Спосіб регенерування ферментативного каталізатора

Реферат: Винахід належить до способу регенерування ферментативного каталізатора в реакторі, що містить мінеральну основу на базі окису металу та принаймні один фермент, причому спосіб включає принаймні одну стадію від'єднання використаних ферментів шляхом сольватування вимиванням каталізатора із застосуванням принаймні одного іонного поверхнево-активного агента, та принаймні одну стадію повторного приєднання активних ферментів, причому ці дві стадії виконують in situ всередині реактора. UA 111326 C2 (12) UA 111326 C2 UA 111326 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід належить до способу регенерування ферментативного каталізатора шляхом відділення/приєднання ферменту на основу, причому зазначений фермент застосовують приєднаним до його основи в каталітичній реакції. Зараз у дедалі більшій кількості процесів застосовують ферментативний каталіз. У великій кількості випадків ці процеси потребують фіксації ферменту на конкретній твердій основі, або для періодичних (циклічних) реакцій, або для реакцій із зафіксованим шаром каталізатора. Проте тривалість дії ферменту має обмежений термін та регенерування каталізаторів, що містять ферменти, є важким порівняно зі звичайними каталізаторами. Регенерування каталізатора передбачає відділення використаного ферменту та потім приєднання активного ферменту на основу. Ця операція часто є ускладненою, зокрема в промислових масштабах, де застосовують величезні кількості ферментів та їхня вартість безпосередньо відображена в ціні вироблених товарів. Фактично, досі регенерування ферментативного каталізатора потребує випорожнення цього каталізатора з реакторів, обробку основи зазначеного каталізатора для видалення використаного ферменту, наприклад, шляхом хімічної обробки та/або кальцинуванням, тоді завантаження основи назад до реактора та нарешті приєднання свіжого активного ферменту на останню для відновлення активного каталізатора. Такий спосіб є трудомістким та дорогим, оскільки він вельми збільшує час простою. Задачею даного винаходу є подолання цих недоліків шляхом пропонування способу, що не потребує ні видалення каталізатору для заміни ферменту, ані випорожнення реактора, що його містить, що зменшує простій реактора. Даний винахід, отже, належить до способу регенерування ферментативного каталізатора, що міститься в реакторі, який містить мінеральну основу на базі принаймні одного окису металу та принаймні одного ферменту, який відрізняється тим, що передбачає принаймні одну стадію від'єднання ферментів з основи шляхом сольватування шляхом вимивання каталізатора із застосуванням принаймні одного іонного поверхнево-активного агента доти, доки використані ферменти є видаленими, та принаймні одну стадію повторного приєднання активних ферментів шляхом очищення зазначеної очищеної основи принаймні одним розчином активних ферментів, причому ці дві стадії здійснюють in situ всередині реактора. Цей спосіб не тільки забезпечує зберігання часу стосовно до операцій маніпулювання та обробки основи, але також фінансову перевагу, що є результатом кращої оптимізації застосування ферментативних каталізаторів. Згідно з ним запропоновано подальшу перевагу для всіх типів ферментів на носії, та всіх застосовувань із використанням ферментів на носіях у реакціях, здійснюваних ферментативним каталізом. Під "ферментом" розуміють молекулу, що дозволяє зниження енергії активації реакції та прискорення хімічних реакцій, що мають місце в середовищі без зміни рівноваги, що була досягнута. Вони також пропонують ту перевагу, що можуть застосовуватися за температури навколишнього середовища. Стадія від'єднання ферментів включає вимивання каталізатора водним розчином так званого амфіфільного іонного поверхнево-активного агента, причому цей агент вибирають з групи, що включає солі алкілсульфонатів, солі алкілсульфатів, солі алкілсульфосукцинатів, солі складних ефірів алкілфосфату, солі алкілбензол сульфонатів, та солі четвертинного амонію, застосовані окремо чи в суміші. + Солі амонію, переважно вибрані із солей формули N R 1R2R3R4 , де R1, R2, R3 та R4, являють собою алкільні, арильні, аралкільні або циклоалкільні групи, що включають 1-30 атомів вуглецю. З-поміж останніх переважними є солі тетраметиламонію, тетраетиламонію, тетрапропіламонію, тетрабутиламонію, тетрапентиламонію, тетрагексиламонію, бензилтриметиламонію, бензилтриетиламонію та гексонію. Солі фосфонію структурно відповідають у всіх аспектах вищезгаданим солям амонію. Під час стадії від'єднання ферментів кількість ферментів, що несе стічний потік, що залишає реактор, вимірюватиметься шляхом вимірювання, безперервного або з перервами, його оптичної щільності згідно зі характеристикою довжини хвилі потрібного ферменту УФспектрометрією. В типовому випадку довжини хвилі, що відповідають ферментам, варіюються в діапазоні від 280 нм (нанометрів) до 420 нанометрів. У разі, коли використаним ферментом є гемоглобін, характеристика довжини хвилі становить 404 нм. Кількість ферментів зменшуватиметься у вихідному стічному потоці з перебігом стадії від'єднання. Концентрація використаних ферментів, виміряна за допомогою оптичної щільності за характеристикою довжини хвилі ферменту в УФ-спектрометрії, зменшується у вихідному стічному потоці під час цілого перебігу зазначеного вимивання. Кінець цієї стадії буде досягнутий, коли диференціальне вимірювання УФ оптичної щільності між вихідним стічним потоком та потоком, що входить до реактора, дорівнюватиме нулю. 1 UA 111326 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 З-поміж іонних поверхнево-активних агентів, перевагу надають солям лужних металів та лужноземельних металів. Їх вибирають із солей алкілсульфатів, де кожна алкільна група включає 6-20 атомів вуглецю в лінійному або розгалуженому парафіновому ланцюзі, причому зазначений ланцюг переважно містить 10-16 атомів вуглецю. Переважним чином, сіль алкілсульфату являє собою натрієву сіль лаурилсульфату, також називану додецилсульфатом натрію (ДЦН). Іонний поверхнево-активний агент або агенти вводять до реактора змішаними з водою, з концентрацією переважно в діапазоні 1-50 г/л, більш переважно 1-20 г/л. Спосіб за винаходом дозволяє від'єднання ферментів, що утворюють частину групи, що складається з шести класів ферментів, тобто гідролаз, трансфераз, оксидоредуктаз, ізомераз, ліаз або декарбоксилаз та ліказ. З-поміж цих ферментів, спосіб особливо придатний для від'єднання оксидоредуктаз, особливо гемопротеїнів та ще більш особливо гемоглобіну. Основи, що дозволяють від'єднання та приєднання ферментів за способом згідно з винаходом, переважно являють собою аморфні та кристалічні мінеральні основи на базі окисів металу, вибраних з групи кристалічних, аморфних або композитних матеріалів, що включає окис алюмінію, двоокис кремнію, двоокис цирконію, двоокис титану або будь-який композитний матеріал, що містить принаймні один з цих матеріалів, з питомою поверхнею в діапазоні від 200 2 до 1000 м /г, переважно із двоокису кремнію та/або окису алюмінію з питомою поверхнею в 2 діапазоні від 200 до 600 м /г. Відповідно до способу за винаходом, повторного приєднання ферментів після операції від'єднання, описаної вище, досягають шляхом вимивання очищеної основи ферментним розчином доти, доки концентрація ферменту, тобто його оптична щільність, виміряна в характеристиці довжини хвилі потрібного ферменту шляхом УФ-спектрометрії, збільшується у вихідному стічному потоці, та досягає тієї самої оптичної щільності, як і у вхідному потоці. Стадію повторного приєднання здійснюють або негайно, або пізніше, з тим самим типом ферменту або іншим його типом. Стадію повторного приєднання ферментів зупиняють, коли диференціальне вимірювання концентрації ферментів, виражене їх оптичною щільністю, виміряною у вхідному потоці та в стічному потоці, що залишає реактор, дорівнює нулю. Фактично, концентрація розчину ферментів на виході ідентична такій розчину, що надходить до реактору, тобто вони мають ідентичну оптична щільність. Якщо кілька ферментів різної природи, але взаємно сумісні, вводили на основу, причому зазначені ферменти вводили разом або послідовно, це також охоплювалося б обсягом даного винаходу. У переважному прикладі здійснення винаходу спосіб включає, між операцією від'єднання використаних ферментів та операцією приєднання активних ферментів, операцію промивання основи в реакторі водою для видалення використаних ферментів та особливо залишкового поверхнево-активного агента. Під час стадії промивання, оптичну щільність вимірюватимуть УФ-спектрометрією при довжині хвилі ДЦН (260-280 нм), оскільки бажано видалити весь ДЦН, використаний для від'єднання, перед повторним приєднанням ферментів. Диференціальне вимірювання оптичної щільності між вихідним стічним потоком та вхідним потоком залишатиметься високим, оскільки поверхнево-активний агент, окремо або змішаний з використаним ферментом, детектуватиметься у водному розчині, що залишає зазначений реактор. Відповідно, стадія промивання добіжить кінця, коли диференціальне вимірювання оптичної щільності між двома потоками дорівнюватиме нулю, чи стосуватиметься це УФ оптичної щільності ДЦН, чи ферментів, що від'єднуються. Відповідно до одного прикладу здійснення, кінця промивання досягають, коли оптична щільність при характеристиці довжини хвилі ферменту у вихідному стічному потоці з реактора дорівнює нулю. Після стадії повторного приєднання, якщо хочуть використовувати регенерований ферментативний каталізатор в органічному середовищі, може бути вигідним циркулювати в реакторі розчин води/розчинника, що містить поступово змінну концентрацію від 100 до 0 % води для 0-100 % органічного розчинника в зазначеній суміші, між початком та кінцем висушування, причому висушування відповідає повному видаленню води з основи та, за необхідністю, видаленню надлишку неприєднаних ферментів. Цей розчинник взагалі відповідатиме розчинникам, вибраним як реакційне середовище, наприклад кетонам, складним ефірам та ефірам. 2 UA 111326 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Другим об'єктом винаходу є використання способу за винаходом до всіх ферментативних каталізаторів, де ферменти приєднують до основи низькоенергетичними зв'язками, як-от зв'язки ван дер Ваалса, електростатичні зв'язки або вуглеводневі зв'язки. Третім об'єктом винаходу є застосування, у ферментативному каталізі, каталізаторів, регенерованих відповідно до способу, описаного вище. Подані нижче приклади та креслення подані для опису винаходу в певних його конкретних прикладах здійснення, але не мають розглядатися як такі, що обмежують його обсяг. Приклад 1 В цьому прикладі готують свіжий ферментативний каталізатор. У реактор завантажують 8.4 2 г Davicat®SI 1700 двоокису кремнію (Merck), з питомою поверхнею 320 м /г, тоді розчин немодифікованого гемоглобіну (пропонованого на ринку компанією Vapran) при 10 г/л у буферному розчині при рН=5. Насос ВЕРХ пристосовують до потоку при 1 мл/хв. для введення розчину гемоглобіну до реактора, та таймер починає працювати в момент, коли перша крапля гемоглобіну входить до реактора. Зразки потоків, що входять до та залишають реактор, відбираються регулярно для вимірювання концентрації гемоглобіну, для визначення диференціального вимірювання між вхідним потоком та вихідним стічним потоком кількості гемоглобіну, абсорбованої двоокисом кремнію. Відтак, оптичні щільності вхідного потоку та вихідного стічного потоку вимірювали УФспектрометрією із застосуванням спектрометру UV UVIKON XS, пропонованого на ринку компанією Socoman, при 404 нм, причому довжина хвилі відповідає такій гемоглобіну. Різницю в оптичній щільності двох потоків, відтак, відстежували як функцію часу введення. Певно, зазначений УФ-спектрометр було заздалегідь відкалібровано із застосуванням різноманітних стандартних розчинів гемоглобіну у воді при різних концентраціях. Калібраційна крива дає вимірювання УФ оптичної щільності як функцію концентрації розчину гемоглобіну, застосованого, наприклад, для приєднання (див. Фіг. 1, калібраційна крива УФ оптичної щільності при 404 нм як функція концентрації розчину гемоглобіну). Шляхом обчислення кількості гемоглобіну, введеної до реактора перед тим, як диференціальне вимірювання оптичної щільності між входом та виходом сягає нуля, можливо визначити максимальну кількість гемоглобіну, приєднаного до двоокису кремнію. На Фіг. 2 подано варіювання кількості гемоглобіну, що приєднується до двоокису кремнію, стосовно до маси двоокису кремнію, введеного до реактора. Насичення двоокису кремнію гемоглобіном становить у цьому випадку 100 мг/г двоокису кремнію. Оскільки гемоглобін розчинний у воді аж до концентрації 100 г/л, можливо повторювати цей експеримент при вищих концентраціях (наприклад, 30 або 50 г/л) для зменшення часу, використаного для приєднання гемоглобіну на двоокис кремнію. Приклад 2 Цей приклад описує ефект швидкості вхідного потоку розчину гемоглобіну на швидкість приєднання останнього на основу двоокису кремнію для розрахунку здійснення поглинання (адсорбування) основи для свіжого ферментативного каталізатора. Яку Прикладі 1, застосованим вхідним потоком є розчин гемоглобіну при 10 г/л у воді, яку перколюють через реактор, заздалегідь завантажений 8.4 г Davicat®SI 1700 двоокисом кремнію. Подачу насосу ВЕРХ встановлюють для варіювання від 0.2 до 1 мл/хв, залежно від експериментів (на Фігурі 3; 0.2 мл/хв; 0.5 мл/хв; 1 мл/хв), та для кожного з них, таймер починає працювати в момент, коли перша крапля розчину гемоглобіну потрапляє до реактора. Зразки стічного потоку у виході з реактора регулярно відбирають для відстежування зміни концентрації гемоглобіну, і, відтак, кількості гемоглобіну, що залишилася приєднаною до двоокису кремнію стосовно до кількості гемоглобіну в потоці, що входить до реактора. Як і перед цим, кількість гемоглобіну, адсорбованого на двоокисі кремнію, визначають з диференціального вимірювання між оптичними щільностями вхідного потоку, які завжди постійні, та такими вихідних стічних потоків, як функцію швидкості впорскування розчину гемоглобіну. На Фіг. 3 показано зміну в кількості гемоглобіну, приєднаного на грам двоокису кремнію, як функцію швидкості потоку подавального насосу для розчину гемоглобіну. Можна побачити, що швидкість поглинання гемоглобіну на двоокисі кремнію збільшується із збільшенням швидкості потоку, що надходить до реактора. Збільшення швидкості потоку вможливлює скорочення часу для насичення двоокису кремнію гемоглобіном. Приклад 3 Цей приклад описує вплив кількості лаурилсульфату натрію (НЛС), застосованого на стадії від'єднання гемоглобіну від основи, підготовленої як у Прикладі 1, на оптичну щільність, виміряну в розчині гемоглобіну, як на вході реактора, так і на виході реактора. 3 UA 111326 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Для врахування впливу наявності НЛС на вимірювання оптичної щільності розчину гемоглобіну, здійснювали вимірювання оптичної щільності УФ-спектрометром між 350-550 нм на розчинах гемоглобіну із змінним умістом НЛС, для калібрування апарату. Ці вимірювання повторювали для двох концентрацій гемоглобіну при 0,25 г/л та при 50 г/л. На Фіг. 4 показано, безвідносно до концентрації гемоглобіну у воді у вхідному потоці, що помічено зменшення в УФ характеристиці оптичної щільності гемоглобіну при 404 нм за наявності НЛС. Проте ця зміна є стабільною з часом. Фактично, концентрація самого тільки НЛС має дуже незначний вплив на оптичну щільність гемоглобіну при 404 нм, та, більше того, лінійність дуже відмічається, безвідносно до концентрації НЛС. Приклад 4 Даний приклад описує стадію від'єднання гемоглобіну, приєднаного до двоокису кремнію в разі каталізатора, підготовленого в Прикладі 2. Відтак, маємо справу з ферментативним каталізатором, що містить 93 мг/г гемоглобіну, абсорбованого на двоокисі кремнію. Під час стадії від'єднання, водний розчин НЛС при 10 г/л подають до реактора за швидкості потоку 1 мл/хв насосом ВЕРХ, описаним вище, описаним вище. Кількість гемоглобіну, від'єднаного від двоокису кремнію, вимірюють шляхом порівняння значень оптичної щільності у вхідному потоці, що містить тільки НЛС у розчині та у вихідному стічному потоці, що містить і НЛС, і також гемоглобін. Калібрування УФ-спектрометра здійснювали, як описано в Прикладі 1, з різними стандартними розчинами гемоглобіну за наявності НЛС. Калібраційні криві дають вимірювання оптичної щільності відповідно до концентрації гемоглобіну стандартного розчину (див. Фіг. 4). Зразки вихідного стічного потоку відбирають через 10 хв., 20 хв., 30 хв., 60 хв., 120 хв., 240 хв. та 480 хв. для оцінки їхньої оптичної щільності при 404 нм та, відтак, їх концентрації гемоглобіну на виході з реактора. Профіль десорбції гемоглобіну під час фази від'єднання показано на Фіг. 6 на основі цих виміряних значень. Наприкінці цієї стадії від'єднання, 88 мг гемоглобіну/г двоокису кремнію відділяли та відновлювали на виході з реактора, тобто 95 % кількості гемоглобіну, початково поглинутого на двоокисі кремнію. Приклад 5 Даний приклад описує стадію повторного приєднання гемоглобіну на основу, від якої гемоглобін був тільки від'єднаний відповідно до Прикладу 4, після стадії промивання або ополіскування реактора водою доти, доки НСЛ більше не детектується у вихідному стічному потоці з реактора. Наприкінці цієї стадії розчин гемоглобіну при 10 г/л постійно вводять знову, як показано у Прикладі 2, доти, доки УФ оптична щільність потоку, який входить до реактора, та стічного потоку на виході з реактора ідентичні, причому вміст гемоглобіну на вході та виході однаковий. Зміна кількості гемоглобіну, зафіксована на Фіг. 5, показує два цикли приєднання. Цикл 1 відповідає приєднанню, як описано у Прикладі 2, та цикл 2 відповідає повторному приєднанню, здійсненому після стадій від'єднання та промивання реактора, описаного в даному прикладі та в Прикладі 4. Можна побачити, що відповідні профілі іммобілізації першого циклу приєднання для приготування свіжого каталізатора та другого циклу після від'єднання ферменту суміщені. Тому обробка НЛС для від'єднання гемоглобіну від двоокису кремнію не призводить до зменшення потенціалу оптичної щільності гемоглобіну на двоокисі кремнію, з метою його іммобілізації. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 50 55 60 1. Спосіб регенерування ферментативного каталізатора, розташованого в реакторі, що містить мінеральну основу на базі принаймні одного окису металу та принаймні одного ферменту, який відрізняється тим, що він включає принаймні одну стадію від'єднання ферментів шляхом сольватування вимиванням каталізатора із застосуванням принаймні одного іонного поверхнево-активного агента, та принаймні одну стадію повторного приєднання активних ферментів шляхом вимивання зазначеної очищеної основи принаймні одним розчином активних ферментів, причому ці дві стадії виконують in situ всередині реактора. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що стадія від'єднання ферменту включає вимивання каталізатора з водним розчином так званого амфіфільного іонного поверхнево-активного агента, вибраного з групи, що включає солі алкілсульфонатів, солі алкілсульфатів, солі алкілсульфосукцинатів, солі складних ефірів алкілфосфату, солі алкілбензолсульфонатів та солі четвертинного амонію. 4 UA 111326 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 3. Спосіб за одним з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що концентрація використаних ферментів, виміряна за оптичною щільністю при характеристиці довжини хвилі ферменту в УФспектрометрії, зменшується у вихідному стічному потоці протягом усього перебігу зазначеного вимивання. 4. Спосіб за одним з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що кінця стадії від'єднання досягають, коли диференціальне вимірювання концентрації ферментів, виражене її оптичною щільністю між вихідним стічним потоком та потоком, що входить до реактора, сягає нуля. 5. Спосіб за одним з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що з-поміж іонних поверхневоактивних агентів солі лужних металів алкілсульфатів вибирають із солей алкілсульфатів, причому кожна алкільна група містить від 6 до 20 атомів вуглецю в лінійному або розгалуженому парафіновому ланцюзі, переважно від 10 до 16 атомів вуглецю. 6. Спосіб за п. 5, який відрізняється тим, що сіль алкілсульфату являє собою натрієву сіль лаурилсульфату. 7. Спосіб за одним з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що ферменти, від'єднані за допомогою зазначеного способу, утворюють частину шести класів ферментів, гідролаз, трансфераз, оксидоредуктаз, ізомераз, ліаз або декарбоксилаз та ліказ. 8. Спосіб за одним з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що від'єднані ферменти утворюють частину оксидоредуктаз, зокрема гемопротеїнів, та найбільш переважним ферментом є гемоглобін. 9. Спосіб за одним з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що стадії від'єднання та приєднання ферментів здійснюють на аморфній або кристалічній мінеральній основі на базі окисів металу, вибраних з групи кристалічних, аморфних або композитних матеріалів, що включає окис алюмінію, двоокис кремнію, двоокис цирконію, двоокис титану або будь-який композитний матеріал, що містить принаймні один з цих матеріалів, з питомою поверхнею в 2 діапазоні від 200 до 1000 м /г, переважно із двоокису кремнію та/або окису алюмінію з питомою 2 поверхнею в діапазоні від 200 до 600 м /г. 10. Спосіб за одним з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що стадію повторного приєднання ферменту отримують за допомогою вимивання очищеної основи розчином ферментів, доки концентрація ферментів, тобто її оптична щільність за характеристикою довжини хвилі, збільшується у вихідному стічному потоці. 11. Спосіб за п. 10, який відрізняється тим, що стадію повторного приєднання ферменту зупиняють, коли диференціальне вимірювання концентрації ферментів, виміряне у вхідному потоці та у вихідному стічному потоці, що залишає реактор, сягає нуля. 12. Спосіб за одним з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що спосіб включає, між стадією від'єднання використаних ферментів та стадією приєднання активних ферментів, стадію промивання основи в реакторі водою для видалення використаних ферментів та особливо залишкового поверхнево-активного агента. 13. Спосіб за п. 12, який відрізняється тим, що кінця промивання сягають, коли оптична щільність за характеристикою довжини хвилі ферменту у вихідному стічному потоці з реактора сягає нуля. 14. Застосування способу за одним з попередніх пунктів, для регенерування всіх ферментативних каталізаторів, де фермент приєднують до основи за допомогою низькоенергетичних зв'язків, таких як зв'язки ван дер Ваальса, електростатичні зв'язки або вуглеводневі зв'язки. 15. Застосування каталізаторів, регенерованих відповідно до способу за одним з пп. 1-13, у ферментативному каталізі. 5 UA 111326 C2 6 UA 111326 C2 Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 7