Антитіло, мішенню якого є поліпептид baffr

Реферат: Винахід стосується антитіл, які зв'язуються з поліпептидом BAFFR (SEQ ID NO: 87) зі значенням КD, що становить 100 нМ або менше, та інгібують проліферацію людських В-клітин, яка індукується BLyS, зі значенням ІС50, яке становить приблизно 10 нМ або менше і виснажують Вклітини in vivo або in vitro. UA 103624 C2 (12) UA 103624 C2 UA 103624 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Цей винахід відноситься до антитіл, які специфічно зв'язуються з рецептором BAFF (BAFFR). Більш конкретний винахід відноситься до специфічних антитіл, які є антагоністами BAFFR, що мають здатність виснажувати В-клітинну активність in vivo, і до композицій і способів застосування антитіл для лікування патологічних порушень, які можна лікувати шляхом знищення або виснаження В-клітин, таких як системний червоний вовчак або ревматоїдний артрит, або інших аутоімунних захворювань або лімфом, лейкозів або мієлом. BAFFR (який позначають також як BR3, TNFRSF13C або CD268) є представником суперсімейства рецепторів факторів некрозу пухлин. Він експресується головним чином на Bлімфоцитах і субпопуляції T-клітин. BAFFR специфічно зв'язується з представником сімейства факторів некрозу пухлин BLyS (який позначають також як BAFF, CD257, TALL-1, THANK, TNFSF13B, ZTNF4), який може експресуватися на різних типах клітин, насамперед на мієлоїдних клітинах. Пара ліганд-рецептор (BLyS /BAFFR) має вирішальне функціональне значення для дозрівання незрілих "перехідних" B-клітин і для виживання, міграції та активації зрілих B-клітин, у тому числі з перемиканням ізотипу. BLyS може діяти індивідуально або у комбінації з B-клітинним рецептором (BCR), інтерлейкіном-4, інтерлейкіном-21 або лігандом CD40. Внаслідок присутності BAFFR на деяких T-клітинах BLyS може проявляти активність як костимулюючий фактор T-клітинної активації. BLyS може зв'язуватися також з двома додатковими рецепторами, виявленими на B-клітинах, а саме, з TACI і BCMA. Надекспресія BLyS або BAFFR в організмі мишей приводить до B-клітинної гіперплазії та розвитку системного аутоімунітету з класичними ознаками системного червоного вовчака (СЧВ). Крім того, у хворих, що мають дефект (NZBxNZW)F1 і що мають ознаки аутоімунного розладу мишей лінії MRL-lpr/lpr, які являють собою тваринні моделі СЧВ, виявлені підвищені концентрації BLyS у сироватці, і рівні BLyS корелюють із розвитком захворювання. Підвищені рівні BLyS виявлені також у хворих людей, що страждають СЧВ, ревматоїдним артритом, синдромом Шегрена, грануломатозом Вегенера та B-клітинними злоякісними захворюваннями. Крім того, у тварин, що використовуються як моделі, фенотип захворюваннях, характерний для аутоімунних захворювань, таких як ревматоїдний артрит (наприклад, індукований колагеном артрит), СЧВ і розсіяний склероз (наприклад, експериментальний аутоімунний енцефаломієліт), можна частково повертати до вихідного стану шляхом блокади BLyS розчинними злитими з рецепторами білками. Аналогічно цьому, лікування за допомогою злитого білка BAFFR:Fc інгібує хронічну реакцію "трансплантат-проти-господаря" (cGVHD) шляхом зниження життєздатності B-клітин. Дані про клінічну ефективність блокувального антитіла до BLyS відносно пацієнтів, що страждають ревматоїдним артритом і СЧВ, підкреслюють патогенну роль BLyS у цих аутоімунних порушеннях. Передача сигналів, що індукується BLyS, імовірно, також впливає на виживання злоякісних B-клітин. Апоптозу B-CLL- (В-клітинний хронічний лімфолейкоз)-клітин можна запобігати шляхом додавання рекомбінантного BLyS або APRIL. І, навпаки, апоптоз B-CLLклітин можна підсилювати шляхом додавання розчинних злитих білків BAFFR або антитіл до APRIL, це свідчить про те, що BLyS і APRIL можуть служити аутокринними факторами росту для злоякісних B-клітин. BAFFR експресується на поверхні широкої різноманітності клітин в ураженій хворобою тканині, включаючи множинну мієлому і не-ходжскінську лімфому. Доступні сучасні шляхи лікування цих аутоімунних захворювань включають застосування імунодепресантів, які мають серйозні побічні дії, вони не виліковують захворювання, а служать для полегшення ознак і симптомів захворювання (лікарські засоби, що модифікують перебіг хвороби). Більшість імунодепресантів, що застосовуються у цей час для лікування СЧВ і РА (ревматоїдний артрит), типу кортикостероїдів, циклофосфаміду, метотрексату і азатіоприну, приводять до загальної протизапальної дії, що обумовлює ризик виникнення серйозних інфекцій, оскільки впливають на всі ефекторні галузі імунної системи. Таким чином, усе ще існує потреба в розробці композицій і способів лікування СЧВ і/або РА та інших споріднених аутоімунних захворювань, зокрема, у створенні агентів, які виявляють інтерферуючий вплив на передачу сигналів BAFFR, у якій BLyS, як очікується, являє собою фактор, що обумовлює захворювання. Таким чином, одним з об'єктів винаходу є антитіло або функціональний білок, яке містить/який містить антигензв'язувальну ділянку антитіла, мішенню якого є поліпептид BAFFR (SEQ ID NO: 87), що відрізняється тим, що антитіло або функціональний білок специфічно зв'язується з поліпептидом BAFFR. В одному з варіантів здійснення винаходу антитіло або функціональний білок має походження з антитіла ссавця, такого як людина або представник верблюжих, або являє собою гуманізоване антитіло. У конкретному варіанті здійснення винаходу антитіло до BAFFR відрізняється наявністю антигензв'язувальної ділянки, специфічної для білка-мішені BAFFR, і зв'язується з BAFFR або фрагментом BAFFR. 1 UA 103624 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В одному з варіантів здійснення винаходу антитіла, пропоновані у винаході, є антагоністами BAFFR, які мають слабку агоністичну активністю або не мають її зовсім. У певних варіантах здійснення винаходу антитіло або функціональний фрагмент зв'язується з білком-мішенню BAFFR і знижує або інгібує зв'язування BLyS з BAFFR. У спорідненому варіанті здійснення винаходу антитіло або функціональний фрагмент інгібує проліферацію людських B-клітин, що індукується BLyS, і/або виробництво IgG1. В іншому варіанті здійснення винаходу антитіла, запропоновані у винаході, виснажують Bклітини in vitro і in vivo. Ще кращі антитіла, запропоновані у винаході, є антагоністами BAFFR, які не мають агоністичної активності і виснажують людські B-клітини in vitro і in vivo. Зв'язування можна оцінювати за допомогою одного або декількох аналізів, які можна застосовувати для вимірювання активності, що представляє собою або антагоністичну, або агоністичну активність антитіла. Переважно аналізи дозволяють оцінювати щонайменше один з видів активності антитіла у відношенні BAFFR, включаючи: проліферацію людських B-клітин, що індукується BLyS, виробництво IgG1 і/або здатність виснажувати людські B-клітини. Інший варіант здійснення винаходу відноситься до антитіл, які специфічно зв'язуються з BLyS-зв'язувальною областю BAFFR. Споріднений варіант здійснення винаходу відноситься до антитіл, які зв'язуються з областю BAFFR, розташованою між амінокислотами 17 і 43 SEQ ID NO: 87, і, наприклад, зв'язуються щонайменше з послідовністю PTPCVPAECFDLLVRHCVACGLLR (SEQ ID NO: 88). Відповідно до іншого конкретного варіанту здійснення винаходу зв'язування антитіл з BAFFR характеризується значенням KD, що становить 100нМ або менше, 10нМ або менше, 1нМ або менше, антитіла інгібують проліферацію людських В-клітин, що індукується BLyS, яка характеризується значенням IC50, що становить приблизно 10нМ або менше, 1нМ або менше або 100пМ або менше, і виснажують B-клітини in vitro, що характеризується значенням EC50, що становить 10нМ або менше, 1нМ або менше або 100пм або менше. В іншому спорідненому варіанті здійснення винаходу антитіла знижують на мишачій моделі in vivo процентний вміст B-клітин у крові або тканині на величину, що складає аж до 70 %, краще 80 % і ще краще 90 %, у порівнянні з неопрацьованими контрольними тваринами. У деяких конкретних варіантах здійснення винаходу антитіла, запропоновані у винаході, не дають перехресну реакцію з білком, споріднені з BAFFR, і більш конкретно не дають перехресну реакцію з людським рецептором TACI або BCMA. В іншому спорідненому варіанті здійснення винаходу антитіла, запропоновані у винаході, являють собою повністю людські або гуманізовані антитіла у вигляді IgG1, що мають антитілообумовлену клітиннозалежну цитотоксичність (ADCC-активність) і здатність зв'язуватися з областю BAFFR, яка розташовано між амінокислотами 17 і 43 SEQ ID NO: 87 і представлена, наприклад, щонайменше наступними пептидами PTPCVPAECFDLLVRHCVACGLLR (SEQ ID NO: 88), і здатністю виснажувати B-клітини in vitro, що характеризується значенням EC50, що становить 10нМ або менше, 1нМ або менше або 100нМ або менше. В іншому спорідненому варіанті здійснення винаходу антитіла, запропоновані у винаході, являють собою людські антитіла, отримані шляхом рекомбінантної експресії в клітинній лінії, у якій відсутня фукозилтрансфераза, наприклад, клітинної лінії ссавця з дефіцитом експресії гена FUT8, який кодує фукозилтрансферазу, що приводить до підвищення ADCC-активності у порівнянні з клітинами дикого типу, які експресують ген FUT8. Цей винахід відноситься до виділених антитіл, насамперед до людських або гуманізованих антитіл, які виявляють інтерферуючий вплив, знижуючи або інгібуючи зв'язування BLyS з BAFFR, і виснажують B-клітини in vitro і in vivo. У конкретних варіантах здійснення винаходу антитіла, запропоновані у винаході, виводять із конкретних послідовностей важких і легких ланцюгів, і/або вони містять конкретні структурні особливості, такі як CDR-ділянки, що містять конкретні амінокислотні послідовності. У винаході запропоновані виділені антитіла, способи створення антитіл, імунокон'югатів і мультивалентних або мультиспецифічних молекул, що містять антитіла, і фармацевтичні композиції, що містять антитіла, імунокон'югати або біспецифічні молекули, запропоновані у винаході. Винахід відноситься також до способів застосування антитіл для інгібування, наприклад, антагоністичного впливу на функцію BAFFR, з метою вповільнення, попередження, попередження виникнення або інгібування розвитку порушення або стану, асоційованого з присутністю BLyS і/або BAFFR, що, наприклад, дозволяє лікувати патологічне порушення, яке опосередковано BAFFR, або яке можна лікувати шляхом знищення або виснаження B-клітин; наприклад, аутоімунне захворювання, таке як системний червоний вовчак (СЧВ) або ревматоїдний артрит (РА), або B-клітинна неоплазма, така як лімфоми, лейкози та мієломи. Таким чином, антитіла, фрагменти антитіл і/або антигензв'язувальні білки можуть знайти застосування як профілактичні, превентивні засоби 2 UA 103624 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 або як компонент методу лікування. З метою кращого розуміння цього винаходу спочатку дані визначення деяких понять. Додаткові визначення наведені в докладному описі винаходу. Поняття "імунна відповідь" відноситься до дії (активності), наприклад, лімфоцитів, антигенпрезентуючих клітин, фагоцитів, гранулоцитів і розчинних макромолекул, яку мають описані вище клітини або печінка (включаючи активність антитіл, цитокінів і комплементу), що приводить до вибіркового ушкодження, деструкції або елімінації з організму людини патогенів, що впровадилися, клітин або тканин, заражених патогенами, ракових клітин або у випадку аутоімунного або патологічного запалення, здоровіших людських клітин або тканин. Поняття "шлях трансдукції сигналу" або "сигнальна активність" відноситься до біохімічного причинного взаємозв'язку, що, як правило, індукується взаємодією типу білок-білок, такою як зв'язування фактора росту з рецептором клітини, що приводить у передачі сигналу від однієї частини, до іншої частини клітини. У цілому, передача сигналу включає специфічне фосфорилювання одного або декількох залишків тирозину, серину або треоніну в одному або декількох білках, що беруть участь у каскаді реакцій, які обумовлюють трансдукцію сигналу. Передостанній процес, як правило, включає пов'язані з ядром події, які приводять до зміни генної експресії. Поняття BAFFR або рецептор BAFF відноситься до людського BAFFR, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 87. У публікаціях патентів згідно PCT WO 2000/04032 і WO 2006/073941 описані антитіла до BAFFR у цілому. В WO 2006/073941 описані специфічні антитіла до BAFFR. Поняття "антитіло" у контексті цього опису включає повні антитіла і будь-який антигензв'язувальний фрагмент (тобто "антигензв'язувальну ділянку") або їх одноланцюгові варіанти. "Антитіло", що зустрічається в природних умовах, являє собою глікопротеїн, який містить щонайменше два важкі (H) ланцюги і два легкі (L) ланцюги, зв'язані між собою дисульфідними містками. Кожний важкий ланцюг складається з варіабельної області важкого ланцюга (скорочено позначена в контексті цього опису як VH) і константної області важкого ланцюга. Константна область важкого ланцюга складається з трьох доменів, тобто CH1, CH2 і CH3. Кожний легкий ланцюг складається з варіабельної області легкого ланцюга (скорочено позначена в контексті цього опису як VL) і константної області легкого ланцюга. Константна область легкого ланцюга складається з одного домена, тобто CL. VH- і VL-області можна додатково підрозділяти на області гіперваріабельності, які називають гіперваріабельними ділянками (CDR), які перемежовуються з більш консервативними ділянками, які називають каркасними ділянками (FR). Кожна VH і VL складається з трьох CDR і чотирьох FR, які розташовані в напрямку від амінокінця до карбоксильного кінця в наступному порядку: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Варіабельні області важких і легких ланцюгів містять зв'язувальний домен, який взаємодіє з антигеном. Константні області антитіл можуть опосередковувати зв'язування імуноглобуліну з тканинами або факторами хазяїна, у тому числі з різними клітинами імунної системи (наприклад, ефекторними клітинами) і першим компонентом (Clq) класичної системи комплементу. Поняття "антигензв'язувальна ділянка" антитіла (або просто "антигенний центр" ("область детермінанти") у контексті цього опису відноситься до повнорозмірного антитіла або одного або декількох фрагментів антитіла, які зберігають здатність специфічно зв'язуватися з антигеном (наприклад, ділянкою BAFFR). Було встановлено, що антигензв'язувальну функцію антитіла можна здійснюватися за допомогою фрагментів повнорозмірного антитіла. Прикладами зв'язувальних фрагментів, що підпадають під поняття "антигензв'язувальна ділянка" антитіл, є Fab-фрагмент, одновалентний фрагмент, що складається з VL-, VH-, CL і CH1-доменів; F(ab)2фрагмент, двовалентний фрагмент, що складається з двох Fab-фрагментів, зв'язаних дисульфідним містком у шарнірній області; Fd-фрагмент, що складається з VH- і CH1-доменів; Fv-фрагмент, що складається з VL- і VH-доменів одного плеча антитіла; dAb-фрагмент (Ward та ін., Nature 341, 1989, сс. 544-546), який складається з VH-домена; і виділена гіперваріабельна ділянка (CDR). Крім того, незважаючи на те, що два домени Fv-фрагмента, тобто VL і VH, кодуються різними генами, їх можна з'єднувати за допомогою методів рекомбінації синтетичним лінкером, який дозволяє створювати з них один білковий ланцюг, у якому пара VL- і VH-областей формує одновалентні молекули (відомі за назвою одноланцюговий Fv-фрагмент (scFv); див., наприклад, Bird і ін., Science 242, 1988, сс. 423-426; і Huston і ін., Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 1988, сс. 58795883). Такі одноланцюгові антитіла також підпадають під поняття "антигензв'язувальна ділянка" антитіла. Зазначені фрагменти антитіла одержують за допомогою загальноприйнятих методів, відомих фахівцям у даній галузі, і фрагменти піддають скринінгу відносно можливості їх 3 UA 103624 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 застосування, аналогічного застосуванню інтактних антитіл. Поняття "виділене антитіло" у контексті цього опису відноситься до антитіла, яке практично вільне від інших антитіл з іншою антигенною специфічністю (наприклад, виділене антитіло, яке специфічно зв'язується з BAFFR, практично вільне від антитіл, які специфічно зв'язуються з антигенами, відмінними від BAFFR). Однак виділене антитіло, яке специфічно зв'язується з BAFFR, може давати перехресну реакцію з іншими антигенами, такими як молекули BAFFR з інших видів. Крім того, виділене антитіло може бути практично вільно від іншого клітинного матеріалу і/або хімічних речовин. Поняття "моноклональне антитіло" або "композиція моноклонального антитіла" у контексті цього опису відносяться до препарату молекул антитіл однакового молекулярного складу. Композиція моноклональних антитіл має однакову специфічність зв'язування і афінність у відношенні конкретного епітопа. Поняття "людське антитіло" у контексті цього опису відноситься до антитіл, що несуть варіабельні області, у яких як каркасні, так і CDR-ділянки виводять із послідовностей, що мають людське походження. Крім того, якщо антитіло містить константну область, то константну область також виводять із таких людських послідовностей, наприклад, послідовностей людської зародкової лінії, або мутантних версій послідовностей людської зародкової лінії або послідовностей консенсусних каркасних ділянок, що входять в антитіло, отриманих шляхом аналізу послідовностей людських каркасних ділянок, наприклад, згідно з методом, описаним у Knappik та ін., J Mol Biol 296, 2000, сс. 57-86. Структури і місця розташування варіабельних областей імуноглобулінів, наприклад, CDR, можна визначати з використанням добре відомих схем нумерації, наприклад, згідно з номенклатурою Кебота (Kabat), номенклатурі Chothia, комбінації номенклатури Kabat і Chothia (AbM), і т.д. (див., наприклад, Sequences of Proteins of Immunological Interest, за ред. Kabat та ін., вид-во U.S. Department of Health and Human Services, 1991.; Al Lazikani та ін., J. Mol. Bio. 273, 1997, сс. 927-948). Людські антитіла, запропоновані у винаході, можуть включати також амінокислотні залишки, які не кодуються людськими послідовностями (наприклад, у результаті мутацій, інтродукованих шляхом випадкового або сайтнаправленого мутагенезу in vitro або соматичної мутації in vivo). Однак у контексті цього опису не мається на увазі, що під поняття "людське антитіло" підпадають антитіла, у яких послідовності CDR, виведені із зародкової лінії інших видів ссавців, таких як миші, трансплантовані в послідовності людських каркасних ділянок. Поняття "людське моноклональне антитіло" відноситься до антитіл, що мають однакову специфічність зв'язування, які мають варіабельні області, у яких як каркасні, так і CDR-ділянки виводять із людських послідовностей. В одному з варіантів здійснення винаходу людські моноклональні антитіла одержують за допомогою гібридоми, яка включає B-клітину, отриману із трансгенної тварини крімлюдини, наприклад, трансгенної миші, у геномі якої міститься трансген людському важкого ланцюга і трансген людського легкого ланцюга, злитий з іморталізованою клітиною. Поняття "рекомбінантне людське антитіло" у контексті цього опису відноситься до всіх людських антитіл, які одержують, експресують, створюють або виділяють за допомогою методів рекомбінації, наприклад, до антитіл, виділених із тварини (наприклад, миші), яка є трансгенною або трансхромосомною завдяки інтродукції генів людського імуноглобуліну, або які отримані з гібридоми, до антитіл, виділених із клітини-хазяїна, трансформованої з метою експресії людського антитіла, наприклад, з використанням трансфектоми, до антитіл, виділених з рекомбінантної комбінаторної бібліотеки людських антитіл, і до антитіл, отриманих, експресованих, створених або виділених будь-якими іншими шляхами, які включають сплайсинг послідовностей усього гена людського імуноглобуліну або його частини з іншими послідовностями ДНК. Зазначені рекомбінантні людські антитіла несуть варіабельні області, у яких каркасні і CDR-ділянки виводять із послідовностей імуноглобуліну людської зародкової лінії. Однак у деяких варіантах здійснення винаходу зазначені рекомбінантні людські антитіла можна піддавати мутагенезу in vitro (або, коли для одержання людських послідовностей Ig використовують трансгенних тварин, та соматичному мутагенезу in vivo), і в результаті амінокислотні послідовності VH- і VL-областей рекомбінантних антитіл являють собою послідовності, які хоча й виведені і є спорідненими послідовностям VH і VL людської зародкової лінії, можуть не зустрічатися в природних умовах у популяції антитіл людської зародкової лінії in vivo. У контексті цього опису поняття "ізотип" відноситься до класу антитіл (наприклад, IgM, IgE, IgG, такому як IgG1 або IgG2), який кодується генами константної області важкоuj ланцюга. Фраза "антитіло, що розпізнає антиген" і "антитіло, специфічне відносно антигену" у 4 UA 103624 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 контексті цього опису застосовують взаємозамінно з поняттям "антитіло, яке зв'язується специфічно з антигеном". У контексті цього опису мається на увазі, що антитіло, яке "специфічно зв'язується з поліпептидом BAFFR", являє собою антитіло, зв'язування якого з поліпептидом людського BAFFR характеризується значенням KD, що становить 100нМ або менше, 10нМ або менше, 1нМ або менше. Антитіло, яке "дає перехресну реакцію з антигеном, відмінним від BAFFR", означає антитіло, зв'язування якого з антигеном характеризується значенням KD, що становлять 0,5 × 8 9 9 10- M або менше, 5 × 10- M або менше або 2 × 10- M або менше. Антитіло, яке "не дає перехресну реакцію з конкретним антигеном", являє собою антитіло, зв'язування якого із 8 зазначеним антигеном характеризується значенням KD, що становить 1,5×10- M або більше або 10 8 7 значенням KD, що становить 5- ×10- M або 1×10- M або більше. У конкретних варіантах здійснення винаходу ті антитіла, які не дають перехресну реакцію з антигеном, характеризуються зв'язуванням із цими білками, що практично не виявляється, при оцінці за допомогою стандартних аналізів зв'язування. У контексті цього опису мається на увазі, що поняття "антагоністичне антитіло" відноситься до антитіла, яке зменшує, знижує і/або інгібує індуковану BAFFR сигнальну активність у присутності BLyS при аналізі з використанням людських B-клітин, такому як аналіз проліферації людських В-клітин або аналіз виробництва IgG1 людськими В-клітинами. Приклади аналізу проліферації людських В-клітин і аналізу виробництва IgG1 людськими В-клітинами більш докладно описані нижче в прикладах. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіла зменшують, знижують або інгібують індуковану BLyS активність, що оцінюється за допомогою аналізу проліферації людських В-клітин, що характеризується значенням IC50, що становить 10нM або менше, 1нM або менше або 100пМ або менше. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіла інгібують індуковану BLyS активність, що оцінюється за допомогою аналізу виробництва IgG1, що характеризується значенням IC50, що становить 10нM або менше, 1нM або менше або 100пМ або менше. У контексті цього опису мається на увазі, що поняття антитіло, "що не має агоністичної активності" відноситься до антитіла, яке не має здатності значно підвищувати опосередковувану BAFFR сигнальну активність у відсутності BLyS у заснованому на застосуванні клітин аналізі, такому як аналіз проліферації людських В-клітин. Зазначені аналізи описані більш докладно нижче в прикладах. У контексті цього опису мається на увазі, що поняття "антитіло, яке виснажує B-клітини in vitro", відноситься до антитіла, яке має здатність викликати виснаження B-клітин, що характеризується значенням EC50, що становить 10нМ або менше, краще значенням EC50, що становить 1нМ або менше, ще краще значенням EC50, що становить 100пМ або менше, при оцінці за допомогою аналізу виснаження людських B-клітин (ADCC). Зазначені аналізи описані більш докладно нижче в прикладах. У контексті цього опису мається на увазі, що поняття "антитіло, яке виснажує B-клітини in vivo", відноситься до антитіла, яке знижує in vivo процентний вміст B-клітин на величину, що складає аж до 70 %, краще 80 % і ще краще 90 %, при оцінці В-клітин за допомогою клітинного сортера з порушенням флуоресценції (FACS). Зазначені аналізи описані більш докладно нижче в прикладах. Поняття "Kassoc" або "Ka" у контексті цього опису відноситься до швидкості асоціації взаємодії конкретних антитіла-антигену, а поняття "Kdis" або "Kd" у контексті цього опису відноситься до швидкості дисоціації взаємодії конкретних антитіла-антигену. У контексті цього опису мається на увазі, що поняття "KD" відноситься до константи дисоціації, яку одержують зі співвідношення Kd до Ka (тобто Kd/Ka) і виражають у молярній концентрації (M). Значення KD для антитіл можна визначати за допомогою методів, добре відомих у даній галузі. Метод визначення значення K D антитіла являє собою метод, заснований на резонансі поверхневого плазмону, або метод, ® заснований на застосуванні біосенсорної системи, такий як система Biacore . У контексті цього опису поняття "афінність" відноситься до сили взаємодії між антитілом і антигеном в одному з антигензв'язувальних центрів антитіла. У кожному антигензв'язувальному центрі варіабельна область "плеча" антитіла взаємодіє за допомогою слабких нековалентних сил з антигеном у численних сайтах; чим сильніше взаємодії, тим сильніше афінність. У контексті цього опису поняття "авідність" відноситься до інформативного критерію загальної стабільності або силі комлекса антитіло-антиген. Вона контролюється трьома основними факторами: афінність антитіла до епітопy; валентність і антигену, і антитіла; і структурна організація взаємодіючих ділянок. Ці три фактори визначають зрештою специфічність антитіла, тобто ймовірність того, що конкретне антитіло буде зв'язуватися саме з конкретним антигенним епітопом. 5 UA 103624 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У контексті цього опису поняття "ADCC-активність" або "антитіло- обумовлена клітиннозалежна цитотоксичність" відноситься до здатності виснажувати людські В-клітини. ADCC-активність можна вимірювати за допомогою аналізів виснаження людських В-клітин, які описані вище. Для одержання високоавідного зонда можна конструювати димерний кон'югат (дві молекули білка антитіла зшиті з FACS-маркером), створюючи тим самим взаємодії, що мають низьку афінність (такі, які мають місце у випадку антитіла зародкової лінії), що більш легко виявляти за допомогою FACS. Крім того, іншим засобом підвищення авідності зв'язування антигену є створення димерів, тримерів або мультимерів кожної з представлених у цьому описі конструкцій антитіл до BAFFR. Зазначені мультимери можна створювати шляхом ковалентного зв'язування індивідуальних молекул, наприклад, шляхом імітації зв'язування C- кінця з N-кінцем, , що зустрічається в природних умовах, або шляхом імітації димерів антитіл, які втримуються разом їх константними областями. Зв'язки, сконструйовані на границі розділу Fc/Fc, можуть бути ковалентними або нековалентними. Крім того, у гібридах BAFFR можна використовувати як партнери димеризуючі або мультимеризуючі компоненти, відмінні від Fc, для створення таких структур більш високого порядку. Наприклад, можна застосовувати мультимеризуючі домени, такі як тримеризуючий домен, описаний в Borean (WO 2004/039841), або пентамеризуючий домен, описаний в опублікованій заявці WO 98/18943. У контексті цього опису поняття "вибіркове, селективне" відносно антитіла відноситься до антитіла, яке зв'язується з певним поліпептидом-мішенню, але не зв'язується із близькоспорідненими поліпептидами. У контексті цього опису поняття "висока афінність" відносно антитіла відноситься до антитіла, для якого значення KD відносно антигену-мішені становить 1пМ або менше. У контексті цього опису поняття "індивідуум" відноситься до будь-якої людини або тварини крім людини. Поняття "тварина крім людини" включає всіх хребетних тварин, наприклад, ссавців і тварин, що не відносяться до ссавців, таких як примати крім людини, вівці, собаки, кішки, коні, корови, кури, амфібії, рептилії і т.д. У контексті цього опису поняття "оптимізована" означає, що нуклеотидна послідовність змінена з позицій кодування амінокислотної послідовності за допомогою кодонів, кращих для продуктивної клітини або організму, як правило, еукаріотичної клітини, наприклад, клітини Pichia, клітини Trichoderma, клітини яєчника китайського хом'ячка (CHO), або клітини людини. Оптимізовану нуклеотидну послідовність створюють так, щоб вона кодувала амінокислотну послідовність, ідентичну або практично ідентичну амінокислотній послідовності, що кодується вихідною нуклеотидною послідовністю, яку називають також "батьківською" послідовністю. Оптимізовані послідовності, представлені в цьому описі, створювали так, щоб вони мали кодони, кращі для клітин ссавця, таких як CHO; однак під обсяг винаходу підпадає також оптимізована експресія цих послідовностей в інших еукаріотичних клітинах. Амінокислотні послідовності, що кодуються оптимізованими нуклеотидними послідовностями, також розглядаються як оптимізовані. Різні об'єкти винаходу описані більш докладно в наведених нижче підрозділах. Стандартні аналізи, призначені для оцінки здатності до зв'язування антитіл з BAFFR різних видів, відомі в даній галузі і включають, наприклад, ELISA, вестерн-блотинг і РІА. Прийнятні аналізи описані докладно в прикладах. Кінетичні характеристики зв'язування (наприклад, афінність до зв'язування) антитіл можна визначати також за допомогою стандартних аналізів, відомих у даній галузі, таких як Biacore-аналіз. Аналізи, призначені для оцінки впливів антитіл на функціональну активність BAFFR (наприклад, зв'язування з рецептором, попередження або індукція проліферації людських клітин B-клітин або виробництво IgG) описані більш докладно в прикладах. Таким чином, слід розуміти, що антитіло, яке "інгібує" одну або декілька з видів активності BAFFR (наприклад, біохімічну, імунохімічну, клітинну, фізіологічну або інші види біологічної активності або т.п.), що визначають на основі методик, відомих у цій галузі і представлених у цьому описі, статистично значимо знижує конкретний вид активності у порівнянні з варіантом без антитіла (або, наприклад, коли є присутнім контрольне антитіло з невідповідною специфічністю). Антитіло, яке інгібує активність BAFFR, викликає статистично значиме зниження оцінюваного параметра щонайменше на 10 % на 50 %, 80 % або 90 %, і в конкретних варіантах здійснення винаходу антитіло, запропоноване у винаході, може інгібувати більш ніж на 95 %, 98 % або 99 % функціональну активність BAFFR. Поняття "перехресно блокує" "перехресно блокований" або "перехресна блокада" у контексті цього опису використовують взаємозамінно для позначення здатності антитіла або 6 UA 103624 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 іншого зв'язувального агента виявляти інтерферуючий вплив на зв'язування інших антитіл або зв'язувальних агентів з BAFFR при оцінці за допомогою стандартного аналізу конкурентного зв'язування. Здатність або ступінь, з якою антитіло або інший зв'язувальний агент може виявляти інтерферуючий вплив на зв'язування іншого антитіла або зв'язувальної молекули з BAFFR, і отже, чи можуть вони розглядатися як перехресно блокувальні згідно з винаходом, можна визначати за допомогою стандартних аналізів конкурентного зв'язування. Один з прийнятних аналізів передбачає застосування Biacore-технології (наприклад, з використанням пристрою BIAcore 3000 (фірма Biacore, Упсала, Швеція)), за допомогою якого можна визначати ступінь взаємодій з використанням технології на основі резонансу поверхневого плазмону. Іншим аналізом, який можна застосовувати для оцінки перехресної блокади, є підхід на основі ELISA. Обидва методи більш докладно описані в прикладах. Згідно з винаходом перехресно блокувальне антитіло або інший зв'язувальний агент, запропонований у винаході, зв'язується з BAFFR при оцінці за допомогою описаного Biacoreаналізу перехресного зв'язування таким чином, що обмірюване зв'язування комбінації (суміші) антитіл або зв'язувальних агентів становить від 80 до 0,1 % (наприклад, від 80 до 4 %) від максимального теоретичного зв'язування, зокрема від 75 до 0,1 % (наприклад, від 75 до 4 %) від максимального теоретичного зв'язування, і більш конкретно від 70 до 0,1 % (наприклад, від 70 до 4 %), і більш конкретно від 65 до 0,1 % (наприклад, від 65 до 4 %) від максимального теоретичного зв'язування (як описано вище) двох антитіл або зв'язувальних агентів у комбінації. Антитіло розглядається як перехресно блокувальне при оцінці за допомогою ELISA-аналізу, який описаний у прикладах, якщо розчинна фаза антитіла до BAFFR має здатність викликати зменшення на 60-100 %, зокрема на 70-100 % і більш конкретно на 80-100% сигналу BAFFR, що виявляється (тобто кількість BAFFR, зв'язана сенсибілізуючим антитілом) у порівнянні із сигналом BAFFR, що виявляється, отриманим у відсутності розчинної фази антитіла до BAFFR (тобто у лунках, що застосовуються як позитивний контроль). Рекомбінантні антитіла Антитіла, запропоновані у винаході, являють собою людські рекомбінантні антитіла, виділені та структурно охарактеризовані згідно з методами, описаними в прикладах. Амінокислотні послідовності VH виділених антитіл представлені в SEQ ID NO: 50-56. Амінокислотні послідовності VL виділених антитіл представлені в SEQ ID NO: 43-49 відповідно. Приклади кращих амінокислотних послідовностей легких ланцюгів повнорозмірних антитіл, запропонованих у винаході, представлені в SEQ ID NO: 71-74. Приклади кращих амінокислотних послідовностей важких ланцюгів повнорозмірних антитіл, запропонованих у винаході, представлені в SEQ ID NO: 75-78 відповідно. Іншими прикладами кращих амінокислотних послідовностей важких і легких ланцюгів повнорозмірних антитіл є послідовності, що кодуються відповідними послідовностями ДНК, які входять до складу плазмід pBW510 і pBW512, депонованих фірмою Novartis Pharma AG, формум 1, CH-4002 Базель, Швейцарія в DSMZ 29 квітня 2009 р. під реєстраційним номером DSM22542 і DSM22543 відповідно. Інші антитіла, запропоновані у винаході, містять амінокислоти, змінені в результаті мутацій, таких як делеція, інсерсія або заміна амінокислот, але CDR-ділянки яких ще щонайменше на 60, 70, 80, 90 або 95 % ідентичні CDR-ділянкам зазначених вище послідовностей, включаючи CDR-ділянки, що кодуються відповідними послідовностями ДНК плазмід pBW510 і pBW512, депонованих фірмою Novartis Pharma AG, формум 1, CH-4002 Базель, Швейцарія в DSMZ 29 квітня 2009 г. під реєстраційним номером DSM22542 і DSM22543 відповідно. Деякі варіанти здійснення винаходу включають мутантні амінокислотні послідовності, у яких не більше 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислот змінені в результаті мутацій, таких як делеція, інсерсія або заміна амінокислот, в CDR-ділянках у порівнянні з CDR-ділянками, представленими в зазначених вище послідовностях. Крім того, батьківські нуклеотидні послідовності варіабельної області важкого ланцюга представлені в SEQ ID NO 64. Батьківські нуклеотидні послідовності варіабельної області легкого ланцюга представлені в SEQ ID NO 57. Повнорозмірні нуклеотидні послідовності легких ланцюгів, оптимізовані для експресії в клітині ссавця, представлені в SEQ ID NO: 83-86. Повнорозмірні нуклеотидні послідовності важких ланцюгів, оптимізовані для експресії в клітині ссавця, представлені в SEQ ID NO: 79-82. Інші антитіла, запропоновані у винаході, включають мутантні амінокислотні або нуклеотидні послідовності, які ще ідентичні щонайменше на 60, 70, 80, 90 або 95 % описаним вище послідовностям. Деякі варіанти здійснення винаходу включають мутантні амінокислотні послідовності, у яких не більше 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислот змінені у результаті мутацій, таких як делеція, інсерсія або заміна амінокислот, у варіабельних областях у порівнянні з варіабельними областями, представленими в зазначених вище послідовностях. Оскільки кожне із зазначених антитіл зв'язується з тим самим епітопом і вони є нащадками 7 UA 103624 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 того самого батьківського антитіла, то послідовності VH, VL, послідовності повнорозмірного легкого ланцюга і повнорозмірного важкого ланцюга (нуклеотидні послідовності та амінокислотні послідовності) можна "змішувати і сполучати" для створення інших анти-BAFFR зв'язувальних молекул, запропонованих у винаході. Зв'язування з BAFFR зазначених отриманих у результаті "змішання і сполучення" антитіл можна оцінювати за допомогою описаних вище і у прикладах аналізів зв'язування (наприклад, ELISA). Коли ці ланцюги змішують і сполучають, то послідовність VH з конкретної пара VH/VL слід заміщати структурно подібною послідовністю VH. Аналогічно цьому, повнорозмірну послідовність важкого ланцюга з конкретної пара повнорозмірна послідовність важкого ланцюга /повнорозмірна послідовність легкого ланцюга слід заміщати структурно подібною повнорозмірною послідовністю важкого ланцюга. Аналогічно цьому, послідовність VL з конкретної пара VH/VL слід заміщати структурно подібною послідовністю VL. Аналогічно цьому, повнорозмірну послідовність легкого ланцюга з конкретної пари повнорозмірна послідовність важкого ланцюга /повнорозмірна послідовність легкого ланцюга слід заміщати структурно подібною повнорозмірною послідовністю легкого ланцюга. Таким чином, одним з об'єктів винаходу є виділене рекомбінантне антитіло або його антигензв'язувальна ділянка, яке/яка має: варіабельнуобласть важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, обрану з групи, що включає SEQ ID NO: 50-56; і варіабельну область легкого ланцюга, який містить амінокислотну послідовність, обрану із групи, що включає SEQ ID NO: 43-49; при цьому антитіло специфічно зв'язується з BAFFR. Іншим об'єктом винаходу є (I) виділене рекомбінантне антитіло яке має: повнорозмірну послідовність важкого ланцюга, який містить амінокислотну послідовність, обрану із групи, що включає SEQ ID NO: 75-78; і повнорозмірну послідовність легкого ланцюга, який містить амінокислотну послідовність, обрану із групи, що включає SEQ ID NO: 71-74; при цьому антитіло специфічно зв'язується з BAFFR, або (II) функціональний білок, що містить його антигензв'язувальну ділянку. Іншим об'єктом винаходу є (I) виділене рекомбінантне антитіло яке має: повнорозмірну послідовність важкого ланцюга, що кодується нуклеотидною послідовністю, яка була оптимізована з метою експресії в клітині ссавця, обрану із групи, що включає SEQ ID NO: 79-82; і повнорозмірну послідовність легкого ланцюга, що кодується нуклеотидною послідовністю, яка була оптимізована з метою експресії в клітині ссавця, обрану із групи, що включає SEQ ID NO: 83-86; при цьому антитіло специфічно зв'язується з BAFFR, або (II) функціональний білок, що містить його антигензв'язувальну ділянку. Амінокислотні послідовності CDR1 VH антитіл представлені в SEQ ID NO: 1-7. Амінокислотні послідовності CDR2 VH антитіл представлені в SEQ ID NO: 8-14. Амінокислотні послідовності CDR3 VH антитіл представлені в SEQ ID NO: 15-21. Амінокислотні послідовності CDR1 VL антитіл представлені в SEQ ID NO: 22-28. Амінокислотні послідовності CDR2 VL антитіл представлені в SEQ ID NO: 29-39. Амінокислотні послідовності CDR3 VL антитіл представлені в SEQ ID NO: 36-42. CDR-ділянки описують за допомогою системи Кебота (Kabat E. A. та ін., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-те вид., вид-в U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991). З урахуванням того, що кожне із зазначених антитіл може зв'язуватися з BAFFR і що специфічність зв'язування з антигеном забезпечується насамперед ділянками CDR1, 2 і 3, послідовності CDR1, 2 і 3 VH і послідовності CDR1, 2 і 3 VL можна "змішувати і сполучати" (тобто, можна змішувати і сполучати CDR з різних антитіл), при цьому з кожного антитіла, що містить CDR1, 2 і 3 VH і CDR1, 2 і 3 VL, створюють інші молекули, , що зв'язуються з BAFFR, запропоновані у винаході. Зв'язування з BAFFR таких отриманих у результаті "змішання і сполучення" антитіл можна оцінювати за допомогою описаних вище і у прикладах аналізів зв'язування (наприклад, ELISA). Коли змішують і сполучають CDR-послідовності VH, то послідовність CDR1, CDR2 і/або CDR3 з конкретної послідовності VH слід заміняти структурно подібною(ими) послідовністю(ями) CDR. Аналогічно цьому, коли змішують і сполучають CDRпослідовності VL, то послідовність CDR1, CDR2 і/або CDR3 з конкретної послідовності VL слід заміняти структурно подібною(ими) послідовністю(ями) CDR. Звичайному фахівцеві у цій галузі повинно бути очевидно, що нові послідовності VH і VL можна створювати шляхом заміни однієї або декількох послідовностей CDR-ділянок VH і/або VL на структурно подібні послідовності CDR, зазначені в цьому описі для моноклональних антитіл, запропонованих у цьому винаході. У деяких варіантах здійснення винаходу виділені рекомбінантні антитіла або їх антигензв'язувальні ділянки містять: CDR1 варіабельної області важкого ланцюга, який має амінокислотну послідовність, обрану із групи, що включає SEQ ID NO: 1-7; CDR2 варіабельної 8 UA 103624 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 області важкого ланцюга, який має амінокислотну послідовність, обрану із групи, що включає SEQ ID NO: 8-14; CDR3 варіабельної області важкого ланцюга, який має амінокислотну послідовність, обрану із групи, що включає SEQ ID NO: 15-21; CDR1 варіабельної області легкого ланцюга, який має амінокислотну послідовність, обрану із групи, що включає SEQ ID NO: 22-28; CDR2 варіабельної області легкого ланцюга, який має амінокислотну послідовність, обрану із групи, що включає SEQ ID NO: 29-35; і CDR3 варіабельної області легкого ланцюга, який має амінокислотну послідовність, обрану із групи, що включає SEQ ID NO: 36-42; при цьому антитіло специфічно зв'язується з BAFFR. У конкретному варіанті здійснення винаходу антитіло містить: CDR1 варіабельної області важкого ланцюга, який має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 2; CDR2 варіабельної області важкого ланцюга, який має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 9; CDR3 варіабельної області важкого ланцюга, який має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 16; CDR1 варіабельної області легкого ланцюга, який має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 23; CDR2 варіабельної області легкого ланцюга, який має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 30; і CDR3 варіабельної області легкого ланцюга, який має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 37. У конкретному варіанті здійснення винаходу антитіло містить: CDR1 варіабельної області важкого ланцюга, який має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 3; CDR2 варіабельної області важкого ланцюга, який має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 10; CDR3 варіабельної області важкого ланцюга, який має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 17; CDR1 варіабельної області легкого ланцюга, який має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 24; CDR2 варіабельної області легкого ланцюга, який має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 31; і CDR3 варіабельної області легкого ланцюга, який має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 38. У конкретному варіанті здійснення винаходу антитіло містить: CDR1 варіабельної області важкого ланцюга, який має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 4; CDR2 варіабельної області важкого ланцюга, який має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 11; CDR3 варіабельної області важкого ланцюга, який має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 18; CDR1 варіабельної області легкого ланцюга, який має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 25; CDR2 варіабельної області легкого ланцюга, який має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 32; і CDR3 варіабельної області легкого ланцюга, який має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 39. У конкретному варіанті здійснення винаходу антитіло містить: CDR1 варіабельної області важкого ланцюга, який має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 5; CDR2 варіабельної області важкого ланцюга, який має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 12; CDR3 варіабельної області важкого ланцюга, який має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 19; CDR1 варіабельної області легкого ланцюга, який має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 26; CDR2 варіабельної області легкого ланцюга, який має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 33; і CDR3 варіабельної області легкого ланцюга, який має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 40. У конкретному варіанті здійснення винаходу антитіло містить: CDR1 варіабельної області важкого ланцюга, який має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 6; CDR2 варіабельної області важкого ланцюга, який має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 13; CDR3 варіабельної області важкого ланцюга, який має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 20; CDR1 варіабельної області легкого ланцюга, який має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 27; CDR2 варіабельної області легкого ланцюга, який має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 34; і CDR3 варіабельної області легкого ланцюга, який має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 41. У конкретному варіанті здійснення винаходу антитіло містить: CDR1 варіабельної області важкого ланцюга, який має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 7; CDR2 варіабельної області важкого ланцюга, який має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 14; CDR3 варіабельної області важкого ланцюга, який має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 21; CDR1 варіабельної області легкого ланцюга, який має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 28; CDR2 варіабельної області легкого ланцюга, який має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 35; і CDR3 варіабельної області легкого ланцюга, який має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 42. Згідно з цим описом людське антитіло містить варіабельні області важкого або легкого ланцюга або повнорозмірні важкі або легені ланцюги, які "є продуктом" або "виведені з" послідовності конкретної зародкової лінії, якщо варіабельні області або повнорозмірні ланцюги антитіла одержують із системи, заснованої на застосуванні генів імуноглобуліну людської 9 UA 103624 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зародкової лінії. Для створення таких систем здійснюють імунізацію трансгенної миші, що несе людські гени імуноглобулінів, з використанням антигена, що представляє інтерес, або здійснюють скринінг фагової дисплейної бібліотеки людських генів імуноглобулінів з використанням антигена, що представляє інтерес. Людське антитіло, яке "є продуктом" або "виведене з" послідовності імуноглобуліну людської зародкової лінії, можна ідентифікувати індивідуально шляхом порівняння амінокислотної послідовності людського антитіла та амінокислотних послідовностей імуноглобулінів людської зародкової лінії і відбору послідовності імуноглобуліну людської зародкової лінії, яка є найбільш близькою за послідовністю (тобто має найвищий % ідентичності) з послідовністю людського антитіла. Людське антитіло, яке "є продуктом" або "виведене з" конкретної послідовності імуноглобуліну людської зародкової лінії, може мати відмінності в амінокислотах у порівнянні з послідовністю зародкової лінії, наприклад, у результаті соматичних мутацій, що зустрічаються в природних умовах, або навмисної інтродукції сайтнаправленої мутації. Однак амінокислотна послідовність відібраного людського антитіла, як правило, щонайменше на 90 % ідентична амінокислотній послідовності, що кодується геном людського імуноглобуліну зародкової лінії, і містить амінокислотні залишки, які свідчать про те, що людське антитіло є людським, при порівнянні з амінокислотними послідовностями імуноглобулінів зародкових ліній інших видів (наприклад, послідовності мишачої зародкової лінії). У певних випадках амінокислотна послідовність людського антитіла може бути щонайменше на 60 %, 70 %, 80 %, 90 % або навіть щонайменше на 95 %, або навіть щонайменше на 96 %, 97 %, 98 % або 99 % ідентична амінокислотної послідовності, що кодується геном імуноглобуліну зародкової лінії. Як правило, людське антитіло, виведене з конкретної послідовності людської зародкової лінії, повинно мати не більше 10 амінокислотних відмінностей у порівнянні з амінокислотною послідовністю, що кодується геном імуноглобуліну людської зародкової лінії. У певних випадках людське антитіло може мати не більше 5 або навіть не більше 4, 3, 2 або 1 амінокислотної відмінності у порівнянні з амінокислотною послідовністю, що кодується геном імуноглобуліну зародкової лінії. Гомологічні антитіла Згідно з ще одним варіантом здійснення винаходу антитіло, запропоноване у винаході, має амінокислотні послідовності повнорозмірних важких і легких ланцюгів; нуклеотидні послідовності повнорозмірних важких і легких ланцюгів; нуклеотидні послідовності варіабельних областей важких і легких ланцюгів або амінокислотні послідовності варіабельних областей важких і легких ланцюгів, які гомологічні амінокислотним і нуклеотидним послідовностям представлених у цьому описі антитіл, і при цьому антитіла зберігають необхідні функціональні властивості антитіл до BAFFR, запропонованих у винаході. Наприклад, у винаході запропоноване виділене рекомбінантне антитіло (або функціональний білок, що містить його антигензв'язувальну ділянку), яке містять варіабельну область важкого ланцюга і варіабельну область легкого ланцюга, де: варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 80 % або щонайменше на 90 % ідентична амінокислотній послідовності, обраній із групи, що включає SEQ ID NO: 50-56; варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 80 % або щонайменше на 90 % ідентична амінокислотній послідовності, обраній із групи, що включає SEQ ID NO: 43-49; антитіло специфічно зв'язується з BAFFR, і антитіло має щонайменше одну з наступних функціональних властивостей: воно інгібує індуковану BLyS проліферацію B-клітин, або індуковане BLyS виробництво IgG1, і воно виснажує B-клітини in vitro або in vivo. В іншому прикладі у винаході запропоноване виділене рекомбінантне антитіло (або функціональний білок, що містить його антигензв'язувальну ділянку), яке містять повнорозмірний важкий ланцюг і повнорозмірний легкий ланцюг, де: повнорозмірний важкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 80 % або щонайменше на 90 % ідентична амінокислотній послідовності, обраній із групи, що включає SEQ ID NO: 75-78; повнорозмірний легкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 80 % або щонайменше на 90 % ідентична амінокислотній послідовності, обраній із групи, що включає SEQ ID NO: 71-74; антитіло специфічно зв'язується з BAFFR, і антитіло має щонайменше одну з наступних функціональних властивостей: воно інгібує індуковану BLyS проліферацію B-клітин, або індуковане BLyS виробництво IgG1, і воно виснажує B-клітини in vitro або in vivo. В іншому прикладі у винаході запропоноване виділене рекомбінантне антитіло (або функціональний білок, що містить його антигензв'язувальну ділянку), яке містять повнорозмірний важкий ланцюг і повнорозмірний легкий ланцюг, де: повнорозмірний важкий ланцюг кодується нуклеотидною послідовністю, яка щонайменше на 80 % або щонайменше на 90 % ідентична нуклеотидній послідовності, обраній із групи, що включає SEQ ID NO: 79-82; 10 UA 103624 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 повнорозмірний легкий ланцюг кодується нуклеотидною послідовністю, яка щонайменше на 80 % або щонайменше на 90 % ідентична нуклеотидній послідовності, обраній із групи, що включає SEQ ID NO: 83-86; антитіло специфічно зв'язується з BAFFR, і антитіло має щонайменше одну з наступних функціональних властивостей: воно інгібує індуковану BLyS проліферацію B-клітин, або індуковане BLyS виробництво IgG1, і воно виснажує B-клітини in vitro або in vivo. У різних варіантах здійснення винаходу антитіло може мати одну або декілька, дві або більше або три з описаних вище функціональних властивостей. Антитіло може являти собою, наприклад, людське антитіло, гуманізоване антитіло або химерне антитіло. Краще антитіло являє собою повністю людське антитіло IgG1-ізотипу. В інших варіантах здійснення винаходу амінокислотні послідовності V H і/або VL можуть бути на 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % ідентичні зазначеним вище послідовностям. В інших варіантах здійснення винаходу амінокислотні послідовності VH і/або VL можуть бути ідентичні за винятком амінокислотної заміни, що зачіпає не більше 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних положень. Антитіло, у якого V H- і VL-області мають високий рівень (тобто 80 % або вище) ідентичності з VH- і VL-областями, представленими в SEQ ID NO: 50-56 і SEQ ID NO: 43-49 відповідно, можна одержувати шляхом мутагенезу (наприклад, сайтнаправленого або опосередковуваного ПЦР мутагенезу) молекул нуклеїнових кислот, які кодують SEQ ID NO: 6470 і SEQ ID NO: 57-63 відповідно, з наступним тестуванням зміненого антитіла, що кодується, відносно збереження функції (тобто перерахованих вище функцій) за допомогою наведених у цьому описі функціональних аналізів. В інших варіантах здійснення винаходу амінокислотні послідовності повнорозмірного важкого ланцюга і/або повнорозмірного легкого ланцюга можуть бути на 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % ідентичні зазначеним вище послідовностям. Антитіло, у якого повнорозмірний важкий ланцюг і повнорозмірний легкий ланцюг мають високий рівень (тобто 80 % або вище) гомології з повнорозмірними важкими ланцюгами, представленими в кожній з SEQ ID NO: 75-78, і з повнорозмірними легкими ланцюгами, представленими в кожній з і SEQ ID NO: 71-74 відповідно, можна одержувати шляхом мутагенезу (наприклад, сайтнаправленого або опосередковуваного ПЦР мутагенезу) молекул нуклеїнових кислот, які кодують SEQ ID NO: 79-82 і SEQ ID NO: 83-86 відповідно, з наступним тестуванням зміненого антитіла, що кодується, відносно збереження функції (тобто перерахованих вище функцій) за допомогою наведених у цьому описі функціональних аналізів. В інших варіантах здійснення винаходу нуклеотидні послідовності повнорозмірного важкого ланцюга і/або повнорозмірного легкого ланцюга можуть бути ідентичні на 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % представленим вище послідовностям. В інших варіантах здійснення винаходу нуклеотидні послідовності варіабельних областей важкого ланцюга і/або легкого ланцюга можуть бути ідентичні на 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % представленим вище послідовностям. Згідно з цим описом відсоток ідентичності двох послідовностей є функцією кількості ідентичних положень у послідовностях (тобто % ідентичності = кількість ідентичних положень/загальна кількість положень × 100), беручи до уваги кількість проломів і довжину кожного пролому, який необхідно інтродукувати для оптимального вирівнювання двох послідовностей. Порівняння послідовностей і визначення відсотка ідентичності двох послідовностей можна визначати за допомогою описаного нижче математичного алгоритму. Відсоток ідентичності двох амінокислотних послідовностей можна визначати за допомогою алгоритму, розробленого E. Meyers і W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4, 1988, сс. 11-17), який включений у програму ALIGN (версія 2.0), з використанням таблиці зважених залишків PAM120, штрафу за довжину пролому 12 і штрафу за пролом 4. Крім того, відсоток ідентичності двох амінокислотних послідовностей можна визначати за допомогою алгоритму Needleman і Wunsch (J. Mol, Biol. 48, 1970, сс. 444-453), який включений у програму GAP, що входить у пакет програм GCG (яка доступна на сайті http://www.gcg.com), з використанням матриці Blossom 62 або матриці PAM250 і ваги проломи 16, 14, 12, 10, 8, 6 або 4 і ваги довжини 1, 2, 3, 4, 5 або 6. Антитіла з консервативними модифікаціями У конкретних варіантах здійснення винаходу антитіло, запропоноване у винаході, має варіабельну область важкого ланцюга, який містить послідовності CDR1, CDR2 і CDR3, і варіабельну область легкого ланцюга, який містить послідовності CDR1, CDR2 і CDR3, де одна або декількох зазначених послідовностей CDR являє собою специфічні амінокислотні послідовності, характерні для антитіл, запропонованих у цьому винаході, або їх консервативні модифікації, і де антитіла зберігають необхідні функціональні властивості антитіл до BAFFR, запропонованих у винаході. Таким чином, у винаході запропоноване виділене рекомбінантне 11 UA 103624 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антитіло або функціональний білок, що містить його антигензв'язувальну ділянку, які містять варіабельну область важкого ланцюга, який містить послідовності CDR1, CDR2 і CDR3, і варіабельну область легкого ланцюга, який містить послідовності CDR1, CDR2 і CDR3, де: послідовності CDR1 варіабельної області важкого ланцюга містять амінокислотні послідовності, обрані із групи, яка включає амінокислотні послідовності, представлені в SEQ ID NO: 1-7, і їх консервативні модифікації; послідовності CDR2 варіабельної області важкого ланцюга містять амінокислотні послідовності, обрані із групи, яка включає амінокислотні послідовності, представлені в SEQ ID NO: 8-14, і їх консервативні модифікації; послідовності CDR3 варіабельної області важкого ланцюга містять амінокислотні послідовності, обрані із групи, яка включає амінокислотні послідовності, представлені в SEQ ID NO: 15-21, і їх консервативні модифікації; послідовності CDR1 варіабельної області легкого ланцюга містять амінокислотні послідовності, обрані із групи, яка включає амінокислотні послідовності, представлені в SEQ ID NO: 22-28, і їх консервативні модифікації; послідовності CDR2 варіабельної області легкого ланцюга містять амінокислотні послідовності, обрані із групи, яка включає амінокислотні послідовності, представлені в SEQ ID NO: 29-35, і їх консервативні модифікації; послідовності CDR3 варіабельної області легкого ланцюга містять амінокислотні послідовності, обрані із групи, яка включає амінокислотні послідовності, представлені в SEQ ID NO: 36-42, і їх консервативні модифікації; антитіло специфічно зв'язується з BAFFR; і антитіло має щонайменше одну з наступних функціональних властивостей: воно інгібує індуковану BLyS проліферацію B-клітин, або індуковане BLyS виробництво IgG1, і воно виснажує B-клітини in vitro або in vivo. У різних варіантах здійснення винаходу антитіло може мати одну або декілька, дві або більше або три або більше із зазначених вище функціональних властивостей. Такі антитіла можуть являти собою, наприклад, людські антитіла, гуманізовані антитіла або химерні антитіла. В інших варіантах здійснення винаходу антитіло, запропоноване у винаході, оптимізоване з метою експресії в клітині ссавця, має повнорозмірну послідовність важкого ланцюга і повнорозмірну послідовність легкого ланцюга, при цьому одна або декілька із цих послідовностей має амінокислотні послідовності, специфічні для антитіл, представлених у цьому описі, або їх консервативні модифікації, і при цьому антитіла зберігають необхідні функціональні властивості антитіл до BAFFR, запропонованих у винаході. Таким чином, винахід відноситься до виділеного моноклонального антитіла, оптимізованого з метою експресії в клітині ссавця, який має повнорозмірну послідовність важкого ланцюга і повнорозмірну послідовність легкого ланцюга, де: повнорозмірний важкий ланцюг має амінокислотні послідовності, обрані із групи, яка включає амінокислотні послідовності, представлені в SEQ ID NO: 75-78, і їх консервативні модифікації; а повнорозмірний легкий ланцюг має амінокислотні послідовності, обрані із групи, яка включає амінокислотні послідовності, представлені в SEQ ID NO: 71-74, і їх консервативні модифікації; антитіло специфічно зв'язується з BAFFR; і антитіло має щонайменше одну з наступних функціональних властивостей: воно інгібує індуковану BLyS проліферацію B-клітин, або індуковане BLyS виробництво IgG1, і воно виснажує B-клітини in vitro або in vivo. У різних варіантах здійснення винаходу антитіло може мати одну або декілька, дві або більше або три або більше із зазначених вище функціональних властивостей. Такі антитіла можуть, наприклад, являти собою людські антитіла, гуманізовані антитіла або химерні антитіла. У контексті цього опису поняття "консервативні модифікації послідовностей" відноситься до амінокислотних модифікацій, які не чинять істотного впливу або не суттєво змінюють характеристики зв'язування антитіла, яке містить зазначену амінокислотну послідовність. Зазначені консервативні модифікації включають амінокислотні заміни, додавання і делеції. Модифікації можна інтродукувати в антитіло, запропоноване у винаході, за допомогою стандартних методів, відомих у цій галузі, таких як сайтнаправленний мутагенез і ПЦРопосередковуваний мутагенез. Консервативні амінокислотні заміни являють собою заміни, при яких амінокислотний залишок заміщають амінокислотним залишком, який має подібний бічний ланцюг. Сімейства амінокислотних залишків з подібними бічними ланцюгами відомі у цій галузі. Ці сімейства включають амінокислотні залишки з оснόвними бічними ланцюгами (наприклад, лізин, аргінін, гістидин), кислотними бічними ланцюгами (наприклад, аспарагінова кислота, глутамінова кислота), незарядженими полярними бічними ланцюгами (наприклад, гліцин, аспарагін, глутамін, серин, треонін, тирозин, цистеїн, триптофан), неполярними бічними ланцюгами (наприклад, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін), бетарозгалуженими бічними ланцюгами (наприклад, треонін, валін, ізолейцин) і ароматичними 12 UA 103624 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 бічними ланцюгами (наприклад, тирозин, фенілаланін, триптофан, гістидин). Таким чином, один або кілька амінокислотних залишків в CDR-ділянках антитіла, запропонованого у винаході, можна заміняти на інші амінокислотні залишки з того самого сімейства бічних ланцюгів, і змінене антитіло можна оцінювати відносно збереження їм функції за допомогою представлених у цьому описі функціональних аналізів. Антитіла, які зв'язуються з тим же епітопом, що й антитіла до BAFFR, запропоновані у винаході Іншим варіантом здійснення винаходу є антитіла, які зв'язуються з тим же епітопом, що й різні специфічні антитіла до BAFFR, запропоновані у винаході. Усі антитіла, описані в прикладах, які мають здатність блокувати індуковану BLyS дію, зв'язуються з високою афінністю з тим самим епітопом в BAFFR, зазначений епітоп розташований між амінокислотами, представленими в SEQ ID NO: 88. Так, додаткові антитіла можна ідентифікувати за їх здатністю до перехресної конкуренції (наприклад, до статистично значимого конкурентного інгібування зв'язування) з іншими антитілами, запропонованими у винаході, при використанні стандартних аналізів зв'язування BAFFR. Здатність антитіла, що тестується, інгібувати зв'язування антитіл, запропонованих у цьому винаході, з людським BAFFR демонструє, що антитіло, яке тестується, може конкурувати з антитілом за зв'язування з людським BAFFR; відповідно до однієї з можливих теорій таке антитіло може зв'язуватися з тим же або спорідненим (наприклад, структурно подібним або перебуваючим у просторовій близькості) епітопом на людському BAFFR, що й антитіло, з яким воно конкурує. Таким чином, іншим об'єктом винаходу є антитіла, які зв'язуються з тим же антигеном і конкурують з антитілами, послідовності яких представлені в цьому описі. У конкретному варіанті здійснення винаходу антитіло, яке зв'язується з тим же епітопом на людському BAFFR, що й антитіла, запропоновані в цьому винаході, являє собою людське рекомбінантне антитіло. Зазначені людські рекомбінантні антитіла можна одержувати і виділяти згідно з описаними у прикладах методам. Сконструйовані та модифіковані антитіла Антитіло, запропоноване у винаході, можна одержувати також з використанням антитіла, яке має одну або декілька зазначених у цьому описі послідовностей V H і/або VL, як вихідний матеріал для створення модифікованого антитіла, де модифіковане антитіло може мати змінені властивості у порівнянні з вихідним антитілом. Антитіло можна створювати шляхом модифікації одного або декількох залишків в одній або обох варіабельних областях (тобто VH і/або VL), наприклад, в одній або декількох CDR-ділянках і/або в одній або декількох каркасних ділянках. У додатковому або альтернативному варіанті антитіло можна створювати шляхом модифікації залишків у константній(их) області(ях), наприклад, для зміни ефекторної(их) функції(ій) антитіла. Для здійснення одного з типів конструювання варіабельної області можна застосовувати трансплатацію CDR. Антитіла взаємодіють з антигенами-мішенями в основному за допомогою амінокислотних залишків, локалізованих у шести гіперваріабельних ділянках (CDR) важкого і легкого ланцюга. З цієї причини між амінокислотними залишками в CDR індивідуальних антитіл існують більш значні відмінності, ніж в послідовностях поза CDR. Оскільки послідовності CDR відповідальні за більшу частину взаємодій антитіло-антиген, можна експресувати рекомбінантні антитіла, які імітують властивості конкретних антитіл, що зустрічаються в природних умовах, шляхом конструювання експресійних векторів, які містять послідовності CDR з конкретного антитіла, що зустрічається в природних умовах, отримані шляхом трансплантації в послідовності каркасних ділянок з інших антитіл з іншими властивостями (див., наприклад, Riechmann L. та ін., Nature 332, 1998, сс. 323-327; Jones P. та ін., Nature, 321, 1986, сс. 522-525; Queen C. та ін., Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86, 1989, сс. 10029-10033; US 5225539 на ім'я Winter і US 5530101; 5585089; 5693762 і 6180370 на ім'я Queen зі співавторами). Таким чином, наступним об'єктом винаходу є виділене моноклональне антитіло до BAFFR або функціональний білок, що містить його антигензв'язувальну ділянку послідовності, що мають, CDR1 варіабельної області важкого ланцюга, які містять амінокислотні послідовності, обрані із групи, що включає SEQ ID NO: 1-7; послідовності CDR2, які містять амінокислотні послідовності, обрані із групи, що включає SEQ ID NO: 8-14; послідовності CDR3, які містять амінокислотні послідовності, обрані із групи, що включає SEQ ID NO: 15-21 відповідно; і послідовності CDR1 варіабельної області легкого ланцюга, які містять амінокислотні послідовності, обрані із групи, що включає SEQ ID NO: 22-28; послідовності CDR2, які містять амінокислотні послідовності, обрані із групи, що включає SEQ ID NO: 29-35; і послідовності CDR3, які містять амінокислотні послідовності, обрані із групи, що включає SEQ ID NO: 36-42 відповідно. Таким чином, зазначені антитіла містять послідовності CDR VH і VL моноклональних 13 UA 103624 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антитіл, крім того, вони можуть містити різні послідовності каркасних ділянок зазначених антитіл. Зазначені послідовності каркасних ділянок можна одержувати з публічних баз даних ДНК або опублікованих посилань, які містять послідовності генів антитіл зародкової лінії. Наприклад, послідовності ДНК генів зародкової лінії варіабельних областей людських важких і легких ланцюгів можна знайти в базі даних послідовностей людської зародкової лінії "Vbase" (доступної в Інтернеті на сайті www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase), а також в Kabat E. A. та ін., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 1991, 15-те вид., вид-в U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson I. M. та ін., J. fol. Biol. 227, 1992, сс. 776-798; і Cox J. P. L. та ін., Eur. J Immunol. 24, 1994, сс. 827-836. Прикладом послідовностей каркасних ділянок, призначених для застосування в антитілах, запропонованих у винаході, є послідовності, структурно подібні послідовностям каркасних ділянок, які входять у відібрані антитіла, запропоновані у винаході, наприклад, консенсусні послідовності і/або послідовності каркасних ділянок, які входять у моноклональні антитіла, запропоновані у винаході. Послідовності CDR1, 2 і 3 VH і послідовності CDR1, 2 і 3 VL можна трансплантувати у каркасні ділянки, які мають послідовність, ідентичну з послідовністю гена імуноглобуліну зародкової лінії, з якого виведена послідовність каркасної ділянки, або послідовності CDR можна трансплантувати у каркасні ділянки, які містять одну або кілька мутацій у порівнянні з послідовностями зародкової лінії. Наприклад, було встановлено, що в певних випадках доцільно змінювати за допомогою мутації залишки в каркасних ділянках для підтримки або підвищення здатності антитіла зв'язуватися з антигеном (див., наприклад, US 5530101; 5585089; 5693762 і 6180370 на ім'я Queen зі співавторами). Другим типом модифікації варіабельної області є мутація амінокислотних залишків в CDR1, CDR2 і/або CDR3 VH- і/або VL-областей, яка підвищує тим самим одну або кілька здатностей до зв'язування (наприклад, афінність) антитіла, яке представляє інтерес, що називають "дозріванням афінності". Для інтродукції мутації(й) і впливу на зв'язування антитіла або на іншу функціональну властивість, що представляє інтерес, можна застосовувати сайтнаправленний мутагенез або ПЦР-опосередковуваний мутагенез, що можна оцінювати за допомогою аналізів in vitro або in vivo, представлених у цьому описі і описаних нижче у прикладах. Можна інтродукувати консервативні модифікації (зазначені вище). Мутації можуть являти собою амінокислотні заміни, додавання або делеції. Крім того, як правило, змінюють не більше 1, 2, 3, 4 або 5 залишків в CDR-ділянці. Таким чином, іншим варіантом здійснення винаходу є виділені моноклональні антитіла до BAFFR або функціональний білок, що містить їх антигензв'язувальні ділянки, які включають варіабельну область важкого ланцюга, що містить: CDR1-ділянку VH-області, яка має амінокислотну послідовність, обрану із групи, що включає SEQ ID NO: 1-7, або амінокислотну послідовність з 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотними замінами, делеціями або додаваннями у порівнянні з SEQ ID NO: 1-7; CDR2-ділянка VH-області, яка має амінокислотну послідовність, обрану із групи, що включає SEQ ID NO: 8-14, або амінокислотну послідовність з 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотними замінами, делеціями або додаваннями у порівнянні з SEQ ID NO: 8-14; CDR3ділянка VH-області, яка має амінокислотну послідовність, обрану із групи, що включає SEQ ID NO: 15-21, або амінокислотну послідовність з 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотними замінами, делеціями або додаваннями у порівнянні з SEQ ID NO: 15-21; CDR1-ділянка VL-області, яка має амінокислотну послідовність, обрану з групи, що включає SEQ ID NO: 22-28, або амінокислотну послідовність з 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотними замінами, делеціями або додаваннями у порівнянні з SEQ ID NO: 22-28; CDR2-ділянка VL-області, яка має амінокислотну послідовність, обрануіз групи, що включає SEQ ID NO: 29-35, або амінокислотну послідовність з 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотними замінами, делеціями або додаваннями у порівнянні з SEQ ID NO: 29-35; і CDR3-ділянка VL-області, яка має амінокислотну послідовність, обрану з групи, що включає SEQ ID NO: 36-42, або амінокислотну послідовність з 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотними замінами, делеціями або додаваннями у порівнянні з SEQ ID NO: 36-42. Трансплантація антигензв'язувальних доменів в альтернативні каркасні ділянки або кістяки Можна застосовувати широку різноманітність кістяків або каркасів антитіла/імуноглобуліну за умови, що поліпептид, що утворюється, включає щонайменше одну єднальну ділянку, яка специфічно зв'язується з ВAFFR. Такі кістяки або каркаси включають п'ять основних ідіотипів людських імуноглобулінів або їх фрагментів (наприклад, які представлені в цьому описі), і включають імуноглобуліни інших видів тварин, які краще мають гуманізовані компоненти. У цьому плані особливо цікавими є антитіла, що складаються тільки з важких ланцюгів, які ідентифіковані в представниках верблюжих. Фахівці у цій галузі продовжують виявляти і створювати нові кістяки, каркаси та фрагменти. 14 UA 103624 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Одним з об'єктів винаходу є створення антитіл, що не відносяться до імуноглобулінів, з використанням неімуноглобулінових каркасів, у які можна трансплантувати CDR, запропоновані у винаході. Можна застосовувати відомі неімуноглобулінові кістяки або каркаси або ті, які будуть створені в майбутньому, за умови, що вони містять зв'язувальну ділянку, специфічну для білка білка-мішені, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 87. Такі з'єднання позначені в контексті цього опису як "поліпептиди, що містять специфічну для мішені зв'язувальну ділянку". Приклади неімуноглобулінових каркасів додатково описані нижче у відповідних розділах (верблюжі антитіла і каркаси, відмінні від характерних для антитіл каркасів). Верблюжі антитіла Білки антитіл, отримані з представників сімейства двогорбих і одногорбих верблюдів (Camelus bactrianus і Calelus dromaderius), включаючи представників тварин Нового Світу, таких як різні види лам (Lama paccos, Lama glama і Lama vicugna), охарактеризовані у відношенні їх розміру, структурної комплексності та антигенності відносно людини. Встановлено, що деякі антитіла типу IgG із цього сімейства ссавців у природних умовах позбавлені легких ланцюгів і тому відрізняються за структурою від типівої четвертинної структури, що складається з чотирьох ланцюгів, з двома важкими і двома легкими ланцюгами, характерною для антитіл з організму інших тварин (див. PCT/EP93/02214 (WO 94/04678, опубліковано 3 березня 1994 р.)). Ділянка верблюжого антитіла, що представляє собою невелику індивідуальну варіабельну область, позначену як VHH, можна створювати за допомогою генної інженерії з одержанням невеликого білка, що має високу афінність до мішені, що приводить до одержання низькомолекулярного виведеного з антитіла білка, який позначають як "верблюже нанотіло" (див. US 5759808, виданий 2 червня 1998 р.; див. також Stijlemans B. та ін., J Biol Chem 279, 2004, сс. 1256-1261; Dumoulin M. та ін., Nature 424, 2003, сс. 783-788; Pleschberger M. та ін. Bioconjugate Chem 14, 2003, сс. 440-448; Cortez-Retamozo V. та ін., Int J Cancer 89, 2002, сс. 456462; і Lauwereys M. та ін., EMBO J 17, 1998, сс. 3512-3520). Створені бібліотеки верблюжих антитіл і фрагментів антитіл доступні на комерційній основі, наприклад, від фірми Ablynx, Гент, Бельгія. Аналогічно іншим антитілам, отриманим з видів крім людини, амінокислотну послідовність верблюжого антитіла можна змінювати рекомбінантно з одержанням послідовності, що більшою мірою нагадує людську послідовність, тобто нанотіло можна "гуманізувати". Таким шляхом можна додатково знижувати природню низьку антигенность верблюжих антитіл для людей. Верблюже нанотіло має молекулярну масу, що складає приблизно 1/10 від молекулярної маси людського IgG, а фізичний діаметр білка становить лише кілька нанометрів. Однією з пов'язаних з малим розміром особливостей є здатність верблюжих нанотіл зв'язуватися з антигенними сайтами, які є функціонально непомітними для більших білкових антитіл, тобто верблюжі нанотіла можна застосовувати як реагенти, що виявляють антигени, які залишаються схованими при використанні класичних імунологічних методів, і можливо як терапевтичні агенти. Таким чином, іншою особливістю верблюжого нанотіла, пов'язаною з його малим розміром, є здатність інгібувати зв'язування зі специфічним сайтом у борозенці або вузькій ущелині білка-мішені, і тому їх можна застосовувати як субстанції, що більше нагадує за своєю функцією класичний низькомолекулярний лікарський засіб, ніж класичне антитіло. Невелика молекулярна маса і компактний розмір обумовлює також дуже високу термостабільність, стабільність при екстремальних значеннях рН і стабільність до протеолітичного розщеплення і низьку антигенність верблюжих нанотіл. Ще одним наслідком зазначених особливостей є те, що верблюжі нанотіла легко проникають з кровоносної системи в тканини і навіть проникають через гематоенцефалітичний бар'єр і їх можна застосовувати для лікування захворювань, що вражають нервову тканину. Нанотитіла можуть полегшувати також транспорт лікарських засобів через гематоенцефалітичний бар'єр (див. заявку на патент США 20040161738, опубліковану 19 серпня 2004 г). Ці особливості в комбінації з низькою антигенністю у відношенні людей свідчать про їх великий терапевтичний потенціал. Крім того, ці молекули можна повністю експресувати у прокаріотичних клітинах, таких як E. сoli, і експресувати у вигляді злитих білків з бактеріофагом, і вони є функціонально активними. Таким чином, відмітною ознакою цього винаходу є верблюже антитіло або нанотіло, що має високу афінність до BAFFR. У конкретних варіантах здійснення винаходу верблюже антитіло або нанотіло одержують у природних умовах у тварині з сімейства верблюжих, тобто воно продукується в організмі представника верблюжих після імунізації BAFFR або його пептидним фрагментом при застосуванні методів, описаних для інших антитіл. В іншому варіанті верблюже нанотіло до BAFFR конструюють, тобто одержують шляхом відбору, наприклад, з фагових дисплейних бібліотек відповідним чином мутованих білком верблюжих нанотіл, за допомогою методу пенінга з використанням як мішені BAFFR, як описано в наведених в цьому описі 15 UA 103624 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 прикладах. В одному з варіантів здійснення винаходу антитіло, представлене в цьому описі, є "камелізованим", що має каркасну ділянку з верблюжого антитіла і CDR1-, CDR2- і/або CDR3ділянки VH, представлені в цьому описі. Сконструйовані нанотіла можна додатково вдосконалити за допомогою генної інженерії таким чином, щоб час їх напівжиття в реципієнтові становив від 45 хв до 2 тижнів. У конкретному варіанті здійснення винаходу верблюже антитіло або нанотіло одержують шляхом трансплантації послідовностей CDR важкого або легкого ланцюга людських антитіл, запропонованих у винаході, у нанотіло або у послідовності каркасних ділянок антитіла, що має один домен, згідно з методами, описаними, наприклад в PCT/EP93/02214. Нехарактерні для антитіл каркаси Відомі неімуноглобулінові кістяки або каркаси включають (але не обмежуючись тільки ними) аднектини (фібронектин) (фірма Compound Therapeutics, Inc., Уолтем, шт. Массачусетс), анкірин (фірма Molecular Partners AG, Цюріх, Швейцарія), домени антитіл (фірма Domantis, Ltd (Кембрідж, шт. Массачусетс) і фірма Ablynx nv (Цвінаарде, Бельгія)), ліпокалін (антикалін) (фірма Pieris Proteolab AG, Фрейзінг, Німеччина), невеликі модульні імунологічні фармацевтичні агенти (фірма Trubion Pharmaceuticals Inc., Сіетл, шт. Вашингтона), максітіла (фірма Avidia, Inc. (Маунтин-В'ю, шт. Каліфорнія), білок A (фірма Affibody AG, Швеція) і афілін (гама-кристалін або убікітин) (фірма Scil Proteins Gmbh, Галле, Німеччина), міметики білкових епітопів (фірма Polyphor Ltd, Аллшвіль, Швейцарія). (I) Фібронектинові каркаси Основою фібронектинових каркасів є краще домен фібронектина типу III (наприклад, десятий модуль фібронектина типу III (домен 10 Fn3). Домен фібронектина типу III несе 7 або 8 бета-ланцюгів, які розподілені між двома бета-складками, які самі упаковані друг навпроти друга з утворенням ядра білка, і додатково містять петлі (аналоги CDR), які з'єднують бета-ланцюги один з одним і є доступними для розчинника. Відомо щонайменше три такі петлі на кожному краї бета-складчастого "сендвіча", при цьому край є границею білка, перпендикулярною до напрямку бета-ланцюгів (US № 6818418). Ці каркаси, основою яких є фібронектин, не являють собою імуноглобулін, хоча загальне укладання дуже схоже на укладання найменшого фрагмента антитіла, що має функціональну активність, тобто варіабельну область важкого ланцюга, який містить повний антиген компонентів в IgG представників верблюжих і лам, що розпізнає. Завдяки зазначеній структурі антитіло, що не представляє собою імуноглобулін, імітує антигензв'язувальні властивості, які нагадують за природою і афінністю властивості антитіл. Ці каркаси можна застосовувати для стратегії рандомізації петель і перестановки in vitro, що подібно процесу дозрівання афінності антитіл in vivo. Такі молекули, основою яких є фібронектин, можна застосовувати як каркаси, у яких області петель молекули можна заміняти на CDR, запропоновані у винаході, за допомогою стандартних методів клонування. (II) Анкірин – фірма Molecular Partners Технологія заснована на застосуванні білків, що несуть виведені з анкірину повторювані модулі як каркаси для варіабельних областей, які можна використовувати для зв'язування з різними мішенями. Повторюваний анкіриновий модуль являє собою поліпептид, що складається з 33 амінокислот, який містить дві антипаралельні α-спіралі і β-петлі. Зв'язування варіабельних областей максимально оптимізують на основі доступності для рибосом. (III) Максітіла/авімери – фірма Avidia Авімери одержують із білка, що зустрічається в природних умовах і містить A-домен, такого як LRP-1. Ці домени використовуються в природних умовах для взаємодій типу білок-білок, і в людини структурною основою більш ніж 250 білків є A-домени. Авімери складаються з декількох різних мономерів "A-домена" (2-10), зчеплених за допомогою амінокислотних лінкерів. Можна створювати авімери, які можуть зв'язуватися з антигеном-мішенню, з використанням методології, описаної, наприклад в 20040175756; 20050053973; 20050048512; і 20060008844. (VI) Білок A – фірма Affibody Ліганди Affibody®, що мають афінність, являють собою невеликі прості білки, що складаються з трьохспірального пучка, основою якого є каркас одного з IgG-зв'язувальних доменів білка A. Білок A являє собою поверхневий білок бактерії Staphylococcus aureus. Цей каркасний домен складається з 58 амінокислот, 13 з яких довільно використовували для створення бібліотек Affibody® з більшою кількістю варіантів ліганда (див., наприклад, US 5831012). Молекули Affibody® нагадують антитіла, їх молекулярна маса становить 6 кДа, для порівняння молекулярна маса антитіл становить 150 кДа. Незважаючи на невеликий розмір, сайт зв'язування молекул Affibody® подібний сайту зв'язування антитіла. (V) Антикаліни (Anticalins®) – фірма Pieris 16 UA 103624 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Антикаліни (Anticalins®) являють собою продукти, розроблені компанією Pieris Proteolab AG. Їх одержують із ліпокалінов, широко розповсюдженої групи невеликих і ефективних білків, які, як правило, беруть участь у фізіологічному транспорті або зберіганні чутливих до хімічних агентів або нерозчинних з'єднань. Декілька ліпокалінів, що зустрічаються в природних умовах, виявлено в тканинах або загальній воді організму людину. Їх білкова архітектура нагадує структуру імуноглобулінів з гіперваріабельними петлями на вершині твердого кістяка. Однак на відміну від антитіл або їх рекомбінантних фрагментів ліпокаліни складаються з одного поліпептидного ланцюга, що містить 160-180 амінокислотних залишків, тобто трохи більшої, ніж один домен імуноглобуліну. Набір із чотирьох петель, які утворюють зв'язувальну кишеню, має виражену структурну пластичність і допускає широка різноманітність бічних ланцюгів. Таким чином, при використанні відповідного процесу сайту зв'язування можна надавати нову форму, призначену для розпізнавання з високою афінністю і специфічністю заздалегідь визначених молекул-мішеней різної форми. Один з білків сімейства ліпокалінів, а саме зв'язувальний білін білок (BBP) з Pieris brassicae (капустяна білявка), використовували для створення антикалінів шляхом мутагенезу, що зачіпає чотири петлі. Однією із заявок на патент, у яких описані "антикаліни", наведеної як приклад, є PCT WO 199916873. (VI) Афілін (Affilin) – білки фірми Scil Proteins Молекули Affilin™ являють собою невеликі неімуноглобулінові білки, які розроблені з метою досягнення специфічних афінностей до білків і невеликих молекул. Нові молекули Affilin™ можна дуже швидко відбирати із двох бібліотек, основою кожної з яких є різні отримані з людського організму білки-каркаси. Молекули Affilin™ не мають якої-небудь структурної гомології з білками імуноглобулінів. На фірмі Scil Proteins застосовують два Affilin™-каркаси, одним з яких є гама-кристалін, людський структурний білків кришталика ока, а іншим є білки суперсімейства "убікітину". Обидва людських каркаси мають дуже малий розмір, характеризуються високою теплостійкістю і практично стійкі до змін значень pH і дії денатуруючих агентів. Зазначена висока стабільність головним чином є результатом розширеної бета-складчастої конформації білків. Приклади виведених з гамакристаліну білків описані в WO 200104144, а приклади "убікітиноподібних" білків описані в WO 2004106368. (VII) Міметики білкових епітопів (PEM) PEM являють собою циклічні, що нагадують пептиди молекули, що мають середній розмір (ММ 1-2 кДа), які імітують вторинні структури білків типу бета-«шпильок", тобто основну вторинну структуру, що бере участь у взаємодіях типу білок-білок. Конструювання каркасних ділянок або Fc До сконструйованих антитіл, запропонованих у винаході, відносяться антитіла, у яких зроблені модифікації в залишках каркасних ділянок в VH і/або VL, наприклад, з метою поліпшення властивостей антитіла. Як правило, такі модифікації каркасних ділянок здійснюють для зниження імуногенності антитіла. Наприклад, один з підходів являє собою "зворотне мутування" одного або декількох залишків каркасної ділянки з одержанням відповідної послідовності зародкової лінії. Більш конкретно, антитіло, яке було піддано соматичній мутації, може містити залишки каркасної ділянки, що відрізняються від послідовності зародкової лінії, з якої виведено антитіло. Такі залишки можна ідентифікувати шляхом порівняння послідовностей каркасних ділянок антитіла з послідовностями зародкової лінії, з якої виведено антитіло. Для повернення послідовностей каркасної ділянки до вихідної конфігурації зародків лінії соматичні мутації можна піддавати "зворотному мутуванню" з одержанням послідовності зародкової лінії, наприклад, за допомогою сайтнаправленого мутагенезу або ПЦР-опосередковуваного мутагенезу. Такі антитіла зі "зворотними мутаціями" підпадають також під обсяг цього винаходу. Інший тип модифікації каркасної ділянки включає зміну шляхом мутації одного або декількох залишків у каркасній ділянці або навіть в одній або декількох CDR-ділянках для видалення Tклітинних епітопів з метою зниження потенційної імуногенності антитіла. Цей підхід позначають також як "деімунізація", і він описаний більш докладно в опублікованому US 2003/0153043 на ім'я Carr зі співавторами. У додатковому або альтернативному варіанті крім модифікацій у каркасних ділянках або CDR антитіла, запропоновані у винаході, можуть включати модифікації в Fc-фрагменті, як правило, для зміни однієї або декількох функціональних властивостей антитіла, таких як час напівжиття в сироватці, фіксація комплементу, зв'язування Fc-рецептора і/або антитілообумовлена клітиннозалежна цитотоксичність. Крім того, антитіло, запропоноване у винаході, можна модифікувати хімічно (наприклад, до антитіла можна приєднувати один або кілька 17 UA 103624 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 хімічних фрагментів) або можна модифікувати для зміни його глікозилювання, і в цьому випадку з метою зміни однієї або декількох функціональних властивостей антитіла. Кожний із зазначених варіантів здійснення винаходу буде додатково описаний нижче. Нумерація залишків в Fc-фрагменті відповідає нумерації EU за Кеботом. В одному з варіантів здійснення винаходу модифікують шарнірну область CH1 так, щоб змінювати, наприклад, збільшувати або знижувати, кількість цистеїнових залишків у шарнірній області. Цей підхід описаний також в US 5677425 на ім'я Bodmer зі співавторами. Кількість цистеїнових залишків у шарнірній області CH1 змінюють, наприклад, для полегшення складання легких і важких ланцюгів або для підвищення або зниження стабільності антитіла. В іншому варіанті здійснення винаходу шарнірну область Fc-фрагмента антитіла можна змінювати за допомогою мутації для зниження біологічного часу напівжиття антитіла. Більш конкретно, інтродукують одну або кілька амінокислотних мутацій в область контакту CH2-CH3доменів шарнірної області Fc-фрагмента для погіршення зв'язування антитіла з білком А золотавого стафілокока Staphylococcyl (SpA) у порівнянні зі зв'язуванням нативної шарнірної області Fc-фрагмента з SpA. Цей підхід описаний більш докладно в US 6165745 на ім'я Ward зі співавторами. В іншому варіанті здійснення винаходу антитіло модифікують для подовження біологічного часу напівжиття. При цьому можливе застосування різних підходів. Наприклад, можна інтродукувати одну або декілька з наступних мутацій: T252L, T254S, T256F, описаних в US 6277375 на ім'я Ward. В іншому варіанті для подовження біологічного часу напівжиття можна змінювати антитіло в CH1- або CL-області шляхом інтродукції епітопа, що зв'язується з рецептором-«рятувальником", отриманого із двох петель CH2-домена Fc-фрагмента IgG, як описано в US 5869046 і US 6121022 на ім'я Presta зі співавторами. В інших варіантах здійснення винаходу Fc-фрагмент змінюють шляхом заміни щонайменше одного амінокислотного залишку на інший амінокислотний залишок для зміни ефекторних функцій антитіла. Наприклад, один або кілька амінокислотних залишків можна заміняти на інший амінокислотний залишок таким чином, щоб у такого антитіла змінювалася афінність до ефекторного ліганда, але зберігалася антигензв'язувальна здатність батьківського антитіла. Ефекторний ліганд, афінність до якого змінюють, може являти собою, наприклад, Fc-рецептор або C1-компонент системи комплементу. Цей підхід описаний більш докладно в US 5624821 і US 5648260, обидва на ім'я Winter зі співавторами. В іншому варіанті здійснення винаходу один або кілька амінокислотних залишків амінокислотної послідовності можна заміняти іншим амінокислотним залишком так, щоб антитіло мало змінену здатність до C1q-зв'язування і/або знижену комплементзалежну цитотоксичність (CDC) або щоб у нього була відсутня CDC. Цей підхід описаний більш докладно в US 6194551 на ім'я Idusogie зі співавторами. В іншому варіанті здійснення винаходу один або кілька амінокислотних залишків модифікують, змінюючи тим самим здатність антитіла до фіксації комплементу. Цей підхід описаний також в опублікованій заявці PCT WO 94/29351 на ім'я Bodmer зі співавторами. Ще в одному варіанті здійснення винаходу Fc-фрагмент модифікують для підвищення здатності антитіла викликати антитіло-обумовлену клітиннозалежну цитотоксичність (ADCC) і/або для підвищення афінності антитіла до Fcγ-рецептора за допомогою модифікації однієї або декількох амінокислот. Цей підхід описаний більш докладно в опублікованій заявці PCT WO 00/42072 на ім'я Presta. Крім того, були картовані сайти зв'язування людського IgG1 з FcγRl, FcγRII, FcγRIII і FcRn, і описані варіанти з поліпшеною здатністю до зв'язування (див. Shields R.L. та ін., J. Biol. Chen. 276, 2001, сс. 6591-6604). У наступному варіанті здійснення винаходу модифікують глікозилювання антитіла. Наприклад, можна створювати аглікозильоване антитіло (тобто антитіло, у якому відсутнє глікозилювання). Глікозилювання можна змінювати, наприклад, для підвищення афінності антитіла до "антигену". Такі вуглеводні модифікації можна здійснювати шляхом, наприклад, зміни одного або декількох сайтів глікозилювання в послідовності антитіла. Наприклад, можна здійснювати одну або кілька амінокислотних замін, які приводять до елімінації одного або декількох сайтів глікозилювання каркасної ділянки варіабельної області, усуваючи тим самим глікозилювання в цьому сайті. Зазначене аглікозилювання може підвищувати афінність антитіла до антигену. Цей підхід описаний більш докладно в US 5714350 і US 6350861 на ім'я Co зі співавторами. У додатковому або альтернативному варіанті можна створювати антитіло зі зміненим типом глікозилювання, наприклад, гіпофукозильоване або нефукозильоване антитіло, яке має знижену кількість фукозильних залишків, або антитіло з підвищеним вмістом поділяючих навпіл GlcNacструктур. Було продемонстровано, що такі змінені схеми глікозилювання підвищують ADCC 18 UA 103624 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 активність антитіл. Зазначені вуглеводні модифікації можна здійснювати, наприклад, шляхом експресії антитіла в клітині-хазяїні зі зміненим механізмом глікозилювання. Клітини зі зміненим механізмом глікозилювання відомі у цій галузі, і їх можна застосовувати як клітини-хазяї, у яких експресують рекомбінантні антитіла, запропоновані у винаході, для одержання тим самим антитіл зі зміненим глікозилюванням. Наприклад, в EP 1176195 на ім'я Hang зі співавторами описана лінія клітин з функціонально порушеним геном FUT8, який кодує фукозилтрансферазу, у результаті чого антитіла, що експресуються в такій клітинній лінії, характеризуються гіпофукозилюванням або відсутністю фукозильних залишків. Таким чином, відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу, антитіла, запропоновані у винаході, одержують шляхом рекомбінантної експресії в клітинній лінії, яка відрізняється схемою гіпофузилювання або відсутністю фукозилювання, наприклад, у клітинної лінії ссавця з дефіцитом експресії гена FUT8, який кодує фукозилтрансферазу. В опублікованій заявці PCT WO 03/035835 на ім'я Presta описаний варіант лінії CHO-клітин, Lecl3-клітини, зі зниженою здатністю приєднувати фукозу до пов'язаних з Asn(297) вуглеводів, що приводить також до гіпофукозилювання антитіл, що експресуються у цій клітині-хазяїні (див. також Shields R.L. та ін., J. Biol. Chem. 277, 2002, сс. 26733-26740). В опублікованій заявці PCT WO 99/54342 на ім'я Umana зі співавторам, описані лінії клітин, сконструйовані для експресії глікозилтрансфераз, що модифікують глікопротеїн (наприклад, бета(1,4)-N-ацетилглюкозамінілтрансферази III (GnTIII)), у результаті чого антитіла, які експресуються в сконструйованих лініях клітин, характеризуються підвищеним вмістом поділяючих навпіл GlcNac-структур, що приводить до підвищеної ADCC-активності антитіл (див. також Umana та ін., Nat. Biotech. 17, 1999, сс. 176-180). Описані також генетично створені на фірмі Eureka Therapeutics клітини ссавців, такі як CHO, що мають здатність продукувати антитіла зі зміненою від характерної для ссавців схемою глікозилювання, у яких відсутні фукозильні залишки (http://www.eurekainc.com/about_us/ companyoverview.html). В альтернативному варіанті антитіла, запропоновані у винаході, можна одержувати в дріжджах або нитчатих грибах, сконструйованих для створення нагадуючої характерну для ссавців схеми глікозилювання, і які мають здатність продукувати антитіла з відсутністю фукози як компонента схеми глікозилювання (див., наприклад, EP 1297172B1). Іншою модифікацією антитіл, що підпадає під обсяг винаходу, є пегілювання. Антитіло можна пегілювати, наприклад, для подовження біологічного (наприклад, у сироватці) часу напівжиття антитіла. Для пегілювання антитіла, як правило, антитіло або його фрагмент піддають взаємодії з поліетиленгліколем (ПЕГ), таким як реакційноздатний складний ефір або альдегідне похідне ПЕГ, в умовах, при яких одна або декілька ПЕГ-груп приєднується до антитіла або фрагмента антитіла. Пегілювання можна здійснювати за допомогою реакції ацилювання або реакції алкілювання з реакційноздатною молекулою ПЕГ (або аналогічним реакційноздатним водорозчинним полімером). У контексті цього опису мається на увазі, що поняття "поліетиленгліколь" відноситься до будь-яких форм ПЕГ, які використовують для дериватизації інших білків, таких як моно(C1-C10)алкокси- або арилоксиполіетиленгліколь або поліетиленглікольмалеімід. У конкретних варіантах здійснення винаходу антитіло, що підлягає пегілюванню, являє собою агліколізоване антитіло. Методи пегілювання білків відомі у цій галузі, і їх можна застосовувати до антитіл, запропонованих у винаході (див., наприклад, EP 0154316 на ім'я Nishimura зі співавторами і EP 0401384 на ім'я Ishikawa зі співавторами). Іншою модифікацією антитіл, що підпадає під обсяг винаходу, є кон'югат або злитий білок, що містить щонайменше антигензв'язувальну ділянку антитіла, запропонованого у винаході, з сироватковим білком, таким як людський сироватковий альбумін або його фрагмент, з метою подовження часу напівжиття молекули, що утворилася. Такий підхід описаний, наприклад, в Ballance зі співавторами в EP 0322094. Іншим можливим варіантом є злиття щонайменше одної антигензв'язувальної ділянки антитіла, запропонованого у винаході, з білками, які можуть зв'язуватися з сироватковими білками, такими як людський сироватковий альбумін, подовжуючи час напівжиття молекули, що утворилася. Такий підхід описаний у Nygren зі співавторами в EP 0486525. Методи створення змінених антитіл Як зазначено вище, антитіла до BAFFR, які мають послідовності V H і VL або послідовності повнорозмірного важкого і легкого ланцюга, представлені в цьому описі, можна застосовувати для створення нових антитіл до BAFFR шляхом модифікації послідовностей повнорозмірного важкого ланцюга і/або легкого ланцюга, послідовностей VH і/або VL або приєднаної(их) до них константної(их) області(ей). Таким чином, згідно з іншим об'єктом винаходу структурні особливості антитіла до BAFFR, запропонованого у винаході, використовують для створення структурно споріднених антитіл до BAFFR, які зберігають щонайменше одну з функціональних властивостей антитіл, запропонованих у винаході, таких як зв'язування з людським BAFFR, а 19 UA 103624 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 також інгібування однієї або декількох функціональних властивостей BAFFR (наприклад, антагоністична активність, здатність виснажувати B-клітини). Наприклад, одну або декілька CDR-ділянок антитіл, запропонованих у цьому винаході, або їх мутантів можна поєднувати рекомбінантно з відомими каркасними ділянками і/або іншими CDR для одержання додаткових, створених з використанням рекомбінантної ДНК антитіл до BAFFR, запропонованих у винаході, за допомогою зазначених вище методів. Інші типи модифікацій включають модифікації, описані в попередньому розділі. Вихідним матеріалом для конструювання є одна або кілька послідовностей V H і/або VL, представлених у цьому описі, або одна або декілька з них CDR-ділянок. Для створення сконструйованого антитіла не є необхідним фактичне одержання (тобто експресія у вигляді білка) антитіла, яке має одну або декілька з послідовностей VH і/або VL, представлених у цьому описі, або однієї або декількох їх CDR-ділянок. Краще інформацію, що міститься в послідовності(ях), використовують як вихідний матеріал для створення послідовності(ей) "другого покоління", виведеної(их) з вихідної(их) послідовності(ей), і потім одержують послідовність(і) другого покоління і експресують у вигляді білка. Таким чином, ще одним варіантом здійснення винаходу є спосіб одержання антитіла до BAFFR, що складається з: послідовності варіабельної області важкого ланцюга антитіла, який містить послідовність CDR1, обрану із групи, що включає SEQ ID NO: 1-7, послідовність CDR2, обрану із групи, що включає SEQ ID NO: 8-14, і/або послідовність CDR3, обрану із групи, що включає SEQ ID NO: 15-21; і послідовності варіабельної області легкої ланцюги антитіла, який містить послідовність CDR1, обрану із групи, що включає SEQ ID NO: 22-28, послідовність CDR2, обрану із групи, що включає SEQ NO: 29-35, і/або послідовність CDR3, обрану із групи, що включає SEQ ID NO: 36-42; що полягає в тому, що змінюють щонайменше один амінокислотний залишок у послідовності варіабельної області важкого ланцюга антитіла і/або варіабельної області легкого ланцюга антитіла для створення щонайменше однієї зміненої послідовності антитіла; і експресують змінену послідовність антитіла у вигляді білка. Таким чином, іншим варіантом здійснення винаходу є спосіб одержання антитіла до BAFFR, оптимізований для експресії в клітині ссавця, який складається з: повнорозмірної послідовності важкого ланцюга антитіла, яка має послідовність, обрану із групи, що включає SEQ ID NO: 7578; повнорозмірної послідовності легкого ланцюга антитіла, який має послідовність, обрану із групи, що включає SEQ ID NO: 71-74; що полягає в тому, що змінюють щонайменше один амінокислотний залишок у повнорозмірної послідовності важкого ланцюга антитіла і/або в повнорозмірної послідовності легкого ланцюга антитіла для створення щонайменше однієї зміненої послідовності антитіла; і експресують змінену послідовність антитіла у вигляді білка. Змінену послідовність антитіла можна створювати також шляхом скринінгу бібліотек антитіл, які мають фіксовані послідовності CDR3, обрані із групи, що включає SEQ ID NO: 15-21 і SEQ ID NO: 36-42, або мінімальні зв'язувальні детермінанти, що мають вирішальне значення, описані в US 20050255552, і різноманітні послідовності CDR1 і CDR2. Скринінг можна здійснювати з використанням будь-якого методу скринінгу, придатного для скринінгу антитіл з бібліотек антитіл, такого як технологія фагового дисплея. Для одержання і експресії зміненої послідовності антитіла можна застосовувати стандартні методи молекулярної біології. Антитіло, що кодується зміненої(ими) послідовністю(ями), являє собою антитіло, яке зберігає одну, декілька або всі функціональні властивості антитіл до BAFFR, представлених у цьому описі, де функціональні властивості являють собою (але не обмежуючись тільки ними) специфічне зв'язування з людським BAFFR; і/або і здатність антитіла інгібувати індуковану BLyS проліферацію B-клітин, індуковане BLyS виробництво IgG1, і здатність антитіла виснажувати B-клітини in vitro або in vivo. Змінене антитіло може мати одну або декілька, дві або більше або три або більше із зазначених вище функціональних властивостей. Функціональні властивості змінених антитіл можна оцінювати за допомогою стандартних аналізів, відомих у цій галузі і/або представлених у цьому описі, таких як описані в прикладах (наприклад, ELISA). У конкретних варіантах способів створення антитіл, запропонованих у винаході, мутації можна інтродукувати довільно або вибірково у всю або в частину послідовності антитіла до BAFFR, , що кодує, і отримані в результаті модифіковані антитіла до BAFFR можна піддавати скринінгу відносно зв'язувальної активності і/або інших описаних вище функціональних властивостей. Методи інтродукції мутацій відомі у цій галузі. Наприклад, в опублікованій заявці PCT WO 02/092780 на ім'я Short описані методи створення і скринінгу мутацій антитіл за допомогою мутагенезу, що насичує, синтетичного складання лігуванням або за допомогою комбінації цих методів. Альтернативно цьому в опублікованій заявці PCT WO 03/074679 на ім'я 20 UA 103624 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Lazar зі співавторами описані альтернативні методи, засновані на обчислювальному скринінзі для оптимізації фізико-хімічних властивостей антитіл. Молекули нуклеїнових кислот, антитіла, що кодують, запропоновані у винаході Наступним об'єктом винаходу є молекули нуклеїнових кислот, які кодують антитіла, запропоновані у винаході. Прикладами нуклеотидних послідовностей повнорозмірного легкого ланцюга, оптимізованих для експресії в клітині ссавця, є послідовності, представлені в SEQ ID NO: 83-86. Прикладами нуклеотидних послідовностей повнорозмірного важкого ланцюга, оптимізованих для експресії в клітині ссавця, є послідовності, представлені в SEQ ID NO: 79-82. Нуклеїнові кислоти можуть бути присутні у цілих клітинах, у клітинних лізатах або можуть являти собою нуклеїнові кислоти в частково очищеній або практично чистій формі. Нуклеїнову кислоту "виділяють" або "одержують її в практично очищеному вигляді", коли її очищають від інших клітинних компонентів або інших забруднювачів, наприклад, інших присутніх у клітині нуклеїнових кислот або білків, за допомогою стандартних методів, включаючи обробку лугом/ДСН, CsCl-бендінг, хроматографію на колонках, електрофорез в агарозному гелі та інших методів, добре відомих у цій галузі (див. Current Protocols in Molecular Biology, за ред. F. Ausubel та ін., вид-в Greene Publishing and Wiley Interscience, New York, 1987). Нуклеїнова кислота, запропонована у винаході, може являти собою, наприклад, ДНК або РНК, і може містити інтронні послідовності або не містити їх. В одному з варіантів здійснення винаходу нуклеїнова кислота являє собою молекулу кДНК. Нуклеїнова кислота може бути присутня у векторі, такому як фаговий дисплейний вектоp або рекомбінантний плазмідний вектор. Нуклеїнові кислоти, запропоновані у винаході, можна одержувати за допомогою стандартних методів молекулярної біології. Для антитіл, що експресуються гібридомами (наприклад, гібридомами, отриманими із трансгенних мишей, які несуть гени людських імуноглобулінів, що буде описано нижче), кДНК, які кодують легкі і важкі ланцюги антитіла, створені з використанням гібридоми, можна одержувати за допомогою стандартних методів ПЦРампліфікації або клонування кДНК. Для антитіл, які одержують із бібліотеки генів імуноглобулінів (наприклад, за допомогою методу фагового дисплея), нуклеїнову кислоту, що кодує антитіло, можна виділяти з різних фагових клонів, які є компонентами бібліотеки. Після одержання ДНК-фрагментів, що кодують VH- і VL-області, ці ДНК-фрагменти можна піддавати додатковій обробці за допомогою стандартних методів рекомбінантної ДНК, наприклад, для перетворення генів варіабельної області в гени повнорозмірного ланцюга антитіла, у гени Fab-фрагмента або в ген scFv-фрагмента. При здійсненні цього процесу ДНКфрагмент, що кодує VL або VH, функціонально зв'язують з іншою молекулою ДНК або фрагментом, яка кодує/який кодує інший білок, такий як константна область антитіла або гнучкий лінкер. Поняття "функціонально зв'язаний" у контексті цього опису означає, що два ДНКфрагменти з'єднують функціональним чином, у результаті чого амінокислотні послідовності, що кодуються двома ДНК-фрагментами, зберігаються в рамці зчитування, або в результаті чого білок експресується під контролем необхідного промотору. Виділену ДНК, що кодує VH-область, можна перетворювати в ген повнорозмірного важкого ланцюга шляхом функціонального зв'язування ДНК, яка кодує VH, з іншою молекулою ДНК, яка кодує константні області важкого ланцюга (CH1, CH2 і CH3). Послідовності генів константної області важкого ланцюга відомі у цій галузі (див., наприклад, Kabat E.A. та ін., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 15-те вид., вид-в U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991), і ДНК-фрагменти, що включають ці області, можна одержувати за допомогою стандартної ПЦР-ампліфікації. Константна область може являти собою константну область IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM або IgD. Краще константну область важкого ланцюга вибирають серед IgG2-ізотипів. У випадку гена Fab-фрагмента важкого ланцюга ДНК, кодуючу VH, можна функціонально зв'язувати з іншою молекулою ДНК, яка кодує тільки константну область CH1 важкого ланцюга. Виділену ДНК, що кодує VL-область, можна перетворювати в ген повнорозмірного легкого ланцюга (а також у ген легкого ланцюга Fab-фрагмента) шляхом функціонального зв'язування ДНК, що кодує VL, з іншою молекулою ДНК, яка кодує константну область легкого ланцюга, тобто CL. Послідовності людських генів константної області легкого ланцюга відомі у цій галузі (див., наприклад, Kabat E.A. та ін., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 15-те вид., вид-в U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991), і ДНКфрагменти, що включають ці області, можна одержувати за допомогою стандартної ПЦРампліфікації. Константна область легкого ланцюга може являти собою константну область каппа- або лямбда-ланцюга. Для створення гена scFv ДНК-фрагменти, які кодують VH і VL, функціонально зв'язують з іншим фрагментом, який кодує гнучкий лінкер, наприклад, який кодує амінокислотну 21 UA 103624 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовність (Gly4-Ser)3, у результаті чого послідовності VH і VL можна експресувати у вигляді суміжного одноланцюгового білка, у якому VL- і VH-області з'єднані гнучким лінкером (див., наприклад, Bird та ін., Science 242, 1988, сс. 423-426; Huston та ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 1988, сс. 5879-5883; McCafferty та ін., Nature 348, 1990, сс. 552-554). Створення моноклональних антитіл, запропонованих у винаході Моноклональні антитіла (МАт) можна одержувати за допомогою різних методів, включаючи загальноприйняті методи одержання моноклональних антитіл, наприклад, за допомогою стандартного методу гібридизації соматичних клітин, описаного в Kohler і Milstein, Nature 256, 1975, с. 495. Для одержання моноклональних антитіл можна застосовувати численні методики, наприклад, трансформацію В-лімфоцитів вірусами або онкогенами. Система тваринного походження, що застосовується для одержання гібридом, являє собою систему, засновану на використанні мишей. Створення гібридоми у миші є добре відомою процедурою. Протоколи імунізації та методи виділення імунізованих спленоцитів, призначених для злиття, добре відомі у цій галузі. Компоненти, що беруть участь у злитті (наприклад, клітини мишачої мієломи), і процедури злиття також добре відомі. Химерні або гуманізовані антитіла, запропоновані в цьому винаході, можна створювати на основі послідовності мишачого моноклонального антитіла, отриманого відповідно до описаного вище методу. ДНК, що кодує важкі і легкі ланцюги імуноглобулінів, можна одержувати з мишачої гібридоми, що представляє інтерес, і створювати так, щоб вона містила немишачі (наприклад, людські) послідовності імуноглобулінів, за допомогою стандартних методів молекулярної біології. Наприклад, для створення химерного антитіла мишачі варіабельні області можна зв'язувати з людськими константними областями з використанням відомих у цій галузі методів (див., наприклад, US 4816567 на ім'я Cabilly зі співавторами). Для створення гуманізованого антитіла мишачі CDR-ділянки можна вбудовувати в людську каркасну ділянку за допомогою відомих у цій галузі методів (див., наприклад, US 5225539 на ім'я Winter і US 5530101; 5585089; 5693762 і 6180370 на ім'я Queen зі співавторами). У конкретному варіанті здійснення винаходу антитіла, запропоновані у винаході, являють собою людські моноклональні антитіла. Такі людські моноклональні антитіла до BAFFR можна створювати з використанням трансгенних або трансхромосомних мишей, що несуть фрагменти людської, а не мишачої імунної системи. До цих трансгенних і трансхромосомних мишей відносяться миші, позначені в контексті цього опису як HuMAb-миші і KM-миші відповідно, і мишей обох зазначених ліній позначають у контексті цього опису як "миші, що несуть людський Ig". ® Миші лінії HuMAb (HuMAb mouse , фірма Medarex, Inc.) містять мінілокуси гена людського імуноглобуліну, який кодує неперегруповані послідовності людського важкого (µ і γ) і легкого κланцюга імуноглобуліну, у комбінації з цільовими мутаціями, які інактивують ендогенні локуси µі κ-ланцюга (див., наприклад, Lonberg та ін., Nature 368(6474), 1994, сс. 856-859). Таким чином, у миші знижена здатність експресувати мишачий IgM або κ-ланцюг, і у відповідь на імунізацію інтродуковані трансгени людського важкого і легкого ланцюга зазнають перемикання класу і соматичної мутації з утворенням людського моноклонального IgGκ, що має високу афінність (Lonberg N. та ін., 1994, вище; оглядова стаття Lonberg N., Handbook of Experimental Pharmacology 113, 1994, сс. 49-101; Lonberg N. і Huszar D., Intern. Rev. Immunol. 13, 1995, сс. 6593 і Harding F. і Lonberg N., Ann. N. Y. Acad. Sci. 764, 1995, сс. 536-546). Одержання та застосування мишей лінії HuMAb і геномні модифікації, які несуть такі миші, описані також у Taylor L. та ін., Nucleic Acids Research 20, 1992, сс. 6287-6295; Chen J. Та ін., International Immunology 5, 1993, сс. 647-656; Tuaillon та ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1993, сс. 3720-3724; Choi та ін., Nature Genetics 4, 1993, сс. 117-123; Chen J. та ін., EMBO J. 12, 1993, сс. 821-830; Tuaillon та ін., J. Immunol. 152, 1994, сс. 2912-2920; Taylor L. та ін., International Immunology, 1994, сс. 579-591; і Fishwild D. та ін., Nature Biotechnology 14, 1996, сс. 845-851 (див. також US 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5789650; 5877397; 5661016; 5814318; 5874299 і 5770429; усе на ім'я Lonberg і Kay; US 5545807 на ім'я Surani зі співавторами; опубліковані заявки PCT WO 92103918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97113852, WO 98/24884 і WO 99/45962, усе на ім'я Lonberg і Kay; і опубліковану заявку PCT WO 01/14424 на ім'я Korman зі співавторами). В іншому варіанті здійснення винаходу людські антитіла, запропоновані у винаході, можна одержувати з використанням миші, яка несе послідовності людського імуноглобуліну на трансгенах і трансхромосомах, наприклад, миші, яка несе трансген людському важкого ланцюга і трансхромосому людському легкого ланцюга. Такі миші, позначені в контексті цього опису як "KM-миші", описані докладно в публікації PCT WO 02/43478 на ім'я Ishida зі співавторами. У цій галузі відомі також й інші альтернативні системи на основі трансгенних тварин, що експресують гени людського імуноглобуліну, і їх можна застосовувати для одержання антитіл до 22 UA 103624 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 BAFFR, запропонованих у винаході. Наприклад, можна використовувати іншу трансгенну систему, позначену як Xenomouse (фірма Abgenix, Inc.); такі миші описані, наприклад, в US 5939598; 6075181; 6114598; 6150584 і 6162963 на ім'я Kucherlapati зі співавторами. Крім того, у цій галузі відомі також інші трансхромосомні системи, створені на основі тварин, для експресії генів людського імуноглобуліну, і їх можна застосовувати для одержання антитіл до BAFFR, запропонованих у винаході. Наприклад, можна використовувати мишей, що несуть як трансхромосому людського важкого ланцюга, так і трансхромосому людського легкого ланцюга, які позначені як "TС-миші"; такі миші описані, наприклад, в Tomizuka та ін. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 2000, сс. 722-727. Крім того, у цій галузі відомі корови, що несуть трансхромосоми людського важкого і легкого ланцюга (Kuroiwa та ін., Nature Biotechnology 20, 2002, сс. 889-894) і їх можна застосовувати для одержання антитіл до BAFFR, запропонованих у винаході. Людські рекомбінантні антитіла, запропоновані у винаході, можна одержувати також з використанням методів фагового дисплея для скринінгу бібліотек генів людських імуноглобулінів. У цій галузі розроблені такі методи фагового дисплея для виділення людських антитіл (див., наприклад: US 5223409; 5403484 і 5571698 на ім'я Ladner зі співавторами; US 5427908 і 5580717 на ім'я Dower зі співавторами; US 5969108 і 6172197 на ім'я McCafferty зі співавторами й US 5885793; 6521404; 6544731; 6555313; 6582915 і 6593081 на ім'я Griffiths зі співавторами). Людські моноклональні антитіла, запропоновані у винаході, можна одержувати також з використанням SCID-мишей (миші з важким комбінованим імунодефіцитом), у яких відновлювали людські імуноцити для того, щоб при імунізації можна було одержувати людську гуморальну імунну відповідь. Такі миші описані, наприклад, в US 5476996 і 5698767 на ім'я Wilson зі співавторами. Створення гібридом, що продукують людські моноклональні антитіла Для створення гібридом, які продукують людські моноклональні антитіла, запропоновані у винаході, можна виділяти спленоцити і/або клітини лімфатичних вузлів з імунізованих мишей і зливати з відповідною іморталізованою лінією клітин, такою як лінія клітин мишачої мієломи. Гібридоми, що утворилися, можна піддавати скринінгу відносно виробництва специфічних для антигену антитіл. Наприклад, суспензії індивідуальних клітин селезінкових лімфоцитів з імунізованих мишей можна зливати в кількості, що становить одну шосту частину від кількості клітин мишачої мієломи лінії P3 × 63-Ag8, що несекретується. 653 (ATCC, CRL 1580) за 5 допомогою 50 % ПЕГ. Клітини висівають приблизно з розрахунку 2×10 /лунку в плоскодонні титраційні мікропланшети, потім інкубують протягом 2 тижнів у середовищі для селекції, що містить 20 % фетальної сироватки (Clone), кондиціонованого середовища "653", 5 % оригена (фірма IGEN), 4мМ L-глутамін, 1мМ піруват натрію, 5мМ HEPES, 0,055мМ 2-меркаптоетанол, 50 од./мл пеніциліну, 50 мкг/мл стрептоміцину, 50 мкг/мл гентаміцину і 1×ГАТ (фірма SIgMa; ГАТ додають через 24 год. після злиття). Приблизно через 2 тижні клітини можна культивувати в середовищі, у якому ГАТ замінений на ГТ. Потім індивідуальні лунки можна піддавати скринінгу за допомогою ELISA у відношенні людських моноклональних антитіл у вигляді IgM і IgG. Після досягнення інтенсивного зростання гібридом здійснюють моніторинг середовища, як правило, через 10-14 днів. Гібридоми, що секретують антитіла, можна пересівати, знову піддавати скринінгу і, якщо усе ще зберігається позитивна реакція у відношенні людського IgG, то моноклональні антитіла можна субклонувати щонайменше двічі з використанням кінцевого розведення. Потім стабільні субклони можна культивувати in vitro для одержання невеликих кількостей антитіл у середовищі для культури тканини з метою подальшої характеризації. Для очищення людських моноклональних антитіл відібрані гібридоми можна вирощувати в 2-літрових обертових колбах з метою очищення моноклональних антитіл. Супернатанти можна фільтрувати і концентрувати перед здійсненням афінної хроматографії з використанням білка A-сефарози (фірма Pharmacia, Піскатавей, шт. Нью-Джерсі). Елюйований IgG можна перевіряти за допомогою гель-електрофорезу і рідинної хроматографії високої роздільної здатності для гарантії чистоти. Буферний розчин можна заміняти на ЗФР і концентрацію визначати на основі ОП280 з використанням коефіцієнта екстинкції 1,43. Моноклональні антитіла можна розділяти на аліквоти і зберігати при -80 °C. Створення трансфектом, що продукують моноклональні антитіла Антитіла, запропоновані у винаході, можна одержувати також у трансфектомі клітинихазяїна з використанням, наприклад, комбінації методів рекомбінантної ДНК і методів генної трансфекції, які добре відомі у цій галузі (див., наприклад, Morrison S., Science 229, 1985, с. 1202). Наприклад, для експресії антитіл або фрагментів антитіл ДНК, які кодують часткові або 23 UA 103624 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 повнорозмірні легкі і важкі ланцюги, можна одержувати за допомогою стандартних методів молекулярної біології (наприклад, за допомогою ПЦР-ампліфікації або клонування кДНК із використанням гібридом, які експресують антитіло, що представляє інтерес), і ДНК можна вбудовувати в експресійні вектори таким чином, щоб гени були функціонально пов'язані з послідовностями, що контролюють транскрипцію і трансляцію. У цьому контексті мається на увазі, що поняття "функціонально зв'язаний" означає, що ген антитіла вбудовують шляхом лігування у вектор таким чином, щоб присутні у векторі послідовності, що контролюють транскрипцію й трансляцію, виконували властиві їм функції регуляції транскрипції і трансляції гена антитіла. Обрані експресійний вектор і контролюючі експресію послідовності повинні бути сумісні із клітиною-хазяїном, що застосовується для експресії. Ген легкого ланцюга антитіла і ген важкого ланцюга антитіла можна вбудовувати в різні вектори або, як правило, обидва гени вбудовують у той самий експресійний вектор. Гени антитіла вбудовують в експресійний вектор стандартними методами (наприклад, вбудовують шляхом лігування комплементарних сайтів рестрикції на фрагменті гена антитіла і вектора, або шляхом лігування "затуплених" кінців, якщо відсутні які-небудь сайти рестрикції). Варіабельні області легких і важких ланцюгів антитіл, запропонованих у винаході, можна використовувати для створення повнорозмірних генів антитіл будь-яких ізотипів шляхом вбудовування їх в експресійні вектори, які вже кодують константні області важкого ланцюга і константні області легкого ланцюга необхідного ізотипу, таким чином, щоб VH-область була функціонально пов'язана з CH-cегментом(ами) у векторі, а VL-область функціонально пов'язана з CL-областю у векторі. В іншому або додатковому варіанті здійснення винаходу рекомбінантний експресійний вектор може кодувати сигнальний пептид, який полегшує секрецію ланцюга антитіла з клітини-хазяїна. Ген ланцюга антитіла можна клонувати у векторі так, щоб сигнальний пептид був зв'язаний у рамці зчитування з N-кінцем гена ланцюгf антитіла. Сигнальний пептид може являти собою сигнальний пептид імуноглобуліну або гетерологічний сигнальний пептид (тобто сигнальний пептид з білка, що не відноситься до імуноглобулінів). Крім генів ланцюга антитіла рекомбінантні експресійні вектори, запропоновані у винаході, несуть регуляторні послідовності, які контролюють експресію генів ланцюга антитіла в клітиніхазяїні. Мається на увазі, що поняття "регуляторна послідовність" відноситься до промоторів, енхансерів та інших контролюючих експресію елементів (наприклад, сигнали поліаденілювання), які контролюють транскрипцію або трансляцію генів ланцюга антитіла. Зазначені регуляторні послідовності описані, наприклад, в Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, вид-в Academic Press, San Diego, CA 1990). Фахівцям у цій галузі повинно бути очевидно, що створення експресійного вектора, включаючи вибір регуляторних послідовностей, може залежати від таких факторів, як вибір клітини-хазяїна для трансформації, необхідний рівень експресії білка і т.д. Регуляторні послідовності, призначені для експресії в клітинах ссавців, включають вірусні елементи, які забезпечують високі рівні експресії білка в клітинах ссавців, такі як промотори і/або енхансери, виведені із цитомегаловіруса (CMV), мавпячого вірусу 40 (SV40), аденовірусу (наприклад, головний пізній промотор аденовірусу (AdMLP)) і вірусу поліоми. В альтернативному варіанті можна використовувати невірусні регуляторні послідовності, такі як промотор убікітину або промотор Pглобіну. Крім того, можна застосовувати регуляторні елементи, що складаються з отриманих з різних джерел послідовностей, такі як промоторна система Sra, яка містить послідовності раннього промотору SV40 і довгий кінцевий повтор вірусу типу 1 людського Т-клітинного лейкозу (Takebe Y. та ін., Mol. Cell. Biol. 8, 1988, сс. 466-472). Крім генів ланцюга антитіла і регуляторних послідовностей рекомбінантні експресійні вектори, запропоновані у винаході, можуть нести додаткові послідовності, наприклад, послідовності, які регулюють реплікацію вектора в клітинах-хазяїнах (наприклад, сайти ініціації реплікації) і гени маркерів, що селектуються. Гени маркерів, що селектуються, полегшують відбір клітин-хазяїв, у які інтродуційовано вектор (див., наприклад, US №№ 4399216, 4634665 і 5179017, усе на ім'я Axel зі співавторами). Наприклад, як правило, ген маркера, що селектується, обумовлює стійкість клітини-хазяїна, у яку інтродуційовано вектор, до лікарських засобів, таких як G418, гігроміцин або метотрексат. До генів маркерів, що селектуються, відносяться ген дигідрофолатредуктази (DHFR) (для застосування в dhfr- клітинах-хазяях при селекції/ампліфікації в присутності метотрексату) і ген neo (для відбору в присутності G418). Для експресії легких і важких ланцюгів експресійним(ими) вектором(ами), що кодує(ють) важкі і легкі ланцюги, трансфектують клітину-хазяїна за допомогою стандартних методів. Під різні форми поняття "трансфекція" підпадає широка різноманітність методів, що звичайно застосовуються для інтродукції екзогенної ДНК у прокаріотичну або еукаріотичну клітинухазяїна, наприклад, електропорація, осадження фосфатом кальцію, трансфекція з 24 UA 103624 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 використанням ДЕАЕ ((диетиламіно)етилцелюлоза)-декстрану і т.п. Теоретично можна експресувати антитіла, запропоновані у винаході, як у прокаріотичних, так і в еукаріотичних клітинах-хазяях. Вважається, що слід здійснювати експресію в еукаріотичних клітинах, насамперед у клітинах-хазяях ссавців, оскільки зазначені еукаріотичні клітини і, насамперед клітини ссавців, з більшою ймовірністю, ніж прокаріотичні клітини, можуть забезпечувати складання і секрецію антитіла, що має правильну укладку і має імунологічну активність. Встановлено, що експресія генів антитіл у прокаріотичних хазяях не може ефективно забезпечувати високі рівні виробництва активного антитіла (Boss M. A. і Wood C. R., Immunology Today 6, 1985, сс. 12-13). Клітини-хазяї ссавців, призначені для експресії рекомбінантних антитіл, запропонованих у винаході, являють собою клітини яєчника китайського хом'ячка (CHO-клітини) (включаючи СНОклітини з дефіцитом dhfr (dhfr-), описані в Urlaub і Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 1980, сс. 4216-4220, які застосовують у комбінації з маркером DHFR, що селектується, наприклад, як описано в R.J. Kaufman і P.A. Sharp, Mol. Biol. 159, 1982, сс. 601-621, клітини мієломи лінії NSO, COS-клітини і SP2-клітини). Зокрема, для застосування у комбінації з клітинами мієломи NSO використовують іншу експресійну систему, що представляє собою експресійну систему GS-гена, як описано в WO 87/04462, WO 89/01036 і EP 338,841. В одному з варіантів здійснення винаходу клітини-хазяї ссавців, призначені для експресії рекомбінантних антитіл, запропонованих у винаході, являють собою лінії клітин ссавців з дефіцитом експресії гена FUT8, наприклад, описані в US 6946292B2. Коли рекомбінантні експресійні вектори, що кодують гени антитіла, інтродукують у клітини-хазяї ссавців, то антитіла одержують шляхом культивування клітин-хазяїв протягом періоду часу, достатнього для здійснення експресії антитіла в клітині-хазяїні або секреції антитіла в культуральне середовище, у якому вирощують клітини-хазяї. Антитіла можна виділяти з культурального середовища за допомогою стандартних методів очищення білків. Імунокон'югати Наступним об'єктом цього винаходу є антитіло до BAFFR або його фрагмент, кон'юговане/кон'югований з фрагментом, що має терапевтичну дію, таким як цитотоксин, лікарський засіб (наприклад, імунодепресант) або радіотоксин. Такі кон'югати позначені в контексті цього опису як "імунокон'югати". Імунокон'югати, які містять один або кілька цитотоксинів, позначають як "імунотоксини". До цитотоксинів або цитотоксичних агентів відноситься будь-який агент, який ушкоджує (наприклад, знищує) клітини. Їх прикладами є таксон, цитохаласин B, граміцидин D, етидію бромід, еметин, мітоміцин, етопосид, тенопосид, вінкрістин, вінбластин, t. колхіцин, доксорубіцин, даунорубіцин, дигідроксиантрациндіон, мітоксантрон, мітраміцин, актиноміцин D, 1-дегідротестостерон, глюкокортикоїди, прокаїн, тетракаїн, лідокаїн, пропранолол і пуроміцин та їх аналоги або гомологи. Терапевтичні агенти являють собою, наприклад, антиметаболіти (наприклад, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6тіогуанін, цитарабін, 5-фторурацил, декарбазин), деструктуючі агенти (наприклад, мехлоретамін, тіотепа, хлорамбуцил, міефалан, кармустин (BSNU) і ломустин (CCNU), циклотосфамід, бусулфан, дибромманіт, стрептозотоцин, мітоміцин C і цис-дихлордиамін платини(II) (DDP), цисплатин, антрацикліни (наприклад, даунорубіцин (колишня назва дауноміцин) і доксорубіцин), антибіотики (наприклад, дактиноміцин (колишня назва актиноміцин), блеоміцин, мітраміцин і антраміцин (AMC)) і антимітотичні агенти (наприклад, вінкрістин і вінбластин). Іншими прикладами терапевтичних цитотоксинів, які можна кон'югувати з антитілом, запропонованим у винаході, є дуокарміцини, каліхеаміцини, майтансини і ауристатини та їх похідні. Наприклад, на ринку є кон'югат антитіла з каліхеаміцином (Mylotarg™; фірма WyethAyerst). Цитотоксини можна кон'югувати з антитілами, запропонованими у винаході, з використанням відомої у цій галузі технології, що передбачає застосування лінкерів. Прикладами типів лінкерів, які можна використовувати для кон'югації цитотоксину з антитілом, є (але не обмежуючись тільки ними) гідразони, складні тіоефіри, складні ефіри, дисульфіди і лінкери, що містять пептид. Можна вибирати лінкер, який, наприклад, чутливий до розщеплення при низькому значенні рН у компартменті лізосоми або чутливий до розщеплення протеазами, наприклад, протеазами, які краще експресуються в пухлинних тканинах, такими як катепсини (наприклад, катепсини B, C, D). Додаткові дані про типи цитотоксинів, лінкери і методи кон'югації терапевтичних агентів і антитіл наведені також в Saito G. та ін., Adv. Drug Deliv. Rev. 55, 2003, сс. 199-215; Trai, P.A. та ін., Cancer Immunol. Immunother. 52 2003, сс. 328-337; Payne G., Cancer Cell 3, 2003, сс. 207-212; Allen T.M., Nat. Rev. Cancer 2, 2002, сс. 750-763; Pastan I. і Kreitman R. J., Curr. Opin. Investig. 25 UA 103624 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Drugs 3, 2002, сс. 1089-1091; Senter P.D. і Springer C.J., Adv. Drug Deliv. Rev. 53, 2001, сс. 247264. Антитіла, запропоновані в цьому винаході, можна кон'югувати також з радіоактивними ізотопами з одержанням цитотоксичних радіоактивних фармацевтичних агентів, які називають також радіоімунокон'югатами. Прикладами радіоактивних ізотопів, які можна кон'югувати з антитілами для застосування в діагностичних або терапевтичних цілях, є (але не обмежуючись l31 111 90 177 тільки ними) йод , індій , ітрій і лютецій . У цій галузі розроблені методи одержання радіоімунокон'югатів. Прикладами наявних на ринку радіоімунокон'югатів є Zevalin™ (фірма DEC Pharmaceuticals) і Bexxar™ (фірма Corixa Pharmaceuticals), і аналогічні методи можна застосовувати для одержання радіоімунокон'югатів антитіл, запропонованих у винаході. Кон'югати антитіл, запропоновані у винаході, можна застосовувати для модифікації конкретної біологічної відповіді, і в контексті цього опису не мається на увазі, що компонент, що представляє собою лікарський засіб, обмежений класичними хіміотерапевтичними агентами. Наприклад, компонент, що є лікарським засобом, може являти собою білок або поліпептид, що процесується з метою надання йому необхідної біологічної активності. Такі білки можуть являти собою, наприклад, токсин, що має ферментативну активність, або його активний фрагмент, такий як абрин, рицин A, екзотоксин Рseudomonas або дифтерійний токсин; такий білок, як фактор некрозу пухлини або інтерферон -γ; або модифікатори біологічної відповіді, такі, наприклад, як лімфокіни, інтерлейкін-1 ("IL-1"), інтерлейкін-2 ("IL-2"), інтерлейкін-6 ("IL-6"), колоніестимулюючий фактор гранулоцитів і макрофагів ("GM-CSF"), колоніестимулюючий фактор гранулоцитів ("G-CSF") або інші фактори росту. Методи конъюгирования фрагмента з антитілами, що має терапевтичну активність, добре відомі (див., наприклад, Amon та ін., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", в: Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, за ред. Reisfeld та ін., вид-в Alan R. Liss, Inc., сс. 243-56, 1985; Hellstrom та ін., "Antibodies For Drug Delivery", в: Controlled Drug Delivery (2-ге вид.), за ред. Robinson та ін., за ред. Marcel Dekker, Inc., сс. 623-53, 1987; Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", в: Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, за ред. Pinchera та ін., 1985, сс. 475-506; "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", в: Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, за ред. Baldwin та ін., вид-в Academic Press, 1985, сс. 303-316 і Thorpe та ін., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of AntibodyToxin Conjugates", Inmunol. Rev., 62, 1982, сс. 119-158). Біспецифічні молекули Наступним об'єктом цього винаходу є біспецифічні або мультиспецифічні молекули, що містять запропоноване у винаході антитіло до BAFFR або його фрагмент. Антитіло, запропоноване у винахід, або його антигензв'язувальні ділянки, можна дериватизувати або зв'язувати з іншою функціонально активною молекулою, наприклад, іншим пептидом або білком (наприклад, іншим антитілом або лігандом рецептора), з одержанням біспецифічної молекули, яка зв'язується щонайменше з двома різними сайтами зв'язування або молекулами-мішенями. Антитіло, запропоноване у винаході, фактично може бути дериватизоване або зв'язане більш ніж з однією іншою функціонально активною молекулою з утворенням мультиспецифічних молекул, які зв'язуються більш ніж з двома різними сайтами зв'язування і/або молекуламимішенями; мається на увазі, що в контексті цього опису зазначені мультиспецифічні молекули також підпадають під поняття "біспецифічна молекула". Для створення біспецифічної молекули, запропонованої у винаході, антитіло, запропоноване у винаході, можна функціонально зв'язувати (наприклад, шляхом хімічної комбінації, генетичного злиття, нековалентної асоціації або іншим способом) з однією або декількома іншими єднальними молекулами, такими як інше антитіло, фрагмент антитіла, пептид або зв'язувальний міметик, з одержанням біспецифічної молекули. Таким чином, цей винахід відноситься до біспецифічних молекул, які мають щонайменше одну першу специфічність, що має здатність до зв'язування з BAFFR, і другу специфічність, що має здатність до зв'язування з другим епітопом-мішенню. Наприклад, другий епітоп-мішень являє собою інший епітоп BAFFR, відмінний від першого епітопа-мішені. Іншим прикладом є біспецифічна молекула, яка містить щонайменше одну першу специфічність, що має здатність до зв'язування з BAFFR, і другу специфічність, що має здатність до зв'язування з епітопом в CD20. Крім того, згідно з варіантом здійснення винаходу, у якому біспецифічна молекула є мультиспецифічною, молекула може додатково включати третю специфічність, що має здатність до зв'язування, на додаток до першого і другого епітопу-мішені. В одному з варіантів здійснення винаходу біспецифічні молекули, запропоновані у винаході, 26 UA 103624 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 містять як специфічність, що має здатність до зв'язування, щонайменше одне антитіло або фрагмент антитіла, наприклад, Fab, Fab', F(ab')2, Fv або одноланцюговий Fv. Антитіло може являти собою також димер легких ланцюгів або важких ланцюгів або будь-який його мінімальний фрагмент, такий як Fv, або одноланцюгову конструкцію, описану в Ladner та ін., US №4946778, зміст якого спеціально включено в цей опис як посилання. До інших антитіл, які можна застосовувати в біспецифічних молекулах, запропонованих у винаході, відносяться мишачі, химерні та гуманізовані моноклональні антитіла. Біспецифічні молекули, запропоновані в цьому винаході, можна одержувати шляхом кон'югації компонентів, що представляють собою специфічності, що мають здатність до зв'язування, за допомогою методів, відомих у цій галузі. Наприклад, кожну специфічність, що має здатність до зв'язування, біспецифічної молекули можна створювати окремо і потім кон'югувати одну з одною. Коли специфічності, що мають здатність до зв'язування, являють собою білки або пептиди, для ковалентної кон'югації можна використовувати цілий ряд агентів для зв'язування або перехресного зшивання. Прикладами перехреснозшиваючих агентів є білок A, карбодиімід, N-сукцинімідил-S-ацетилтіоацетат (SATA), 5,5'-дитіобіс(2-нітробензойна кислота) (DTNB), o-фенілендималеімід (oPDM), N-сукцинімідил-3-(2-піридилдитіо)пропіонат (SPDP) і сульфосукцинімідил-4-(N-малеімідометил)циклогексан-l-карбоксилат (сульфо-SMCC) (див., наприклад, Karpovsky та ін., J. Exp. Med. 160, 1984, с. 1686; Liu M.A. та ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 1985, с. 8648). Інші методи являють собою методи, описані в Paulus, Behring Ins. Mitt. No. 78, 1985, сс. 118-132; BrenNaN та ін., Science 229, 1985, сс. 81-83) і Glennie та ін., J. Immunol. 139, 1987, сс. 2367-2375). Такі призначені для кон'югації агенти, як SATA і сульфоSMCC, обидва надходять у продаж від фірми Pierce Chemical Co. (Рокфорд, шт. Іллінойс). Коли специфічності, що мають здатність до зв'язування, являють собою антитіла, то їх можна кон'югувати за допомогою сульфгідрильного зв'язку C-кінцевих шарнірних областей двох важких ланцюгів. У конкретному варіанті здійснення винаходу шарнірну область модифікують таким чином, щоб вона до кон'югації містила непарну кількість сульфгідрильних залишків, наприклад, один. В альтернативному варіанті обидві специфічності, що мають здатність до зв'язування можна кодувати в тому самому векторі та експресувати і збирати в одній і тій же клітині-хазяїні. Цей метод є найбільш доцільним, коли біспецифічна молекула являє собою злитий білок, такий як МАт × МАт, МАт × Fab, Fab ×F(ab')2 або ліганд × Fab. Біспецифічна молекула, запропонована у винаході, може являти собою одноланцюгову молекулу, яка містить одноланцюгове антитіло і зв'язувальну детермінанту, або одноланцюгову біспецифічну молекулу, яка містить дві зв'язувальні детермінанти. Біспецифічні молекули можуть містити щонайменше дві одноланцюгові молекули. Методи одержання біспецифічних молекул описані, наприклад, в US 5260203; 5455030; 4881175; 5132405; 5091513; 5476786; 5013653; 5258498 і 5482858. Зв'язування біспецифічних молекул з їх специфічними мішенями можна підтверджувати, наприклад, твердофазним імуноферментним аналізом (ELISA), радіоімуноаналізом (РІА), FACSаналізом, біологічним аналізом (наприклад, інгібування росту) або аналізом методом вестернблоттінга. Кожний із зазначених аналізів дозволяє виявляти присутність конкретних комплексів білок-антитіло, що представляють інтерес, при використанні міченого реагенту (наприклад, антитіла), специфічного у відношенні комплексу, що представляє інтерес. Багатовалентні антитіла Наступним об'єктом цього винаходу є багатовалентні антитіла, що містять щонайменше два ідентичні або різні антигензв'язувальні ділянки антитіл, запропонованих у винаході, які зв'язуються з BAFFR. Одним з варіантів здійснення винаходу є багатовалентні антитіла, які містить щонайменше дві, три або чотири антигензв'язувальні ділянки антитіл. Антигензв'язувальні ділянки можна з'єднувати разом шляхом білкового злиття або ковалентного або нековалентного зв'язку. В іншому варіанті можна застосовувати методи зв'язування, описані для біспецифічних молекул. Чотиривалентні з'єднання можна одержувати, наприклад, шляхом перехресного зшивання антитіл, запропонованих у винаході, з антитілом, яке зв'язується з константними областями антитіл, запропонованих у винаході, наприклад, з Fc або з шарнірною областю. Фармацевтичні композиції Наступним об'єктом цього винаходу є композиція, наприклад, фармацевтична композиція, що містить одне або комбінацію моноклональних антитіл або їх антигензв'язувальну(ні) ділянку(ки), запропоновані в цьому винаході, у комбінації з фармацевтично прийнятним носієм. Такі композиції можуть включати одне або комбінацію (наприклад, два або більшу кількість різних) антитіл або імунокон'югатів або біспецифічних молекул, запропонованих у винаході. Наприклад, фармацевтична композиція, запропонована у винаході, може містити комбінацію 27 UA 103624 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антитіл, які зв'язуються з різними епітопами на антигені-мішені, або які мають додатковий вид активності. Фармацевтичні композиції, запропоновані у винаході, можна застосовувати також для комбінованої терапії, тобто в комбінації з іншими агентами. Наприклад, для комбінованої терапії можна застосовувати антитіло до BAFFR, запропоноване в цьому винаході, у комбінації щонайменше з одним іншим протизапальним агентом або іншим хіміотерапевтичним засобом, наприклад, цитотоксичним, протираковим або антипроліферативним засобом. Приклади терапевтичних засобів, які можна застосовувати в комбінованій терапії, більш докладно описані нижче в розділі, присвяченому застосуванню антитіл, запропонованих у винаході. У контексті цього опису поняття "фармацевтично прийнятний носій" включає кожний і всі розчинники, дисперсійні середовища, матеріали для нанесення покриття, антибактеріальні та протигрибкові засоби, агенти, що надають ізотонічність, і агенти, що сповільнюють абсорбцію, і т.п., які є фізіологічно сумісними. Носій повинен бути придатним для внутрішньовенного, внутрішньом'язового, підшкірного, парентерального, спинального або епідермального введення (наприклад, шляхом ін'єкції або інфузії). Залежно від шляху введення на діючу речовину, тобто антитіло, імунокон'югат або біспецифічну молекулу, можна наносити покриття з матеріалу, що захищає з'єднання від впливу кислот та інших факторів навколишнього середовища, які можуть інактивувати з'єднання. Фармацевтичні з'єднання, запропоновані у винаході, можуть включати одну або декілька фармацевтично прийнятних солей. Поняття "фармацевтично прийнятна сіль" відноситься до солі, яка зберігає необхідну біологічну активність батьківського з'єднання і не викликає ніяких небажаних токсикологічних дій (див., наприклад, Berge S.M., та ін., J. Pharm. Sci. 66, 1977, сс. 119). Прикладами таких солей є кислотно-адитивні солі та солі приєднання основ. До кислотноадитивних солей відносяться солі, утворені з нетоксичних неорганічних кислот, таких як соляна, азотна, фосфорна, сірчана, бромводнева, йодводнева, фосфориста кислота і т.п., а також з нетоксичних органічних кислот, таких як аліфатичні моно- і дикарбонові кислоти, заміщені фенілом алканові кислоти, оксиалканові кислоти, ароматичні кислоти, аліфатичні та ароматичні сульфонові кислоти і т.п. Солі приєднання основ включають солі, утворені з лужноземельними металами, такими як натрій, калій, магній, кальцій і т.п., а також з нетоксичними органічними амінами, такими як N, N'-дибензилетилендиамін, N-метилглюкамін, хлорпрокаїн, холін, диетаноламін, етилендиамін, прокаїн і т.п. Фармацевтична композиція, запропонована у винаході, може містити також фармацевтично прийнятний антиоксидант. Прикладами фармацевтично прийнятних антиоксидантів є: водорозчинні антиоксиданти, такі як аскорбінова кислота, гідрохлорид цистеїну, бісульфат натрію, метабісульфіт натрію, сульфіт натрію і т.п.; жиророзчинні антиоксиданти, такі як аскорбілпальмітат, бутильований гідроксианізол (ВГА), бутильований гідрокситолуол (БГТ), лецитин, пропілгалат, альфа-токоферол і т.п.; металхелатуючі агенти, такі як лимонна кислота, етилендиамінтетраоцтова кислота (ЕДТК), сорбіт, винна кислота, фосфорна кислота і т.п. Прикладами прийнятних водних і неводних носіїв, які можна застосовувати у фармацевтичних композиціях, запропонованих у винаході, є вода, етанол, поліоли (такі як гліцерин, пропіленгліколь, поліетитіленгліколь і т.п.) та їх прийнятні суміші, рослинні олії, такі як маслинова олія, і придатні для ін'єкцій складні органічні ефіри, такі як етилолеат. Необхідну плинність можна підтримувати, наприклад, за допомогою матеріалів, що застосовуються для нанесення покриттів, таких як лецитин, зберігаючи необхідний розмір частинок у випадку дисперсій, і за допомогою поверхнево-активних речовин. Зазначені композиції можуть містити також ад'юванти, такі як консерванти, агенти, що змочують, емульгатори та диспергуючі речовини. Відсутність мікроорганізмів можна гарантувати як за допомогою описаних вище процесів стерилізації, так і включенням різних антибактеріальних і протигрибкових засобів, таких, наприклад, як парабен, хлорбутанол, фенол, сорбінова кислота і т.п. Може виявитися бажаним включати в композиції агенти, що надають ізотонічність, такі як цукри, хлорид натрію і т.п. Крім того, можна одержувати фармацевтичну форму з пролонгованою абсорбцією, що ін'єкується, наприклад, шляхом включення агентів, які сповільнюють абсорбцію, таких як моностеарат алюмінію і желатин. Фармацевтично прийнятні носії являють собою стерильні водяні розчини або дисперсії та стерильні порошки для приготування при необхідності стерильних розчинів, що ін'єкуються, або дисперсії. Застосування таких середовищ і агентів для фармацевтичних діючих речовин відомо у цій галузі. За винятком випадку, коли будь-які із загальноприйнятих середовищ або агентів не сумісні з діючою речовиною, передбачається їх застосування у фармацевтичних композиціях, запропонованих у винаході. У композиції можна включати також додаткові діючі речовини. Терапевтичні композиції, як правило, повинні бути стерильними та стабільними в умовах 28