIA) і імуноблоттинга. Огляд різних імуноаналізів і реагентів, які можна застосовувати для розглянутої мети, наведений в: Bioanalytik, під ред. Lottspeich і Zorbas, 1-і изд., з Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, Germany, 1998. Переважно комбінації зондів або антитіл до різним маркерних полінуклеотидам або маркерним білкам поставляють у формі набору, як описано вище для кращих комбінацій маркерних полінуклеотидів або маркерних білків. В іншому варіанті здійснення винаходу запропонований спосіб відбору композиції, призначеної для інгібування прогресування захворювання в пацієнта, що полягає в тому, що: а) піддають окремо аліквоти біологічного зразка, узятого з організму страждаючим раком пацієнта, впливу ряду тестованих композицій; б) порівнюють рівень експресії маркерного гена або комбінації маркерних генів, вибраних із групи, що включає маркерні гени амфірегуліну, епідермального фактора росту, трансформуючого фактора росту альфа й HER2, в аліквотах біологічного зразка, наведених у контакт із тестованими композиціями, і рівень експресії маркерного гена або комбінації маркерних генів, вибраних із групи, що включає маркерні гени амфірегуліну, епідермального фактора росту, трансформуючого фактора росту альфа й HER2, в аліквотах біологічного зразка, не наведених у контакт із тестованими композиціями, в) відбирають одну з тестованих композицій, що змінює рівень експресії маркерного гена або комбінації маркерних генів в аліквоті, що містить тестовану композицію, у порівнянні з аліквотою, не введеної в контакт із тестованої композицією, де критерієм для відбору тестованої композиції є наявність достовірної або щонайменше 10%-ний різниці між рівнем експресії маркерного гена або комбінації маркерних генів в аліквоті біологічного зразка, введеної в контакт із тестованої композиції, і рівнем експресії відповідного маркерного гена або комбінації маркерних генів в аліквоті біологічного зразка, не введеної в контакт із тестованої композиції. Захворювання переважно являє собою рак, і пацієнт переважно являє собою страждаючим раком пацієнта. Наступним варіантом здійснення винаходу є спосіб відбору композиції, призначеної для інгібування прогресування захворювання в пацієнта, що полягає в тому, що: а) аліквоти біологічного зразка, узятого з організму страждаючим раком пацієнта, піддають окремо впливу декількох тестованих композицій; б) порівнюють рівень експресії - маркерного гена або комбінації маркерних генів, вибраних із групи, що включає маркерні гени епідермального фактора росту, трансформуючого фактора росту альфа й HER2, або - комбінації маркерних генів, що включає маркерний ген амфірегуліну й маркерний ген, вибраний із групи, що включає маркерні гени епідермального фактора росту, трансформуючого фактора росту альфа й HER2 93989 28 в аліквотах біологічного зразка, наведених у контакт із тестованими композиціями, і рівень експресії - маркерного гена або комбінації маркерних генів, вибраних із групи, що включає маркерні гени епідермального фактора росту, трансформуючого фактора росту альфа й HER2, або - комбінації маркерних генів, що включає маркерний ген амфірегуліну й маркерний ген, вибраний із групи, що включає маркерні гени епідермального фактора росту, трансформуючого фактора росту альфа й HER2 в аліквотах біологічного зразка, не наведених у контакт із тестованими композиціями, в) відбирають одну з тестованих композицій, що змінює рівень експресії маркерного гена або комбінації маркерних генів в аліквоті, що містить тестовану композицію, у порівнянні з аліквотою, не введеної в контакт із тестованої композицією, де критерієм для відбору тестованої композиції є наявність достовірної або щонайменше 10%-ний різниці між рівнем експресії маркерного гена або комбінації маркерних генів в аліквоті біологічного зразка, введеної в контакт із тестованої композицією, і рівнем експресії відповідного маркерного гена або комбінації маркерних генів в аліквоті біологічного зразка, не введеної в контакт із тестованої композиції. Захворювання переважно являє собою рак, і пацієнт переважно являє собою страждаючим раком пацієнта. Рівень експресії маркерного гена «вірогідно» відрізняється від рівня експресії маркерного гена в зразку, з яким виробляється порівняння, якщо рівень експресії в зразку, узятому з організму пацієнта, відрізняється від рівня експресії в зразку, узятому з організму індивідуума, з яким виробляється порівняння, на величину, що перевищує стандартну погрішність методу аналізу, застосовуваного для оцінки рівня експресії, і переважно перевищуючу щонайменше на 10%, і більш переважно на 25%, 50%, 75%, 100%, 125%, 150%. 175%. 200%, 300%, 400%, 500% або 1000% цю величину. В альтернативному варіанті можна вважати, що рівень експресії маркерного гена в пацієнта «вірогідно» нижче рівня експресії в контрольного індивідуума, якщо рівень експресії в зразку, узятому з організму пацієнта, менше рівня експресії в зразку, узятому з організму контрольного індивідуума, на величину, що перевищує стандартну помилку методу аналізу, застосовуваного для оцінки рівня експресії, і переважно перевищуючу щонайменше на 10%, і більш переважно на 25%, 50%, 75%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 300%, 400%, 500% або 1000% цю величину. Різниця між рівнями експресії може доходити аж до 10000 або 50000%. Переважно різниця між рівнями експресії становить від 10 до 10000%, більш переважно від 25 до 10000%, від 50 до 10000%, від 100 до 10000%, ще більш переважно від 25 до 5000%, від 50 до 5000%, від 100 до 5000%. Ще одним варіантом здійснення винаходу є спосіб виявлення (або ідентифікації) агентакандидата, що полягає в тому, що: а) приводять у контакт аліквоту біологічного зразка, узятого з організму страждаючим раком 29 пацієнта, з агентом-кандидатом і визначають рівень експресії маркерного гена або комбінації маркерних генів, вибраних із групи, що включає маркерні гени амфірегуліну, епідермального фактора росту, трансформуючого фактора росту альфа й HER2 в аліквоті, б) визначають рівень експресії відповідного маркерного гена або відповідної комбінації маркерних генів в аліквоті біологічного зразка, не введеної в контакт із агентом-кандидатом, в) оцінюють вплив агента-кандидата шляхом порівняння рівня експресії маркерного гена або комбінації маркерних генів в аліквоті біологічного зразка, введеної в контакт із агентом-кандидатом, і рівня експресії відповідного маркерного гена або відповідної комбінації маркерних генів в аліквоті біологічного зразка, не введеної в контакт із агентом-кандидатом, г) виявляють (або ідентифікують) агент на основі оцінки зазначеного впливу, де критерієм для оцінки впливу агента-кандидата є наявність щонайменше 10%-ний різниці між рівнем експресії маркерного гена або комбінації маркерних генів в аліквоті біологічного зразка, введеної в контакт із агентом-кандидатом, і рівнем експресії відповідного маркерного гена або комбінації маркерних генів в аліквоті біологічного зразка, не наведеного в контакт із агентом-кандидатом. Ще одним варіантом здійснення винаходу є спосіб виявлення агента-кандидата, що полягає в тому, що: а) приводять у контакт аліквоту біологічного зразка, узятого з організму страждаючим раком пацієнта, з агентом-кандидатом і визначають рівень експресії в аліквоті - маркерного гена або комбінації маркерних генів, вибраних із групи, що включає маркерні гени епідермального фактора росту, трансформуючого фактора росту альфа й HER2, або - комбінації маркерних генів, що включає маркерний ген амфірегуліну й маркерний ген, вибраний із групи, що включає маркерні гени епідермального фактора росту, трансформуючого фактора росту альфа й HER2, б) визначають рівень експресії відповідного маркерного гена або відповідної комбінації маркерних генів в аліквоті біологічного зразка, не введеної в контакт із агентом-кандидатом, в) оцінюють вплив агента-кандидата шляхом порівняння рівня експресії маркерного гена або комбінації маркерних генів в аліквоті біологічного зразка, введеної в контакт із агентом-кандидатом, і рівня експресії відповідного маркерного гена або відповідної комбінації маркерних генів в аліквоті біологічного зразка, не введеної в контакт із агентом-кандидатом, г) виявляють агент на основі оцінки зазначеного впливу, де критерієм для оцінки впливу агентакандидата є наявність щонайменше 10%-ної різниці між рівнем експресії маркерного гена або комбінації маркерних генів в аліквоті біологічного зразка, введеної в контакт із агентом-кандидатом, і рівнем експресії відповідного маркерного гена або комбінації маркерних генів в аліквоті біологічного 93989 30 зразка, не наведеного в контакт із агентомкандидатом. Переважно агент-кандидат являє собою інгібуючий агент-кандидат. Переважно агенткандидат являє собою посилюючий агенткандидат. Наступним варіантом здійснення винаходу є агент-кандидат, виявлений способом, пропонованим у винаході. Іншим варіантом здійснення винаходу є фармацевтична композиція, що містить агент, пропонований у винаході. Ще одним варіантом здійснення винаходу є застосування агента, пропонованого у винаході, для готування композиції, призначеної для лікування раку. Кращі типи раку описані вище. Іншим кращим варіантом здійснення винаходу є спосіб одержання лікарського засобу, що полягає в тому, що здійснюють стадії способу, пропонованого у винаході, і I) синтезують агент-кандидат, ідентифікований на стадії в), або його аналог або похідне в кількості, достатньому для того, щоб можна було ввести лікарський засіб у терапевтично ефективній кількості пацієнтові; і/або II) поєднують призначений для лікарського засобу-кандидата агент-кандидат, ідентифікований на стадії в), або його аналог або похідне з фармацевтично прийнятним носієм. У наступному варіанті здійснення винаходу маркерний білок або маркерний полінуклеотид, вибраний із групи, що включають маркерні білки або маркерні полінуклеотиди амфірегуліну, епідермального фактора росту, трансформуючого фактора росту альфа й HER2, застосовують для виявлення агента-кандидата або для відбору композиції, призначеної для інгібування прогресування захворювання в пацієнта. Захворювання переважно являє собою рак, і пацієнт переважно являє собою страждаючого раком пацієнта, як описано вище. Ще в одному варіанті здійснення винаходу інгібітор димеризації HER застосовують для готування лікарського засобу, призначеного для лікування страждаючої раком людини, що відрізняється тим, що лікування й процедура лікування включають оцінку в біологічному зразку, узятому з організму пацієнта, - маркерного гена або комбінації маркерних генів, вибраних із групи, що включає маркерні гени епідермального фактора росту, трансформуючого фактора росту альфа й HER2, або - комбінації маркерних генів, що включає маркерний ген амфірегуліну й маркерний ген, вибраний із групи, що включає маркерні гени епідермального фактора росту, трансформуючого фактора росту альфа й HER2. Готування лікарського засобу, призначеного для лікування страждаючим раком людини, і насамперед його склад, описані в WO 01/00245, включеної в даний опис як посилання, насамперед у частини, що стосується антитіла 2С4. У кращому варіанті здійснення винаходу при застосуванні інгібітору димеризації HER для готування лікарського засобу, призначеного для ліку 31 вання страждаючої раком людини, лікування включає здійснення один раз або кілька разів у процесі лікування оцінки маркерного гена або комбінації маркерних генів. Переважно оцінюють рівень експресії маркерного гена або рівень експресії комбінації маркерних генів. Переважно інгібітор димеризації HER являє собою антитіло, краще антитіло 2С4. Переважно пацієнт являє собою пацієнта, що страждає на рак молочної залози, раком яєчника, раком легені або раком передміхурової залози. У всіх варіантах здійснення винаходу застосовують, як описано вище комбінації маркерних генів, маркерних полінуклеотидів або маркерних білків. У всіх варіантах здійснення винаходу кращими значеннями для різниці в рівнях експресії, які визначають на відповідних стадіях, також є зазначені вище значення. Наведені нижче приклади, перелік послідовностей і креслення дані для більшого розуміння даного винаходу, справжній об'єм якого втримується в прикладеній формулі винаходу. Очевидно, що в описані процедури можна модифікувати без відхилення від сутності винаходу. Опис креслень На кресленнях показані: на фіг. 1 - графік розкиду залежності розподіленого по категоріях сприятливої клінічної дії від концентрації TGF-альфа в логарифмічному масштабі; на фіг. 2 - графік розкиду залежності розподіленої по категоріях сприятливої клінічної дії від концентрації амфірегуліну в логарифмічному масштабі; на фіг. 3 - сприятлива клінічна дія (у порядку зростання) TGF-альфа; на фіг. 4 - сприятлива клінічна дія (у порядку зростання) амфірегуліну; на фіг. 5 - сприятлива клінічна дія (у порядку зростання) EGF; на фіг. 6 - сприятлива клінічна дія (у порядку зростання) HER2-ECD; на фіг. 7 - зведення отриманих у дослідженні граничних значень і логарифмічних рангових значень р для ТТР і TTD для амфірегуліну, EGF, TGFальфа, HER2-ECD; на фіг. 8 - графік Каплана-Мейера періоду часу до прогресування захворювання/настання смерті, заснований на використанні отриманого в дослідженні граничного значення одного маркера, що представляє собою TGF-альфа; на фіг. 9 - графік Каплана-Мейера періоду часу до настання смерті, заснований на використанні отриманого в дослідженні граничного значення одного маркера, що представляє собою TGFальфа; на фіг. 10 - графік Каплана-Мейера періоду часу до настання смерті, заснований на використанні отриманого в дослідженні граничного значення одного маркера, що представляє собою амфірегулін; на фіг. 11 - графік Каплана-Мейера періоду часу до настання смерті, заснований на використанні отриманого в дослідженні граничного значення одного маркера, що представляє собою амфірегулін; 93989 32 на фіг. 12 - графік Каплана-Мейера періоду часу до настання смерті, заснований на використанні отриманого в дослідженні граничного значення одного маркера, що представляє собою EGF; на фіг. 13 - графік Каплана-Мейера періоду часу до настання смерті, заснований на використанні отриманого в дослідженні граничного значення одного маркера, що представляє собою EGF; на фіг. 14 - графік Каплана-Мейера періоду часу до настання смерті, заснований на використанні отриманого в дослідженні граничного значення одного маркера, що представляє собою HER2-ECD; на фіг. 15 - графік Каплана-Мейера періоду часу до настання смерті, заснований на використанні отриманого в дослідженні граничного значення одного маркера, що представляє собою HER2-ECD; на фіг. 16 - приклад використання комбінації балів, що дозволяє додатково поліпшувати поділ на групи з більшою сприятливою клінічною дією/меншою сприятливою клінічною дією у відношенні ТТР: сприятлива клінічна дія (у порядку зростання) комбінації HER2-ECD і TGF альфа; на фіг. 17: - зведення отриманих у дослідженні граничних значень і логарифмічних рангових значень р для ТТР і TTD для комбінації TGF-альфа й HER2-ECD; на фіг. 18 - графік Каплана-Мейера періоду часу до прогресування захворювання/настання смерті, заснований на використанні отриманих у дослідженні граничних значень комбінації маркерів НЕR2-ЕСD/ТGF-альфа; на фіг. 19 - графік Каплана-Мейера періоду часу до настання смерті, заснований на використанні отриманих у дослідженні граничних значень комбінації маркерів НЕR2-ЕСD/ТGF-альфа; Приклади Загальні зауваження, що стосуються прогностичних правил: Загальна форма прогностичного правила являє собою визначення функції одного або декількох біомаркерів, що потенційно включає клінічні коваріанти, призначені для прогнозування відповіді або відсутності відповіді, або в більше загальному випадку прогнозування сприятливого впливу або відсутності сприятливого впливу в термінах відповідним чином певних клінічних кінцевих результатів. Найбільш простою формою прогностичного правила є одноваріантна модель без обліку коваріант, за допомогою якої прогнозування здійснюють із використанням граничного або граничного значення. Цю модель можна представити в термінах функції Хевисайда для конкретного граничного значення с і обмірюваного в експерименті рівня біомаркера х, коли потрібно зробити подвійне прогнозування А або В, у цьому випадку: якщо Н(х - с) = 0, то передвіщається А якщо Н(х - с) = 1, то передвіщається В. Це являє собою найбільш простий шлях використання одноваріантних вимірів рівня біомаркера в прогностичних правилах. Якщо таке просте пра 33 вило є достатнім, то воно дозволяє здійснювати просту ідентифікацію напрямку впливу, тобто які рівні експресії, високі або низькі, є сприятливими для пацієнта. Ситуація може бути більше складною в тому випадку, якщо потрібно враховувати клінічні коваріанти, і/або якщо в різноманітних прогностичних правилах використовують декілька біомаркерів. Для ілюстрації цього нижче наведені два гіпотетичних приклади: Коваріантне коректування (гіпотетичний приклад): У клінічному досліді для популяції пацієнтів установлено, що високі рівні експресії біомаркера X асоціюються з поганим прогнозом (одноваріантний аналіз). Більш ретельний аналіз показав, що в пацієнтів у популяції присутні два типи пухлин, один із яких пов'язаний з більше поганим прогнозом, чим інший, і в той же час експресія біомаркера для цієї групи пухлин, як правило, є більше високою. Скорегований коваріантний аналіз дозволив установити, що для кожного типу пухлини зв'язок між клінічно сприятливою дією й прогнозом варто змінити на протилежну, тобто для кожного з типів пухлин окремо більше низькі рівні експресії асоціюються із кращим прогнозом. Отриманий загальний протилежний ефект маскувався коваріантним типом пухлини й коваріантний скоректований аналіз, що є складовою частиною прогностичного правила, привів до зміни напрямку на протилежне. Різноманітне прогнозування (гіпотетичний приклад): У клінічному досвіді для популяції пацієнтів установлено, що високі рівні експресії біомаркера X слабко асоціюються з поганим прогнозом (одноваріантний аналіз). Для другого біомаркера Y з використанням одноваріантного аналізу був зроблений такий же висновок. Використання комбінації X і Y дозволило встановити, що гарний прогноз має місце в тому випадку, коли рівні обох біомаркерів є низькими. У цьому випадку правило пророкує сприятливу дію в тому випадку, коли рівні обох біомаркерів перебувають нижче певних граничних значень («AND»-зв’язок у прогностичній функції Хевисайда). Для комбінованого правила не існує простого правила, яке можна було б сформулювати в одноваріантному змісті. Наприклад, присутність більше низьких рівнів експресії X не приводить автоматично до більш сприятливого прогнозу. Ці прості приклади показують, що прогностичні правила з урахуванням і без обліку коваріант не можна використати на одноваріантному рівні кожного біомаркера. Комбінація декількох біомаркерів плюс можливе коректування з використанням коваріант не дозволяє встановлювати прості співвідношення відносно окремих біомаркерів. Статистичні методи Статистичні аналізи включають здійснення наступних стадій: 1. попередній відбір біомаркерів-кандидатів; 2. попередній відбір стосовних до розглянутого питання клінічних прогностичних коваріант; 93989 34 3. відбір біомаркерних прогностичних функцій на одноваріантному рівні; 4. відбір біомаркерних прогностичних функцій, що включають клінічні коваріанти, на одноваріантному рівні; 5. відбір біомаркерних прогностичних функцій на різноманітному рівні; 6. відбір біомаркерних прогностичних функцій, що включають клінічні коваріанти, на різноманітному рівні. Нижче наведено більше докладний опис різних стадій: 1. Попередній відбір біомаркерів-кандидатів: Статистичний попередній відбір біомаркерівкандидатів орієнтований на ступінь їхньої кореляції з оцінками клінічно сприятливої дії. Для цієї мети різні клінічні кінцеві результати можна трансформувати в розраховані сурогатні бали, такі, наприклад, як упорядкована (ранжирувана) оцінка величини клінічно сприятливої дії або бали захворюваності, що стосуються ТТР або TTD, у яких не враховуються результати контрольних обстежень. Такі сурогатні трансформовані оцінки легко можна використати для простого кореляційного аналізу, наприклад, за допомогою непараметричного рангового кореляційного підходу Спирмана. Альтернативним підходом у цьому випадку є використання результатів вимірів рівнів біомаркерів у вигляді метричних коваріант у регресійних моделях типу «проміжок часу до події», таких, наприклад, як регресійна модель пропорційного ризику Коксу (Сох). Залежно від статистичного розподілу величин рівнів біомаркерів для цієї стадії може вимагатися певна попередня обробка, така, наприклад, як стабілізуючу дисперсію трансформації, і використання зручних шкал, або в альтернативному варіанті стадія стандартизації, така, наприклад, як використання процентилей замість вихідних (нескоректованих) результатів вимірів. Інший підхід полягає в аналізі двохваріантних графіків розкиду, наприклад, що представляють собою графік розкиду (по х-осі відкладають рівень біомаркера, по у-осі відкладають оцінку клінічно сприятливої дії) для одного пацієнта. Для більше наочного подання кореляції між рівнем біомаркера й клінічно сприятливою дією можна використати також деякі непараметричні регресійні криві, такі, наприклад, як криві, одержувані за допомогою сплайнов, що згладжують. Ціль цих різних підходів полягає в попередньому відборі біомаркерів-кандидатів, для яких є певна кореляція із клінічно сприятливою дією у відношенні щонайменше одного з використовуваних оцінюваних параметрів сприятливої дії, причому результати оцінок інших параметрів не повинні бути суперечливими. Якщо є можливість використання контрольних груп, то розходження в кореляції біомаркерів із клінічно сприятливою дією для різних груп можуть бути ознакою різного прогнозування, це свідчить про те, що біомаркер придатний для подальшого розгляду. 2. Попередній відбір стосовних до розглянутого питання клінічних прогностичних коваріант: У контексті даного опису поняття «клінічна коваріанта» використовують для позначення будь-якої ін 35 шої клінічної інформації про пацієнта, що, як правило, одержують на вихідному рівні. Ці клінічні коваріанти являють собою демографічну інформацію, таку як пол, вік і т.д., іншу анамнестичну інформацію, що супроводжують захворювання, що супроводжують методи лікування, результат об'єктивного обстеження, загальні отримані в лабораторних умовах параметри, відомі властивості пухлини-мішені, інформацію про кількісну оцінку ступеня злоякісного захворювання, клінічні бали оцінки працездатності типу ECOG або індексу Карновскі, клінічну стадію захворювання, графік і результат попередніх обробок і історію хвороби, а також будь-яку аналогічну інформацію, що може мати відношення до клінічного прогнозу. Статистичний попередній відбір клінічних коваріант проводять паралельно з попереднім відбором біомаркерів, і він також орієнтований на ступінь кореляції з оцінками клінічно сприятливої дії. Таким чином, можна застосовувати ті ж самі методи, які описані в п. 1. Комі того, для попереднього відбору стосовних до розглянутого питання клінічних прогностичних коваріант на додаток до статистичних критеріїв можна використати також критерії, засновані на клінічному досвіді, і теоретичні відомості. Прогноз на основі клінічних коваріант може впливати на прогноз на основі біомаркерів. Їх (коваріанти) при необхідності варто враховувати для уточнення прогностичних правил. 3. Відбір біомаркерних прогностичних функцій на одноваріантному рівні: Поняття «прогностична функція» використовується в загальному значенні для позначення чисельної функції результатів вимірів рівня біомаркера, що дозволяє одержувати число, що зводять до певного масштабу для одержання необхідного прогнозування. Простим прикладом є вибір функції Хевисайда для конкретного граничного значення с і обмірюваного в експерименті рівня біомаркера х, коли потрібно зробити подвійне прогнозування А або В, у цьому випадку: якщо Н(х - с) = 0, то передвіщається А якщо Н(х - с) = 1, то передвіщається В. Це являє собою, очевидно, найбільш загальний шлях використання одноваріантних вимірів рівня біомаркера в прогностичних правилах. Визначення прогностичної функції, як правило, здійснюють із повторюваним використанням наявного в розпорядженні набору даних для настроювання, якому можна застосовувати для дослідження можливостей прогнозування. Одержання придатного граничного значення с з використанням набору для настроювання можна здійснювати різними шляхами. По-перше, для визначення граничного значення можна використати зазначений у п. 1 графік розкиду із що згладжує сплайном. В альтернативному варіанті можна вибирати певні проценти розподілу, наприклад, медіану або квартиль. Граничні значення можна також систематично виключати при дослідженні всіх можливих граничних значень залежно від їхнього потенціалу прогнозування відносно оцінок клінічно сприятливої дії. Далі, отримані результати можна представляти графічно для відбору або вручну, або з використанням певного оптимального алгоритму пошуку. 93989 36 Цей підхід був реалізований з використанням як кінцеві результати ТТР і TTD за допомогою моделі Коксу, у якій для кожного тестованого граничного значення використали біомаркер у вигляді подвійної коваріанти. Критеріями прогнозування були отримані в результаті цього співвідношення ризику. Потім результати оцінки ТТР і TTD можна розглядати спільно для вибору граничного значення, що дозволяє одержувати прогнозування, що погодиться з обома кінцевими результатами. Інший нестандартний підхід до вибору прогностичної функції може бути заснований на регресійній моделі Коксу з фіксованими параметрами, що одержують на основі набору для настроювання з використанням величин рівнів біомаркера (можливо трансформованих) у якості коваріант. У цьому випадку прогнозування може залежати просто від того, менше або більше 1 розраховане співвідношення ризику. Інша можливість полягає в тому, щоб рішення було засновано на певнім відношенні правдоподібності (або його монотонній трансформованій формі), де щільності ймовірності - мішені заздалегідь визначені в наборі даних для настроювання для поділу передвіщених станів. У цьому випадку біомаркер повинен бути включений у певну функцію коефіцієнтів щільності. 4. Відбір біомаркерних прогностичних функцій, що включають клінічні коваріанти, на одноваріантному рівні: «Одноваріантний» у цьому випадку відноситься до використання тільки одного біомаркера, при цьому у відношенні клінічних коваріант така модель може бути різноманітною моделлю. Цей підхід аналогічний пошуку без обліку клінічних коваріант за винятком того, що в цьому випадку методи повинні дозволяти включати стосовну до розглянутого питання пов'язану з коваріантами інформацію. Метод вибору граничного значення на основі графіка розкиду допускає тільки обмежене застосування коваріант, наприклад, подвійна коваріанта повинна кодуватися на графіку іншими кольорами. Якщо аналіз заснований на певному регресійному підході, то це, як правило, полегшує використання коваріант (також і у випадку одночасного застосування декількох з них). Пошук граничного значення на основі моделі Коксу, описаної в п. 3, дозволяє легко включати коваріанти й тим самим приводить до методу пошуку одноваріантного граничного значення з урахуванням коваріант. Облік коваріант можна здійснювати шляхом введення коваріант у модель або шляхом включення в стратифікований аналіз. Інші підходи до вибору прогностичних функцій також дозволяють ураховувати коваріанти. Вибір моделі Коксу як прогностична функція є очевидним. Існує варіант, у якому оцінюють вплив коваріант на інтерактивному рівні, що означає, наприклад, що для різних вікових груп використовують різні коефіцієнти ризику. Для типу прогностичних функцій, заснованих на відношенні правдоподібності, щільності прогнозування повинні бути визначені з урахуванням коваріант. У цьому випадку можна застосовувати методологію різноманітної схеми розпізнавання або величини рівнів біомаркера можна коректува 37 ти за допомогою множинної регресії на коваріантах (до визначення щільності). Технологію CART (Класифікаційні й регресійні дерева (Classification and Regression Trees); Breiman L., Friedman J.H., Olshen R.A., Stone C.J., з Chapman & Hall (Wadsworth, Inc.), New York, 1984) можна застосовувати для біомаркера (рівень вихідних (нескоректованих) обмірюваних даних) плюс клінічний коваріант із використанням оцінки клінічної сприятливої дії як відповідь. Таким шляхом здійснюють пошук граничних значень і можна визначати прогностичні функції типу дерева прийняття рішень із урахуванням коваріант. Граничні значення й алгоритми, обрані за допомогою CART, часто виявляються близькими до оптимального і їх можна поєднувати й уніфікувати шляхом розгляду різних оцінок клінічно сприятливої дії. 5. Відбір біомаркерних прогностичних функцій на різноманітному рівні: Коли є декілька біомаркерів-кандидатів, які мають свій потенціал прогнозування при різних вибраних одноваріантних прогностичних функціях, то можна досягати подальшого поліпшення шляхом використання комбінацій біомаркерів, тобто шляхом розгляду різноманітних прогностичних функцій. На основі простої моделі з використанням функції Хевисайда можна оцінювати комбінації біомаркерів, наприклад, шляхом аналізу біваріантних графіків розкиду величин рівнів біомаркерів, на якому зазначені оптимальні граничні значення. Потім для досягнення поліпшеного прогнозування можна визначати комбінацію біомаркерів шляхом об'єднання різних функцій Хевисайда з використанням логічних операторів «AND» і «OR». Метод CART можна застосовувати з використанням декількох біомаркерів (рівень вихідних обмірюваних даних) і оцінки клінічно сприятливої дії як відповідь для одержання граничних значень рівнів біомаркерів і прогностичних функцій типу дерева прийняття рішень. Граничні значення й алгоритми, обрані за допомогою CART, часто виявляються близькими до оптимального і їх можна поєднувати й уніфікувати шляхом розгляду різних оцінок клінічно сприятливої дії. Регресійний метод Коксу можна застосовувати на різних рівнях. Перший шлях являє собою включення декількох біомаркерів «двійковим» образом (тобто на основі функцій Хевисайда з певними 93989 38 граничними значеннями). Інший варіант полягає в застосуванні біомаркерів «метричним» шляхом (після відповідних трансформацій) або шляхом об'єднання «двійкового» і «метричного» підходів. Отримана в результаті різноманітна прогностична функція являє собою функцію типу функції Коксу, описану в п. 3. Реалізація різноманітного підходу на основі відношення правдоподібності є скрутною, однак цей підхід також дозволяє створювати варіанти різноманітних функцій, що прогнозують. 6. Відбір біомаркерних прогностичних функцій, що включають клінічні коваріанти, на різноманітному рівні: Коли існують стосовні до розглянутого питання клінічні коваріанти, то можна домогтися подальшого поліпшення прогнозування шляхом об'єднання декількох біомаркерів з декількома клінічними коваріантами. Варто оцінювати різні обрані прогностичні функції з погляду можливості обліку клінічних коваріант. У прогностичну функцію на основі логарифмічної регресійної моделі, отриманої з використанням набору даних для настроювання можна включати додаткові коваріанти з використанням логічних комбінацій функцій Хевисайда. Метод CART і еволюційні дерева прийняття рішень можна легко застосовувати в сполученні з додатковими коваріантами, які повинні бути включені в алгоритм прогнозування. У всіх прогностичних функціях на основі регресійного методу Коксу можна використати додаткові клінічні коваріанти. Існує варіант, у якому оцінюють вплив коваріант на інтерактивному рівні, що означає, наприклад, що для різних вікових груп використовують різні коефіцієнти ризику. Різноманітний підхід з використанням відношення правдоподібності не може бути безпосередньо розповсюджений на випадок обліку додаткових коваріант. Приклад 1 У вихідній сироватці крові, узятої з організму пацієнтів, що страждають метастатичним раком молочної залози з низьким рівнем експресії HER2, яких лікували пертузумабом, оцінювали рівні лігандов HER і виділився в середовище HER2 (HER2 ECD) відповідно до описаного нижче методу. Для оцінки рівня біомаркерів у сироватці використали наступні набори: 39 Протоколи: HER2-ECD: ELISA HER2-ECD здійснювали відповідно до рекомендацій виробника. Амфірегулін: - Наготовлюють всі реагенти (входять до складу набору), стандартні розведення (входять до складу набору) і зразки; - Вносять рівномірно сенсибілізовані козячим антитілом до мишачого Ig смужки для титраційного мікропланшета (фірма R&D, каталожний номер СР002; не входять до складу набору) у форму. Далі форму позначають як планшет для ELISA. - Визначають необхідну кількість лунок (кількість стандартних розведень + кількість зразків). - Визначають план планшета. - У кожну лунку додають по 100 мкл розведеного призначеного для захоплення антитіла (входить до складу набору; 1:180 у ЗФР). - Інкубують при КТ протягом 1 год. - Видаляють рідину з кожної лунки шляхом аспірації й здійснюють відмивання, повторюють цей процес ще три рази, здійснюючи в цілому чотири відмивання. Відмивання здійснюють шляхом заповнення кожної лунки 400 мкл буферу для відмивання (не входить до складу набору; застосовують 0,05% Твін-20 у ЗФР) за допомогою розподільної гребінки й наступного видалення рідини шляхом аспірації. Після останнього відмивання видаляють весь буфер, що залишився, для відмивання шляхом аспірації. Перевертають планшет і промокають чистими паперовими рушниками. - Додають у кожну лунку по 100 мкл стандартного розведення або розведеного зразка (див. 93989 40 нижче). Після кожної стадії пипетування насадок заміняють. - Покривають планшет адгезивною смужкою (входить до складу набору). - Інкубують протягом 2 год при КТ на хитній платформі. - Повторюють описану вище процедуру аспірації/відмивання. - Аспировані зразки й розчини для відмивання обробляють лабораторним дезінфікуючим засобом. - Додають у кожну лунку по 100 мкл ідентифікуючого антитіла (входить до складу набору), розведеного в співвідношенні 1:180 у розріджувачі для реагенту (не входить до складу набору; використовують 1% БСА (фірма Roth; фракція альбуміну V, каталожний номер Т844.2) у ЗФР). - Інкубують протягом 2 год при КТ. - Повторюють описану вище процедуру аспірації/відмивання. - Додають у кожну лунку по 100 мкл робітника розведення кон'югату стрептавидин-HRP (входить до складу набору; розведення 1:200 у розріджувачі для реагенту). Покривають новою адгезивною смужкою. - Інкубують протягом 20 хв при КТ. - Повторюють описану вище процедуру аспірації/відмивання. - Додають у кожну лунку по 100 мкл розчину субстрату (фірма R&D, каталожний номер DY999; не входить до складу набору). - Інкубують протягом 20 хв при КТ. Захищають від світла. - Додають у кожну лунку по 50 мкл розчину для припинення реакції (1,5М H2SO4 (чиста сірчана 41 кислота, фірма Merck, каталожний номер 713); не входить до складу набору). Обережно змішують. - Відразу визначають оптичну щільність у кожній лунці за допомогою ридера для мікропланшетів, установленого на довжину хвилі 450 нм. Стандартна крива для амфірегуліну: Наготовлюють матковий розчин амфірегуліну з концентрацією 40 нг/мол в 1% БСА в ЗФР, розділяють на аліквотів і зберігають при -80°С. Розчини амфірегуліну в 20% БСА в ЗФР після закінчення 2 тижнів втрачають стабільність і тому їх не застосовують. Перед кожним експериментом одержують знову стандартну криву для амфірегуліну в 20% БСА в ЗФР із використанням аліквотів маткового розчину амфірегуліну. Найбільша концентрація становить 1000 пг/мол (розведення 1:40 маткового розчину амфірегуліну). Для стандартів, що входять до складу набору для ELISA, одержують лінійну стандартну криву. Метод аналізу кривих на основі програми Excel дозволяє визначати рівняння кривих для кожного ELISA-експерименту. Зразки амфірегуліну: Коли зразки розбавляють у співвідношенні 1:1 у розріджувачі для реагенту, то всі зразки перебувають у лінійному діапазоні ELISA. Для кожного зразка виміру проводять із дублюванням. При необхідності залежно від якості отриманих даних і достатніх кількостей сироватки виміру можна повторювати в наступних експериментах. EGF: - Наготовлюють всі реагенти (входять до складу набору), стандартні розведення (входять до складу набору) і зразки; - Видаляють із форми надлишок сенсибілізованих антитілом смужок для титраційного мікропланшета (входять до складу набору). Далі форму позначають як планшет для ELISA. - Визначають необхідну кількість лунок (кількість стандартних розведень + кількість зразків) ? 2. - Визначають план планшета. - Додають у кожну лунку по 50 мкл розріджувача для аналізу RD1 (входить до складу набору). - Додають у кожну лунку по 200 мкл стандартного розведення або розведеного зразка (наприклад, у співвідношенні 1:20 у розріджувачі для калібратора RD6H). Після кожної стадії пипетування насадок заміняють. - Покривають планшет адгезивною смужкою (входить до складу набору). - Інкубують протягом 2 год при КТ на хитній платформі. - Видаляють рідину з кожної лунки шляхом аспірації й здійснюють відмивання, повторюють цей процес ще три рази, здійснюючи в цілому чотири відмивання. Відмивання здійснюють шляхом заповнення кожної лунки 400 мкл буферу для відмивання (входить до складу набору) за допомогою розподільної гребінки й наступного видалення рідини шляхом аспірації. Після останнього відмивання видаляють весь буфер, що залишився, для відмивання шляхом аспірації. Перевертають планшет і промокають чистими паперовими рушниками. 93989 42 - Аспіровані зразки й розчини для відмивання обробляють лабораторним дезінфікуючим засобом. - Додають у кожну лунку по 200 мкл кон'югату (входить до складу набору). Покривають нової адгезивною смужкою. - Інкубують протягом 2 год при КТ. - Повторюють описану вище процедуру аспірації/відмивання. - Додають у кожну лунку по 200 мкл розчину для субстрату (входить до складу набору). - Інкубують протягом 20 хв при КТ. Захищають від світла. - Додають у кожну лунку по 50 мкл розчину для припинення реакції (входить до складу набору). Обережно змішують. - Протягом періоду часу, що становить до 30хв, визначають оптичну щільність у кожній лунці за допомогою рідера для мікропланшетів, установленого на довжину хвилі 450 нм. Стандартна крива для EGF: За допомогою стандартних протоколів, прикладених до набору для ELISA, одержують лінійну стандартну криву. Навіть при дуже малих концентраціях одержували виявляють результати, що. Зразки EGF: Здійснюють у цілому чотири аналізи зразків. Для кожного зразка виміру проводять 2-5 разів, кількість вимірів залежить від якості результатів (середнє значення ± С.К.О.) і доступності достатніх кількостей сироватки. Коли зразки розводять у співвідношенні 1:20 у розріджувачі для калібратора RD6H, всі зразки перебувають у лінійному діапазоні ELISA. TGF-альфа: - Наготовлюють всі реагенти (входять до складу набору), стандартні розведення (входять до складу набору) і зразки; - Видаляють із форми надлишок сенсибілізованих антитілом смужок для титраційного мікропланшета (входять до складу набору). Далі форму позначають як планшет для ELISA. - Визначають необхідну кількість лунок (кількість стандартних розведень + кількість зразків) * 2. - Визначають план планшета. - Додають у кожну лунку по 100 мкл розріджувача для аналізу RD1W (входить до складу набору). - Додають у кожну лунку по 50 мкл стандартного розведення або розведеного зразка. Після кожної стадії пипетування насадок заміняють. - Покривають планшет адгезивною смужкою (входить до складу набору). - Інкубують протягом 2 год при КТ на хитній платформі. - Видаляють рідину з кожної лунки шляхом аспірації й здійснюють відмивання, повторюють цей процес ще три рази, здійснюючи в цілому чотири відмивання. Відмивання здійснюють шляхом заповнення кожної лунки 400 мкл буферу для відмивання (входить до складу набору) за допомогою розподільної гребінки й наступного видалення рідини шляхом аспірації. Після останнього відмивання видаляють весь буфер, що залишився, для 43 відмивання шляхом аспірації. Перевертають планшет і промокають чистими паперовими рушниками. - Піддані відсмоктуванню зразки й розчини для відмивання обробляють лабораторним дезінфікуючим засобом. - Додають у кожну лунку по 200 мкл кон'югату (входить до складу набору). Покривають нової адгезивною смужкою. - Інкубують протягом 2 год при КТ. - Повторюють описану вище процедуру відсмоктування/відмивання. - Додають у кожну лунку по 200 мкл розчину субстрату (входить до складу набору). - Інкубують протягом 20 хв при КТ. Захищають від світла. - Додають у кожну лунку по 50 мкл розчину для припинення реакції (входить до складу набору). Обережно змішують. - Протягом періоду часу, що становить до 30хв, визначають оптичну щільність у кожній лунці за допомогою рідера для мікропланшетів, установленого на довжину хвилі 450 нм. Стандартна крива для TGF-альфа: За допомогою стандартних протоколів, прикладених до набору для ELISA, одержують лінійну стандартну криву. Навіть при дуже малих концентраціях одержували виявлені результати. Зразки TGF-альфа: Здійснюють у цілому чотири аналізи зразків. Для кожного зразка виміру проводять 2-4 рази. Отримані для сироватки дані аналізували для ідентифікації факторів, вихідні рівні яких у сироватці могли корелювати з відповіддю на лікування пертузумабом. Для всіх факторів виявлена асиметрична (скошена) схема розподілу (середнє значення, стандартне відхилення, медіана, мінімум, максимум). Для зменшення ступеня скошеності застосовували монотонне логарифмічне перетворення: Log(x+1). При здійсненні одноваріантного аналізу визначали, чи можна виявити придатні граничні значення для факторів, які були б пов'язані з імовірністю відповіді (у даному прикладі він позначений як клінічно сприятлива дія). У цьому випадку пацієнти, у яких виявлена клінічна сприятлива дія, являли собою пацієнтів, у яких виявлена часткова відповідь (PR) або в яких підтримувався стабільний стан захворювання протягом щонайменше 6 місяців. Було проведене вивчення графіків розкиду факторів від категорій відповіді. Для ілюстрації даного підходу на фіг. 1 і фіг. 2 представлені графіки залежності категорій клінічної відповіді від рівнів (у логарифмічному масштабі) у сироватці TGF-альфа й амфірегуліну відповідно. На основі графіків розкиду були обрані граничні значення факторів з метою визначення груп пацієнтів, у яких виявлене більше клінічно сприятлива дія. На фіг. 3 (TGF-альфа), фіг. 4 (амфірегулін), фіг. 5 (EGF) і фіг. 6 (HER2-ECD) представлений зв'язок клінічно сприятливої дії з різними групами факторів, отриманий з використанням дослідницьких граничних значень, розрахованих для вихідних одиниць факторів. Граничні значення дозволяють відокремити пацієнтів, у яких не вияв 93989 44 лено клінічно сприятливої дії, і тим самим підвищити коефіцієнт відповіді для групи, у якій виявлений більше високий клінічно сприятлива відповідь. Приклад 2 У цьому прикладі отримані в прикладі 1 дослідницькі граничні значення застосовували для оцінки одноваріантного впливу груп факторів на різні оцінки клінічно сприятливої дії лікування пертузумабом, використовуючи в якості альтернативних клінічних кінцевих результатів проміжок часу до прогресування захворювання/або настання смерті (ТТР) і проміжок часу до настання смерті (TTD). Як представлено у зведенні результатів, введеної на фіг. 7, для TGF-альфа, амфірегуліну, EGF і HER2ECD були отримані достовірні результати відносно ТТР і/або TTD при використанні оцінок на основі методу Каплана-Мейера й логарифмічних рангових критеріїв. Графіки Каплана-Мейера, на яких представлені коефіцієнти ризику для ТТР і TTD (найбільша кількість випадків, що відбулися), наведені на фіг. 8 і фіг. 9 (TGF-альфа), фіг. 10 і фіг. 11 (амфірегулін), фіг. 12 і фіг. 13 (EGF) і фіг. 14 і фіг. 15 (HER2ECD), демонструють виражений вплив угруповання на основі зазначених факторів на клінічний результат у пацієнтів, що піддавалися лікуванню пертузумабом. Приклад З У цьому прикладі застосовували різноманітні підходи для ідентифікації комбінацій факторів, які дозволили б ще більше поліпшити ідентифікацію пацієнтів, на яких лікування пертузумабом робить більш сприятливу дію. Представлено результати, отримані за допомогою підходу на основі CART. Підхід на основі CART-класифікації вимагає віднести до групи сприятливої дії всі значення клінічно сприятливої дії, що перевищують 0. У якості змінних використали рівні Her2-ECD, TGF-альфа, амфірегуліну й EGF у сироватці. Як комбінація, що дає найкращий результат, була обрана комбінація рівнів Her2-ECD у сироватці й TGF-альфа в сироватці. На основі результатів, отриманих за допомогою CART, були розраховані оптимізовані граничні значення комбінації рівнів Her2-ECD у сироватці й TGF-альфа в сироватці, що дозволило сформулювати правило дослідницького поділу на категорії досліджуваної популяції з погляду клінічно сприятливої дії - комбінація низьких рівнів Her2ECD у сироватці й низьких рівнях TGF-альфа в сироватці відповідає 2/2 випадкам PR і 2/3 випадкам SD>6 місяців у досліджуваній популяції й дозволяє виключити розумну кількість пацієнтів з швидким прогресуванням захворювання. На фіг.16 представлена кореляція клінічно сприятливої дії й угруповань на основі комбінації TGF-альфа/HER2ECD з використанням дослідницької комбінації граничних значень. На фіг. 17 узагальнений вплив комбінації TGF-альфа й HER2-ECD на ТТР і TTD. Оцінки методом Каплана-Мейера й коефіцієнти ризику, наведені на фіг. 18 (ТТР) і фіг. 19 (TTD), свідчать про достовірний вплив угруповання на основі комбінації зазначених факторів на клінічний результат для пацієнтів, що піддавалися лікуванню пертузумабом. 45 93989 46 47 93989 48 49 93989 50 51 93989 52 53 93989 54 55 93989 56 57 93989 58 59 93989 60