Композиція антитіла до cd105 та її застосування

Реферат: Винахід стосується композиції, що містить від приблизно 25 до приблизно 100 мг/мл антитіла до CD105, від 10 до 20 мМ буферного агента, до приблизно 240 мМ поліолу та рН від приблизно 4,0 до приблизно 5,5; де буферним агентом є ацетат, гістидин або фосфат, де поліол є цукром, і де композиція підтримує стабільність та ефективність антитіла до CD105. Також винахід стосується заздалегідь наповненого шприца, придатного для внутрішньовенного або інтравітреального введення, що включає дану композицію, та застосування композиції у формуванні лікарського засобу для лікування захворювання, пов'язаного з ангіогенезом. UA 115789 C2 (12) UA 115789 C2 UA 115789 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [0001] Ця заявка містить перелік послідовностей, який був представлений у форматі ASCII з допомогою програмного додатку EFS-Web та є включеним сюди у вигляді посилання в повному обсязі. Зазначена копія ASCII, створена 4 вересня 2013 р., отримала назву 35882-714.601_SL.txt та має розмір 22121 байт. [0002] Рак є другою головною причиною смерті людини після серцево-судинних захворювань, та кожен рік мільйони людей вмирають від цієї хвороби. Тільки у Сполучених Штатах кожного року рак викликає смерть значно більш, ніж півмільйона осіб разом з появою приблизно 1,4 мільйонів нових встановлених випадків цього захворювання. У той час, як кількість смертельних випадків від серцево-судинних захворювань значно скорочується, кількість смертей від раку звичайно зростає, та у багатьох країнах рак вже є головною причиною смерті. [0003] Крім того, загальний досвід навіть тих хворих на рак, якім спочатку вдалося вижити після первинної стадії захворювання, показав, що їх життя різко змінилося. Багато хворих на рак відчувають сильні побоювання, обумовлені усвідомленням можливості повторення хвороби або невдалого лікування. Також багато хворих на рак після лікування відчувають значне фізичне виснаження. [0004] Взагалі кажучи, основною проблемою у лікуванні найбільш смертоносних видів раку є відсутність ефективної та нетоксичної системної терапії. Рак є складним захворюванням, що характеризується наявністю генетичних мутацій, які призводять до неконтрольованого росту клітин. Ракові клітини є присутніми у всіх організмах, та в нормальних умовах їх надмірний ріст жорстко регулюється різними фізіологічними факторами. [0005] Ангіогенез є фізіологічним процесом, при якому з вже існуючих судин розвиваються нові кровоносні судини. Припускають, що ангіогенез відіграє важливу роль у розвитку як нормальних, так і патологічних процесів. Наприклад, ангіогенні процеси є залученими до розвитку судинних систем тваринних органів та тканин. [0006] У разі виникнення деяких патологічних станів стимулювання ангіогенезу є засобом забезпечення належного постачання крові та поживних речовин до клітин всередині ураженої тканини. Багато з цих патологічних станів охоплюють проліферацію та/або регулювання аберантних клітин. Солідні види раку та ексудативна дегенерація жовтої плями залежать від задіяння нового кровопостачання для подовження росту, а також утворення метастазу. [0007] Заявленим винаходом створені нові композиції анти-CD105 антитіл, попередньо заповнені шприці, які містять ці композиції та застосування цих композицій у лікуванні пов’язаних з ангіогенезом розладів. Заявленим винаходом створені композиції, які можуть бути застосовані для внутрішньовенного або внутрішньоочного введення, наприклад, для лікування пов’язаних з CD105 онкологічних захворювань та офтальмологічних станів. [0008] У одному аспекті передбачено композицію, яка містить приблизно 1-150 мг/мл антиCD105 антитіла або його антиген-зв’язуючого фрагменту, до приблизно 100 мM буферизуючого агента, до приблизно 1 M поліолу, та має pH у межах приблизно 4,0-7,5. [0009] У одному аспекті, композиція в процесі отримання є стійкою речовиною, яку можна піддати перевірці з допомогою загальноприйнятних засобів. Щодо стійкості композиції протягом часу, то принаймні 95% анти-CD105 антитіла або його антиген-зв’язуючого фрагменту може знаходитися у вигляді мономерів протягом принаймні приблизно 12-місячного зберігання при температурі приблизно 2-8°C, як було виміряно шляхом ексклюзійної хроматографії (SEC). У деяких втіленнях буферизуючим агентом такої композиції є гістидин або фосфатно-сольовий буфер. Також щодо стійкості композиції протягом часу слід зазначити, що принаймні 90% антиCD105 антитіла або його антиген-зв’язуючого фрагменту може знаходитися у вигляді мономерів протягом принаймні приблизно 6-місячного зберігання при температурі приблизно 25°C, як було виміряно ексклюзійної хроматографії (SEC). У деяких втіленнях буферизуючим агентом таких композицій є ацетат. [0010] Крім того, анти-CD105 антитіло або його антиген-зв’язуючий фрагмент виявляє приблизно 50-150% зв’язування в результаті CD105 ІФА перевірки на зв’язувальну властивість після зберігання при температурі приблизно 2-8°C протягом принаймні 12 місяців.. [0011] Середня ізоелектрична точка (pI) анти-CD105 антитіла може дорівнювати приблизно 8.7-9.2 після принаймні приблизно 12-місячного зберігання при температурі приблизно 2-8°C, як було визначено, шляхом наприклад, капілярного електрофорезу-ізоелектричного фокусування. [0012] Будь-якому фахівцю буде зрозуміло, що анти-CD105 антитіло або його антигензв’язуючий фрагмент може зберігати стійкість протягом принаймні приблизно 12 місяців, принаймні приблизно 18 місяців, принаймні приблизно 24 місяців, принаймні приблизно 30 місяців, принаймні приблизно 36 місяців або більше. [0013] Композиція може містити принаймні 95% анти-CD105 антитіл у вигляді мономерів, як 1 UA 115789 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 було виміряно шляхом SEC під час циклів заморожування-відтавання цієї речовини. Альтернативним чином або додатково композиція може містити принаймні 95% анти-CD105 антитіл у вигляді мономерів, як було виміряно шляхом SEC при їх струшуванні. [0014] Анти-CD105 антитіло або його антиген-зв’язуючий фрагмент може містити будь-яку послідовність, яка має CDR-ділянки, здатні до зв’язування з CD105. У одному необмеженому втіленні анти-CD105 антитіло містить легколанцюгову змінну ділянку (V L), яка має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №: 1; легколанцюгову сталу ділянку (CL), яка має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №: 2; важколанцюгову змінну ділянку (VH), яка має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №: 3; та сталу ділянку (Fc), яка має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №: 4 (Див., наприклад, Фіг. 1). [0015] У іншому необмеженому втіленні анти-CD105 антитіло містить ділянку VL CDR1, яка має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №: 5; ділянку VL CDR2, яка має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №: 6; ділянку VL CDR3, яка має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №: 7; ділянку V H CDR1, яка має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №: 8; ділянку V H CDR2, яка має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №: 9; та ділянку V H CDR3, яка має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №: 10. [0016] Виділені гуманізовані, деімунізовані анти-CD105 антитіла можуть містити важколанцюгову змінну ділянку, як має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №: 11 та легколанцюгову змінну ділянку, яка має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №: 12. Інші необмежені приклади гуманізованих-деімунізованих важких ланцюгів охоплюють, але без обмеження, послідовності SEQ ID №№: 13, 14, 15 та 16. Інші необмежені приклади гуманізованих-деімунізованих легких ланцюгів охоплюють, але без обмеження, послідовності SEQ ID №№: 17, 18, 19, 20, 21, 22, та 23. Ці послідовності наведені нижче у Прикладі 17. [0017] Композиція може містити приблизно 1-150 мг/мл анти-CD105 антитіл або їх антигензв’язуючих фрагментів або будь-яку їх кількість, включаючи, але без обмеження приблизно 2 мг/мл, приблизно 5 мг/мл, приблизно 7.5 мг/мл, приблизно 10 мг/мл, 20 мг/мл, приблизно 25 мг/мл, приблизно 30 мг/мл, приблизно 35 мг/мл, приблизно 40 мг/мл, приблизно 45 мг/мл, приблизно 50 мг/мл, приблизно 55 мг/мл, приблизно 60 мг/мл, приблизно 65 мг/мл, приблизно 70 мг/мл, приблизно 75 мг/мл, приблизно 80 мг/мл, приблизно 85 мг/мл, приблизно 90 мг/мл, приблизно 95 мг/мл, приблизно 100 мг/мл, приблизно 105 мг/мл, приблизно 110 мг/мл, приблизно 115 мг/мл, приблизно 120 мг/мл, приблизно 125 мг/мл, приблизно 130 мг/мл, приблизно 135 мг/мл, приблизно 140 мг/мл, приблизно 145 мг/мл, приблизно 150 мг/мл або більше. [0018] У одному втіленні композиція містить приблизно 25 мг/мл анти-CD105 антитіл або їх антиген-зв’язуючих фрагментів. [0019] У іншому втіленні композиція містить приблизно 50 мг/мл анти-CD105 антитіл або їх антиген-зв’язуючих фрагментів. [0020] У іншому втіленні композиція містить приблизно 100 мг/мл анти-CD105 антитіл або їх антиген-зв’язуючих фрагментів [0021] Композиції, подібні описаним тут можуть містити буферизуючий агент, як-то, наприклад, гістидин, ацетат, цитрат або фосфат. У одному втіленні композиція містить приблизно 5 мM, приблизно 7.5 мM, приблизно 10 мM, приблизно 12.5 мM, приблизно 15 мM, приблизно 17.5 мM, 20 мM, приблизно 22.5 мM, приблизно 25 мM, приблизно 30 мM, приблизно 35 мM, приблизно 40 мM, приблизно 45 мM, приблизно 50 мM, приблизно 55 мM, приблизно 60 мM, приблизно 65 мM, приблизно 70 мM, приблизно 75 мM, приблизно 80 мM, приблизно 85 мM, приблизно 90 мM, приблизно 95 мМ або приблизно 100 мМ гістидину, ацетату, цитрату або фосфату. [0022] Композиції можуть бути отримані для будь-якого відомого для антитіл типу введення, які охоплюють, але без обмеження, ін'єкцію у склоподібне тіло та внутрішньовенне введення. [0023] Створені тут композиції можуть додатково містити прийнятний носій або наповнювач, включаючи будь-який носій або наповнювач, який є фармацевтично прийнятним носієм або наповнювачем та який є прийнятним для введення пацієнту. [0024] У одному втіленні передбачена тут композиція є ізотонічною. Термін “ізотонічний” означає, що інтересуюча композиція має по суті такий саме осмотичний тиск, як і людська кров. Головним чином ізотонічні композиції мають осмотичний тиск приблизно 250-350 міліосмолей (мOсм). Ізотонічність можна виміряти з застосуванням газопарових або кріоскопічних осмометрів. Наприклад. у іншому втіленні, передбачена там композиція є гіпертонічною. Якщо “ізотонічна” композиція є такою, що має по суті такий саме осмотичний тиск, як і людська кров, то, відповідно, термін “гіпертонічна” застосовують для описання композиції, осмотичний тиск 2 UA 115789 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 якого перевищує осмотичний тиск людської крові. [0025] Передбачена тут композиція може містити поліол з концентрацією, меншою, ніж 1 M. Наприклад, композиція може містити поліол з концентрацією приблизно 50 мM, приблизно 75 мM, приблизно 100 мM, приблизно 150 мM, приблизно 200 мM, приблизно 225 мM, приблизно 240 мM, приблизно 250 мM, приблизно 300 мM, приблизно 350 мM, приблизно 400 мM, приблизно 450 мM, приблизно 500 мM, приблизно 550 мM, приблизно 600 мM, приблизно 650 мM, приблизно 700 мM, приблизно 750 мM, приблизно 800 мM, приблизно 850 мM, приблизно 900 мM, приблизно 950 мM, приблизно 1 M або яка дорівнює будь-якому цілому числу у цих межах. У одному втіленні ізотонічну композицію отримують з сіллю з концентрацією приблизно 100-175 мM, наприклад, композицію, яка містить менш, ніж 300 мМ поліолу отримують у ізотонічному стані з сіллю з концентрацією приблизно 130 мM. [0026] У одному аспекті, поліол для застосування у передбачених тут композиціях може бути цукром, як-то, наприклад, невідновлювальним цукром. Типові приклади невідновлювальних цукрів охоплюють, але без обмеження, трегалозу та цукрозу. Наприклад, композиція може містити приблизно 200 мМ - 300 мМ трегалози або цукрози. У одному втіленні композиція може містити приблизно 240 мМ трегалози або цукрози. [0027] Альтернативним чином, цукор може бути сорбітом у кількості (з концентрацією) приблизно 200-300 мM. У одному втіленні композиція може містити приблизно 240 мМ сорбіту. [0028] Додатковими необмеженими прикладами передбаченої тут композиції є будь-які з композицій 1-39 у Таблиці 1. [0029] Передбачена тут композиція може мати pH приблизно 4,0-7,5. У одному втіленні передбачена тут композиція може мати pH приблизно 4.5, приблизно 5.0, приблизно 5.5, приблизно 6.0, приблизно 6.5 або приблизно 7.0. [0030] У одному втіленні створені тут композиції не містять поверхнево-активну речовину, але вибірково, у деяких випадках, поверхнево-активна речовина може бути включеною до складу композицій. Необмежені приклади поверхнево-активних речовин охоплюють полісорбат 20, полісорбат 80 та Pluronic® F68. [0031] Також винаходом передбачено попередньо наповнений шприц, прийнятний для внутрішньовенного введення або введення у скловидне тіло, який містить описану тут композицію. Такі попередньо наповнені шприці можуть бути запакованими та обладнаними маркуванням для застосування у лікуванні пов’язаного з ангіогенезом стану, як-то будь-якого з описаних тут станів. Також пакування можуть містити інструкції по зберіганню та застосуванню. Також передбачено пакування, яке містить один або декілька попередньо заповнених шприців, прийнятних для внутрішньовенного введення або до введення у скловидне тіло, що містять композиція за будь-яким з попередніх пунктів. [0032] Одне втілення цієї заявки передбачає застосування будь-якої з описаних тут композицій для отримання лікарського препарату для лікування описаних тут розладів. Лікарські препарати можуть бути отримані у залежності від фізичних характеристик пацієнта/суб’єкта, який потребує лікування та можуть бути отримані у вигляді однієї або декількох композицій. Лікарські препарати можуть бути запакованими у прийнятне пакування з відповідним маркуванням для розподілу у клініки та лікарні, яке містить вказівки по лікуванню розладу у суб’єкта. Лікарські препарати можуть бути запакованими у вигляді однієї або декількох одиниць. Також пакування може містити інструкції по дозуваннюта застосуванню описаних тут композицій. [0033] Заявленим винаходом передбачено спосіб лікування захворювання, пов’язаного з ангіогенезом у пацієнта (суб’єкта), який потребує такого лікування, який полягає у введенні зазначеному пацієнту описаної тут композиції. Такі композиції можуть бути введені пацієнту або внутрішньовенно або шляхом введення у скловидне тіло. [0034] Описані тут захворювання, пов’язані з ангіогенезом можуть бути, наприклад, раком або метастазами. У одному втіленні рак є твердою пухлиною. Прийнятні для лікування види раку охоплюють, наприклад, пухлини на основі епітеліальної тканини. Необмежені прийнятні для лікування приклади захворювань на рак охоплюють, але без обмеження, рак легенів, гінекологічні злоякісні хвороби, меланому, рак молочної залози, рак підшлункової залози, рак яєчника, рак матки, рак товстої кишки, рак передміхурової залози, рак нирок, рак голови, рак підшлункової залози, рак печінки (гепатоцелюлярний рак), рак шиї, рак нирок (нирково-клітинний рак), саркому, мієлому та лімфому. Композиції для лікування раку або метастазів можуть бути введені пацієнту внутрішньовенно. [0035] Альтернативним чином, описане тут пов’язане з ангіогенезом захворювання може бути, наприклад, офтальмологічним станом. Офтальмологічні стани охоплюють, але без обмеження, вікову макулодистрофію, діабетичну ретинопатію, макулярний набряк та/або 3 UA 115789 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 хоріоїдальну неоваскуляризацією Вікова макулодистрофія може сухою та вологою. Композиції для лікування офтальмологічного стану можуть бути введені пацієнту у скловидне тіло. [0036] З допомогою таких способів композицію можна вводити пацієнтові один або більше разів. Наприклад, композицію можуть вводити раз на день, раз на тиждень, раз на місяць, раз на два місяці, раз на два місяці, раз на три місяці, раз на чотири місяці, через кожні 5 місяців або раз на 6 місяців. Схеми лікування можуть бути збільшені або зменшені в разі необхідності в залежності від реакції пацієнта на лікування. [0037] У одному аспекті композицію вводять аж до усунення однієї або декількох ознак або симптомів пов’язаного з ангіогенезом захворювання. [0038] Щодо офтальмологічних станів, то одна або більше ознак або симптомів таких станів може охоплювати, але без обмеження, пов'язане з очної хворобою скорочення кровоносних судин, пригнічення проліферації ендотеліальних клітин, чіткі ознаки або симптоми кровотечі, лікування помутніння зору, забезпечення затримки втрати зору, поліпшення зору, підвищення гостроти зору, зменшення макулярного набряку та/або запобігання витоку кровоносних судин. [0039] Відносно раку або метастазів слід зазначити, що лікування може привести до покращення стану пацієнта та його результати можна оцінити шляхом визначення появи одного або декількох наступних факторів, як-то зниження клітинної проліферації, зниження кількості клітин, збільшення апоптозу або зниження виживання принаймні частини клітин, уражених клітинним проліферативним розладом. [0040] Лікування може привести до часткового або до повного усунення пухлин або метастазів та/або до подовження строку життя пацієнта. [0041] У одному втіленні після введення пацієнту однієї або декількох доз композиції тривалість або суворість однієї або декількох ознак або симптомів скорочується приблизно на 2%, приблизно на 5%, приблизно на 10%, приблизно на 15%, приблизно на 20%, приблизно на 25%, приблизно на 30%, приблизно на 35%, приблизно на 40%, приблизно на 45%, приблизно на 50%, приблизно на 55%, приблизно на 60%, приблизно на 65%, приблизно на 70%, приблизно на 75%, приблизно на 80%, приблизно на 90%, приблизно на 95% або приблизно на 100%. [0042] У іншому втіленні після введення пацієнту однієї або декількох доз композиції тривалість або суворість однієї або декількох ознак або симптомів скорочується приблизно у 2 рази, приблизно у 5 разів, приблизно у 10 разів, приблизно у 15 разів, приблизно у 20 разів, приблизно у 25 разів, приблизно у 30 разів, приблизно у 35 разів, приблизно у 40 разів, приблизно у 45 разів, приблизно у 50 разів, приблизно у 55 разів, приблизно у 60 разів, приблизно у 65 разів, приблизно у 70 разів, приблизно у 75 разів, приблизно у 80 разів, приблизно у 90 разів, приблизно у 95 разів, приблизно у 100 разів або більше. [0043] Заявленим винаходом передбачено спосіб лікування офтальмологічного стану у пацієнта, який того потребує, який полягає у введенні зазначеному пацієнту описаної тут композиції, в результаті чого одна або декілька ознак або симптомів зазначеного офтальмологічного стану покращуються шляхом лікування. Введення композиції також може бути здійснено у скловидне тіло. [0044] Також заявленим винаходом передбачено спосіб запобігання або лікування раку або метастазів у суб’єкта, який цього потребує, який полягає у введенні пацієнту описаної тут композиції, в результаті чого виникає покращення однієї або декількох ознак або симптомів вказаного раку або метастазів. Введення композиції може бути внутрішньовенним. [0045] У передбачених тут способах призначений для лікування суб’єкт може бути людиною або твариною. Створені тут композиції можуть бути введені один або багато разів залежно від стану здоров'я пацієнта, розвитку захворювання або стану та від ефективності лікування. Відповідні узгодження в ході терапії та лікування можуть бути здійснені впродовж курсу лікування (наприклад, шляхом змінення дозування антитіл у композиції). [0046] Заявленим винаходом передбачено спосіб моніторингу ефективності одного або кількох з будь-яких передбачених тут способів. Рівні розчинного CD105 корелюють з виживанням пацієнтів, хворих на рак та можуть піддані моніторингу перед та протягом терапії, отже вони можуть бути свідченням того, що терапевтичний режим є ефективним для лікування пацієнта. Процедури, описані тут, можуть включати в себе один або більше додаткових етапів лікування. Включення шляхом посилання. [0047] Всі зазначені у цій заявці публікації, патенти та патентні заявки включені сюди у вигляді посилання в такій саме мірі, як якщо б кожна окрема публікація, патент або заявка на патент була б конкретно та індивідуально зазначена включеною шляхом посилання. 60 4 UA 115789 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Стислий опис фігур. [0048] Нові ознаки втілень докладно наведені у доданій Формулі Винаходу. Краще розуміння особливостей та переваг цих втілень може бути отримано шляхом посилання на подальший докладний опис, який містить ілюстративні втілення, у яких застосовано принципи втілень та доданими кресленнями, у яких: [0049] У Фіг. 1A-J наведені зразкові амінокислотні послідовності описаного тут анти-CD105 антитіла (TRC105). У Фіг. 1A наведено послідовність типового змінного легкого (VL) ланцюга анти-CD105 антитіла (SEQ ID №: 1); у Фіг. 1B наведено послідовність типового сталого легкого ланцюга (CL) анти-CD105 антитіла (SEQ ID №: 2); у Фіг. 1C наведено послідовність типового змінного важкого (VH) ланцюга анти-CD105 антитіла (SEQ ID №: 3); та у Фіг. 1D наведено послідовність типового сталого гамма-1 важкого ланцюга анти-CD105 антитіла (SEQ ID №: 4). У Фіг. 1E-G, відповідно, наведені CDR 1, 2 та 3 типового змінного легкого (VL) ланцюга. У Фіг. 1HJ, відповідно, наведені CDR 1, 2 та 3 типового змінного важкого (VН) ланцюга. [0050] У Фіг. 2 наведено діаграму шляху сигналування TGF-/ALK5. Шлях TGF-/ALK5 (A) веде до пригнічення клітинної проліферації. Шлях TGF-/ALK1 (B) викликає проліферацію ендотеліальних клітин та потребує наявності CD105 (ендогліну) для сигналування ALK1. Пунктирними лініями позначені неактивні або заблоковані шляхи. Напівжирна стрілка вказує на стимулювання шляху сигналування. [0051] Слід розуміти, що застосована у цьому документі термінологія наведена з метою опису лише певних втілень та не призначена для обмеження. Крім того, слід розуміти, що у практичному втіленні цих винаходів можуть бути застосовані численні способи та матеріали, які є подібними до описаних тут. [0052] У відповідності з цією заявкою також можуть бути застосовані способи звичайної клітинної біології, молекулярної біології, мікробіології та застосування рекомбінантних ДНК, як повністю описано у цій галузі. [0053] Як застосовано у цій заявці та у доданій Формулі Винаходу, одиничні значення можуть охоплювати також посилання на множину, якщо тільки у контексті ясно не зазначено іншого. Отже, наприклад, посилання на “спосіб” охоплює один або декілька способів та/або етапів описаного тут типу та/або які стануть очевидними для фахівців в даній галузі після читання цієї заявки. [0054] Анти-CD105 антитіла можуть бути застосовані для лікування або запобігання різних форм розладів, пов’язаних з ангіогенезом. Тут описані способи лікування різних форм раку, твердих пухлин, метастазів тощо шляхом введення описаних тут композицій. [0055] Як тут застосовано, термін “антитіло” має відношення до імуноглобуліну (Ig), який є природним або частково або повністю має синтетичне походження. Термін також охоплює будьякий поліпептид або білок, який має зв’язувальний домен, який є антиген-зв’язуючим доменом або є гомологічним цьому домену. Термін також охоплює “антиген-зв’язувальні фрагменти” та інші взаємозамінні терміни для позначення подібних зв’язувальних фрагментів, як-то описані нижче. [0056] Нативні антитіла та нативні імуноглобуліни звичайно є гетеротетрамерними глікобілками розміром приблизно у 150,000 Да, які складаються з двох ідентичних легких (L) ланцюгів та двох ідентичних важких (H) ланцюгів. Кожен легкий ланцюг звичайно є приєднаним до важкого ланцюга з допомогою одного ковалентного дисульфідного зв'язку, тоді як число дисульфідних зв'язків варіює серед важких ланцюгів різних ізотипів імуноглобуліну. Кожен важкий та легкий ланцюг також має регулярно розташовані всередині дисульфідні містки. Кожен важкий ланцюг має на одному кінці змінний домен (“VH” або “VH”), за яким знаходиться кілька сталих доменів (“CH” або “CH”). Кожен легкий ланцюг має на одному кінці змінний домен (“V L” або “VL”) та сталий домен (“CL” або “CL”) на іншому кінці, сталий домен легкого ланцюга є вирівняним з першим сталим доменом важкого ланцюга та змінний домен легкого ланцюга є вирівняним зі змінним доменом важкого ланцюга. Вважається, що окремі амінокислотні залишки утворюють поверхню поділу між легко- та важколанцюговим змінними доменами. [0057] Як тут застосовано, терміни “синтетичний полінуклеотид,” “синтетичний ген” або “синтетичний поліпептид,” означають, що відповідна полінуклеотидна послідовність або її частина або амінокислотна послідовність або її частина є отриманою з послідовності, розробленої або синтезованої de novo або зміненою порівняно до еквівалентної послідовності природного походження. Синтетичні полінуклеотиди (антитіла або антиген-зв’язуючі фрагменти) або синтетичні гени можуть бути отримані з допомогою відомих у цій галузі способів, включаючи, але без обмеження, хімічний синтез нуклеїнових кислот або амінокислотних послідовностей. Синтетичні гени звичайно відрізняються від генів природного походження на амінокислотному або на полінуклеотидному рівні (або на обох рівнях) та, як правило, 5 UA 115789 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 розташовані у контексті синтетичних послідовностей, контролюючих експресію. У порівнянні з природним геном, полінуклеотидні послідовності синтетичного гена не обов'язково кодують білки з різними амінокислотами. Наприклад, вони можуть також містити синтетичні полінуклеотидні послідовності, які включають різні кодони, але кодують ту ж саме амінокислоту (тобто нуклеотидні змінення, які являють собою “мовчазні “мутації на амінокислотному рівні). [0058] Щодо антитіл, то термін “змінний домен” має відношення до змінних доменів антитіл, які є залученими у зв’язуванні та мають відношення до специфічності кожного окремого антитіла до свого окремого антигену. Однак, мінливість є нерівномірно розподіленою по довжині змінних доменів антитіл, а скоріше, вона є сконцентрованою у трьох сегментах, які мають назву гіперзмінних ділянок (також відомі як CDR) в обох змінних доменах легкого та важкого ланцюга. Набагато більш консервативні частини змінних доменів отримали назву “каркасних ділянок” або “FR.” Кожен зі змінних доменів немодифікованих важкого та легкого ланцюгів містить чотири FR (FR1, FR2, FR3 та FR4), в основному приймаючих бета-листову конфігурацію, яка перемежається з трьома CDR, які утворюють петлі, що з'єднують та, у деяких випадках, складають частину бета-листової структури. CDR у кожному ланцюзі утримуються разом в безпосередній близькості від FR та, разом з CDR з іншого ланцюга, сприяють утворенню антиген-зв’язуючої ділянки антитіла (див. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (“Послідовності білків, цікавих з імунологічної точки зору“), 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), pages 647-669). [0059] Застосовані тут терміни “гіперзмінна ділянка” та “CDR” мають відношення до амінокислотних залишків антитіл, відповідних за зв’язування з антигеном. CDR містять амінокислотні залишки з трьох послідовностей ділянок, які комплементарно зв’язуються з антигеном та відомі під назвами CDR1, CDR2, та CDR3 для кожного з V H та VL ланцюгів. Звичайно ділянки CDR у змінному домені легкого ланцюга приблизно відповідають залишкам 24-34 (CDRL1), 50-56 (CDRL2) та 89-97 (CDRL3) та ділянки CDR у змінному домені важкого ланцюга звичайно приблизно відповідають залишкам 31-35 (CDRH1), 50-65 (CDRH2) та 95-102 (CDRH3) (згідно з Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (“Послідовності білків, цікавих з імунологічної точки зору“), 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Зрозуміло, що ділянки CDR різних антитіл можуть містити вставки, отже нумерація амінокислот може відрізнятися. Система нумерації Kabat враховує ці вставки з допомогою схеми нумерації, у якій застосовано букви, прикріплені до певних залишків (наприклад, 27A, 27B, 27C, 27D, 27E, та 27F у CDRL1 легкого ланцюга) для відображення будьяких вставок у нумераціях між різними антитілами. Альтернативним чином, згідно до системи нумерації від Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987), звичайно ділянки CDR у змінному домені легкого ланцюга приблизно відповідають залишкам 26-32 (CDRL1), 50-52 (CDRL2) та 91-96 (CDRL3) та ділянки CDR у змінному домені важкого ланцюга звичайно приблизно відповідають залишкам 26-32 (CDRH1), 53-55 (CDRH2) та 96-101 (CDRH3). [0060] Як тут застосовано, “каркасна ділянка” або “FR” має відношення до каркасних амінокислотних залишків, які утворюють частину антиген-зв’язуючої кишені або щілини та амінокислотні залишки у петельній ділянці або можуть або не можуть контактувати з антигеном. Звичайно каркасні ділянки містять ділянки, які розташовані між CDR. У змінному домені легкого ланцюга, FR-ділянки звичайно приблизно відповідають залишкам 0-23 (FRL1), 35-49 (FRL2), 5788 (FRL3) та 98-109 та у змінному домені важкого ланцюга FR-ділянки звичайно приблизно відповідають залишкам 0-30 (FRH1), 36-49 (FRH2), 66-94 (FRH3) та 103-133 (згідно з Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (“Послідовності білків, цікавих з імунологічної точки зору“), 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Як обговорювалося вище щодо нумерації Kabat для легкого ланцюга, система нумерації Kabat також подібним чином враховує вставки для важкого ланцюга (наприклад, 35A, 35B CDRH1 у важкому ланцюзі). Альтернативним чином, згідно до системи нумерації від Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987), звичайно FR-ділянки у змінному домені легкого ланцюга приблизно відповідають залишкам 0-25 (FRL1), 33-49 (FRL2) 53-90 (FRL3), та 97-109 (FRL4) та звичайно FR-ділянки у змінному домені важкого ланцюга приблизно відповідають залишкам 025 (FRH1), 33-52 (FRH2), 56-95 (FRH3), та 102-113 (FRH4). [0061] Сталі домени (Fc) антитіл безпосередньо не залучені до зв’язування антитіл з антигеном, але вони часто демонструють різні ефекторні функції, як-то участь антитіл у залежній від антитіл клітинній токсичності шляхом взаємодії з, наприклад Fc-рецепторами (FcR). Fc-домени також можуть збільшувати біодоступність антитіл у кровотоці після введення пацієнту. Заміщення мишачого Fc-домену Fc-доменом людини може також зменшити побічні HAMA-реакції. [0062] У залежності від амінокислотної послідовності сталого домену своїх важких ланцюгів, 6 UA 115789 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 імуноглобуліни можуть бути розподілені на різні класи. Існує 5 головних класів імуноглобулінів: IgA, IgD, IgE, IgG, та IgM та деякі з них також додатково можуть бути розділені на підкласи (підтипи), наприклад, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, та IgA2. Сталі домени важкого ланцюга (Fc), які відносяться до різних класів імуноглобулінів отримали, відповідно, назви , , ,  та . Субодиничні структури та тривимірні конфігурації різних класів імуноглобулінів є добре відомими. [0063] Беручи за основу амінокислотні послідовності їх сталих доменів, “легкі ланцюги” антитіл будь-яких видів хребетних тварин можна віднести до одного із двох чітко відокремлених типів, які отримали назву каппа або (“”) та лямбда або (“”). [0064] Терміни “антиген-зв’язувальна частка антитіла,” “антиген-зв’язуючий фрагмент,” “антиген-зв’язуючий домен,” “фрагмент антитіла” або “функціональний фрагмент антитіла” тут застосовані взаємозамінне для позначення одного або декількох фрагментів антитіла, які зберігають здатність до специфічного зв’язування з антигеном. Необмежені приклади фрагментів антитіла, які охоплюються цими термінами охоплюють, але без обмеження, (i) фрагмент Fab, моновалентний фрагмент, який складається з доменів VL, VH, CL та CH1; (ii) фрагмент F(ab')2, бівалентний фрагмент, який містить два фрагменти Fab, приєднані через дисульфідний місток до шарнірної ділянки; (iii) фрагмент Fd, який складається з доменів V H та CH1; (iv) фрагмент Fv, який містить домени VL та VH у складі одного”плеча” антитіла, (v) фрагмент dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544 546), який містить домен V H; та (vi) виділений CDR. Додатково це визначення охоплює “половинні” антитіла, які містять одиничний важкий та одиничний легкий ланцюги та інші форми антитіл з одиничними ланцюгами, як-то діатіла. [0065] Функціональні групи “F(ab')2” та “Fab'“ можуть бути отримані шляхом обробки імуноглобулінів протеазою, як-то пепсином та папаїном та містять фрагменти антитіл, отримані шляхом розщеплення імуноглобуліну поруч з дисульфідними зв'язками, розташованими між шарнірними ділянками у кожному з двох важких ланцюгів. Наприклад, папаїн розщеплює IgG перед дисульфідними зв'язками, розташованими між шарнірними ділянками у кожному з двох важких ланцюгів з отриманням двох гомологічних фрагментів антитіла, у яких легкий ланцюг, що складається з VL та CL (легколанцюгова стала ділянка), та фрагмент важкого ланцюга, що складається з VH та ділянки CH1 (1) у сталій ділянці важкого ланцюга) є з’єднаними у Скінцевих ділянках дисульфидним зв'язком. Кожен з цих двох гомологічних фрагментів антитіла має назву Fab'. Пепсин розщеплює IgG за дисульфідними зв'язками, розташованими між шарнірними ділянками у кожному з двох важких ланцюгів з отриманням фрагменту антитіла, трохи довшого, ніж фрагмент, у якому два зазначених вище фрагмента Fab' є з’єднаними у шарнірній ділянці. Цей фрагмент антитіла отримав назву F(ab')2. [0066] Фрагмент Fab також містить сталий домен легкого ланцюга та перший сталий домен (CH1) важкого ланцюга. Фрагменти Fab' відрізняються від фрагментів Fab додаванням кількох залишків на С-кінці домену CH1 важкого ланцюга, включаючи один або декілька цистеїнів з шарнірної ділянки антитіла. Фрагмент Fab', у якому цистеїновий залишок(залишки) сталих доменів несуть вільну тіолову групу має у цьому документі назву Fab'-SH. [0067] Фрагменти антитіл F(ab')2 спочатку були отримані у вигляді пар фрагментів Fab', які мають між ними шарнірні цистеїни. Також відомі інші хімічні поєднання фрагментів антитіл. “Fv” є фрагментом антитіла, який містить повний сайт впізнавання антигену та антигензв’язуючий сайт. Ця ділянка складається з димеру одного важкого ланцюга та одного змінного домену легкого ланцюга, щільно поєднаних нековалентним або ковалентним шляхом (дисульфідно зв’язаний Fvs було описано у науковій літературі, див. Reiter et al. (1996) Nature Biotechnology 14:1239-1245). Він знаходиться у такій конфігурації, що три CDR кожного змінного домену взаємодіють для визначення антиген-зв’язуючого сайту на поверхні димеру VH-VL. Сукупним чином, комбінація одного або декількох CDR з кожного V H та VL ланцюга наділяє антитіло антиген-зв’язуючою специфічнiстю. Наприклад, має бути зрозуміло, що у разі перенесення ланцюгів VH та VL реципієнта або їх антиген-зв’язуючих фрагментів однієї наявності CDRH3 та CDRL3 може бути достатньо для надання антитілу антиген-зв’язуючої специфічності та ці комбінації CDR можуть бути перевірені на зв’язування, спорідненість тощо з застосуванням будь-якого з описаних тут способів. Навіть одиничний змінний домен (або половина фрагменту Fv, яка містить тільки три специфічні для антигену CDR-ділянки) має здатність до впізнавання та зв’язування антигену, хоча скоріше він має нижчу спорідненість, ніж при поєднанні з другим змінним доменом. Крім того, хоча два домени фрагменту Fv (V L та VH) кодуються окремими генами, вони можуть бути з'єднані з застосуванням рекомбінантних технологій через синтетичний лінкер, що дозволяє тримати їх у вигляді єдиного білкового ланцюга, у якому ділянки VL та VH спаровуються з утворенням моновалентних молекул 7 UA 115789 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (відомих, як одиничний ланцюг Fv (scFv); Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; та Osbourn et al. (1998) Nat. Biotechnol. 16:778). Такі молекули scFv також охоплюються терміном “антиген-зв’язуюча частина” антитіл. Для отримання векторів експресії, що кодують повні молекули Ig (наприклад, IgG) або інших ізотопів, до Fc-ділянки кДНК або геномних послідовностей можуть бути приєднані будь-які послідовності VH- та VL-специфічних scFv. Послідовності VH та VL також можуть бути застосовані для отримання Fab, Fv або інших фрагментів Igs з допомогою або хімії білків або способів рекомбінантної ДНК. [0068] “Одноланцюгові Fv” або “sFv” фрагменти антитіл містять домени VH та VL антитіл, які знаходяться у одиничному поліпептидному ланцюзі. У деяких втіленнях поліпептид Fv додатково містить поліпептидний лінкер між доменами VH та VL, який дозволяє sFv утворювати бажану структуру для зв’язування антигену. Огляд різних sFv, див., наприклад, у книзі Pluckthun А. The Pharmacology of Monoclonal Antibodies (“Фармакологія моноклональних антитіл“), Vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994). [0069] Термін “AVIMER™” має відношення до класу терапевтичних білків людського походження, які не мають відношення до антитіл та фрагментів антитіл та складаються з декількох модулярних та багаторазових зв'язуючих доменів, позначених як A-домени (також позначених, як модуль класу A, повтор комплементарного типу або LDL-рецепторний домен класу А). Також їх можна отримати з зовнішньоклітинних рецепторних доменів людини з допомогою фаг-дисплею або перемішування екзонів in vitro (Silverman et al., 2005, Nat. Biotechnol. 23:1493-1494; Silverman et al., 2006, Nat. Biotechnol. 24:220). Отримані білки можуть містити багато незалежних зв’язуючих доменів, які можуть демонструвати спорідненість (у деяких випадках, субнаномолярну) та специфічність, яка є підвищеною у порівнянні з білками, що зв’язують одиничний епітоп. Див., наприклад, патентні заявки США U.S. Patent Application Publ. №№. 2005/0221384, 2005/0164301, 2005/0053973 та 2005/0089932, 2005/0048512, та 2004/0175756, кожну з яких повністю включено сюди шляхом посилання. [0070] Кожен з відомих 217 A-доменів людини містить ~35 амінокислот (~4 кДа); та ці домени відокремлені лінкерами, які в середньому займають 5 амінокислот у довжину. Нативні A-домени швидко та ефективно згортаються у однорідну та стійку структуру, яка насамперед є опосередкованою через зв’язування кальцію та утворення дисульфідних зв’язків. Ця загальна структура вимагає наявності консервативної скелетної характерної послідовності довжиною лише у 12 амінокислот. Кінцевим результатом є одиничний білковий ланцюг, який містить багато доменів, кожен з яких демонструє окрему функцію. Кожен домен білків незалежно зв’язується та енергетичні внески кожного домену є адитивними. Ці білки отримали назву авимерів (“AVIMER™”) через авидність мультимерів. [0071] Термін “діатіла” має відношення до маленьких фрагментів антитіл з двома антигензв’язуючими сайтами, які містять важколанцюговий змінний домен (VH), приєднаний до змінного домену легкого ланцюга (VL) у складі того ж саме поліпептидного ланцюга (VH-VL). з допомогою лінкера, який є занадто коротким, щоб дозволити спарювання двох доменів на одному ланцюзі, внаслідок чого домени змушені спаровуватися з комплементарними доменами іншого ланцюга та створювати два антиген-зв'язуючих сайти. Діатіла більш докладно описані у, наприклад, EP 404,097; WO 93/11161; та Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444 6448 (1993). [0072] Антиген-зв’язуючі поліпептиди також містять важколанцюгові димери, як-то, наприклад, антитіла верблюдових та акул. Антитіла верблюдових та акул містять гомодимерну пару двох ланцюгів V-подібних та C-подібних доменів (та ніколи не мають легких ланцюгів). Ділянка VH важколанцюгового димеру IgG верблюдових не може утворювати гідрофобні взаємодії з легким ланцюгом, оскільки ділянка важкого ланцюга, яка звичайно контактує з легким ланцюгом у них замінена гідрофільними амінокислотними залишками. Домени V H важколанцюгового димеру IgG отримали назву доменів VHH. Ig-NAR акул містить гомодимер одного змінного домену (який отримав назву “домен V-NAR“) та п'ять C-подібних сталих доменів (домени C-NAR). Різноманітність набору антитіл у верблюдових обумовлена наявністю CDR 1, 2 та 3 у ділянках VH або VHH. CDR3 у ділянці VHH верблюдових відрізняється відносно великою довжиною, яка сягає у середньому 16 амінокислот (Muyldermans et al., 1994, Protein Engineering 7(9): 1129) на відміну від ділянок CDR3 антитіл багатьох інших видів, наприклад, CDR3 мишачого домену VH (довжиною у 9 амінокислот). Бібліотеки змінних ділянок антитіл тварин родини верблюдових, які зберігають свою різноманітність in vivo можуть бути отримані, наприклад, з допомогою способів, наведених у патентній заявці США U.S. Patent Application Ser. No. 20050037421. [0073] “Химерні” форми антитіл іншого, окрім людини походження (наприклад, мишачих) охоплюють химерні антитіла, які містять мінімальну послідовність, отриману з Ig-імуноглобулінів 8 UA 115789 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 тваринного походження. Здебільшого химерні антитіла є мишачими антитілами, у яких принаймні частка сталої ділянки імуноглобуліну (Fc), звичайно людського імуноглобуліну є вставленою замість мишачої Fc-ділянки. Більш детально див. Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992). [0074] Як тут застосовано, термін “моноклональне антитіло” має відношення до антитіл, отриманих з популяції суттєво гомогенних антитіл, тобто індивідуальні антитіла у складі популяції є ідентичними, виключаючи можливі мутації, які трапляються в природі, що можуть бути присутніми у незначних кількостях. Моноклональні антитіла є високоспецифічними, оскільки вони спрямовані до одиничного антигенного сайту. Крім того, на відміну до композицій традиційних (поліклональних) антитіл, які можуть містити різні антитіла безпосередньо до різних сайтів зв'язування (епітопів), кожне моноклональне антитіло є спрямованим лише до одиничного сайту зв'язування антигена. Визначення "моноклональне" вказує на характер антитіла, отриманого з практично гомогенної популяції антитіл та не повинно бути тлумачено так, як вимагає отримання антитіла будь-яким певним способом. Наприклад, моноклональні антитіла можуть бути отримані з допомогою гібридомного способу, який першим описали Kohler et al., Nature 256:495 (1975) або можуть бути отримані шляхом застосування технологій рекомбінантних ДНК (див., наприклад, Патент США U.S. Pat. No. 4,816,567). У деяких втіленнях моноклональні антитіла можуть бути виділені з фагових бібліотек антитіл з допомогою способів, описаних, наприклад, у Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) та Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991). [0075] Антитіла можуть бути виділені та очищені з культурального супернатанту або згаданого вище асциту шляхом осадження насиченим сульфатом амонію, шляхом еуглобулінового висолювання, з допомогою способу з застосуванням капроевої кислоти, каприлової кислоти, іонообмінної хроматографії (DEAE або DE52) або афінної хроматографії з застосуванням анти-Ig колонки або колонки з білком A, G або L, як більш детально описано нижче. [0076] При конструюванні імуноглобулінової молекули, її змінні ділянки або частини можуть бути злиті, зв'язані або іншим чином приєднані до однієї або до декількох її сталих ділянок або частин для отримання будь-якого з описаних тут антитіл.. Це може бути досягнуто з допомогою різних відомих у цій галузі способів, в тому числі, але без обмеження, способів молекулярного клонування або прямого синтезу нуклеїнових кислот, які кодують молекули. [0077] Як тут застосовано, термін “імунореактивний” має відношення до зв’язуючих агентів, антитіл або їх фрагментів, які є специфічними до послідовності амінокислотних залишків (“сайт зв’язування” або “епітоп”), навіть якщо вони є перехресно-реактивними до інших пептидів/білків та які є нетоксичними у кількостях, у яких їх отримують для введення людині. Термін “зв’язування” має відношення до безпосереднього з'єднання двох молекул з допомогою, наприклад, взаємодій, опосередкованих ковалентним, електростатичним, гідрофобним, іонним та/або водневим зв’язком у фізіологічних умовах та включаючи такі взаємодії, як сольові та водні містки та будь-які інші звичайні засоби зв’язування. Термін “переважно зв’язує” означає, що зв’язуючий агент зв’язується з сайтом зв’язування з більшою спорідненістю, ніж він зв’язується зі сторонніми амінокислотними послідовностями. Спорідненість може бути принаймні у 1 рази більшою, принаймні у 2 рази більшою, принаймні у 3 рази більшою, принаймні у 4 рази більшою, принаймні у 5 разів більшою, принаймні у 6 разів більшою, принаймні у 7 разів більшою, принаймні у 8 разів більшою, принаймні у 9 разів більшою, у 10 разів більшою, принаймні у 20 разів більшою, принаймні у 30 разів більшою, принаймні у 40 разів більшою, принаймні у 50 разів більшою, принаймні у 60 разів більшою, принаймні у 70 разів більшою, принаймні у 80 разів більшою, принаймні у 90 разів більшою, принаймні у 100 разів більшою або принаймні у 1000 разів більшою, ніж спорідненість зв’язуючого агенту до сторонніх амінокислотних послідовностей. Терміни “імунореактивний” та “переважно зв’язує” тут застосовано взаємозамінне. [0078] Як тут застосовано, термін “спорідненість” має відношення до константи рівноваги для оборотного зв'язування двох агентів та є вираженою у вигляді Kd. Спорідненість зв’язувального білка до ліганда, як-то спорідненість антитіла для епітопу може дорівнювати, приблизно 100-0.1 наномолей (нM), приблизно 100 нM - 1 пікомоль (пM) або приблизно 100 nM 1 фемтомоль (фM). Як тут застосовано, термін “авидність” має відношення до стійкості комплексу двох або більше агентів до дисоціації після розведення. Виявлені спорідненості можуть бути визначені з допомогою імуноферментного аналізу (ІФА) або будь-якого іншого способу, відомого будь-якому фахівцю у цей галузі. Значення авидностей можуть бути визначені з допомогою, наприклад, аналізу Скетчарда або будь-якого іншого способу, відомого 9 UA 115789 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 будь-якому фахівцю у цей галузі. [0079] “Епітоп” має відношення до частини антигену або іншої макромолекули, здатної утворювати зв’язувальну взаємодію зі змінною ділянкою зв’язувальної кишені антитіла. Такі зв’язувальні взаємодії можуть проявлятися у вигляді міжмолекулярного контакту з одним або декількома амінокислотними залишками однієї або декількох CDR-ділянок. Зв’язування антигену може охоплювати, наприклад, CDR3 або пару CDR3 або, у деяких випадках може охоплювати взаємодії, до яких залучено до шести CDR-ділянок ланцюгів VH та VL. Епітоп може бути лінійною пептидною послідовністю (тобто бути “безперервним”) або може складатися з несуміжних амінокислотних послідовностей (тобто бути “конформаційним” або “переривчастим”). Aнтитіло може впізнавати одну або декілька амінокислотних послідовностей; отже епітоп можна визначити у вигляді більш, ніж однієї окремої амінокислотної послідовності. Епітопи, які впізнають антитіла можуть бути визначені з допомогою відомих фахівцям у цей галузі способів пептидного картування та аналізу послідовності. Зв’язувальні взаємодії проявляються у вигляді міжмолекулярних контактів з одним або декількома амінокислотними залишками CDR. TRC105 є мишачим антитілом, яке має таку ж саме амінокислотну послідовність, як і мишаче антитіло, описане, як Y4-2F1 або SN6j у патентах США (US patent №№ 5,928,641; 6,200,566; 6,190,660; та 7,097,836). Попередньо були визначені епітопи, яких впізнають антитіла Y4-2F1 та SN6j, отже й антитіло TRC105.. [0080] Термін “специфічно” має відношення до ситуації, в якій антитіло не демонструє будьякого значного зв’язування з іншими молекулами, крім антигену, що містить епітоп якого впізнає антитіло. Термін також застосовують, наприклад, тоді, коли антиген - зв’язуючий домен є специфічним для окремого епітопу, який є у складі кількох антигенів та у такому разі антитіло буде здатним зв’язуватися з різними антигенами, що несуть цей епітоп. Терміни “переважно зв’язується” або “специфічно зв’язується” означає, що антитіло зв’язується з епітопом зі збільшеною спорідненістю, ніж воно зв’язується зі сторонніми амінокислотними послідовностями та, за умови перехресної реактивності до інших поліпептидів, які містять цей епітоп, воно є нетоксичним у кількостях, у яких ці антитіла отримують для введення людині. У одному аспекті, така спорідненість є принаймні у 1 раз більшою, принаймні у 2 рази більшою, принаймні у 3 рази більшою, принаймні у 4 рази більшою, принаймні у 5 разів більшою, принаймні у 6 разів більшою, принаймні у 7 разів більшою, принаймні у 8 разів більшою, принаймні у 9 разів більшою, у 10 разів більшою, принаймні у 20 разів більшою, принаймні у 30 разів більшою, принаймні у 40 разів більшою, принаймні у 50 разів більшою, принаймні у 60 разів більшою, принаймні у 70 разів більшою, принаймні у 80 разів більшою, принаймні у 90 разів більшою, принаймні у 100 разів більшою або принаймні у 1000 разів більшою, ніж спорідненість антитіл до сторонніх амінокислотних послідовностей. Терміни “імунореактивний” “зв’язується,” “переважно зв’язується” та “специфічно зв’язується” тут застосовано взаємозамінне. Термін “зв’язування” має відношення до безпосереднього з'єднання двох молекул з допомогою, наприклад, взаємодій, опосередкованих ковалентним, електростатичним, гідрофобним, іонним та/або водневим зв’язком у фізіологічних умовах та включаючи такі взаємодії, як-то сольові та водні містки та будь-які інші звичайні засоби зв’язування. [0081] “Виділений” (застосовано взаємозамінне з “суттєво чистим”) при застосуванні до поліпептидів означає поліпептид або його частину, який в силу свого походження або в результаті маніпуляції: (i) існує у клітині-хазяїні у вигляді продукту експресії частини вектора експресії або (ii) є приєднаним до білка або до іншої хімічної функціональної групи, іншої, ніж та, до якої він є приєднаним у природі; або (iii) не зустрічається у природі, як-то, наприклад, білок, який було отримано шляхом хімічних маніпуляцій, як-то шляхом прикріплення або додавання до білка принаймні однієї гідрофобної функціональної групи таким чином, що отриманий білок знаходиться у формі, яка не існує у природі. Під “виділеним” також мається на увазі білок, який є: (i) хімічно синтезованим; або (ii) є продуктом експресії у клітині-хазяїні та є очищеним від асоційованих з ним та забруднюючих білків. Звичайно цей термін має відношення до поліпептиду, відокремленому від з інших білків та нуклеїнових кислот, з якими він зустрічається в природі. Звичайно поліпептид є також відокремленим від інших речовин, як-то антитіл або для його очищення застосовують гелеві матриці (поліакриламідний гель). [0082] Як тут застосовано, терміни “пригнічуючий ангіогенез,” “пригнічення ангіогенезу” або “анти-ангіогенетичний” стосуються пригнічення розвитку судин та призначені означати такі, що впливають на зменшення ступеня, кількості або швидкості неоваскуляризації. Зменшення ступеня, кількості або швидкості проліферації ендотеліальних клітин або їх міграції у тканині є специфічним прикладом пригнічення ангіогенезу. [0083] Термін “композиція, яка пригнічує ангіогенез” має відношення до композиції, яка пригнічує опосередковані ангіогенезом процеси, як-то міграцію, проліферацію ендотеліальних 10 UA 115789 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 клітин, утворення судинної трубки та згодом веде до пригнічення утворення нових кровоносних судин з вже існуючих, отже впливає на ангіогенез-залежні стани. [0084] Як тут застосовано, термін “ангіогенез-залежний стан” означає стан, при якому процес ангіогенезу або васкулогенезу підтримує або посилює патологічний стан або корисно впливає на нормальні фізіологічні процеси. Таким чином, лікування ангіогенез-залежного стану, при якому ангіогенез сприяє патологічному стану може призвести до послаблення захворювання, тоді як лікування ангіогенез-залежного стану, при якому ангіогенез корисно впливає на нормальні фізіологічні процеси може призвести, наприклад, до покращення нормального процесу. [0085] Ангіогенез є утворенням нових кровоносних судин з попередньо існуючих капілярів або з пост-капілярних венул. Васкулогенез є утворенням нових кровоносних судин, які виникають з ангіобластів, які є попередниками ендотеліальних клітин. Обидва процеси призводять до утворення нових кровоносних судин та охоплюються значенням терміну ангіогенез-залежних станів. Як тут застосовано, термін “ангіогенез” стосується утворення судин de novo, як-то судин, що виникають в результаті васкулогенезу, а також судин, що виникають шляхом розгалуження та проростання існуючих судин, капілярів та венул. Також до ангіогенезу може бути залучено ALK1 сигналування та пов’язане з ним фосфорилювання та/або сигналування Smad 1/5/8. Також відомо про залучення CD105 до шляху сигналування ALK1 та таким чином це також включено до значення ангіогенезу. + [0086] Клітинні популяції CD105 , які викликають пухлини були знайдені у ниркових + карциномах людини. Клітини CD105 містять характерні стовбурові пухлинні клітини, які раніше були описані, як ракові стовбурові клітини, наявні у інших видів пухлин. Спостережені клітини CD105+, які були клоногенними, здатними до експресії стовбурових клітинних маркерів та позбавленими диференціативних маркерів, були здатними перетворюватися in vitro у епітеліальні та ендотеліальні типи клітин та утворювати in vivo здатні до серійного перевивання пухлини. Незважаючи на те, що ці пухлини були отримані з клонів, які мають експресію мезенхимальних маркерів, вони, як і початкові пухлини, були епітеліальними + карциномами та відрізнялися підтриманням пухлинoгенної популяції клітин CD105 та наявністю непухлиногенної диференційованої популяції клітин CD105 . [0087] “Викликання імунної відповіді хазяїна” означає, що пацієнт відчуває полегшення або зменшення ознак або симптомів хвороби та, зокрема, охоплює, без обмеження, збільшення строку виживання. [0088] Як тут застосовано, терміни “проліферативний розлад” та “проліферативний стан” означають будь-який патологічний або непатологічний фізіологічний стан, який відрізняється аномальною або небажаною проліферацією. Терміни “клітинний проліферативний розлад” та “клітинний проліферативний стан” означають будь-який патологічний або непатологічний фізіологічний стан, який відрізняється аномальною або небажаною клітинною проліферацією, а також охоплюють стани, які відрізняються аномальною або небажаною клітинною проліферацією або клітинним виживанням (наприклад, завдяки дефектному апоптозу), стани, які відрізняються дефектним або аномальним або недостатнім апоптозом, а також стани, які відрізняються аномальним або небажаним або непотрібним клітинним виживанням. Термін “розлад диференціації” означає будь-який патологічний або непатологічний фізіологічний стан, який відрізняється аномальною або недостатньою диференціацією. [0089] Проліферативні розлади або розлади диференціації, які піддаються лікуванню включають захворювання, доброякісні та неопластичні стани, які відрізняються аномальними або небажаними кількістями клітин, ростом клітин або виживанням клітин. Отже, такі розлади або стани можуть являти собою хворобливий стан та охоплюють всі типи ракових пухлин або онкогенних процесів, метастатичних тканин або злоякісно трансформованих клітин, тканин або органів. [0090] Клітини, які мають проліферативний розлад або розлад диференціації можуть бути скупчені у клітинну масу або бути розсіяними. “Нетверда пухлина” має відношення до новоутворень кровотворної системи, як-то лімфоми, мієломи та лейкози або неоплазії, яких не помітно неозброєним оком в природі, оскільки вони зазвичай не утворюють твердої маси. Окремі приклади лейкемій охоплюють, наприклад, гостру та хронічну лімфобластну, мієлобластну та множинну мієлому. [0091] Термін “тверда пухлина” має відношення до новоутворень або метастазів, які звичайно скупчуються разом з утворенням маси. Такі розлади охоплюють новоутворення або онкологічні захворювання, як-то рак, саркому, меланому, метастатичні розлади або гемопоетичні пухлинні розлади, які можуть вплинути на практично будь-яку клітину або типтканини. Метастатична пухлина може виникнути з безлічі типів первинних пухлин, у тому числі, 11 UA 115789 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 але без обмеження, лімфоїдних пухлин, пухлин молочної залози, легень, щитовидної залози, голови та шиї, головного мозку, шлунково-кишкового тракту (рота, стравоходу, шлунка, тонкої кишки, товстої кишки, прямої кишки), сечостатевого тракту (матки, яєчників, шийки матки, сечового міхура, яєчок, статевого члена, передміхурової залози), нирок, підшлункової залози, печінки, кісток, м'язів, шкіри тощо. [0092] Карциноми є злоякісними новоутвореннями епітеліальних або ендокринних тканин та охоплюють карциноми дихальної системи, шлунково-кишкового тракту, сечостатевої системи, яєчок, молочної залози, передміхурової залози, ендокринної системи та меланоми. Тирові карциноми охоплюють карциноми, які виникають у шийці матки, легенях, передміхуровій залозі, молочній залозі, ділянках голови та шиї, товстому кишечнику, печінці та яєчниках. Цей термін також охоплює, наприклад, карциносаркоми, як-то новоутворення, які містять злоякісні пухлини, що складаються з карциноматозних та саркоматозних тканин. Аденокарцинома охоплює карциному залозистої тканини або карциному, в якій пухлина утворює залозоподібну структуру. [0093] Злоякісними тканинами. які підлягають лікуванню є, наприклад, ендотеліальні тканини або трансформовані клітини, в яких відбувається експресія аномального рівня CD105. Як тут застосовано, термін "трансформовані клітини" відноситься до клітин, які спонтанно переходять до стану необмеженого зростання, тобто вони набувають здатність до росту через необмежену кількість поділів у культурі. Трансформовані клітини можуть бути охарактеризовані, як неопластичні, анапластічні та/або гіперпластичні, а також по відношенню до їх втрати контролю над ростом. Для цілей заявленого винаходу терміни "трансформований фенотип злоякісних клітин ссавців" та "трансформований фенотип" призначені для охоплення, але без обмеження, будь-яких з наступних фенотипічних ознак, пов'язаних з клітинною трансформацією клітин ссавців: іморталізацію, морфологічну або ростову трансформацію та здатність викликати пухлини, як виявлено шляхом подовженого росту у клітинній культурі, росту у напівтвердому середовищі або онкогенного росту у імуно-некомпетентних або сингенних тваринах. [0094] Термін “антиген пухлинної клітини” визначено тут, як антиген, який є присутнім у пухлинній клітині або у рідинах організму у підвищених, порівняно до неспоріднених пухлинних клітин, нормальних клітин або рідин здорового організму кількостях. Присутність антигену може бути перевірена з допомогою будь-якого з численних аналізів, відомих фахівцям у цей галузі, які охоплюють, без обмеження, негативний та/або позитивний відбір з антитілами, як-то ІФА-аналіз, Вестерн-блот аналіз або радіоімунний аналіз. [0095] Терміни “апоптоз” або “запрограмована загибель клітин” має відношення до фізіологічного процесу, з допомогою якого здійснюється усунення небажаних або неприйнятних клітин під час розвитку та інших нормальних біологічних процесів. Апоптоз є режимом загибелі клітин, що відбувається у нормальних фізіологічних умовах та клітина є активним учасником своєї власній загибелі ("клітинне самогубство"). Це найбільш часто зустрічається в ході нормального обігу клітин та тканинного гомеостазу, ембріогенезу, індукції та підтримання імунної толерантності, розвитку нервової системи та залежної від ендокринної системи атрофії тканин. Клітини на стадії апоптозу демонструють характерні морфологічні та біохімічні особливості, які охоплюють агрегацію хроматину, нуклеарне та цитоплазматичне ущільнення, розділення цитоплазми та ядра на мембранозв'язані везикули (апоптичні тільця), які містять рибосоми, морфологічно інтактні мітохондрії та ядерний матеріал. In vivo ці апоптичні тільця швидко впізнають та піддають фагоцитозу макрофаги, дендритні клітини або прилеглі епітеліальні клітини. Завдяки цьому ефективному механізму усунення апоптотичних клітин в природних умовах не виникає жодної запальної реакції. В умовах in vitro апоптотичні органи, а також позосталі клітинні фрагменти зрештою набухають та потім розчиняються. Цей кінцевий етап загибелі клітин in vitro отримав назву "вторинного некрозу." Апоптоз може бути виміряно з допомогою способів, відомих фахівцям у цій галузі, як-то шляхом фрагментації ДНК, дії анексину V, шляхом активації каспаз, вивільнення цитохрому с тощо. Клітини, які були індуковані для загибелі тут мають назву "апоптичних клітин." [0096] “Агент, який викликає апоптоз”, як тут визначено, спричинює апоптоз/програмовану загибель клітин та охоплює, наприклад, анти-CD105 антитіла, анти-VEGF антитіла, випромінювання, хіміотерапевтичні агенти або рецепторні лігуючі агенти, з допомогою яких клітини, наприклад, пухлинні або ендотеліальні клітини зазнають запрограмованої загибелі. Типові агенти, які викликають апоптоз більш детально описані нижче. [0097] Апоптоз можна перевірити з застосуванням стандартного аналізу апоптозу з композиціяом анексин V. У цьому аналізі клітини NIH:OVCAR-3 підрощують у 6-луночних планшетах (NUNC) та піддають дії випромінювання або обробляють антагоністом (або у поєднанні з іншими протипухлинними ліками) протягом 4-48 год., після чого промивають та фарбують реактивом анексин V-FITC (BD-Pharmingen) протягом години. Потім клітини 12 UA 115789 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 досліджують шляхом проточної цитометрії (проточний цитометр Becton-Dickinson, програмне забезпечення CellQuest), дофарбовують йодистим пропідієм та знову досліджують у проточному цитометрі. Способи виготовлення та експресії антитіл [0098] Химерні імуноглобуліни конструюють шляхом генної інженерії. Більшість попередньо описаних химерних імуноглобулінів містить VH- та VL- ділянки мишачих моноклональних антитіл та CL- та Fc-ділянки антитіл людини. Fc-ділянки можуть бути застосовані з будь-яким з описаних тут ізотипів. Як тут описано, химери також можуть задовольняти критеріям, з допомогою яких з метою підвищення спорідненості антитіл змінюють обмежену кількість амінокислот каркасної ділянки змінної ділянки легкого ланцюга та/або змінної ділянки важкого ланцюга. [0099] Химерні антитіла звичайно мають деякі потенційні переваги над мишачими антитілами стосовно застосування у терапії людини. Через те, що ефекторна частина таких антитіл є людською, вважається, що вона краще взаємодіє з іншими частинами імунної системи людини (наприклад, більш ефективно руйнує клітини-мішені шляхом комплемент-залежної цитотоксичності (CDC) або залежної від антитіл клітинної цитотоксичності (ADCC)). Крім того, імунна система людини не повинна впізнавати сталу ділянку химерного антитіла, як чужорідну, отже відповідь організму проти таких введених шляхом ін'єкції антитіл повинна бути в загальному випадку меншою, ніж проти повністю чужорідних мишачих антитіл. Нарешті, відомо, що мишачі антитіла у порівнянні з людськими мають більш короткий період напівжиття у кровотоці людини, отже можливо, що химерні антитіла можуть мати період напівжиття, який буде більш подібний до періоду напівжиття людських антитіл природного походження, що дозволить застосовувати менші дози та менш часто їх вводити. [00100] Якщо бажаною є підвищена спорідненість антитіл, то залишки всередині їх CDRділянок можуть бути додатково заміщені іншими амінокислотами зі звичайним заміщенням не більш, ніж чотирьох амінокислотних залишків у складі CDR та ще більш звичайним заміщенням не більш, ніж двох залишків у складі CDR за виключенням важколанцюгових CDR2, у яких може бути заміщено до 10 залишків. Змінення спорідненості можуть виміряні шляхом загальноприйнятних способів, як-то описаних тут (наприклад, Biacore). [00101] Антитіла можуть бути побудовані та отримані з застосуванням відомих у цій галузі загальноприйнятних способів. Крім того, антитіла рекомбінантного походження можна часто отримувати у великих кількостях, особливо у разі застосування векторів з високим рівнем експресії. [00102] Антитіла для ветеринарних цілей можуть бути синтезовані для внутрішньовенного введення тварині (як-то примат, корова, кінь, свиня тощо) з застосуванням Fc-ділянок тваринного походження. [00103] Для змінення нуклеотидів, що кодують амінокислотні послідовності з застосуванням рекомбінантних способів у сайтах рестрикції ендонуклеаз з застосуванням рекомбінантних способів може бути застосовані створені та включені у цю заявку добре відомі у цей галузі способи. [00104] Для експресії передбачено відповідну систему експресії, як-то GS-систему (Lonza) з застосуванням гена глютамін-синтази у якості селективного маркера. Стисло кажучи, трансфекцію здійснюють у клітинах CHO шляхом електропорації (250 В) з застосуванням GSсистеми (Lonza) та гена глютамін-синтази у якості селективного маркера. Клітини CHO дикого типу підрощують у середовищі DMEM (Sigma), яке містить 10% діалізовану телячу 7 ембріональну сироватку (FCS) з 2 мМ глютаміном. Потім клітини СНО (6x10 клітин) трансфікують 300 мкг лінеаризованої ДНК шляхом електропорації. Після електропорації клітини ресуспендують у середовищі DMEM з глютаміном, наносять у 36 x 96-луночних планшетів (50 мкл/лунку) та інкубують їх при 37°C. у 5% CO2. Наступного дня до лунок додають селективне середовище DMEM без глютаміну (150 мкл/лунку). Через приблизно три тижні колонії досліджують шляхом ІФА-аналізу (див. нижче) з застосуванням нерелевантних антитіл в якості негативного контролю. Всі колонії, які продукують >20 мкг/мл переносять у 24-луночніі планшети та потім у двох копіях у флакони T25. [00105] Для отримання високих рівнів продукту широко застосовують систему експресії у ссавцях, в якій застосовано процедуру ампліфікації гена, передбачену у клітинах яєчників китайського хом'яка, дефектних по дигідрофолатредуктазі (“dhfr-“). Ця система побудована на основі гена дигідрофолатредуктази “dhfr”, який кодує фермент ДГФР, що каталізує перетворення дигідрофолату на тетрагідрофолат. Для досягнення високої продуктивності dhfrклітини СНО трансфікують з вектором експресії, який містить функціональний ген ДГФР разом з геном, який кодує бажаний білок. У цьому разі бажаний білок є важким та/або легким ланцюгом 13 UA 115789 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 рекомбінантного антитіла. [00106] Шляхом підвищення кількості конкурентного пригнічувача ДГФР метотрексату (MTX), у рекомбінантних клітинах розвивається стійкість за рахунок ампліфікації гена dhfr. У стандартних випадках застосована одиниця ампліфікації є набагато довшою, ніж розмір гена dhfr та в результаті відбувається спільна ампліфікація важкого ланцюга антитіла. [00107] Коли бажано отримати великомасштабне виробництво білка, як-то ланцюга антитіла, то приймаються до уваги як рівень експресії, так і стійкість застосованих клітин. У культурі з тривалим строком життя популяції рекомбінантних клітин CHO втрачають гомогенність з точки зору їх специфічної продуктивності антитіл протягом ампліфікації, навіть якщо вони походять з одного батьківського клону. [00108] У цій заявці передбачено виділений полінуклеотид (нуклеїнову кислоту), який кодує антитіло або її частину, як описано тут, вектори, які містять такі полінуклеотиди та клітини-хазяї та системи експресії для транскрипції та трансляції таких полінуклеотидів у поліпептиди. [00109] У цій заявці також передбачено конструкції у вигляді плазмід, векторів, касет для транскрипції або експресії, які містять принаймні один полінуклеотид, як зазначено вище. [00110] У цій заявці також передбачено рекомбінантну клітину-хазяїна, яка містить одну або декілька конструкцій, як зазначено вище. Нуклеїнова кислота, яка кодує будь-яке описане тут антитіло утворює аспект цієї заявки, як і спосіб отримання антитіл, який полягає у досягненні експресії білка, закодованого у зазначеній нуклеїновій кислоті. Ця експресія може бути зручно досягнута шляхом культивування у відповідних умовах рекомбінантних клітин-хазяїв, які містять нуклеїнову кислоту. Після отримання шляхом експресії, антитіла або їх частини можуть бути виділені та/або очищені з застосуванням будь-якого прийнятного способу та потім застосовані у разі необхідності. [00111] Специфічні антитіла (або їх частини), які кодуються молекулами нуклеїнової кислоти та вектори з зазначеним тут вмістом можуть бути надані виділеними та/або очищеними, наприклад, з їх природного оточення у суттєво чистій або гомогенній формі. У випадку нуклеїнових кислот, вони є вільними або суттєво вільними від нуклеїнових кислот або генів, які мають інше походження, ніж послідовність, яка кодує поліпептид з потрібною функцією. Послідовності нуклеїнових кислот можуть містити ДНК або РНК та можуть бути повністю або частково синтетичними. Способи очищення є добре відомими у цій галузі. [00112] Системи для клонування та експресії поліпептиду у багатьох різних клітинах-хазяях є добре відомими. Прийнятні клітини-хазяї охоплюють клітини бактерій, ссавців, дріжджів та бакуловірусні системи. Відомі у цій галузі прийнятні для експресії гетерологічного поліпептиду клітинні лінії ссавців охоплюють, але без обмеження, клітини яєчників китайського хом'ячка, клітини HeLa, клітини нирок новонародженого хом'яка, клітини мишачої мієломи NS0 та багато інших клітинних ліній. [00113] Широке розмаїття одноклітинних клітин-хазяїв також є корисним для експресії послідовностей ДНК. Ці хазяї охоплюють добре відомих про- та еукаріотів, як-то штами E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, грибів, як-то дріжджів та клітини тварин, як-то клітини CHO, YB/20, NS0, SP2/0, Rl.l, B-W та L-M, клітини нирок африканської зеленої мавпи (наприклад, клітини COS1, COS7, BSC1, BSC40, та BMT10), клітини комах (наприклад, Sf9), та людські та рослинні клітини у культурі тканин. [00114] Експресія антитіл або їх частин у клітинах прокаріот, як-то E. coli є добре відомою у цій галузі. Відповідний огляд, див., наприклад, у Plückthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991). [00115] Експресія у культурі еукаріотичних клітин також доступна фахівцям в якості опції для отримання описаних тут антитіл. Сучасний огляд див., наприклад, у статтях Raff, M.E. (1993) Curr. Opinion Biotech. 4: 573-576; Trill J.J. et al. (1995) Curr. Opinion Biotech 6: 553-560, кожна з яких є повністю включеною сюди шляхом посилання. [00116] Можуть бути вибрані або побудовані прийнятні вектори, які містять відповідні регуляторні послідовності, включаючи промоторні послідовності, термінаторні послідовності, послідовності поліаденілування, підсилюючі послідовності, маркерні гени та інші послідовності у разі необхідності. Вектори, відповідно, можуть бути плазмідами або вірусними векторами, наприклад, на основі фагів або фагмід. Більш детально див., наприклад, книгу Molecular Cloning: a Laboratory Manual (“Лабораторний підручник по молекулярному клонуванню“): 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Багато відомих способів та протоколів, присвячених маніпуляціям з нуклеїновою кислотою, наприклад, присвячених отриманню конструкцій на основі нуклеїнових кислот, мутагенезу, сиквенсу, введенню ДНК у клітини, генній експресії та аналізу білків детально описано у книзі Short Protocols in Molecular Biology (“Короткі протоколи у молекулярній біології“), Second Edition, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992. Способи, наведені у вищезгаданих книгах є добре відомими у цій галузі та 14 UA 115789 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 повністю включені сюди шляхом посилання. [00117] Отже, додатковим аспектом передбачено клітину-хазяїна, яка містить нуклеїнову кислоту, як зазначено тут. У іншому додатковому аспекті передбачено спосіб, який полягає у введенні такої нуклеїнової кислоти клітині-хазяїну. Для такого введення може бути застосовано будь-який прийнятний спосіб. Для еукаріотичних клітин прийнятні способи можуть, наприклад, полягати у трансфекції з фосфатом кальцію, трансфекції з DEAE-декстраном, електропорації, трансфекції, опосередкованої ліпосомами та у трансдукції з застосуванням ретровірусу або іншого вірусу, наприклад, вірусу коров'ячої віспи або бакуловірусів для клітин комах. Для бактеріальних клітин прийнятні способи можуть, наприклад, полягати у трансформації з хлоридом кальцію, електропорації та трансфекції з застосуванням бактеріофагів. [00118] Після введення може бути викликана або дозволена експресія продукту з нуклеїнової кислоти, наприклад, шляхом культивування клітини-хазяїна в умовах, прийнятних для експресії гена. [00119] У одному втіленні нуклеїнова кислота є вбудованою у геном (наприклад, у хромосому) клітини-хазяїна. Сприяння подібній інтеграції може бути здійснено шляхом включення послідовності, яка сприяє рeкомбінації з геномом у відповідності зі стандартними способами. При необхідності максимізування експресії може бути запущено підсилення Ig. [00120] Також у цій заявці передбачено спосіб, який полягає у застосуванні зазначеної вище конструкції у системі експресії з метою досягнення експресії антитіл (або їх частин) як зазначено вище. [00121] Ця заявка також стосується виділених нуклеїнових кислот, як-то рекомбінантних молекул ДНК або клонованих генів або їх вироджених варіантів, мутантів, аналогів або фрагментів, які кодують антитіло, що зв’язується з CD105. [00122] У додатковому втіленні повнорозмірна послідовність ДНК рекомбінантної молекули ДНК або клонованого гена антитіла або його описаної тут частини може бути функціонально приєднаною до послідовності, яка контролює експресію та може бути введена відповідному хазяїну. Винахід відповідно охоплює також одноклітинних хазяїв, трансформованих клонованим геном або рекомбінантною молекулою ДНК, яка містить послідовність ДНК, що кодує V H, VL, CL та/або Fc-ділянку антитіла. [00123] Іншою особливістю є експресія описаних тут послідовностей ДНК. Як добре відомо у цій галузі, експресія послідовностей ДНК може бути викликана шляхом їх функціонального приєднання до послідовності, яка контролює експресію у прийнятному векторі експресії та застосування цього вектора експресії для трансформації відповідного одноклітинного хазяїна. [00124] Зрозуміло, що таке оперативне приєднання послідовності ДНК до послідовності, яка контролює експресію у разі, якщо вона сама вже не є частиною зазначеної послідовності ДНК, полягає у забезпеченні розташування ініціюючого кодону ATG, у належній рамці зчитування перед послідовністю ДНК. [00125] Полінуклеотиди та вектори можуть бути надані у виділеній та/або a очищеній формі (наприклад,вільній або суттєво вільній від полінуклеотидів іншого походження, ніж полінуклеотид, який кодує поліпептид з бажаною функцією). Як тут застосовано, “суттєво чистий,” та “суттєво вільний” відносяться до розчину або до суспензії, яка містить менш ніж, наприклад, приблизно 20% або ще менше стороннього матеріалу, як-то приблизно 10% або ще менше стороннього матеріалу, як-то приблизно 5% або ще менше стороннього матеріалу, як-то приблизно 4% або ще менше стороннього матеріалу, як-то приблизно 3% або ще менше стороннього матеріалу, як-то приблизно 2% або ще менше стороннього матеріалу, як-то приблизно 1% або ще менше стороннього матеріалу. [00126] Для експресії послідовності ДНК заявленого винаходу може бути застосовано широкий вибір комбінацій хазяїн/вектор експресії. Корисні вектори експресії, наприклад, можуть складатися з сегментів послідовності хромосомної, нехромосомної та синтетичної ДНК. Прийнятні вектори охоплюють, але без обмеження, похідні SV40 та відомих бактеріальних плазмід, наприклад, плазмід E. coli El, Pcr1, Pbr322, Pmb9 та їх похідних, таких плазмід, як RP4; фагову ДНК, наприклад, численні похідні фага , наприклад, NM989 та іншу фагову ДНК, наприклад, M13 та ниткоподібну одноланцюгову фагову ДНК; плазмід дріжджів, як-то плазміду 2u або її похідні; вектори, корисні для застосування у еукаріотичних клітинах, як-то вектори, корисні для застосування у клітинах комах або ссавців; вектори, отримані з комбінацій плазмідної та фагової ДНК, як-то плазміди, які були змінені для застосування фагової ДНК або інших послідовностей, що контролюють експресію тощо . [00127] Також заявленим винаходом передбачено рекомбінантну клітину-хазяїна, що містить одну або декілька полінуклеотидних конструкцій. Полинуклеотид, що кодує антитіло, як це передбачено в даному документі, утворює аспект цієї заявки, так само як і спосіб отримання 15 UA 115789 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антитіла, який полягає у досягненні експресії одного або декількох полінуклеотидів, якої може бути досягнуто, наприклад, шляхом культивування у відповідних умовах рекомбінантних клітинхазяїв, які містять полінуклеотид, після чого бажане антитіло може бути виділено та/або очищено з застосуванням будь-якого прийнятного способу з наступним застосуванням у разі необхідності. [00128] Для експресії послідовностей ДНК у цих векторах можуть бути застосовані будь-які з широкого спектру послідовностей, які контролюють експресію функціонально приєднаної до них послідовності ДНК. Такі корисні послідовності, що контролюють експресію охоплюють, наприклад, ранній або пізній промотори SV40, CMV, коров'ячої віспи, поліоми або аденовірусу, системи lac, trp, TAC, TRC, LTR, головну операторну та промоторну ділянки фагу , контрольні ділянки білка оболонки fd, промотор 3-фосфогліцераткинази або інших гликолитических ферментів, промотори кислої фосфатази (наприклад, Pho5), промотори дріжджових факторів альфа-парування та інші послідовності, відомі своєю здатністю контролювати експресію генів прокаріотичних або еукаріотичних клітин або їх вірусів та різні їх комбінації. [00129] Слід розуміти, що не всі вектори, послідовності, що контролюють експресію та хазяї будуть функціонувати однаково добре при експресії послідовності ДНК. Не всі хазяї будуть функціонувати однаково добре з однією і тією ж системою експресії. Тим не менш, фахівець у цій галузі зможе вибрати відповідні вектори, послідовності, що контролюють експресію та хазяїв без зайвого експериментування для досягнення бажаної експресії та без відходу від суті та обсягу цієї заявки. Наприклад, при виборі вектора також повинен розглядатися хазяїн, оскільки вектор повинен функціонувати в ньому. Також можуть бути розглянуті такі фактори, як кількість копій вектора, здатність контролювати це число копій та експресію будь-яких інших білків, що кодуються вектором, як-то антибіотичних маркерів. [00130] Цією заявкою також створені, як описано тут в іншому місці, конструкції у вигляді плазмід, векторів, касет для транскрипції або експресії, які містять принаймні один полинуклеотид, як описано вище. Прийнятні вектори, які можна вибрати або побудувати, містять відповідні регуляторні послідовності, промоторні послідовності, термінаторні послідовності, послідовності поліаденілування, підсилюючі послідовності, маркерні гени та інші послідовності у разі необхідності. Вектори відповідно можуть бути плазмідами або вірусними векторами, наприклад, на основі фагів або фагмід. Більш детально див., наприклад, книгу Molecular Cloning: a Laboratory Manual (“Лабораторний підручник по молекулярному клонуванню“): 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Багато відомих способів та протоколів, присвячених маніпуляціям з нуклеїновою кислотою, наприклад присвячених отриманню конструкцій на основі нуклеїнових кислот, мутагенезу, сиквенсу, введенню ДНК у клітини, генній експресії та аналізу білків детально описано у книзі Short Protocols in Molecular Biology (“Короткі протоколи у молекулярному клонуванні“), Second Edition, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992. Способи, наведені у вищезгаданих книгах є добре відомими у цій галузі та повністю включені сюди шляхом посилання. [00131] При виборі послідовності, яка контролює експресію, як правило, будуть розглянуті різні фактори, які, наприклад, охоплюють відносну силу системи, її керованість та її сумісність з певною послідовністю ДНК або з геном, експресію якого досліджують, особливо відносно потенційних вторинних структур. Прийнятні одноклітинні хазяї будуть обрані шляхом розгляду, наприклад, їх сумісності з обраним вектором, їх секретивним характеристикам, їх здатності до належного згортання білків, їх ферментативним критеріям, а також ступеня токсичності для хазяїна продукту, який кодується послідовністю ДНК, експресію якої треба отримати та легкості очищення продуктів експресії. [00132] Додатковим аспектом передбачено клітину-хазяїна, що містить один або декілька полінуклеотидів, як зазначено в цьому документі. Іншим додатковим аспектом передбачено спосіб введення клітині-хазяїну такого одного або декількох полінуклеотидів з допомогою будьякого прийнятного способу. Для еукаріотичної клітини подібні прийнятні способи можуть, наприклад, полягати у трансфекції з фосфатом кальцію, трансфекції з DEAE-декстраном, електропорації, трансфекції, опосередкованої ліпосомами та у трансдукції з застосуванням ретровірусу або іншого вірусу, наприклад, вірусу коров'ячої віспи або бакуловірусів для клітин комах. Для бактеріальних клітин прийнятні способи можуть, наприклад, полягати у трансформації з хлоридом кальцію, електропорації та трансфекції з застосуванням бактеріофагів. [00133] Після введення може бути викликано або дозволено проведення експресії з одного або декількох полінуклеотидів, наприклад шляхом культивування клітин-хазяїв в прийнятних для експресі одного або декількох поліпептидів з одного або декількох полінуклеотидів. Для цього можуть бути застосовані індуцибельні системи та викликання експресії може бути 16 UA 115789 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 здійснено шляхом додавання активатора. [00134] У одному втіленні полінуклеотиди можуть бути приєднані до геному (наприклад, хромосоми) клітини-хазяїна. Для сприяння цієї інтеграції з геномом з допомогою стандартних способів можуть бути приєднані послідовності, які сприяють рекомбінації з геномом та у іншому втіленні нуклеїнову кислоту підтримують у складі епісомального вектора у клітині-хазяїні. [00135] Створені тут способи охоплюють застосування зазначеної вище конструкції у системі експресії з метою експресії певного поліпептиду. [00136] З урахуванням цих та інших факторів, фахівець цій галузі зможе сконструювати різні комбінації векторів/послідовностей, що контролюють експресію/хазяїв, з допомогою яких можна здійснити експресію послідовностей ДНК, прийнятну для ферментації або для великомасштабної культури тваринних клітин. [00137] Окрім клонування або швидше, ніж шляхом клонування, полінуклеотид, який кодує антитіло або його частину може бути отримано рекомбінантним/синтетичним шляхом. Полинуклеотид може бути сконструйовано з застосуванням відповідних кодонів та загалом будь-хто може вибрати бажані кодони для призначеного хазяїна при застосуванні відповідної послідовності для експресії. Повний полинуклеотид може бути зібрано з перекриваються олігонуклеотидів, отриманих з допомогою стандартних способів та зібраних у повну кодуючу послідовність. Див., наприклад, Edge, Nature, 292:756 (1981); Nambair et al., Science, 223:1299 (1984); Jay et al., J. Biol. Chem., 259:6311 (1984). [00138] Одночасне застосування нуклеїнових кислот, які кодують антитіла (або їх частини) та замін у вибраних положеннях амінокислот може бути здійснено з допомогою різних способів, відомих фахівцям у цій галузі, включаючи, наприклад, рекомбінантні технології та хімічний синтез. Анти-CD105 антитіла [00139] Ендоглін (CD105) експресується на клітинній поверхні у вигляді гомодимерного трансмембранного білка у 180 кДА. Зовнішній домен зв’язує TGF-1 та -3 iзоформи з високою спорідненістю (50 нM) та трансмембранний та внутрішньоклітинний домени CD105 мають 71% схожість послідовності до бетаглікану. Ген CD105 людини, розташований на хромосомі 9q34 було визначено з допомогою флуоресцентної гібридізації in situ. Було виявлено, що його кодуюча ділянка містить 14 екзонів та описані дві різні ізоформи (L та S) CD105 зі здатністю до зв’язування TGF-. На відміну від ізоформи S-CD105, яка складається з 600 амінокислотних залишків з 14 амінокислотними залишками у цитоплазматичному хвості, ізоформа L-CD105 складається з 633 амінокислотних залишків з 47 амінокислотними залишками у цитоплазматичному хвості, однак L-CD105 є домінуючою формою. CD105 постійно фосфорилюється у ендотеліальних клітинах, головним чином по сериновим та треоніновим залишкам та це фосфорилювання відбуівається завдяки постійній активності TGF- RII всередині клітини. Зв’язування TGF- з CD105 веде до пригнічення фосфорилювання, подібного до спостереженої дії пригнічувачів протеїнкінази C. Амінокислотна послідовність CD105 людини містить трипептид RGD (аргінін-гліцин-аспарагінова кислота), розташований у оголеній ділянці позаклітинного домену. Пептид RGD є ключовою структурою розпізнавання, знайденою у білках позаклітинної матриці, як-то фибронектин, вітронектин, фактор фон Віллебранда (ФВ), колаген першого типу та фібриноген та її впізнають інтегрини клітинної поверхні. Адгезія інтегрину є залученою до гемостазу, тромбозу, ангіогенезу та запалення, тобто до процесів, у яких ендотелій відіграє важливу роль. (Duff et al., FASEB J., 17:984-992 (2003)). [00140] CD105 є членом родини рецепторів TGF-, експресія яких відбувається шляхом проліферації ендотеліальних клітин, для якої потрібна присутність нормальних кількостей CD105. Експресія CD105 підвищується через клітинну гіпоксію завдяки продукуванню фактора індукції гіпоксії 1- (HIF-1-) та захищає гіпоксичні клітини від апоптозу. Деякі функції CD105 є пов’язаними з сигналуванням TGF-. Сигналування TGF- відбувається через гетеродимерні рецептори, які складаються з серинових кіназ, рецептора I (RI) та рецептора II (RII),. Зв’язування TGF- з зовнішніми доменами рецептора викриває активність цитоплазматичної кінази RII, яка фосфорилює TGF- RI, який потім може взаємодіяти з низовими сигнальними факторами, як-то білки Smad. CD105 утворює частину рецепторного комплексу TGF- та також може бути незалежно присутнім на клітинній поверхні. У багатьох клітинах in vitro CD105 пригнічує сигналування TGF- . [00141] CD105 також зв’язує інші фактори росту, активин A та кісткові морфогенетичні білки (BMP) -10, -9, -7 та -2. Зв’язування TGF- або іншого з лігандів фактора росту до CD105 потребує наявності принаймні рецептора RII та сам по собі він не спроможний до зв’язування лігандів. Об'єднання CD105 з рецепторами не змінює їх власної спорідненості до ліганду. В результаті об'єднання цитоплазматичний домен CD105 фосфорилюється кіназами TGF- RI та 17 UA 115789 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 TGF- RII з наступною дисоціацією кінази TGF- RI (але не TGF- RII) від рецепторного комплексу. [00142] Експресія CD105 пригнічує рівні фосфорилювання TGF- RII, але підвищує рівні фосфорилювання TGF- RI, що веде до підвищеного фосфорилювання тільки Smad 2, але не Smad 3. Оскільки Smad 2 може взаємодіяти з різними факторами транскрипції, спільними активаторами та супресорами, фосфорильований Smad 2 може виступати в якості інтегратора кількох сигналів для модулювання транскрипції генів. Отже, CD105 знижує функції TGF- шляхом взаємодії з TGF- RI та TGF- RII та змінює фосфорилювання білків Smad низового рівня. [00143] Дія CD105 полягає у зниженні сигналування численних кіназних рецепторних комплексів надродини TGF-, включаючи рецептори TGF- (TGF-R), рецептороподібні кінази активіну (ALK) та рецептори активіну. За відсутністю CD105 активування рецепторів TGF- веде до фосфорилювання білків SMAD (SMAD 2 та 3), які пригнічують ріст ендотеліальних клітин. Однак, активування CD105 з допомогою TGF- змінює фосфорилювання білка SMAD (включаючи фосфорилювання SMAD 1, 5 та 8). Кінцевим результатом є інкубування росту ендотеліальних клітин через активування рецептора TGF- (див. Фіг. 2). Не дивно, що запобігання активування CD105 шляхом дії анти-CD105 антитіл або антисенсового олігонуклеотиду діє з TGF- синергічним чином, пригнічуючи ріст ендотеліальних клітин. [00144] Промотор CD105 має 2.6 кб. у довжину, але не містить відрізків ініціації транскрипції TATA або CAAT. Проте він містить дві ділянки, багаті GC-парами, консенсусні характерні послідовності для Sp1, ets, GATA, AP-2, NGF-, та Mad, а також елементи відповіді TGF-. Тим не менше, CD105 має відносно обмежений розподіл у клітинах. Основний рівень транскрипції, як видається, вимагає наявності сайту ets у положенні -68 та сайтів Sp1, але вважається, що до відносного обмеження експресії, наприклад для ендотеліальних клітин, залучені численні регуляторні ділянки, зокрема одна у положенні -1294 - -932 та друга, яка розташована дуже близько до сайту ініціації транскрипції. CD105 активується з допомогою TGF- та, як було показано, потребує наявності сайту Sp1 у положенні -37 - -29, а також участі одного або декількох розташованих поруч нижче SBE сайтів зв’язування Smads 3 та/або 4 (які активуються шляхом сигналування TGF-). Гіпоксія є спільною рисою ішемічних тканин та пухлин та потужним стимулятором для експресії гена CD105 у судинних ендотеліальних клітинах (EC). Таку дію можна підсилити у поєднанні з TGF-1. Активування CD105 може виконувати самозахисну роль у EC-клітинах в умовах гипоксичного стресу. [00145] Судинні EC-клітини є головним джерелом CD105. Інші типи клітин, включаючи судинних гладком'язові клітини, фібробласти, макрофаги, лейкозні клітини пре-В та мієломоноцитарного походження та еритроїдні попередники здатні до експресії CD105 у меншій кількості. [00146] CD105 є залученим до ангіогенезу. Антисенсові експерименти демонструють, що пригнічення експресії CD105 у клітинах HUVEC веде до помітного пригнічення ангіогенезу in vitro у комбінації з TGF-1, що вказує на те, що CD105 є проангіогенним компонентом ендотеліальних клітин. Додаткове свідоцтво важливої ролі CD105 у ангіогенезі було отримано шляхом експериментів з мишами, які мали заблокований ген CD105. Такі миші мали численні судинні та серцеві дефекти, які призводили до смерті тварин на ранній ембріональній стадії. Важкі судинні порушення, які спостерігали у цих мишах вказують на те, що CD105 є необхідним для утворення кровоносних судин у позаембріональній судинній системі, що додатково підтверджує безпосередню роль CD105 у ангіогенезі. [00147] CD105, який також має назву ендогліну або edg-1 є гомодимерним мембранним глікобілком першого типу, який має високі рівні експресії у проліферуючих судинних ендотеліальних клітинах. Отже, CD105 головним чином є пов’язаним з проліферацією маркером для ендотеліальних клітин, які проходять стадію активного ангіогенезу. Однак може існувати обмежена експресія CD105 через судинний ендотелій нормальних тканин. Відомо, що CD105 людини специфічно зв’язує трансформуючий фактор росту- (TGF-), та визначена амінокислотна послідовність CD105 має сильну гомологію до -глюкану, який є типом рецептора TGF-. [00148] Застосування CD105 було орієнтовано на способи зменшення пухлинної судинної системи на основі застосування антитіл, оскільки CD105 є пов’язаним з проліферацією антигеном у ендотеліальних та лейкозних клітинах. Його експресія активується у пов’язаному з пухлинами судинному ендотелії та CD105 є необхідним для ангіогенезу. Ангіогенез, який полягає у утворенні нових капілярних кровоносних судин веде до неоваскуляризації а також підтримує існуючу судинну систему. Він є комплексним процесом, який охоплює серії 18 UA 115789 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовних кроків, включаючи ендотеліальну клітинно-опосередковану деградацію судинної базальної мембрани та міжтканевих матриць, міграцію ендотеліальних клітин, проліферацію ендотеліальних клітин та утворення цими клітинами капілярних петель. [00149] CD105 можна знайти на клітинах, які складають та підтримують існуючу судинну систему, а також клітинах, які сприяють ріст та стають частиною нової судинної системи. Ці антитіла можуть зв'язувати CD105 та тим самим пригнічувати ангіогенез, пригнічувати існуючу судинну систему або підтримку існуючої судинної системи та/або пригнічувати розповсюдження малих судин. Додатково до їх застосування для очищення CD105, ці антитіла є корисними для очищення, визначення та для діагностичних та терапевтичних цілей. Створені тут антитіла можуть бути застосовані для отримання лікарських засобів для лікування різних станів та захворювань, у способах лікування зазначених станів та захворювань та їх визначення або діагностики. Як тут застосовано, ангіогенез охоплює ріст та/або розвиток нових кровоносних судин (який також має назву неоваскуляризації), розповсюдження дрібних судин, надмірний або тривалий судинний ріст та підтримку існуючої судинної системи. Ангіогенні стани та захворювання стосуються таких захворювань та станів, які мають відношення до, спричинені або пов'язані з ангіогенезом. Необмежені приклади таких захворювань охоплюють, наприклад, різні форми раку (початкові пухлини та метастази). До CD105 були отримані мишачі моноклональні антитіла (mAb), які знижують активність CD105 та таким чином пригнічують ангіогенез та/або пригнічують розповсюдження малих кровоносних судин. Ці мишачі антитіла описані у патентах США (U.S. patents 5,928,641, 6,200,566, 6,190,660 та 7,097,836), кожен з яких повністю включено сюди шляхом посилання. Крім того була підтверджена ефективність кількості цих антитіл ex vivo та in vivo та моноклональні антитіла, які зв’язують CD105 становлять інтерес у якості сполук для зниження кількості CD105. Проте терапевтичне застосування мишачих антитіл є недоцільним, оскільки їх введення має ряд обмежень, включаючи їх імуногенність у вигляді, наприклад, анти-мишачих антитіл людини (HAMA). [00150] Були також описані деякі антитіла до CD105, зокрема моноклональні антитіла (“mAb”) до CD105. MAb SN6 є антитілом, отриманим внаслідок імунізації мишей глікобілковими сумішами клітинних мембран клітин лейкемії людини (Haruta and Seon, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. 83:7898-7902). SN6 є мишачим моноклональним антитілом, яке впізнає CD105 людини. MAb 44G4 є антитілом, отриманим внаслідок імунізації мишей цільною клітинною суспензією клітин pre-B лейкемії людини (Gougos and Letarte, 1988, J. Immunol. 141:1925-1933; 1990, J. Biol. Chem. 265:8361-8364). 44G4 є також мишачим моноклональним антитілом, яке впізнає CD105 людини. MAb MJ7/18 є антитілом, отриманим внаслідок імунізації щурів запальною мишачою шкірою (Ge and Butcher, 1994, supra). MJ7/18 також є мишачим моноклональним антитілом, яке впізнає CD105 людини. mAb Tec-11 є антитілом, отриманим внаслідок імунізації мишей ендотеліальними клітинами з пупочної вени людини (Burrows et al., 1995, Clin. Cancer Res. 1:1623-1634). Tec-11 є мишачим моноклональним антитілом з обмеженою реактивністю до CD105 людини. Також описані химерні антитіла, які зв’язують CD105, які демонструють зменшену імуногенність при зберіганні та/або покращену специфічність. Додатковим чином, для розв'язання проблем, пов’язаних з мишачими антитілами, тут також описані химерні антитіла, які зв’язують CD105 та зменшують та/або пригнічують ангіогенез та демонструють зменшену імуногенність при зберіганні та/або покращену специфічність. Ці анти-CD105 антитіла є корисними для діагностики та лікування різних станів та захворювань, а також для очищення та визначення CD105. Антитіла до CD105 є важливими елементами для розвитку терапії для лікування різних захворювань та станів, які призводять до ангіогенезу або які знаходяться під його впливом або виникають через ангіогенез. [00151] Заявленим винаходом створено антитіла, які зв’язуються з CD105, а також антитіла, (або їх антиген-зв’язуючі фрагменти), які зв’язуються з CD105 та пригнічують (частково або повністю) або стримують розвиток/лікують (частково або повністю) ангіогенез/неоваскуляризацію, розповсюдження малих судин, пригнічення клітинної проліферації або пригнічення пухлинного росту. Аналогічним чином, пригнічення або зв’язування CD105 також охоплює пригнічення функції CD105 (наприклад, сигналування, зв’язування, активування тощо). У іншому втіленні антитіло пригнічує ангіогенез шляхом зв’язування з CD105. Винаходом також створені клітинні лінії, які можуть бути застосовані для отримання антитіл, способи отримання клітинних ліній, способи отримання експресiї та очищення антитіл. [00152] Можна визнати, що отримані з застосуванням описаних тут способів антитіла, які специфічно зв’язують CD105 можуть бути перевірені з допомогою передбачених тут або відомих у цій галузі аналізів на здатність до зв’язування CD105 з застосуванням стандартних способів, як-то, але без обмеження, ІФА. Спорідненість описаних тут антитіл також може бути 19 UA 115789 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 визначена з застосуванням стандартних способів, як-то, але без обмеження, Biacore або поверхневий плазмонний резонанс. [00153] Заявленим винаходом створені антитіла, які зв’язують CD105, а також створені антитіла, які зв’язують CD105 та пригнічують ангіогенез. [00154] Заявленим винаходом створено антитіло, яке містить змінну ділянку легкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №: 1, сталу ділянку легкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №: 2, змінну ділянку важкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №: 3 та сталу ділянку (Fc) гамма 1 (1), яка має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №: 4., позначену, як SEQ ID №: 3; та сталу ділянку (Fc), яка має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №: 4. [00155] У іншому необмеженому втіленні анти-CD105 антитіло містить ділянку VL CDR1, яка має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №: 5; VL CDR2, яка має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №: 6; VL CDR3, яка має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №: 7; VH CDR1, яка має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №: 8; VH CDR2, яка має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №: 9; та VH CDR3, яка має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №: 10. [00156] У іншому необмеженому втіленні виділене гуманізоване, деімунізоване антитіло до CD105 може містити змінну ділянку важкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №: 11 та змінну ділянку легкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №: 12. Інші необмежені приклади гуманізованихдеімунізованих важких ланцюгів охоплюють, але без обмеження, послідовності SEQ ID №№: 13, 14, 15 та 16. Інші необмежені приклади гуманізованих-деімунізованих легких ланцюгів охоплюють, але без обмеження, послідовності SEQ ID №№: 17, 18, 19, 20, 21, 22 та 23. Послідовності наведені нижче у Прикладі 17. [00157] У іншому аспекті, заявленим винаходом створено антитіло, здатне конкурувати з описаним тут анти-CD105 антитілом в умовах, у яких зв’язування з CD105 принаймні 5% антитіл, які мають послідовності VH та VL блокується шляхом конкуренції з таким антитілом, як доведено шляхом ІФА аналізу. [00158] Також тут створено нейтралізуючі антитіла, які зв’язуються з CD105 та зменшують його активність. Нейтралізуючі антитіла можуть, наприклад, пригнічувати ангіогенез шляхом зв’язування з CD105. [00159] Описані тут антитіла є корисними у визначенні або у діагностичних застосуваннях, як більш детально описано нижче. Описані тут антитіла є корисними для зв’язування з CD105, яке, в свою чергу, може пригнічувати ангіогенез, як описано тут. [00160] Описані тут антитіла можуть додатково містити терапевтичні функціональні групи для застосування з терапевтичною метою. [00161] Описані тут антитіла також можуть бути застосовані у якості імунокон’югатів. Як тут застосовано для цілей цієї заявки та Формули Винаходу, імунокон’югати мають відношення до кон’югатів, які містять анти-CD105 антитіла або їх фрагменти за заявленим винаходом та принаймні одну терапевтичну мітку. Терапевтичні мітки містять протипухлинні агенти та пригнічувачі ангіогенезу. Такі протипухлинні агенти відомі у цій галузі та охоплюють, але без обмеження, токсини, лікарські препарати, ферменти, цитокіни, радіонукліди, фотодинамічні агенти та інгібітори ангіогенезу. Токсини, охоплюють, але без обмеження, А - ланцюг рицину, мутантні екзотоксини Pseudomonas, дифтерійний анатоксин, стрептонігрин, боаміцин, сапорин, гелонін та антивірусний білок лаконосу американського. Лікарські препарати охоплюють даунорубіцин, метотрексат та каліхеаміцин. Радіонукліди охоплюють радіометали. Цитокіни охоплюють, але без обмеження, трансформуючий фактор росту (TGF)-, інтерлейкіни, інтерферони та фактори некрозу пухлин. Фотодинамічні агенти охоплюють, але без обмеження, порфірини та їх похідні. Також передбачено застосування добре відомих додаткових терапевтичних міток. Способи отримання комплексів моноклональних антитіл до CD105 або їх фрагментів з принаймні одним протипухлинним агентом добре відомі фахівцям у цей галузі (тобто кон'югатів антитіл, розглянутих у Ghetie et al., 1994, Pharmacol. Ther. 63:209-34). Такі способи можуть полягати у застосуванні одного з декількох прийнятних гетеробіфункціональних реагентів, застосованих для з'єднання або зв'язування молекул. Далі тут надано опис додаткових радіонуклідів разом з додатковими способами зв’язування молекул, як-то терапевтичних та діагностичних міток. [00162] Антитіла можуть бути змінені з різною метою з допомогою відомих у цій галузі способів, як-то, наприклад, шляхом додавання поліетиленгліколю (ПЕГ). Модифікація з допомогою ПЕГ (ПЕГілування) може привести до одно- або до багатократного підвищення часу 20 UA 115789 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 обігу, підвищеної розчинності, підвищеної стійкості до протеолізу, зниженої антигенності та імуногенності, підвищеної біодоступності, зменшеної токсичності, покращення стійкості та до більш легкого отримання композиції. (огляд див. у Francis et al., International Journal of Hematology 68:1-18, 1998). [00163] Fc-частини антитіл можуть бути змінені для підвищення часу напівжиття у кровообігу після введення пацієнту. Змінення можуть бути визначені з застосуванням стандартних засобів у цій галузі, як-то, наприклад, засоби, описані у патенті США U.S. Patent No. 7,217,798, повністю включеним сюди у якості посилання. [00164] Також відомі інші способи підвищення часу напівжиття злитих білків на основі антитіл у кровообігу, як-то, наприклад, способи, описані у патентах США U.S. Patent №№. 7,091,321 та 6,737,056, кожен з яких є також повністю включеним сюди у якості посилання. Додатково можуть бути отримані антитіла або досягнута експресія антитіл, які не будуть містити фукозу на їх складних цукрових ланцюгах з приєднаним N-глікозидом. Відомо, що усунення такої фукози підвищує ефекторні функції антитіл та антиген-зв’язуючих фрагментів, в том числі, але без обмеження, залежну від антитіл клітинно-опосередковану цитотоксичність (ADCC) та комплемент-залежну цитотоксичність (CDC). Аналогічним чином, антитіла, які можуть зв'язувати CD105 можуть бути прикріплені за їх C-кінець до частини або до повного важкого ланцюга імуноглобуліну, отриманого від антитіла будь-якого ізотипу, наприклад, IgG, IgA, IgE, IgD та IgM та від будь-якого з підкласів ізотипів, особливо IgG1, IgG2b, IgG2a, IgG3 та IgG4. [00165] Крім того, описані тут антитіла можуть також бути змінені таким чином, щоб вони набули здатність перетинати гематоенцефалічний бар'єр. Таке змінення антитіл, описаних вище дозволяє лікувати захворювання мозку, як-то мультиформну гліобластому (GBM). Зразкові модифікації, які дозволяють білкам, як-то антитілам, перетинати гематоенцефалічний бар'єр описані у патенті США US Patent Publication 20070082380, повністю включеному сюди у якості посилання. [00166] Було показано, що глікозилування імуноглобулінів значно впливає на їх ефекторні функції, структурну стійкість та швидкість їх виділення клітинами, які їх продукують (Leatherbarrow et al., Mol. Immunol. 22:407 (1985)). Відповідні за ці властивості вуглеводні групи звичайно є прикріпленими до сталих (C) ділянок антитіл. Наприклад, глікозилування IgG по аспарагіну 297 у CH 2 домені є необхідним для набуття максимального потенціалу антитіл IgG у активуванні класичного шляху комплемент-залежного цитолізу (Tao and Morrison, J. Immunol. 143:2595 (1989)). Глікозилування IgM по аспарагіну 402 у C H 3 домені є необхідним для належної збірки та цитолітичної активності антитіл (Muraoka and Shulman, J. Immunol. 142:695 (1989)). Усунення сайтів глікозилування у положеннях 162 та 419 у доменах C H 1 та CH 3 антитіл IgA веде до внутрішньоклітинної деградації та принаймні до 90% пригнічення секреції (Taylor and Wall, Mol. Cell. Biol. 8:4197 (1988)). Додатково можуть бути отримані антитіла або досягнута експресія антитіл, які не будуть містити фукозу на їх складних цукрових ланцюгах з приєднаним N-глікозидом. Відомо, що усунення такої фукози підвищує ефекторні функції антитіл та антигензв’язуючих фрагментів, в том числі, але без обмеження, залежну від антитіл клітинноопосередковану цитотоксичність (ADCC) та комплемент-залежну цитотоксичність (CDC). Ці “дефукозиловані” антитіла можуть бути отримані з допомогою різних систем з застосуванням відомих у цій галузі способів молекулярного клонування, до яких залучені, але без обмеження, трансгенні тварини, трансгенні рослини або клітинні лінії, змінені шляхом генетично-інженерних способів таким чином, що вони більше не містять ферментів та біохімічних шляхів, необхідних для включення фукози у складні цукрові ланцюги з приєднаним N-глікозидом (також відомі під назвою тварин, рослин та клітин з фукозилтрансферазним «нокаутом»). Необмежені приклади клітин, з яких можна створити клітини з фукозилтрансферазним “нокаутом“охоплюють клітини СНО, SP2/0, NS0 та YB2/0 . [00167] Також дослідники спостерігали глікозилування імуноглобулінів у змінній (V) ділянці. Sox та Hood повідомили, що приблизно 20% антитіл людини є гліколізованими у V-ділянці (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 66:975 (1970)). Вважається, що глікозилування V-домену виникає через випадкову наявність сигналу N-приєднаного глікозилування Asn-Xaa-Ser/Thr у послідовності Vділянки та не доведено, що воно відіграє роль у функціонуванні імуноглобуліну. [00168] Глікозилування у залишку змінного домену каркасної ділянки може змінити зв’язувальну взаємодію антитіла з антигеном. Заявленим винаходом створені критерії, з допомогою яких обмежену кількість амінокислот у складі каркасної ділянки або CDR-ділянок ланцюга імуноглобуліну можна буде вибрати для мутації (наприклад, шляхом заміщення, усунення або додавання залишків) з метою підвищення спорідненості антитіл. [00169] Спорідненість до зв’язування антигену може, звичайно, бути зменшена шляхом введення однієї або декількох мутацій у V-ділянку каркасної ділянки, звичайно у ділянки, 21 UA 115789 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 прилеглі до одного або до кількох CDR та/або у одну або у декілька каркасних ділянок. Звичайно такі мутації передбачають введення заміщень консервативних амінокислот, які або руйнують або створюють послідовності сайту глікозилування, але суттєво не зачіпають гідрофобні структурні властивості поліпептиду та при цьому звичайно уникають мутацій, пов'язаних з введенням пролінового залишку. Глікозилування антитіл додатково описано у патенті США No. 6 350 861, вміст якого, який стосується глікозилування включений сюди у якості посилання. [00170] Можуть також бути отримані антитіла, призначені для короткострокової або для довгострокової доставки. [00171] Антитіла, які зв’язуються з CD105 також можуть бути застосовані для очищення CD105 та/або для визначення рівнів CD105 у зразку або у організмі пацієнті для визначення або для діагностики захворювання або розладу, пов’язаного з CD105, як більш детально описано нижче. [00172] Отримані з застосуванням таких способів антитіла, які зв’язують CD105 можуть бути перевірені на одну або на декілька їх властивостей, як-то спорідненість зв’язування, авидність та нейтралізуючі можливості. Корисні антитіла можуть бути застосовані для введення пацієнту для запобігання, пригнічення, стримування або лікування стану, захворювання або розладу, пов’язаного з ангіогенезом. [00173] Антитіла можна оцінити відносно однієї або декількох притаманних їм характеристик, як-то спорідненість зв’язування, авидність та швидкості асоціації та дисоціації. У одному аспекті антитіла можна оцінити на їх здатність до нейтралізовування активності CD105 або VEGF. Вимірювання спорідненості зв’язування авидності та швидкостей асоціації та дисоціації може бути здійснено з застосуванням відомих у цій галузі способів, як-то, але без обмеження, імуноферментний аналіз (ІФА), аналіз Скетчарда, аналіз з допомогою системи Biacore (поверхневий плазмонний резонанс) тощо, а також з допомогою інших загальноприйнятних відомих фахівцям у цій галузі способів аналізу. [00174] Вимірювання зв’язування антитіл з CD105 та/або здатності антитіл, наприклад, пригнічувати ангіогенез може бути визначено з застосуванням, наприклад, імуноферментного аналізу (ІФА), аналізу конкурентного зв'язування, аналізу ELISPOT або будь-якого іншого корисного відомого у цій галузі аналізу. Ці аналізи є загальноприйнятними та відомими пересічним фахівцям у цій галузі. [00175] У одному необмеженому втіленні для вимірювання зв’язувальної здатності певних антитіл, які зв’язуються з CD105 може бути застосовано ІФА-аналіз. [00176] Аналізи, як-то ІФА, також можуть бути застосовані для визначення антитіл, які демонструють підвищену специфічність до CD105 у порівнянні з іншими антитілами. Аналізи, як-то ІФА, також можуть бути застосовані для визначення антитіл, які зв’язуються з епітопами через один або декілька поліпептидів та через один або декілька видів CD105 або VEGF. Аналіз специфічності може бути проведено шляхом здійснення паралельних ІФА-аналізів, в яких досліджуване антитіло одночасно перевіряють у різних камерах для аналізу на здатність до зв’язування одного або кількох епітопів з різними видами поліпептиду, який містить епітопи CD105 для визначення антитіл, які зв’язуються з CD105. Іншим відомим фахівцям у цій галузі способом вимірювання виявленої спорідненості зв’язування є спосіб поверхневого плазмонного резонансу (аналіз здійснюють з допомогою системи BIACORE 2000) (Liljeblad, et al., Glyco. J. 2000, 17:323-329). Стандартні вимірювання та традиційні способи аналізу зв’язування описані у Heeley, R. P., Endocr. Res. 2002, 28:217-229. [00177] Антитіла, які специфічно зв’язуються з CD105 також можуть бути досліджені на їх здатність до лікування різних захворювань та станів, пов’язаних з ангіогенезом у зв'язку з різними формами раку (наприклад, первинними пухлинами, рецидивними пухлинами та метастазами). Для перевірки цих ефектів може бути застосовано будь-якій прийнятний та відомий будь-якому фахівцю у цій галузі аналіз та деякі подібні способи описані тут. У одному прикладі, описані тут антитіла досліджують на їх здатність до зв’язування CD105. У іншому прикладі, константи спорідненості для описаних тут антитіл визначають шляхом поверхневого плазмонного резонансу (SPR). У іншому прикладі, описані тут антитіла досліджують на їх вплив на пригнічення ангіогенезу. [00178] Крім активного інгредієнта створені тут композиції (анти-CD105 антитіла або їх фрагменти) можуть додатково містити фармацевтично прийнятний наповнювач, носій, буфер, стабілізатор, поверхнево-активну речовину або інші добре відомі фахівцям у цій галузі матеріали. Такі матеріали повинні бути нетоксичними та не впливати на ефективність активного інгредієнта (інгредієнтів). Точна природа носія або іншого матеріалу буде залежати від шляху введення. 22 UA 115789 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [00179] Заявленим винаходом створені нові композиції анти-CD105 антитіл, попередньо заповнені шприці, які містять композиції та застосування таких композицій, корисних у лікуванні розладів, пов’язаних з ангіогенезом. Цією заявкою також створені композиції, які можуть бути застосовані для внутрішньовенного або внутрішньоочного введення, наприклад, для лікування пов’язаних з CD105 захворювань на рак та офтальмологічних станів. Описані тут зв’язування, спорідненість, авидність та активність антитіл або їх антиген-зв’язуючих фрагментів до CD105 тут можуть бути оцінені з допомогою відомих у цей способів, включаючи, але не без обмеження, описані вище та нижче у Прикладах способи аналізу. [00180] У одному аспекті, заявленим винаходом передбачено композицію, яка містить приблизно 1-150 мг/мл анти-CD105 антитіла або його антиген-зв’язуючого фрагмента, до 100 мМ буферизуючого агента, до 1 M поліолу та має pH, який дорівнює приблизно 4,0-7,5. [00181] У одному аспекті, композиція є стійкою після отримання, що може бути перевірено у відповідності зі стандартними засобами. Безпечне застосування композицій, які містять білки та поводження з ними створюють значні труднощі для фармацевтичних рецептур. Білки володіють унікальними хімічними та фізичними властивостями, які мають проблеми, пов’язані зі стійкістю, тобто існують різні шляхи деградації білків, в тому числі як хімічна, так і фізична нестійкість. Хімічна нестійкість охоплює дезамінування, агрегацію, усічення пептидного каркасу та окислення залишків метіоніну. Фізична нестійкість охоплює багато явищ, у тому числі, наприклад, агрегацію. [00182] “Стійка” композиція є такою, у якої білок у його складі суттєво зберігає свою фізичну та/або хімічну стійкість та/або біологічну активність протягом зберігання. Різні аналітичні способи вимірювання стійкості білка є прийнятними у цій галузі та огляд їх можна знайти, наприклад, у книгах Peptide and Protein Drug Delivery (“Доставка ліків на основі пептидів та білків”), 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) and Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. (“Розширений огляд доставки ліків”) 10: 29-90 (1993). Стійкість може бути виміряна при вибраній температурі та у вибраному періоді часу. Переважним чином, композиція є стійкою при кімнатній температурі (приблизно 30°C) або при 40°C протягом принаймні 1 місяця та/або стійкою при температурі приблизно 2-8°C протягом принаймні 1 року або принаймні 2 років. Крім того, композиція може бути стійкою після заморожування (наприклад, до -80°C) та відтавання. [00183] Білок “зберігає свою фізичну стійкість” у складі фармацевтичної композиції, якщо він не демонструє ознак агрегації, осаджування та/або денатурації під час візуальної перевірки кольору та/або прозорості або як було виміряно шляхом розсіювання УФ-випромінювання або шляхом ексклюзійної хроматографії (SEC). Способи визначення таких вимірювань відомі у цій галузі та більш детально описані нижче. [00184] Білок “зберігає свою хімічну стійкість” у композиції, якщо хімічна стійкість у даний момент часу є такою, що білок, як вважають, як і раніше зберігає свою біологічну активність, як визначено нижче. Хімічну стійкість можна оцінити шляхом виявлення та кількісного аналізу хімічно змінених форм білка. Хімічна зміна може охоплювати змінення розміру (наприклад, усічення), які можуть бути оцінені з допомогою, наприклад, ексклюзійної хроматографії, електрофорезу в поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрію (SDS-PAGE) та/або матрично-активованої лазерної десорбції/іонізації/мас-спектрометрії з часом прольоту (MALDI/TOF MS), Інші типи хімічних змінень охоплюють змінення заряду (наприклад, що виникають внаслідок дезамідування), які можуть бути оцінені, наприклад, з допомогою іонообмінної хроматографії або капілярного електрофорезу та ізоелектричного фокусування (cIEF). [00185] Aнтитіло “зберігає свою біологічну активність” у композиції, якщо біологічна активність антитіл у даний момент часу дорівнює, наприклад, приблизно 50-150% (у межах похибки аналізу) від біологічної активності, яку спостерігали при отриманні композиції, як визначено, наприклад, шляхом аналізу зв’язування антигену. Інші аналізи “біологічної активності” для антитіл висвітлені нижче. [00186] Щодо стійкості композиції протягом часу, то принаймні 95% анти-CD105 антитіла або його антиген-зв’язуючого фрагменту може бути присутніми у вигляді мономерів після принаймні приблизно 12-місячного зберігання при температурі приблизно 2-8°C, як було виміряно шляхом ексклюзійної хроматографії (SEC). Також тут передбачено застосування додаткових визнаних у цей галузі способів оцінки стійкості, охоплюючи, але без обмеження, способи, описані у Прикладах. [00187] Додатково анти-CD105 антитіло або його антиген-зв’язуючий фрагмент може демонструвати приблизно 50-150% зв’язування при вимірюванні шляхом ІФА-аналізу зв’язування CD105 після їх зберігання з температурою приблизно 2-8 °C протягом принаймні 23 UA 115789 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 приблизно 12 місяців. [00188] Середня ізоелектрична точка (pI) анти-CD105 антитіла після його зберігання з температурою приблизно 2-8 °C протягом принаймні приблизно 12 місяців може дорівнювати приблизно 8.8-9.2, як було виміряно шляхом, наприклад, капілярного електрофорезу та ізоелектричного фокусування. [00189] Зрозуміло, що анти-CD105 антитіло або його антиген-зв’язуючий фрагмент може зберігати стійкість протягом принаймні приблизно 12 місяців, принаймні приблизно 18 місяців, принаймні приблизно 24 місяців, принаймні приблизно 30 місяців, принаймні приблизно 36 місяців або ще більше. [00190] Композиція може містити принаймні 95% анти-CD105 антитіла у вигляді мономеру, як було виміряно шляхом SEC після циклів заморожування та відтавання композиції. Альтернативним або додатковим чином композиція може містити принаймні 95% анти-CD105 антитіла у вигляді мономеру, як було виміряно шляхом SEC зі струшуванням композиції. [00191] Анти-CD105 антитіло або його антиген-зв’язуючий фрагмент може містити будь-яку послідовність, CDR-ділянки у складі якої є здатними до зв’язування з CD105. У одному необмеженому втіленні анти-CD105 антитілом є TRC105, яке містить змінну ділянку легкого ланцюга (VL), що має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №: 1; сталу ділянку легкого ланцюга (CL), яка має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №: 2; змінну ділянку важкого ланцюга (VH), яка має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №: 3; та сталу ділянку (Fc), яка має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №: 4. [00192] У іншому необмеженому втіленні анти-CD105 антитіло містить ділянку VL CDR1, яка має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №: 5; VL CDR2, яка має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №: 6; VL CDR3, яка має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №: 7; VH CDR1, яка має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №: 8; VH CDR2, яка має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №: 9; та VH CDR3, яка має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №: 10. [00193] Композиція може містити приблизно 1-150 мг/мл анти-CD105 антитіл або їх антигензв’язуючих фрагментів або будь-яку їх кількість (включаючи, але без обмеження, приблизно 2 мг/мл, приблизно 5 мг/мл, приблизно 7.5 мг/мл, приблизно 10 мг/мл, 20 мг/мл, приблизно 25 мг/мл, приблизно 30 мг/мл, приблизно 35 мг/мл, приблизно 40 мг/мл, приблизно 45 мг/мл, приблизно 50 мг/мл, приблизно 55 мг/мл, приблизно 60 мг/мл, приблизно 65 мг/мл, приблизно 70 мг/мл, приблизно 75 мг/мл, приблизно 80 мг/мл, приблизно 85 мг/мл, приблизно 90 мг/мл, приблизно 95 мг/мл, приблизно 100 мг/мл, приблизно 105 мг/мл, приблизно 110 мг/мл, приблизно 115 мг/мл, приблизно 120 мг/мл, приблизно 125 мг/мл, приблизно 130 мг/мл, приблизно 135 мг/мл, приблизно 140 мг/мл, приблизно 145 мг/мл, приблизно 150 мг/мл або більше або вона може дорівнювати будь-якому цілому числу, яке існує між цими значеннями. Як тут застосовано відносно до концентрацій антитіла, термін “приблизно” означає ± 2% вказаного значення. [00194] У одному втіленні композиція містить приблизно 25 мг/мл анти-CD105 антитіла або його антиген-зв’язуючого фрагмента. У іншому втіленні композиція містить приблизно 50 мг/мл анти-CD105 антитіла або його антиген-зв’язуючого фрагмента. У іншому втіленні композиція містить приблизно 100 мг/мл анти-CD105 антитіла або його антиген-зв’язуючого фрагмента. [00195] Як тут описано, композиції можуть містити буферизуючий агент, як-то, наприклад, гістидин, ацетат, цитрат або фосфат. Буферизуючі агенти можуть бути включені у кількості приблизно 5-100 мM. У одному втіленні композиція містить приблизно 5 мM, приблизно 7.5 мM, приблизно 10 мM, приблизно 12.5 мM, приблизно 15 мM, приблизно 17.5 мM, приблизно 20 мM, приблизно 22.5 мM, приблизно 25 мM, приблизно 30 мM, приблизно 35 мM, приблизно 40 мM, приблизно 45 мM, приблизно 50 мM, приблизно 55 мM, приблизно 60 мM, приблизно 65 мM, приблизно 70 мM, приблизно 75 мM, приблизно 80 мM, приблизно 85 мM, приблизно 90 мM, приблизно 95 мM або приблизно 100 мМ гістидину, ацетату, цитрату або фосфату або ця концентрація може дорівнювати будь-якому цілому числу, яке існує між цими значеннями. Як тут застосовано відносно до концентрацій буферу, термін “приблизно” означає ± 2% вказаного значення. [00196] Композиції можуть бути отримані для будь-якого відомого для антитіл типу введення, включаючи, але без обмеження, введення у скловидне тіло та внутрішньовенне введення. [00197] Створені тут композиції можуть додатково містити прийнятний носій або наповнювач, включаючи будь-який носій або наповнювач, який є фармацевтично прийнятним та прийнятним для введення пацієнту. [00198] У одному втіленні передбачена тут композиція є ізотонічною. Типові ізотонічні 24 UA 115789 C2 5 10 15 20 25 композиції охоплюють, але без обмеження, композиції з осмотичним тиском приблизно у 250350 мОсм. У іншому втіленні передбачена тут композиція є гіпертонічною. Типові гіпертонічні композиції охоплюють, але без обмеження, композиції з осмотичним тиском приблизно у 3511000 мОсм. [00199] До описаної тут композиції також можуть бути додані поліоли з концентрацією до 1 M. Наприклад композиція може містити поліол з концентрацією приблизно 50 мM, приблизно 75 мM, приблизно 100 мM, приблизно 150 мM, приблизно 200 мM, приблизно 225 мM, приблизно 240 мM, приблизно 250 мM, приблизно 300 мM, приблизно 350 мM, приблизно 400 мM, приблизно 450 мM, приблизно 500 мM, приблизно 550 мM, приблизно 600 мM, приблизно 650 мM, приблизно 700 мM, приблизно 750 мM, приблизно 800 мM, приблизно 850 мM, приблизно 900 мM, приблизно 950 мM, приблизно 1 M або з концентрацією, яка дорівнює будь-якому цілому числу, яке існує між цими значеннями. У одному втіленні передбачена тут композиція містить поліол у кількості, меншій, ніж 300 мМ та композицію отримують в ізотонічному стані з сіллю з концентрацією приблизно 100 мМ - 175 мM. Наприклад, композицію, яка містить поліол у кількості, меншій, ніж 300 мМ отримують в ізотонічному стані з сіллю з концентрацією приблизно 130 мM. Як тут застосовано відносно до концентрацій поліолу, термін “приблизно” означає ± 2% вказаної кількості. У одному аспекті, поліол для застосування у передбачених тут композиціях може бути цукром, як-то, наприклад, невідновлюючим цукром. Типові приклади невідновлюючих цукрів охоплюють, але без обмеження, трегалозу та цукрозу. наприклад, композиція може містити приблизно 200 мМ - 300 мМ трегалози або цукрози. У одному втіленні композиція може містити приблизно 240 мМ трегалози або цукрози. Альтернативним чином, цукор може бути сорбітом у кількості (концентрації) приблизно 200 мМ - 300 мM. У одному втіленні композиція може містити приблизно 240 мМ сорбіту. [00200] Додаткові необмежені приклади передбаченої тут композиції є будь-якими з композицій 1-39, наведених у Таблиці 1. Таблиця 1 Композиція pH №. F01 7 F02 6 F03 6 F04 5 F05 6 F06 5 F07 4 F08 5 F09 5 F10 5 F11 5 F12 6 F13 6 F14 6 F15 6 F16 7 F17 6 F18 6 F19 5 F20 6 F21 5 F22 4 F23 5 F24 5 F25 5 F26 5 F27 6 F28 6 Фосфат Гістидин Цитрат (мM) (мM) (мМ) 20 0 0 20 0 0 0 20 0 0 20 0 0 0 20 0 0 20 0 0 0 0 0 0 0 20 0 0 0 20 0 0 0 10 0 0 0 10 0 10 0 0 0 10 0 20 0 0 20 0 0 0 20 0 0 20 0 0 0 20 0 0 20 0 0 0 0 0 0 0 20 0 0 0 20 0 0 0 10 0 0 0 10 0 Ацетат (мМ) 0 0 0 0 0 0 20 20 0 0 20 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 20 20 0 0 20 0 0 25 NaCl (мМ) 130 130 130 130 130 130 130 130 0 0 0 0 0 80 80 130 130 130 130 130 130 130 130 0 0 0 0 0 Трегалоза (мМ) 0 0 0 0 0 0 0 0 240 240 240 240 240 120 120 0 0 0 0 0 0 0 0 240 240 240 240 240 Сорбіт Білок мг/мл 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 50 UA 115789 C2 Таблиця 1 Композиція №. F29 F30 F31 F32 F33 F34 F35 F36 F37 F38 F39 pH 6 6 7 7 5.5 5.5 4 5.5 4 5.5 4 Фосфат Гістидин Цитрат (мM) (мM) (мМ) 10 0 0 0 10 0 17 0 0 17 0 0 0 20 0 0 20 0 0 0 0 0 20 0 0 0 0 0 20 0 0 0 0 Ацетат (мМ) 0 0 0 0 0 0 20 0 20 0 20 NaCl (мМ) 80 80 145 145 0 0 0 0 0 0 0 Трегалоза (мМ) 120 120 0 0 240 0 0 240 240 240 240 Сорбіт Білок мг/мл 0 0 0 0 0 240 240 0 0 0 0 50 50 5 7 25 25 25 50 50 100 100 Фосфат. - фосфатно-сольовий буфер; 5 10 15 20 25 30 35 40 45 [00201] Передбачена тут композиція може мати pH приблизно 4,0-7,5. У одному втіленні передбачена тут композиція може мати pH приблизно 4,5, приблизно 5,0, приблизно 5,5, приблизно 6,0, приблизно 6,5 або приблизно 7,0. Як тут застосовано по відношенню до pH, термін “приблизно” стосується значень pH ± 0.05, 0,1 або 0,2. [00202] Зрозуміло, що композиції, які містять антитіла або антиген-зв’язуючі фрагменти, визначені з допомогою описаних тут способів можуть бути підготовлені для зберігання шляхом змішування білка, який має бажаний ступінь чистоти з вибірковими фізіологічно прийнятними носіями, наповнювачами та/або стабілізаторами у вигляді водних розчинів (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)). [00203] Прийнятні носії є фізіологічно прийнятними для введення пацієнту та зберігають терапевтичні властивості сполук, з якими/у які їх вводять. Прийнятні носії та їх композиції звичайно описані у, наприклад, Remington’ pharmaceutical Sciences (18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA 1990). Одним зі зразкових носіїв є фізіологічний сольовий розчин. Фраза “фармацевтично прийнятний носій”, як тут застосовано, означає прийнятний матеріал, композицію або засіб доставки, як-то рідкий або твердий наповнювач, розріджувач, допоміжну речовину та/або розчинник, залучений до перенесення або до транспортування сполук суб’єкта з розташованого на одному органі або частині тіла місця введення до іншого органу або частини тіла. Кожен носій повинен бути прийнятним у сенсі сумісності з іншими інгредієнтами композиції та нешкідливим для суб’єкта, якому його вводять. Прийнятний носій не повинен змінювати специфічну активність сполук суб’єкту. [00204] У одному аспекті створені фармацевтично прийнятні або фізіологічно прийнятні та сумісні з введенням композиції, які містять розчинники (водні або неводні), розчини, емульсії, дисперсні середовища, оболонки, ізотонічні агенти та агенти, які сприяють абсорбції або затримують її. Отже, композиції або препарати є композиціями, прийнятними для терапевтичного та/або діагностичного застосування у суб’єкті. Композиції та препарати містять певну кількість описаної тут сполуки та фармацевтично або фізіологічно прийнятного носія. [00205] Композиції можуть бути отримані таким чином, щоб бути сумісними з певним шляхом введення (тобто системним або місцевим). Отже, композиції містять прийнятні для введення різними шляхами носії, розріджувачі або наповнювачі. [00206] Композиції можуть бути введені, наприклад, шляхом ін’єкції, включаючи, але без обмеження, підшкірне введення, введення у скловидне тіло, внутрішньошкірне, внутрішньовенне, внутрішньоартеріальне, внутрішньочеревне або внутрішньом'язове ін’єкційне введення. Також до складу композиції можуть бути включені ізотоничні агенти, як-то цукри, багатоатомні спирти, як-то як маніт та сорбіт, а також хлорид натрію. Отримані розчини можуть бути упаковані для застосування як є або у ліофілізованому вигляді та у цьому разі така ліофілізована композиція потім перед введенням може бути об'єднаною зі стерильним розчином. Для внутрішньовенної ін'єкції або ін'єкції у місце ураження активний інгредієнт може знаходитися у формі парентерально прийнятного водного розчину, який є апірогенним та має прийнятний рН, ізотонічність та стійкість. Будь-які кваліфіковані фахівці у цій галузі цілком здатні отримати відповідні розчини з застосуванням, наприклад, прийнятних для ін'єкції изотонічних носіїв, як-то хлорид натрію, розчин Рингера або лактований розчин Рингера. У разі необхідності ці розчини також можуть містити консерванти, стабілізатори, буфери, антіоксиданти та/або інші 26 UA 115789 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 домішки. Стерильні прийнятні для ін'єкційного введення розчини можуть бути отримані шляхом поєднання активного інгредієнта у потрібній кількості у прийнятному розчиннику з одним з перелічених вище інгредієнтів або з комбінацією таких інгредієнтів з наступною стерилізацією шляхом фільтрування. [00207] У одному втіленні описана тут композиція не містить поверхнево-активних речовин. У іншому втіленні описана тут композиція вибірково містить поверхнево-активні речовини, як-то, ® ® наприклад, полісорбат 20 або 80, TWEEN , PLURONIC F68 або поліетиленгліколь (ПЕГ). [00208] Якщо композиції розглядають для застосування у складі лікарських композицій або у будь-яких з описаних тут способів, то передбачається, що вони можуть бути суттєво апірогенними та при введенні пацієнту-людині вони не будуть викликати запальних або небажаних алергічних реакцій. Перевірка композицій на пірогени та отримання суттєво апірогенних композицій є добре відомими для пересічних фахівців у цей галузі процедурами та вони можуть бути здійснені з застосуванням наявних у продажу наборів. [00209] Фраза “фармацевтично прийнятний” має відношення до молекулярних об'єктів та композицій, які є фізіологічно толерантними та звичайно при введені суб’єкту не спричинюють алергічних або подібних несприятливих реакцій, як-то розлад шлунку, запаморочення тощо. [00210] Термін “одиниця дози” при застосуванні по відношенню до терапевтичної композиції має відношення до фізично різних одиниць, прийнятних у якості унітарного дозування для суб’єктів, де кожна одиниця містить заздалегідь визначену кількість активного матеріалу, розраховану для отримання бажаного терапевтичного ефекту у поєднанні з потрібним розріджувачем; тобто носієм або засобом доставки. [00211] Композиції можна вводити сумісним з лікарським способом та в терапевтично ефективній кількості. Кількість, яку треба вводити залежить від суб'єкта, який підлягає лікуванню, здатності імунної системи суб'єкта застосовувати активний інгредієнт та від ступеня бажаної зв'язувальної здатності. Точні необхідні для введення кількості активного інгредієнта залежать від розсуду лікаря та є індивідуальними для кожної людини. Прийнятні схеми первісного введення та бустерних доз також варіюють, але є типізованими у вигляді початкового введення з наступними повторними дозами з одним або кількома годинними інтервалами з наступною ін'єкцією або іншим типом введення. Крім того, також розглядаються безперервні внутрішньовенні вливання, достатні для підтримки концентрації в крові. [00212] Одним втіленням передбачено застосування описаної тут композиції для отримання лікарського засобу для лікування описаного тут розладу або стану. Лікарські засоби можуть бути сформульовані на основі фізичних характеристик пацієнта/суб’єкта, який потребує лікування та можуть бути отримані у вигляді одного або кількох композицій у залежності від стадії стану, захворювання або розладу. Лікарські засоби можуть бути запакованими у прийнятне пакування з відповідним маркуванням для розподілення по лікарням та клінікам з показаннями по лікуванню суб’єкту, який має описане тут захворювання. Лікарські засоби можуть бути запакованими у вигляді однієї або кількох одиниць. [00213] Також заявленим винаходом передбачено попередньо наповнений шприц, прийнятний для внутрішньовенного введення або введення у скловидне тіло, який містить описаний тут композиція. Такі попередньо заповнені шприці також можуть бути запаковані та помічені маркуванням для застосування у лікуванні пов’язаного з ангіогенезом стану, як-то будь-який з описаних тут станів. Додатково пакування цих композицій може містити інструкції по зберіганню та застосуванню. Заявленим винаходом передбачено пакування, яке містить один або декілька попередньо заповнених шприців, прийнятних для внутрішньовенного введення або введення у скловидне введення, що містять композиція за будь-яким з попередніх пунктів. Також заявленим винаходом передбачено отримання лікарського засобу, який містить описану тут композицію для лікування стану, пов’язаного з ангіогенезом, як-то будь-якого з описаних тут станів. Способи лікування. [00214] Заявленим винаходом передбачено спосіб лікування суб’єкта (людини або іншої живої істоти) шляхом введення суб’єкту композиції антитіл, які переважним чином зв’язуються з CD105. Також створені способи запобігання або лікування одного або декількох захворювань або розладів, пов’язаних з ангіогенезом/неоваскуляризацією, надмірною васкуляризацією, ростом пухлин, розповсюдженням пухлинних клітин або розвитком малих судин, який полягає у веденні композиції, що містить анти-CD105 антитіло або його антиген-зв’язуючий фрагмент, тим самим забезпечуючи запобігання, лікування, пом'якшення або послаблення перебігу або тяжкості захворювання. [00215] Ефективної відповіді за заявленим винаходом досягають, коли суб’єкт відчуває затримку або часткове або повне полегшення або зменшення ознак або симптомів хвороби та 27 UA 115789 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вона специфічно охоплює, без обмеження, подовження періоду виживання. Очікуваний період виживання без випадків прогресування захворювання може бути виміряним у вигляді місяців або років у залежності від прогностичних факторів, які охоплюють кількість рецидивів захворювання, стадію захворювання та інші фактори. Пролонговане виживання охоплює, без обмеження, час, який сягає принаймні 1 місяць, приблизно принаймні 2 місяці, приблизно принаймні 3 місяці, приблизно принаймні 4 місяці, приблизно принаймні 6 місяців, приблизно принаймні 1 рік, приблизно принаймні 2 роки, приблизно принаймні 3 роки, приблизно принаймні 4 роки, приблизно принаймні 5 років тощо або будь-який інтервал між ними. Загальне виживання або виживання без випадків прогресування захворювання може бути також виміряно строком від місяців до років. Альтернативним чином, ефективною відповіддю може бути така, при якої ознаки або симптоми суб’єкта або маса злоякісних пухлин залишаються незмінними та не погіршуються. Додатково показання до лікування більш детально описані нижче. [00216] Композиції описаних тут антитіл можуть бути застосовані у якості нетерапевтичних агентів (наприклад, у якості агентів афінної очистки). Звичайно, у одному такому втіленні інтересуючий білок з допомогою стандартних відомих у цій галузі способів імобілізують на твердому носії, як-то смола Sephadex® або фільтрувальний папір та такий імобілізований білок контактує зі зразком, що містить інтересуючу речовину (або її фрагмент) для його очищення, після чого підтримуючий носій промивають прийнятним розчинником, який усуває суттєво весь сторонній матеріал у зразку за виключенням білка-мішені, який є зв'язаним з імобілізованим антитілом. Зрештою підтримуючий носій промивають іншим прийнятним розчинником, як-то гліциновим буфером, pH 5.0, який вивільнює цільовий білок. Додатково, крім очищення, композиції можуть бути застосовані для визначення, діагностики та терапії пов’язаних з CD105 захворювань та розладів. [00217] Визначений тут термін “контактування” означає засоби залучення композиції, як тут передбачено, до фізичної близькості з клітиною, органом, тканиною або рідиною, як тут описано. Контактування охоплює системні або місцеві введення будь-якої з передбачених тут композицій та також охоплює, але без обмеження, процедури та способи in vitro, in vivo та/або ex vivo. "Комбінування" та "контактування" тут застосовані взаємозамінне та покликані бути визначені таким саме чином. Для застосувань in vivo контактування може відбуватися, наприклад, шляхом введення композиції пацієнту будь-як прийнятним способом. Композиції з фармацевтично прийнятними наповнювачами та носіями більш детально описані вище. [00218] Як тут застосовано, “запобігання” має відношення до профілактики, запобігання перебігу ознак або симптомів, запобігання прогресування захворювання або розладу, пов’язаного з ангіогенезом або розладу, який корелює з активністю CD105. У одному необмеженому втіленні пацієнтам з діагнозом першої стадії раку може бути введено описану тут композицію, тим самим запобігаючи розвитку другої стадії раку. У ще іншому втіленні описана тут композиція може бути введеною пацієнту, який не має симптомів, але є тест-позитивним на один з біомаркерів раку, тим самим запобігаючи розвитку цієї хвороби. Як тут застосовано, терміни “пригнічення” та “лікування” тут застосовують взаємозамінне та вони означають, наприклад, затримку розвитку ознак або симптомів, пролонгування виживання, часткове або повне покращення ознак або симптомів та часткове або повне усунення пухлин або метастазів. [00219] “Суб’єкт” або “пацієнт” (наприклад, ссавець, як-то людина або тварина, яка не є людиною, як-то примати, гризуни, корови, коні, свині, вівці, верблюди, лами тощо.) може бути ссавцем, який демонструє один або декілька клінічних проявів та/або ознак або симптомів описаного тут захворювання або розладу. У певних випадках суб’єкт може бути безсимптомним та все-таки мати клінічні прояви захворювання або розладу. Антитіло може бути кон’юговано до терапевтично функціональної групи або бути злитим білком, який містить терапевтично функціональну групу. Також антитіло може бути кон’юговано до прийнятної для визначення функціональної групи або бути злитим білком, який містить прийнятну для визначення функціональну групу. У одному втіленні антитіло може бути кон’юговано як до терапевтичної функціональної групи, так і до прийнятної для визначення функціональної групи. Aнтитіло може бути кон’юговано до афінної мітки або рекомбінантним чином побудовано разом з нею (наприклад, з міткою очистки). Афінні мітки є стандартними у цій галузі. [00220] Створені тут антитіла або їх фрагменти є такими, що вони можуть бути кон’юговані або приєднані до терапевтичної функціональної групи та/або здатної до візуалізації або прийнятної для визначення функціональної групи та/або до афінної мітки. Способи кон’югації або зв’язування поліпептидів є добре відомі у цій галузі. Асоціації (зв’язування) між сполуками та мітками охоплює будь-які відомі у цій галузі засоби, як-то, але без обмеження, ковалентні та не ковалентні взаємодії, хімічну кон’югацію, а також рекомбінантні способи. [00221] Застосований тут термін “ангіогенез” охоплює всі аспекти підтримки та розвитку 28