Застосування штаму реліктових бактерій bacillus sp. f як радіаційнозахисного засобу

Реферат: Винахід належить до застосування радіаційнозахисного засобу. штаму реліктових бактерій Bacillus sp. F як UA 105605 C2 (12) UA 105605 C2 UA 105605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до біотехнологій, зокрема до промислових штамів мікроорганізмів, і отримання радіаційнозахисних препаратів. З більше шести мільйонів відомих до теперішнього часу хімічних речовин близько сорока тисяч мають шкідливі для людини властивості, а дванадцять тисяч є токсичними і негативно впливають на репродуктивну функцію людини, викликають злоякісні новоутворення і порушують апарат спадковості, при цьому багато з цих речовин є неминучими супутниками більшості технологічних процесів, в тому числі і в фармацевтичних виробництвах. Існує навіть думка, що з урахуванням наслідків, що викликаються вживанням хімічно синтезованих лікарських засобів, створених з застосуванням сучасних технологій, відмова від лікування у ряді випадків менш небезпечна, ніж лікування рядом фармпрепаратів (у Сполучених Штатах Америки щорічно витрачується 3 чи 4 мільярда доларів на подолання наслідків, створених використанням лікарських засобів). Тому в передових в технологічному відношенні (в частині молекулярної біології і генетики) країнах ведуться інтенсивні пошуки методів отримання лікарських засобів, заснованих на використовуванні рослинної і мікробіологічної сировини. Одержані при цьому фармпрепарати відрізняються від синтетичних продуктів великою різноманітністю структур і фізико-хімічних властивостей, оскільки рослини і мікроорганізми утворилися в природі по схемах біоценозу, що сформувалися протягом тисячоліть, близькі тваринним організмам і легко залучаються до процесів обміну, а в рослинних зразках і мікроорганізмах природа часто створює фармакоформи, які не мають аналогів в синтетичних продуктах. Відомий штам бактерії Bacillus megaterium, призначений для деструкції фосфатоорганічних пестицидів (авт. свід. СРСР № 1735359, 1992 p.). Штам може виконувати важливу функцію очищення природних середовищ, але вузька направленість не дозволяє використовувати його як бази для виробництва лікарських засобів для людей і тварин. Відомий штам бактерій Bacillus mucilaginsous продукт біостимулятора неспецифічного імунітету телят (авт. свід. RU 1210452, 1996 p.). Недоліками зазначеного штаму є то, що він незадовільно росте в лабораторних умовах разом з низькою біологічною (ферментативною) активністю і складним технологічним процесом його отримання, який включає ультрафіолетове опромінення та заморожування у рідкому азоті. Відомі штами бактерій групи Bacillus subtilis (патенти UA 56348, 15.05.2003 та 80995, 26.11.2007), які одержані шляхом аналітичного селекціонування та виділені із ґрунтів відповідно, і які мають імуностимулюючу та протипухлинну активність. Відомий штам бактерії Bacillus subtilis P-1 - переважно як продуцент протеази (патент RU 2208633, 2001 p.). Відомий також штам бактерій Bacillus macroides Excel 00, виділений з міцелію лікарського гриба Agaricus Blazei Murill, що проявляє імунну активність і здатність перешкоджати старінню і хворобам (заявка JP 2008-005702 А, 2008 p.). Основним недоліком вказаних штамів є тривалість процесу культивування і необхідність вирощування на дорогих живильних середовищах, що включають нестандартні і рідкісні харчові компоненти, а також нестабільність біологічних продуктів. Відомий штам бактерій Bacillus subtilis 1779 (прототип), по видовій подібності найближчий до штаму, що заявляється, виділений в природних умовах, проявляючий широкий спектр активності антагоніста, низьку адгезивну здатність, імуномодулюючу активність і продукуючий комплекс гідролітичних ферментів (патент RU 2298032, 2007 p.). Проте вузька сировинна база для штаму-прототипу, обмежений діапазон живильних середовищ для його культивування, відсутність даних про його гепатозахисні властивості і по фармакокінетиці в дослідженнях in vivo вимушують вести пошук інших штамів з більш високими споживчими характеристиками. В Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАН України 03 грудня 2010 р. задепоновано новий штам реліктової бактерії Bacillus sp. F (реєстровий номер Bacillus sp. 1MB В-7323), і в патенті UA96709, 2011 р. представлено технологію культивування штаму та його імуномодулюючі та геропротекторні властивості. Радіаційнозахисні властивості не виявлені. В основу пропонованого винаходу покладено задачу застосування штаму реліктових бактерій Bacillus sp. F як радіаційнозахисного засобу. Для вирішення поставленої задачі пропонується застосування штаму реліктових бактерій Bacillus sp. F, задепонованого в Депозитарії Інституту мікробіологіїі вірусології НАН України, як радіаційнозахисного засобу. Штам виділений із стародавніх багаторічномерзлих порід верхнеплейстоценового віку в геологічному оголенні Мамонтової гори (Центральна Якутія). 1 UA 105605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Штам являє собою слабо рухомі прямі палички із закруглюючими кінцями розмірами (11,2)(3-10) мкм, по 1-2 ланцюжки і іноді до 7, ендоспори бацилярного типу, грампозитивний, психротолерантний, факультативний анаероб. На щільних живильних середовищах спостерігається утворення та зростання непрозорих блискучих м'яких колоній жовтуватого кольору при температурі від +5 до + 43 °C і рН 5-12. Дослідження проводилися на безпородних білих мишах-самцях масою 18-22 г і щурахсамках масою 180-200 г. В цій серії дослідів тварини піддавалися загальному однократному рентгенівському опромінюванню в середньолетальній і мінімально абсолютно летальній дозах, встановлених експериментально для даного стада. Для мишей доза LD50/30 склала 5,8 Гр, для щурів - 6,2 Гр. Мінімальна абсолютно летальна доза для мишей LD100/30 склала 7,5 Гр, для щурів - 8,0 Гр. На першому етапі радіобіологічних експериментів була поставлена задача оцінити ефективність лізату Bacillus sp. F при дії летальних доз іонізуючої радіації. Для оцінки впливу лізату Bacillus sp. F на тварини, які були опромінені, вивчались, перш за все, такі інтегральні характеристики як виживаність, середня тривалість життя загиблих тварин; основні показники стану периферичної крові і кісткового мозку. Для проведення радіаційнобіологічних експериментів тварини були розділені на наступні групи: 1. Контрольна група одержувала "несправжнє" опромінювання. Тварини цієї групи піддавалися всім процедурам, передуючим і супроводжуючим опромінювання, тобто перебували в спеціальних клітках в рентгенівському кабінеті протягом всього часу опромінювання, але при вимкненому апараті; 2. Групи опромінених (RO) тварин без лікування (нелікований контроль); 3. Тварини з опромінюванням, що одержували препарат Bacillus sp. F по наступних схемах (дослідні групи): а) введення лізату за 1 годину до опромінювання в дозі 0,5 мл/кг внутрішньоочеревинно (П1+RO); б) введення лізату через 1 годину після опромінювання в дозі 0,5 мл/кг внутрішньоочеревинно (RO+П2); в) введення лізату до і після опромінювання у вказані терміни в тих же дозах (П1+RO+П2). Спостереження проводилися протягом 30 діб. Статистичну обробку одержаних даних проводили на ПЕОМ за допомогою пакету програм STATISTIC А, дані по виживанню обробляли за програмою Survival analisys. Достовірність відмінностей при порівнянні показників оцінювали за допомогою критерію Log-rank test. Дані про виживання опромінених мишей, що одержували препарат Bacillus sp.F по трьох схемах, представлені в табл.1 і 2. Одержані факти свідчать, що ефективним виявилося введення лізату Bacillus sp. F за 1 годину до опромінювання. При опромінюванні в середньолетальній дозі (5,8 Гр) збільшення кількості тварин, що вижили до 30-ої доби, склало приблизно 20 %, а середня тривалість життя (СТЖ) від радіаційного опромінювання до загибелі тварин збільшилася на 9 діб (Р0,05). Оптимальною виявилася схема подвійного введення лізату -до і після опромінювання. При цій схемі виживаність опромінених тварин збільшилася на 41 %, а СТЖ - на 11 діб в порівнянні з опроміненим нелікованим контролем (Р