Антитіла до рецептора кінцевих продуктів глибокого глікування (rage) і їх застосування

Реферат: Винахід стосується моноклональних антитіл, що зв'язуються з білком RAGE, призначені для лікування захворювання або розладу, характеризованого наявністю або індукованого патофізіологічними лігандами RAGE, наприклад білками з неправильним укладанням, подібними амілоїду  і кінцевим продуктам глибокого глікування. UA 105768 C2 (12) UA 105768 C2 UA 105768 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ, ДО ЯКОЇ НАЛЕЖИТЬ ВИНАХІД Дана заявка стосується антитіл, зокрема моноклональних антитіл і, зокрема, їх CDRщеплених гуманізованих варіантів, які можна застосовувати для лікування і діагностики хвороби Альцгеймера (AD), дегенерації клітин центральної нервової системи, порушення навчання і пам'яті, аномального транспорту амілоїду β і інших нейрозапальних станів, асоційованих з рецептором кінцевих продуктів глибокого глікування (RAGE). Зокрема, даний винахід стосується антитіл і їх фрагментів, які зв'язуються з RAGE. РІВЕНЬ ТЕХНІКИ Хвороба Альцгеймера (AD) є найбільш частою причиною деменції у людей похилого віку з частотою зустрічальності близько 10 % у популяції людей у віці понад 65 років. Зі збільшенням віку імовірність захворювання також зростає. У світі близько 15 мільйонів людей уражені захворюванням, і передбачається, що подальше збільшення тривалості життя приведе до збільшення кількості людей, уражених захворюванням, приблизно в три рази протягом наступних десятиліть. З точки зору вищесказаного існує величезна і невідкладна потреба в лікуванні AD. У випадку такого лікування уражені пацієнти зможуть підтримувати функціональний і активний спосіб життя протягом багатьох років, що неможливо без такого лікування. Таким чином, існують не тільки фінансові переваги такого лікування, але також переваги для "якості життя" пацієнтів, а також для людей, що здійснюють догляд за хворими. З молекулярної точки зору AD характеризується відкладеннями аномально агрегованих білків. У випадку позаклітинних амілоїдних бляшок такі відкладення головним чином складаються з філаментів β-амілоїдних пептидів (Aβ), і у випадку внутрішньоклітинних нейрофібрилярних клубків (NFT), головним чином, з білка tau. AD також характеризується підвищеною експресією RAGE у нейронах. RAGE є рецептором сімейства імуноглобулінів, що має багато лігандів, який функціонує як акцептор Aβ, що передає сигнал, на клітинній поверхні. Декількома групами показано, що інфузія Aβ40 у мишей приводить до вазоконстрикції судин головного мозку й ослаблення мозкового кровообігу (CBF). Пацієнти, які страждають AD, також мають ослаблений мозковий кровообіг. У мишачих моделях AD, у яких трансгенні тварини надекспресують білок амілоїдного попередника (APP), що приводить до захворювання, викликаючи утворення бляшок, показано, що RAGE залучений як патогенний фактор у прогресування захворювання (Deane et al. Nature Medicine, 9(7) pp. 907-913, 2003; Arancio et al. EMBO J, 1-10, 2004). Показано, що RAGE зв'язується з Aβ-пептидами. Інгібування такої взаємодії пригнічує накопичення Aβ у трансгенних тварин у моделі; тому вважають, що RAGE залучений у AD. Показано, що лікування з використанням sRAGE (розчинного RAGE), а також анти-RаGеантитілами знижує кількість бляшок (Deane et al., 2003). Блокування взаємодії RAGE з амілоїдом за допомогою антитіл може бути придатним способом лікування пацієнтів з AD; однак, існуючі поліклональні антитіла, одержані з сироватки тварин, не придатні для постійного лікування людини. Взаємодія RAGE з Aβ розкрита в заявці WO 2006/077101 A1, у якій описана конкуренція RAGE, у якому відсутній v-домен, за зв'язування Aβ з RAGE, а також конкуренція пептидів, які являють собою частини C-кінцевого домену RAGE, головним чином C1-домену. Взаємодія антиRаGе-антитіл з v-доменом RAGE описана в WO 2007109749(A2), де також описано, що зв'язування різних лігандів (S100b, HMGB1 (білок 1 високомобільної групи), амілоїд Аβ) з RAGE може здійснюватися за допомогою зв'язування з зазначеним доменом. У публікації WO 2008/137552 A2 описане зв'язування деяких моноклональних анти-RаGеантитіл з різними доменами RAGE. Більшість із зазначених антитіл інгібує взаємодію RAGE людини і комплексу HMGB1 і CpG-днк. Публікація WO 2006/077101 стосується ідентифікації, функціональності і застосування пептидів RAGE, названих AGER-RME і AGER-CDP. Зазначені пептиди поряд з іншим застосовні для ідентифікації й одержання RAGE-зв'язувальних лігандів, подібних до анти-RAGE-антитіл. У даному винаході описані нові моноклональні антитіла, що зв'язуються з C-доменами RAGE, і специфічна взаємодія і конкуренція за зв'язування Aβ з моноклональними антитілами до C1- і C2-домену RAGE. СУТЬ ВИНАХОДУ Даний винахід стосується зв'язувальних молекул, зокрема антитіл, що специфічно зв'язуються з RAGE; типові анти-RаGе-антитіла відповідно до винаходу можуть містити щонайменше одну з амінокислотних послідовностей варіабельної області антитіла, показаних у SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17 і 21, або їх окремі CDR або споріднені CDR послідовності, які більш докладно охарактеризовані нижче. 1 UA 105768 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Зокрема, у даному винаході пропонуються моноклональні антитіла, що зв'язуються з RAGE, більш конкретно моноклональні антитіла, що зв'язуються з C-доменом RAGE. У даний винахід включені анти-RаGе-антитіла, які специфічно зв'язуються з RAGE і містять варіабельну область легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 90 % ідентична будь-якій з послідовностей SEQ ID NO: 5, 13 і 21, або являє собою RAGEзв'язувальний фрагмент антитіла в межах зазначених послідовностей. Також пропонуються анти-RаGе-антитіла, які специфічно зв'язуються з RAGE і містять варіабельну область важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 90 % ідентична будь-якій з послідовностей SEQ ID NO: 1, 9 і 17, або являє собою RAGEзв'язувальний фрагмент антитіла в межах зазначених послідовностей. Конкретний варіант здійснення даного винаходу представлений декількома моноклональними антитілами, що здатні зв'язуватися з C-доменом RAGE і блокувати зв'язування Aβ-глобуломерів. Більш конкретно даний винахід стосується моноклонального антитіла 11E6, яке зв'язується з C-2-доменом RAGE, не зв'язується з пептидами з амінокислотними послідовностями, використовуваними для створення поліклональних антитіл, і здатне нейтралізувати in vivo вплив Aβ1-40 на судини головного мозку у мишей. До анти-RаGе-антитіл відповідно до винаходу належать антитіла, які специфічно зв'язуються з C-доменом RAGE. Анти-RаGе-антитіла відповідно до винаходу включають анти-RаGе-антитіло або його RAGEзв'язувальний фрагмент, яке описане вище і яке вибране з групи, що складається з химерного антитіла, CDR-щепленого або гуманізованого антитіла, одноланцюжкового антитіла, злитого білка й антитіла людини. У різних варіантах антитіла відповідно до винаходу являють собою рекомбінантні антитіла або моноклональні антитіла. Конкретні нейтралізуючі антитіла, описані в даній заявці, названі mAb7F9 mAb11E6 і mAb4E5, і функціональні фрагменти таких антитіл і інші антитіла і функціональні фрагменти антитіл із властивостями, еквівалентними властивостям mAb7F9, mAb11E6 і mAb4E5, такими як висока афінність зв'язування з RAGE з низькою кінетикою дисоціації і висока нейтралізуюча здатність, вважаються частиною даного винаходу. Однак антитіла людини згідно з даним винаходом можуть містити амінокислотні залишки, які не закодовані в імуноглобуліні зародкової лінії до імуногенного поліпептиду RAGE або його фрагмента, що можуть бути визначені будь-яким способом, відомим у даній галузі. Наприклад, афінність зв'язування може бути виміряна в конкурентних ELISA, РІА, з використанням методики BIAcore або KinExА. Швидкість дисоціації також може бути виміряна з використанням методики BIAcore або KinExА. Афінність зв'язування і швидкість дисоціації вимірюють на основі резонансу поверхневого плазмону, використовуючи, наприклад, BIAcore. Одне з моноклональних антитіл згідно з даним винаходом, антитіло mAb7F9, має щонайменше 90 % ідентичність амінокислотної послідовності з послідовністю, яка включає в себе варіабельну область важкого ланцюга (область VH), що містить послідовність SEQ ID NO: 1 і послідовності SEQ ID NO: 2, 3 і 4, які являють собою залишки 31-35, 50-68 і 101-108 послідовності SEQ ID NO: 1, відповідно. Антитіло mAb7F9 згідно з даним винаходом має щонайменше 90 % ідентичність амінокислотної послідовності з послідовністю, яка включає в себе варіабельну область легкого ланцюга (область VL), що містить послідовність SEQ ID NO: 5 і послідовності SEQ ID NO: 6, 7 і 8, які являють собою залишки 24-34, 50-56, 89-97 послідовності SEQ ID NO: 5, відповідно. Інше з зазначених моноклональних антитіл згідно з даним винаходом, антитіло mAb11E6, має щонайменше 90 % ідентичність амінокислотної послідовності з послідовністю, яка включає в себе варіабельну область важкого ланцюга (область VH), що містить послідовність SEQ ID NO: 9 і послідовності SEQ ID NO: 10, 11 і 12, які являють собою залишки 31-35, 50-66 і 99-109 послідовності SEQ ID NO: 9, відповідно. Антитіло mAb11E6 згідно з даним винаходом має щонайменше 90 % ідентичність амінокислотної послідовності з послідовністю, яка включає в себе варіабельну область легкого ланцюга (область VL), що містить послідовність SEQ ID NO: 13 і послідовності SEQ ID NO: 14, 15 і 16, які являють собою залишки 24-34, 50-56, 89-97 послідовності SEQ ID NO: 13, відповідно. mAb11E6 зв'язується з C-2-доменом RAGE, не зв'язується з пептидами з амінокислотними послідовностями, використовуваними для створення поліклональних антитіл, і здатне нейтралізувати in vivo вплив Aβ1-40 на судини головного мозку у мишей. Інше з зазначених моноклональних антитіл згідно з даним винаходом, антитіло mAb4E5, має щонайменше 90 % ідентичність амінокислотної послідовності з послідовністю, яка включає в себе варіабельну область важкого ланцюга (область VH), що містить послідовність SEQ ID NO: 17 і послідовності SEQ ID NO: 18, 19 і 20, які являють собою залишки 31-35, 50-66 і 99-109 2 UA 105768 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовності SEQ ID NO: 17, відповідно. Антитіло mAb4E5 згідно з даним винаходом має щонайменше 90 % ідентичність амінокислотної послідовності з послідовністю, яка включає в себе варіабельну область легкого ланцюга (область VL), що містить послідовність SEQ ID NO: 21 і послідовності SEQ ID NO: 22, 23 і 24, які являють собою залишки 24-34, 50-56, 89-97 послідовності SEQ ID NO: 21, відповідно. Також передбачається, що виділені моноклональні антитіла, що взаємодіють з RAGE, згідно з даним винаходом можуть являти собою глікозилований зв'язувальний білок, при цьому антитіло або його антигензв'язувальна частина містить один або декілька вуглеводних залишків. Утворений in vivo білковий продукт може піддаватися подальшому процесингу, відомому як посттрансляційна модифікація. Зокрема, можуть бути ферментативно додані залишки цукру (глікозил) у ході процесу, який називається глікозилування. Одержувані в результаті білки, що несуть ковалентно зв'язані олігосахаридні бічні ланцюги, відомі як глікозиловані білки або глікопротеїди. Глікозилування білків залежить від амінокислотної послідовності білка, що представляє інтерес, а також клітини-хазяїна, у якій білок експресується. Різні організми можуть продукувати різні ферменти глікозилування (наприклад, глікозилтрансферази і глікозидази) і мають різні доступні субстрати (цукри нуклеотидів). Унаслідок таких факторів картина глікозилування білків і склад глікозильних залишків можуть відрізнятися, залежно від системи хазяїна, у якій експресується конкретний білок. Залишки глікозилу, застосовні в даному винаході, можуть включати без обмеження глюкозу, галактозу, манозу, фукозу, нацетилглюкозамін і сіалову кислоту. Антитіла згідно з даним винаходом містять константну область важкого ланцюга, таку як константна область IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM або IgD. Крім того, антитіло може містити константну область легкого ланцюга або константну область легкого ланцюга каппа, або константну область легкого ланцюга лямбда. Зокрема, антитіло містить константну область легкого ланцюга каппа. Альтернативно, частина антитіла може являти собою, наприклад, Fabфрагмент або одноланцюжковий Fv-фрагмент. У даній галузі відомі заміни амінокислотних залишків у Fc-частині для зміни ефекторної функції антитіла (Winter, et al. Патенти США № 5648260, 5624821). Fc-частина антитіла опосередковує декілька важливих ефекторних функцій, наприклад індукцію цитокінів, ADCC, фагоцитоз, залежну від комплементу цитотоксичність (CDC) і час напівжиття/швидкість кліренсу антитіла і комплексів антиген-антитіло. У деяких випадках такі ефекторні функції вимагаються для терапевтичних антитіл, але в інших випадках вони можуть бути необов'язковими або навіть шкідливими, залежно від терапевтичних цілей. Деякі ізотипи IgG людини, зокрема, IgG1 і IgG3, опосередковують ADCC і CDC у результаті зв'язування з Fcγ R і C1q комплементу, відповідно. Неонатальні Fc-рецептори (FcRn) є важливими компонентами, які визначають час напівжиття антитіл у циркуляції. У ще одному варіанті заміняють щонайменше один амінокислотний залишок у константній області антитіла, наприклад Fc-області антитіла, так що такі ефекторні функції антитіла змінюються. КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ На Фіг. 1A-1C показаний аналіз ELISA зв'язування рекомбінантних і одержаних з гібридом моноклональних антитіл проти RAGE людини 7F9, 11E6 і 4E5 з рекомбінантним RAGE людини. На Фіг. 2 показана характеристика моноклональних антитіл 7F9, 11E6 і 4E5 з використанням дот-блот-зв'язування. На Фіг. 3A-3C показані результати аналізу HTRF, що показують конкуренцію sRAGE-Aβглобуломери-моноклональні антитіла. На Фіг. 4 показаний аналіз HTRF зв'язування sRAGE-Aβ-глобуломер. На Фіг. 5 показане зв'язування Aβ-глобуломера з sRAGE-Fc і з v-доменом RAGE. На Фіг. 6A-6C показані експерименти зв'язування в ELISA моноклональних антитіл відповідно до винаходу з різними фрагментами RAGE. На Фіг. 7A-7C показані експерименти зв'язування в ELISA моноклональних антитіл відповідно до винаходу з різними фрагментами RAGE. На Фіг. 8a-8f показані зміни мозкового кровообігу, індуковані різними дозами Aβ1-40. На Фіг. 9a-9c показаний вплив 11E6 на Aβ1-40-індуковані зміни мозкового кровообігу. На Фіг. 10 показані зміни мозкового кровообігу, спостережувані у старих мишей Tg2576, яких лікували різними дозами 11E6 або контрольного антитіла. На Фіг. 11 показано, що антитіло 11E6 захищає нейрони гіпокампа від Aβ-індукованого розщеплення динаміну. Верхня панель: показані зразки, що представляють повторювані експериментальні умови в одному експерименті, концентрації обробки (у мкм) зазначені вище. У клітинах без додавання Aβ головним чином спостерігали сигнали інтактного (~100 кд) динаміну I (1-й стовпчик), кількість якого зменшувалося, і який перетворювався в продукт розщеплення ~90 кд у клітинах, оброблених 5 мкм Aβ (2-й стовпчик). Обробка антитілом 11E6 (3-й стовпчик) 3 UA 105768 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 запобігає розщепленню, тоді як контрольне IgG1-антитіло (4-й стовпчик) не робить вираженого захисного ефекту. Нижня панель: кількісна оцінка сигналу динаміну в трьох незалежних експериментах (виражена у вигляді % динаміну +/- SEM після нормалізації відносно обробки 0 мкм Aβ) виявила статистично значимий захисний ефект 11E6 (однофакторний ANOVA, критерій Краскала-Уолліса з наступним використанням критерію Данна; * означає p