Спосіб одержання l-фосфінотрицину шляхом ферментативного трансамінування аспартатом

1. Спосіб одержання L-2-аміно-4(гідроксиметилфосфініл)масляної кислоти (Lфосфінотрицин, L-ФТ) формули (І), її похідних, які вибирають з групи естерів та амідів карбонових кислот та естерів фосфінової кислоти, та/або її відповідних солей C2 2 (19) 1 3 Винахід стосується області техніки, що відноситься до синтезу біологічно активних засобів захисту рослин, зокрема, синтезу L-2-aмінo-4(гідpoкcимeтилфocфініл)мacлянoї кислоти (Lфосфінотрицин, L-ΦΤ) з 4(гідроксиметилфосфініл)-2-оксомасляної кислоти (ГМФОМК) шляхом ферментативного трансамінування аспартатом в присутності специфічної до ГМФОМК аспартаттрансамінази (Асп-ТА). Сполука L-ΦΤ, її солі і деякі и похідні є амінокислотами або їх солями і похідними, що мають гербіцидну дію і не зустрічаються в білках [заявка на патент ФРН 2717440]. Відповідна L-форма є при цьому біологічно активною, в той час, як відповідна D-форма практично неактивна [заявка на патент ФРН 2856260]. Уже відомо, що трансамінази внаслідок їх високої стереоселективності і відносно широкої специфічності до субстрату добре підходять для хірального ферментативного синтезу амінокислот з їх відповідних кетокислотних попередників. Недоліком у випадку технологічного використання трансаміназ є, однак, їхня константа рівноваги, приблизно рівна 1, так що бажаний продукт може бути отриманий, загалом, тільки з виходом 50% [патент США №4,826,766]. У [заявці на європейський патент 0344683 і в патенті США №5,221,737] описується одержання біологічно активної речовини з гербіцидною дією, L-фосфінотрицину [(Lгомоаланін-4-іл(метил)фосфінова кислота, L-2аміно-4-(гідроксиметил-фосфініл)масляна кислота, L-ΦΤ) амінокислоти, що не зустрічається в білках, шляхом трансамінування з відповідної кетокислоти [(2-оксо-4-(гідроксиметилфосфініл)масляна кислота, ГМФОМК] за допомогою 4-амінобутират: 2кетоглутарат - трансамінази ( -аміномасляна кислота /ГАМК/ - трансаміназа, у класифікації ферментів /КФ/ 2.6.1.19) з Escherichia соli. Для кількісного перетворення потрібний більш високий молярний надлишок глутамату як донора аміногрупи, що утруднює очищення продукту реакції. Вирішення цієї проблеми можливо шляхом застосування аспартату як донора аміногрупи, тому що відповідна кетокислота, оксалоацетат, нестійка у водяному середовищі і спонтанно декарбоксилюється в піруват. Завдяки видаленню продукту реакції з рівноваги, не може відбуватися жодна зворотна реакція і можливо кількісне перетворення також при еквімолярному використанні кетокислоти і донорної амінокислоти. Подібний спосіб описується, наприклад, у [заявці на європейський патент 0135846]. Використання такого принципу для ферментативного синтезу L-фосфінотрицину було, однак, дотепер неможливо, тому що описана ГАМКтрансаміназа не акцептує аспартат в якості донора аміногрупи і не була відома ніяка інша трансаміназа з загальною специфічністю до Lфосфінотрицину й аспартату. Додатково була запропонована спарена система з 2 ферментів, що складається зі специфічних до ФТ трансамінази і глутамат : оксалоацетаттрансамінази (ГОТ, КФ 2.6.1.1) [заявки на європейські патенти 0249188 і 0477902]. При такім проведенні реакції витрачений при синтезі L-ΦΤ глу 75331 4 тамат регенерується з аспартату за допомогою ГОТ, сама аспартат-трансаміназа не має ніякої специфічності стосовно L-ΦΤ/ГМФОМК. Спонтанне перетворення оксалоацетату в піруват приводить також у загальній реакції до зсуву рівноваги в напрямку синтезу L-ΦΤ. При цьому можливі кількісні виходи продукту при еквімолярному використанні ГМФОМК і аспартату і при явному надлишку глутамату. Завдяки цьому спареному ферментному способу, можна явно зменшити передозування донорних амінокислот, що знаходяться в розчині субстрату, в порівнянні з акцепторною кетокислотою ГМФОМК, що спрощує обробку розчину продукту. Однак, при спареному проведенні реакції далі необхідне застосування глутамату, який в рівновазі з кетоглутаратом повинен залишатися в продукті реакції чи повинен відокремлюватися за допомогою дорогого способу очищення від дуже близької за структурою амінокислоти L-ФТ. Крім того, оптимізація проведення реакції при застосуванні двох ферментів складніше через різні кінетичні параметри, ніж у випадку одного ферменту. Хоча раніше відомі аспартаттрансамінази, як, наприклад, ГОТ, не показали ніякого перетворення ГМФОМК, були зовсім випадково знайдені аспартаттрансамінази з мікроорганізмів, що також акцептували L-ΦΤ/ΓΜΦΟΜΚ із високою специфічністю в якості субстрату. Ці ферменти каталізують прямий перенос -аміногрупи аспартату на ГМФОМК. Об'єктом даного винаходу тому є спосіб одержання L-2-аміно-4(гідроксиметилфосфініл)масляної кислоти (Lфосфінотрицин, L-ΦΤ) формули (I), її похідних і/чи солей з 4-(гідроксиметилфосфініл)-2-оксомасляної кислоти (ГМФОМК) формули (II), її похідних і/чи солей в якості акцептора шляхом ферментативного трансамінування в присутності аспартату як донора, причому трансамінування в оксалоацетат і сполуку формули (І), її похідні і/ чи солі здійснюють у присутності однієї чи декількох специфічних до акцептора, переважно специфічних до ГМФОМК, аспартаттрансаміназ (Асп-ТА), краще в присутності однієї чи декількох термостабільних і/чи виділених аспартаттрансаміназ і найкраще в присутності однієї чи декількох аспартаттрансаміназ з можливо більш незначною субстратною специфічністю до пірувату, так що утворення в якості побічного продукту аланіну може зменшуватися або значно скорочуватися. Солі L-ΦΤ є, в основному, солями з неорганічними і/чи органічними кислотами або моно- і дисо 5 75331 6 лями з неорганічними і/чи органічними основами. 0,5-2:1 (у розрахунку на L-аспарагінову кислоту: Солі з кислотами (солі, отримані в результаті приГМФОМК), переважно 0,75-1,5:1, особливо, прибєднання кислот) є, наприклад, солями з мінеральлизно еквімолярному При використанні сумішей Lними кислотами, як, наприклад, із соляною кислоі D-аспарагінових кислот (солей) вирішальним є тою (гідрохлорид) чи із сірчаною кислотою молярна кількість L-аспарагінової кислоти (солі). (сульфати), чи з вугільною кислотою (карбонати, Похідні ГМФОМК використовуються в молярних гідрокарбонати), чи з органічними кислотами, як, кількостях відносно ГМФОМК. Присутність глутанаприклад, оцтова кислота (ацетати), мурашина мату в розчині субстрату не є обов'язковою. Деякі кислота (форміати), пропіонова кислота (пропіоназі знайдених ферментів характеризуються відмінти) чи винна кислота (тартрати). Солями з основаною термостабільністю. Проведення процесу тому ми є, наприклад, солі з лужними і лужноземельниможливо в широкому діапазоні температур від 10 ми металами, амонійні солі, солі з органічними до 95°С, переважно від 40 до 90°С, особливо, від амінами, наприклад, з первинними, вторинними чи 60 до 85°С. Для ферментів, що не мають особлитретинними амінами, і сіль четвертинної амонієвої вої термостабільності, краща область температур основи. знаходиться при 20-70°С, особливо, від 30 до Похідними є, наприклад, складні ефіри L-ΦΤ, 40°С. які проетерифіковані за кислотною групою фосфіЗавдяки відносно високим температурам швинової кислоти, наприклад, проетерифіковані за дкість реакції значно збільшується, що сприяє тадопомогою алканолів з 1-12 атомами вуглецю в кож перетворенню концентрованих розчинів субалкильному залишку, як, наприклад, метанол, етастрату (10%-них) з високою об'ємною нол, н-пропанол, ізопропанол, н-, ізо- і втор- чи продуктивністю. Реакція здійснюється переважно трет-бутанол, і (С3-С6)циклоалканолів, як, наприпри значенні pH в області 6,5-10, переважно від 7 клад, циклогексанол. Похідними також є складні до 9, особливо, від 7,5 до 8,5, у відповідній придаефіри L-ΦΤ, що альтернативно або додатково тній буферній системі зі значенням рКа в області проетерифіковані за карбоксильною групою кар7-9, між іншим, у фосфатному буфері або трисбонової кислоти, наприклад, за допомогою уже буфері. Несподівано біохімічно більш детально вищезгаданих спиртів. Похідними є також утвореохарактеризовані ферменти не мають специфічний за карбоксильною групою амід L-ФТ і його поності до ГАМК і чітко відрізняються тим самим від хідні, при відомих умовах N-алкіл- чи Nраніше відомих специфічних до L-ФТ/ГМФОМК діалкіламіди, переважно з 1-4 атомами вуглецю в трансаміназ. алкільному залишку. Особливо високі швидкості перетворення доПохідними ГМФОМК є, наприклад, її солі з несягаються в реакції, коли можна уникнути або скоорганічними і/чи органічними основами, причому ротити до мінімуму утворення аланіну при трансадля цього підходять основи, вже згадані в зв'язку з мінуванні. З цією метою можуть застосовуватися L-ΦΤ. Похідними є, наприклад, також складні ефіпри необхідності оптимізовані варіанти Асп-ТА без ри ГМФОМК, що отримані при етерифікації за карсубстратної специфічності до пірувату. Альтернабоксильною групою, чи за кислотною групою фостивно, піруват може бути вилучений з реакційної фінової кислоти, чи за обома. В якості спиртів для суміші фізично, наприклад, завдяки застосуванню складноефірних груп формально підходять спирмембран із селективною проникністю, і/чи хімічно ти, що використовуються для одержання складних або ферментативно, наприклад, при реакції з піруефірів L-ΦΤ, переважно названі вище алканоли. ватдекарбоксилазою, піруватоксидазою чи ацетоПохідними є також утворений за карбоксильною лактатсинтазою [див., наприклад, Taylor і ін., ТІВгрупою амід ГМФОМК і його похідні, які проетериТЕСН (1998) том 16, 412-418; Fotheringham і ін., фіковані за кислотною групою фосфінової кислоти, CHІMІCA OGGІ/ chemistry today (1997), 9/10, 33-38; а також, при необхідності відповідні N-алкіл- чи міжнародна заявка на патент 98/53088]. Очищення Ν,Ν-діалкіламіди. продукту, L-ФТ, з реакційного розчину можна, при Аспартат означає переважно L-аспарагінову необхідності, здійснити відомими і загальноприйкислоту або її солі, переважно солі з лужними менятими способами, наприклад, шляхом екстракції талами. Але в якості аспартату може також викометилізобутилкетоном чи за допомогою катіоноористовуватися L-аспарагінова кислота в сумішах з бмінної хроматографії, наприклад, з використанD-аспарагіновою кислотою, наприклад, як рацеміням амберліту ІR 120 (виробник фірма Сігма). чна D,L- аспарагінова кислота. Спосіб за винаходом пояснюється далі в наАльтернативно піруват, який є при необхідносступних прикладах, і винахід визначається пунктаті в способі за винаходом, може бути вилучений з ми формули винаходу. Зрозуміло, що наведені реакційної суміші фізичними методами, хімічно і/чи далі приклади не слід розглядати в цьому відноферментативно, переважно шляхом перетворення шенні обмежуючими. за допомогою ферментативного каталізу, наприПриклади: клад, за допомогою ацетолактатсинтази (АЛС), 1) Виділення мікроорганізмів ґрунту зі специпіруватдекарбоксилази, піруватоксидази, особлифічною до L-ΦΤ аспартат-трансаміназною активніво, ацетолактатсинтази; найбільш переважно здійстю: снюють перетворення пірувату в присутності відПо 1г різних проб ґрунту (гумус, глина, пісок, носно термостабільного ферменту. Застосовувані Schwanheimer Dune, Франкфурт) екстрагували при цьому ферменти можуть знаходитися, при 10мл 10мМ натрійфосфатного буфера, рН=7,0 , необхідності, в імобілізованій формі. протягом 1г при кімнатній температурі. Збагачені Обидва субстрати (донор і акцептор) застосокультури з екстрактів висівали в наступне середовуються, наприклад, у молярному співвідношенні вище: 7 75331 8 5мМ глюкоза робник Феноменекс)] (розчинник: 2мм сульфат міді 5мМ сукцинат (2), 10% метанол, швидкість потоку: 0,5мл/хв., Уф10мМ гліцерин детектування: 254нм, час утримання: L-ΦΤ: приб10мМ ГМФОМК лизно 17хв., D-ΦΤ: приблизно 21хв.). В усіх чоти10мМ L-аспарагінова кислота рьох досліджуваних пробах змогли в такий спосіб 50мл/л розчину А знайти в якості продукту реакції L-ΦΤ, а не D-ΦΤ. 25мл/л розчину Б Для одержання L-ΦΤ за допомогою біотрансРозчин А: 50г/л вторинного кислого фосфату формації, а також для кількісного аналізу протікалію кання реакції використовували по 1л культур штаРозчин Б: 2,5г/л сульфату магнію мів бактерій із грунту DSM 13354, DSM 13355 і 0,5г/л хлористого натрію DSM 13356 у середовищі, описаному на стор.6 і 7, 25мл/л концентрованого основного розчину, протягом 48 годин при 28°С. Клітини видаляли при що містить: центрифугуванні, промивали 1х в 10мМ хлориді натрію, 10мМ фосфаті натрію, рн 7,5, і потім під1г/л FeSC4 7H2O давали ліофілізації протягом ночі. 0,22г/л MnSO4 H2O Для здійснення біотрансформації по 200мг ви0,1г/л H3BO3 сушеної клітинної маси вищепозначених штамів 0,1г/л Na2MoO4 2H2O бактерій із грунту заново суспендували в 10мл 0,18г/л ZnSO4 7H2O наступного розчину субстрату: 0,16г/л CuO4 5H2O 100мМ ГМФОМК 0,1г/л СоCI 6H2O 200мМ L-аспарагінова кислота 1мл/л 1н. HCl 100мМ трис/НСі, рн=8,0 Культури інкубували протягом 3-5 днів при 1мМ піридоксальфосфат. 28°С і 200об./хв. у струшуючому пристрої. З однієї Суміші інкубували на струшуючому пристрої з досліджуваних проб ґрунту (гумус) виходили збадля інкубування при 200об./хв і 37°С. Через 1, 2, 4, гачені мікроорганізми, що могли рости з L8, 24 і 30г відбирали проби по 200мкл і аналізувааспарагіновою кислотою як єдине джерело азоту. ли за допомогою ВЕРХ, як описано на стор.11 і 12. Культуру багаторазово в такому ж середовищі Результати аналізу L-ΦΤ і L-аспарагінової кислоти піддавали подальшому пасажу і потім для видіпредставлені в таблиці 1. Максимально досягнулення окремих клонів висівали на агаризоване тий ступінь перетворення [продукований Lтверде живильне середовище подібного складу. ФТ/ГМФОМК у субстраті 100] складав приблизно Після інкубування протягом 3-5 днів при 28°С ви59% (DSM 13355). діляли всього 100 окремих колоній і знову їх висівали в рідке середовище (див. вище). Поділ на Таблиця 1 агарових планшетах повторювали ще двічі, щоб забезпечити одержання чистих культур. Протікання реакції ГМФОМК/аспартатПісля таких циклів селекції мали 20 окремих трансамінування шляхом біотрансформації за доштамів, що могли рости з L-аспарагіновою кислопомогою ізолятів із грунту тою як єдине джерело азоту. Для вивчення активності аспартаттрансамінаТривалість Аспарагінова зи у відношенні ГМФОМК використовували по 2мл Штам L-ΦΤ [мМ] реакції [год]* кислота [мМ] культур штамів, як зазначено вище. Потім кожні DSM 13354 1 3,9 174,0 400мкл культур обробляли для надання проникно2 5,7 150,0 сті 0,5% толуолом, 0,5% етанолом протягом 30хв. 4 10,3 100,0 при 37°С. Клітинні пелети ресуспендували в кожні 50мкл реакційної суміші, що складається з 50мМ 8 23,8 30,3 ГМФОМК, 50мМ L-аспарагінової кислоти, 50мМ 24 38,3 0 трис/НСІ, рН=8,0, 10мкМ піридоксальфосфату, і 30 48,4 0 інкубували протягом ночі при 28°С. DSM 13355 1 4,5 143,1 Для якісної оцінки утвореного ФТ реакційну 2 7,7 122,7 надосадкову рідину розбавляли водою 1:5 і по 5мл 4 11,1 98,8 такого розведення аналізували за допомогою тон8 24,8 76,4 кошарової хроматографії на целюлозних пласти24 44,9 17,2 нах для високоефективної тонкошарової хромато30 59,1 9,8 графії (фірма Мерк) з використанням нDSM13356 1 5,7 138,1 бутанола:крижаної оцтової кислоти:води = 2 8,4 124,4 60:15:25 в якості розчинника. Амінокислоти візуа4 12,5 95,9 льно визначали за допомогою фарбування нінгид8 27,5 58,8 рином. У випадку 4 штамів (DSM 13353, DSM 24 51,3 14,3 13354, DSM 13355, DSM 13356; усі штами були депоновані в "Німецьку Колекцію Мікроорганізмів і 30 49,6 7,2 Клітинних Культур Гмбх" /DSM/) змогли підтвердити утворення фосфінотрицину. Енантіомерна чис* Температура реакції: 37°С тота продукту реакції була досліджена за допомогою хіральної високоефективної рідинної 2) Доказ прямого ГМФОМК/аспартатхроматографії (ВЕРХ) [стовпчик для поділу трансамінування за допомогою ферментних преChirex (D) з пеніциламіном в якості матриці (випаратів, що містять трансамінази: 9 75331 10 Всього 7 різних комерційно доступних транса1 9,5 47,8 міназ досліджувалися в дослідах по 2 20,8 33,8 ГМФОМК/аспартат-трансамінуванню. Це похідні 4 25,7 12,5 від мікроорганізмів трансамінази (термостабільні 7 29,7 0 трансамінази AMN-001-01, -001-02, -001-03, -00124 28,1 0.4 04, -001-05, що є в наборі амінотрансфераз для досліджень, з каталожним номером у розділі "Різ* Температура реакції: 80°С не" AMN-001 (1998); глутаматоксалоацетаттрансаміназа (ГОТ), глутаматпіруваттрансаміназа 4) Ферментативний хіральний синтез L-ΦΤ із (ГДТ), (фірма Сігма). Ферментні препарати розчиГМФОМК і аспартату за допомогою частково очиняли при концентрації білка 5мг/мл у 50мМ щеної термостабільної трансамінази ΑΜΝ-001-03: трис/НО-буфері, pH 8,0, і потім протягом ночі підДля вивчення синтезу використовували частдавали діалізу при 4°С проти подібного ж буфера. ково очищену трансаміназу ΑΜΝ-001-03 зі специЗавдяки цьому повинні видалятися можливо прифічною активністю 107нкат/мг білка (1нкат=1нмоль сутні у ферментних препаратах донори й акцептоаспартату/сек). Реакційний розчин об'ємом 1мл ри аміногруп, що могли б діяти як проміжні перемістив 552мМ ГМФОМК (10%), 700мМ Lносники при трансамінуванні. Потім концентрацію аспарагінову кислоту, 0,1мМ піридоксаль-фосфат, розчинів ферментів встановлювали 1мг/мл і інкурН=8,0, встановлений за допомогою бікарбонату бували в сумішах об'ємом 50мкл із буфером для калію, і 11,5мг ферменту. Суміш інкубували при реакції, що складаються з 50мМ ГМФОМК, 50мМ 80°С. Добір проб і аналіз проводили, як описано в L-аспарагінової кислоти, 50мМ трис/HCl, рн=8,0, прикладі 3. 10мкм піридоксальфосфату, протягом 1г при опРезультати узагальнені в таблиці 3. В цьому тимальній для відповідного ферменту температурі. дослідженні рівновага реакції досягалося вже чеАналіз ферментних проб проводили за допорез 1г. L-аспарагінова кислота, донор аміногрупи, могою тонкошарової хроматографії і хіральної була повністю витрачена через 4г. Ступінь перетВЕРХ, як описано в прикладі 1. Для 2 термостабіворення складала приблизно 52% і об'ємна продульних ферментів, AMN-001-03 і AMN-001-04 (темктивність знаходилася при 4,5 [г L-ΦΤ/г біокаталіпература реакції 80°С), змогли підтвердити енанзатора/год]. В паралельному досліді з однаковим тиоселективне утворення L-ΦΤ із L-аспарагінової розчином субстрату й однаковою концентрацією кислоти при трансамінуванні. Всі інші досліджені ферменту, але при температурі реакції 60°С, був ферменти не виявили активності. досягнутий аналогічний ступінь перетворення при, 3) Кількісне вивчення ГМФОМК/аспартатзрозуміло, явно зменшеній швидкості реакції. трансамінування за допомогою термостабільної Об'ємна продуктивність складала тільки 0,95 [г Lтрансамінази AMN-001-03: ΦΤ/г біокаталізатора/год]. Ці результати підтверВнаслідок більш високої специфічної активноджують велике значення високої термостабільноссті була обрана трансаміназа AMN-001-03 для ті трансамінази для ступеня перетворення й ефекбільш точної характеристики реакції синтезу L-ΦΤ. тивного проведення реакції. Iнкубували 1мл розчину субстрату, що складаєтьЛише помірний ступінь перетворення в 52%, в ся з 40мМ ГМФОМК, 48мМ L-аспарагінової кислоосновному, пояснюється утворенням побічного ти, 50мМ трис/НСI, рН=8,0, 0,1мМ піридоксальпродукту, аланіна, внаслідок трансамінування піфосфату, з 1мг трансамінази AMN-001-03 при рувату. Істотно більш високі ступені перетворення 80°С. Для аналізу протікання реакції через промідосягаються, коли зменшується утворення аланіна жок часу в 24г відбирали аліквотні проби по 50мкл при реакції. і заморожували при -20°С. L-ΦΤ і аспартат визначали в амінокислотному аналізаторі (Біотронік LC Таблиця 3 5001). Результати представлені в таблиці 2. При обраних умовах реакційна рівновага при синтезі LОдержання L-ΦΤ при трансамінуванні за допомоΦΤ досягалася через 2-4г. Використана в якості гою частково очищеної термостабільної трансамідонора аміногрупи L-аспарагінова кислота через нази AMN-001-03 7г була повністю витрачена. Був досягнутий ступінь перетворення [продукований L-ΦΤ/ГМФОМК у Тривалість реакції L-ΦΤ Аспартат Аланін [мМ] субстраті 100] приблизно в 75%. [год]* [мМ] [мМ] Таблиця 2 Протікання реакції ГМФОМК/аспартат-трансамінування за допомогоютрансамінази ΑΜΝ-001-03 Тривалість реакції [год]* L-ФТ [мМ] Аспартат [мМ] 0 0 53,4 0 0,5 1 2 4 8 0 155,3 286,4 288,5 284,0 251,9 700,0 405,8 193,1 15,2 1,9 1,3 * Температура реакції: 80°С 0 0 98,7 181,5 284,1 234,5 11 Комп’ютерна верстка О. Гапоненко 75331 Підписне 12 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601