Спосіб генетичної стратифікації серцево-судинного ризику в пацієнтів з артеріальною гіпертензією

Реферат: UA 123010 U UA 123010 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі медицини, а саме кардіології, внутрішньої та профілактичної медицини, і може бути використана для стратифікації серцево-судинного ризику (ССР), первинної та вторинної профілактики у хворих на артеріальну гіпертензію (АГ). Артеріальна гіпертензія є однією із найважливіших медико-соціальною проблем охорони здоров'я в усьому світі. Поширеність АГ більше 20 % і з кожним десятиліттям є тенденція до її зростання. Відомо, що у пацієнтів з АГ в 4-6 разів підвищується ризик розвитку таких ускладнень як інфаркт, інсульт, серцева недостатність, що в подальшому формує високі показники серцево-судинної смертності та інвалідизації. Стратифікація ССР у пацієнтів з АГ є важливим компонентом їх тривалого лікувального та профілактичного менеджменту. Відома на даний час методика стратифікації ССР у хворих на АГ, яка базується на оцінці факторів ризику, таких як вік, стать, рівень артеріального тиску, рівень холестерину, куріння, ураження органів-мішеней і наявність супутніх захворювань, не враховує генетичні фактори, які, будучи незмінними, можуть бути визначені до розвитку АГ як захворювання і розвиток серцево-судинних ускладнень [1]. До теперішнього часу використовується традиційний спосіб стратифікації ССР у пацієнтів з АГ, який запропонований Європейським товариством кардіологів та Міжнародним товариством гіпертензіологів у Рекомендаціях по лікуванню артеріальної гіпертензії 2013 року [1], в якому стратифікація ССР у пацієнтів з АГ проводиться на підставі оцінки систолічного артеріального тиску (CAT), діастолічного артеріального тиску (ДАТ), наявності факторів ризику, безсимптомного ураження органів-мішеней, цукрового діабету, стадії ХХН або клінічно маніфестних серцево-судинних захворювань з визначенням категорій низького, помірного, високого та надвисокого ризику. При цьому поняття низького ризику визначає вірогідність виникнення серцево-судинних ускладнень впродовж 10 років менше, ніж 10 %. Помірний ризик вірогідність виникнення серцево-судинних ускладнень впродовж 10 років від 10 % до 20 %, Високий ризик - від 20 % до 30 % та надвисокий ризик - більше 30 % вірогідності виникнення серцево-судинних ускладнень впродовж 10 років. Недоліком цього способу стратифікації ССР є те, що в більшій мірі використовуються змінні фактори ризику, серед яких найбільш суттєвого значення набуває вік. Тому більшість молодих пацієнтів потрапляє в категорію низького та середнього ризику і не отримує достатніх лікувальних та профілактичних заходів. Крім цього у традиційному підході до стратифікації ССР відсутнє врахування впливу генетичних факторів, що також є суттєвим недоліком, оскільки в багатьох сучасних дослідженнях доведений їх значний вплив на розвиток, перебіг та прогноз АГ. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосыб стратифікації серцевосудинного ризику у пацієнтів з артеріальною гіпертензією на основі аналізу генетичних факторів, а саме наявності або відсутності генних поліморфізмів, з урахуванням генетичних факторів пацієнта, що дозволить з високим ступенем вірогідності персоніфіковано прогнозувати виникнення серцево-судинних ускладнень у пацієнтів з АГ з урахуванням генетичних факторів. Поставлена задача вирішується тим, що, згідно з корисною моделлю, у заявленому способі стратифікації серцево-судинного ризику в пацієнтів з артеріальною гіпертензію виконують шляхом формування генно-модифікаційного індексу за допомогою визначення відсоткового вмісту "патологічних" генотипів у загальній сукупності генотипів генів-кандидатів ADD1:1378, AGT:704, AGT:521, AGTR1:1166, AGTR2:1675, CYP11B2:-344, GNB3:825, NOS3:-786, NOS3:894, при цьому питомій вазі "патологічного" гомозиготного поліморфізму одного гена присвоюють 1,5 бали, "патологічному" гетерозиготному поліморфізму - 1 бал, "нормальному" гомозиготному поліморфізму - 0 балів, після чого суму присвоєних балів наявних генетичних поліморфізмів N переводять у відсоткове співвідношення модифікованих генів за формулою:  ГМІ   100 , 13,5 де: N=n1+n2+n3+n4+n5+n6+n7+n8+n9; 13,5 - максимально можлива кількість балів наявних поліморфізмів, яка є постійною величиною, і при значеннях генно-модифікаційного індексу від 0 до 20 % констатують низький генетичний серцево-судинний ризик, від 21 до 40 % - помірний ризик, від 41 до 70 % - високий ризик, від 71 до 100 % - надвисокий генетичний серцево-судинний ризик. Враховуючи, що АГ належить до полігенних спадкових захворювань, використання одиночних генетичних поліморфізмів з прогностичної метою не є перспективним. На теперішній час накопичені різноманітні дані поширеності поліморфізмів генів-кандидаті в АГ в різних популяційних середовищах, проте їх використання з прогностичною метою дотепер не вирішене. За даними останніх мета-аналізів, використання поодиноких поліморфізмів з метою прогнозування АГ має суттєві недоліки та визнано неефективним. Виникло насущне завдання 1 UA 123010 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 розглядати генні поліморфізми в їх взаємодії та взаємопосиленні. Тому перспективним є формування генетичних шкал з урахуванням множинних генних поліморфізмів, що є новим інноваційним напрямком в прогнозуванні перебігу серцево-судинних захворювань та їх ускладнень. Накопичені дані поліморфізмів генів-кандидатів при артеріальній гіпертензії формують обґрунтовану перспективу використання генетичних шкал ризику, що дозволить використовувати як для вторинної, так і для вторинної профілактики. Технічний результат, який досягається при здійсненні корисної моделі, полягає в тому, що застосування запропонованої моделі дозволить прогнозувати виникнення серцево-судинних ускладнень у пацієнтів з артеріальною гіпертензією на основі аналізу генетичних факторів, а саме - визначення поліморфізмів генів-кандидатів. Генетичні поліморфізми визначалися в ДНКматеріалі клітин венозної крові методом полімеразної ланцюгової реакції з використанням флуоресцентно-помічених праймерів. Заявлений спосіб стратифікації є вкрай ефективним, так як враховує стійкі немодифіковані фактори ризику і може бути застосованим на будь-якому етапі розвитку артеріальної гіпертензії, а також у донозологічному періоді. Спосіб здійснюється наступним чином. У пацієнта зі встановленим діагнозом артеріальної гіпертензії проводять забір венозної крові, як транспортне середовище використовують вакутайнер з антикоагулянтом К3-ЕДТА. Далі, в отриманому матеріалі методом полімеразної ланцюгової реакції вивчають поліморфізми генів-кандидатів. Використовують традиційну та загальноприйняту методику полімеразної ланцюгової реакції, яку виконують в ампліфікаторі в режимі реального часу "real time" з використанням флуоресцентно-помічених праймерів. ПЛР-аналіз складається із декількох етапів: - обробка клінічного матеріалу (венозної крові); - ампліфікація; - детекція продуктів ампліфікації. Обробка клінічного матеріалу включає виділення ДНК із зразків венозної крові пацієнта. Виконують автоматично шляхом магнітної сепарації клітин у забраній венозній крові. Після виділення ДНК із венозної крові пацієнта проводять ампліфікацію отриманого ДНКматеріалу та одночасну детекцію продуктів ампліфікації з використанням флуоресцентнопомічених праймерів у режимі реального часу "real time" за стандартною методикою. Для кожного досліджуваного генного поліморфізму використовують специфічний праймер. Досліджують наступні поліморфізми генів-кандидатів: ADDl:1378, AGT:704, AGT:521, AGTR1:1166, AGTR2:1675, CYP11B2:-344, GNB3:825, NOS3;-786,NOS3:894. Ген ADD1 кодує аддуцин - гетеродимерний білок цитоскелета клітини, який регулює активність (Na+, К+)-АТФази, що бере участь в перенесенні іонів натрію і калію через мембрану епітелію нирок. Заміна нуклеотиду Гуаніну (G) в кодуючій ділянці гена ADD1 в позиції 1378 на Тимін (Т) позначається як генетичний маркер G1378T (ADD1:1378). Змінений білок активує (Na +, К+)-АТФази в ниркових канальцях і тим самим сприяє затриманню натрію в організмі, що є пусковим механізмом розвитку артеріальної гіпертензії, тобто підвищеного артеріального тиску [2]. Асоціація з розвитком гіпертонії показана для заміни тиміну (Т) на цитозин (С) у позиції 704 послідовності ДНК гену AGT - дана ділянка зветься генетичним маркером Т704С (AGT:704). В результаті такої заміни в білку ангіотензиногену в позиції 235 амінокислотної послідовності відбувається заміщення амінокислоти Метіоніну на Триптофан (Met235Thr), а також підвищується базальний рівень транскрипції гену. Внаслідок цього наявність генотипу СС обумовлює збільшення в плазмі концентрації ангіотензиногену на 10-20 %, порівняно з генотипом ТТ. Частота народження С-алеля в європейській популяції становить 41 %, він найбільш поширений в африканській популяції (87 %) [3]. Ще один поліморфізм у гені AGT, асоційований з ризиком гіпертензії - поліморфізм Т174М, коли замість Треоніну в пептидному ланцюзі в позиції 174 стоїть Метіонін. Причиною заміни є точкова мутація в позиції 521 - заміна Цитозину на Тимін (AGT:521). Фактором ризику гіпертензії вважається фенотип Т/Т. В результаті заміни також підвищується рівень ангіотензиногену в плазмі, що призводить до розвитку АГ і гіпертрофії лівого шлуночка (ГЛШ) [4]. Ген AGTR1 знаходиться на довгому плечі 3-ї хромосоми (3q21-25). Причиною посилення експресії гена AGTR1 в результаті заміни Аденіну (А) на Цитозин (С) у позиції 1166 у регуляторній області (AGTR1:1166) є зміна характеру регуляції трансляції гена за допомогою мікроРНК miR155. МікроРНК miR155 негативно регулює експресію гена AGTR1, але зв'язуватися вона може тільки з мРНК, що синтезується з алелі А, тому при заміні А на С 2 UA 123010 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 порушується регуляція трансляції, білка синтезується більше, підвищується чутливість рецептора до ангіотензину ІІ. Це і є причиною асоціації алелі С з артеріальною гіпертензією. Численні дослідження показали, що частота генотипів АС і СС по маркеру А1166С гена AGTR1 достовірно вище в групах пацієнтів, що страждають гіпертонією, ніж у контрольній групі здорових людей. Ген AGTR1 і його алель 1166С є факторами, що призводять до розвитку ГЛШ [5, 6, 7]. Ген AGTR2 (Xq23) - ділянка в регуляторній області послідовності ДНК гена AGTR2, в якому Гуанін (G) замінюється на Аденін (А) у позиції 1675, називається генетичним маркером G1675А (AGTR2:1675). У результаті такого заміщення змінюється характер регуляції експресії гена. Алель G асоційований з активацією транскрипції і збільшенням на поверхні клітини кількості рецепторів ангіотензину ІІ 2-го типу. Алель А, навпаки, асоційований із зменшенням кількості AGTR2 на поверхні клітин, а також з відносною гіперстимуляцією AGTR1 ангіотензином IІ. У зв'язку з цим підвищується ризик розвитку АГ, ускладнень під час вагітності та ішемічної хвороби серця [8]. Останню стадію синтезу гормону альдостерону каталізує фермент альдостеронсинтаза (CYP11B2). Найбільш повно досліджено поліморфізм, що проявляється в заміні Цитозину на Тимін в 344-му положенні нуклеотидної послідовності, в регуляторній області гена (CYP11B2:344). Ця ділянка є сайтом зв'язування стероїдогенного фактора транскрипції SF-1, регулятора експресії гена альдостеронсинтази. Алель Т призводить до посилення продукції альдостерону, що в свою чергу пов'язано з артеріальною гіпертонією, а також з фіброзом і гіпертрофією міокарда та з ризиком гіпертензивних ускладнень вагітності. Крім того, гіперпродукція альдостерону сприяє посиленню експресії інгібітору активатора плазміногену-1, що тягне за собою розвиток ендотеліальної дисфункції, що є причиною кардіоваскулярних ускладнень [9]. Останнім часом великого значення надають вивченню нещодавно описаного С825Тполіморфізму гена   3 субодиниці G-протеїну (GNB3). G-протеїн - універсальний мембранний трансдуктор, що передає сигнали більш ніж від 1000 рецепторів до багатьох внутрішньоклітинних ефекторів, включаючи ферменти та іонні канали. За його участю здійснюється передача сигналів більшості нейромедіаторів і біологічних речовин, таких як інсулін, тромбоцитарний і епідермальний фактори росту. У результаті мутації в 10-м екзоні гена, яка полягає в заміні Цитозину на Тимін в позиції 825 (GNB3:825), відбувається синтез функціонально більш активного варіанта G-протеїну, що в свою чергу призводить до підвищення концентрації кальцію в цитозолі, збільшенню внутрішньоклітинної передачі сигналів, і, як наслідок, до посиленої реакції клітин на гормональне збудження. Генетично фіксована підвищена активність G-протеїну може привести до підвищення AT, гіпертрофічним змінам серця і судин. Крім цього дослідження показують асоціацію наявності Т-алеля і підвищеного ризику розвитку ЦЦ 2-го типу та ожиріння [10]. Ген eNOS локалізований в 7-й хромосомі (7q35-36) і складається з 26 екзонів. У екзонах і інтронах гена eNOS виявлено кілька поліморфних ділянок, серед яких найбільш значущими є поліморфізми G894T (Glu298Asp) 7-го екзона та Т(-786)С промотора гена eNOS. Останній поліморфізм полягає у заміні азотистої основи тиміну (Т) на цитозин (С) в 5'-кінці гена N0S3 призводить до значного пригнічення промоторної активності гена і відповідно до зниження синтезу ендотеліального NО (NOS3:-786). У хворих з гострим коронарним синдромом (ГКС) в 3 рази частіше, ніж у здорових донорів, виявляють гомозиготи з патологічним генотипом СС промотора гена NOS3, що вказує на роль поліморфізму Т (-786) С в патогенезі ОКС, особливо у чоловіків з передчасним розвитком атеросклерозу [11]. Поліморфізм G894T екзона 7 гена eNOS є структурним і полягає в заміні G/T в позиції 894 нуклеотидної послідовності гена eNOS, що призводить до заміни глутаміну аспарагіном в 298-й позиції (NOS3:894). За даними метаналізу залежності різних поліморфізмів гена eNOS з наявністю АГ та ІХС, гомозиготи ТТ асоціювалися з підвищеним ризиком розвитку цих захворювань [12]. На основі отриманих генотипів наведених вище генів-кандидатів формують генномодифікаційний індекс (ГМІ) шляхом визначення відсоткового вмісту змінених ("патологічних") генотипів в загальній сукупності досліджуваних генів-кандидатів: ADD1:1378, AGT:704, AGT:521, AGTR1:1166, AGTR2:1675, CYP11В2:-344, GNB3:825, NOS3:-786, NOS3:894. При цьому питомій вазі "патологічного" гомозиготного поліморфізму одного гену присвоюють 1,5 бали, гетерозиготного поліморфізму - 1 бал, відповідно "нормальному" генотипу присвоюють 0 балів. В таблиці 1 надана бальна оцінка поліморфізмів генів-кандидатів артеріальної гіпертензії у визначенні генно-модифікаційного індексу. 60 3 UA 123010 U Таблиця 1 Поліморфний генетичний маркер ADD1:1378 (альфа-аддуктин) AGT:704 (ангіотензиноген) AGT:521 (ангіотензиноген) AGTR 1:1166 (рецептор 1–го типу до ангіотензину II) AGTR2:1675 (рецептор 2-го типу до ангіотензину II) CYP11В2:-344 (цитохром11b2- альдостерон-синтаза) GNB3:825 (гуанін-зв'язуючий білок) NOS3:-786 (синтаза оксиду азоту) NOS3:894 (синтаза оксиду азоту) Генотип G/G G/T Т/Т T/T T/C C/C C/C C/T T/T А/А А/С С/С G/G G/A А/А С/С С/Т T/T C/C C/T T/T T/T T/C C/C G/G G/T Т/Т Бали 0 1 1,5 0 1 1,5 0 1 1,5 0 1 1,5 0 1 1,5 0 1 1,5 0 1 1,5 0 1 1,5 0 1 1,5 Сума балів Генно-модифікаційний індекс 5 10 15 20 25 В подальшому проводиться розрахунок генно-модифікаційного індексу (ГМІ) за формулою:  ГМІ   100 , 13,5 де: N - сума балів наявних генетичних поліморфізмів, N=n1+n2+n3+n4+n5+n6+n7+n8+n9; 13,5 - максимальна можлива кількість балів наявних поліморфізмі, яка є постійною величиною. Далі, на основі отриманого ГМІ проводять генетичну стратифікацію ССР. При значеннях генно-модифікаційного індексу від 0 до 20 % констатують низький генетичний серцево-судинний ризик, від 21 до 40 % - помірний ризик, від 41 до 70 % - високий ризик, від 71 до 100 % надвисокий генетичний серцево-судинний ризик. У дослідженні було обстежено 240 пацієнтів з артеріальною гіпертензією. Діагноз артеріальної гіпертензії встановлювався на підставі протоколу МОЗ України 2012 року та рекомендацій Європейського товариства кардіологів (ЄТК) 2013 року. Всім пацієнтам була проведена традиційна стратифікація серцево-судинного ризику згідно критерій ЄТК 2013р. Пацієнти були розподілені на 4 групи: з низьким, помірним, високим та надвисоким ССР. Після цього всім пацієнтам був проведений аналіз поліморфізмів 9 генів-кандидатів методом ПЛР: ADD1:1378, AGT:704, AGT:521, AGTR1:1166, AGTR2:1675, CYP11B2:-344, GNB3:825, NOS3:786, NOS3:894. Була проведена бальна оцінка генотипу кожного гена-кандидата: "патологічний" гомозиготний поліморфізм одного гену складає 1,5 бали, гетерозиготний поліморфізм - 1 бал, "нормальний" гомозиготний поліморфізм - 0 балів (табл. 1). В подальшому проводився розрахунок генно-модифікаційного індексу (ГМІ) за заявленою формулою та на його основі проводили генетичну стратифікацію серцево-судинного ризику. Був виконаний статистичний аналіз кореляційних зв'язків (коефіцієнт кореляції r) між традиційною та генетичною стратифікацією ССР у пацієнтів з АГ. 4 UA 123010 U 5 В результаті традиційної стратифікації ССР група з низьким ризиком склала 24 пацієнта, при цьому у 75 % хворих визначався аналогічний низький серцево-судинний генетичний ризик згідно з розрахованим ГМІ (r=0,72, р