Спосіб визначення гліклазиду в біологічних об’єктах

Реферат: Спосіб визначення гліклазиду в біологічних об'єктах включає ізолювання гліклазиду з біологічних об'єктів підкисленим органічним розчинником, очищення первинних вилучень та екстрактів, одержаних з цих біологічних об'єктів від біогенних домішок та співекстрактивних речовин, виявлення та кількісного визначення гліклазиду в екстрактах з біологічних об'єктів. Ізолювання гліклазиду з біологічних об'єктів проводять ацетонітрилом. підкисленим 6 Μ розчином кислоти хлоридної до рН 3,0 з подальшим фільтруванням, очищенням одержаного вилучення від домішок білкової природи 2,5 % розчином натрію сульфату та н-гексаном від органічних співекстрактивних речовин з подальшим екстрагуванням гліклазиду з кислого середовища хлороформом. Виявлення даної речовини в хлороформному екстракті та додатковим очищенням даного екстракту від співекстрактивних речовин методом ТШХ з використанням як систем розчинників етилацетату та суміші метиленхлорид-етилацетаткислота ацетатна льодяна (50:50:1), а також специфічних реагентів 1 % розчину ваніліну та 5 % розчину хлоралгідрату; виявлення та кількісне визначення гліклазиду в метанольних елюатах методом ВЕРХ. UA 123009 U (54) СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ ГЛІКЛАЗИДУ В БІОЛОГІЧНИХ ОБ'ЄКТАХ UA 123009 U UA 123009 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини, зокрема до судово-токсикологічних досліджень і стосується способу визначення гліклазиду в біологічних об'єктах. Гліклазид є поширеними антидіабетичними засобами для лікування цукрового діабету (ЦД) 2 типу [1-3]. Згідно з даними сайтів Food and Drug Administration (FDA) і patientsville.com, у багатьох країнах світу в період 2010-2015 pp. зареєстровано близько 600 випадків отруєнь даним препаратом. Серед них, понад 60 випадків - летальні отруєння, які в основному обумовлені навмисним передозуванням гліклазидом у дозах, що перевищують терапевтичні в десятки та більше разів. Кількість випадків летальних отруєнь гліклазидом може бути значно більшою за умов їх реєстрації в інших країнах, у тому числі і в Україні, що пов'язане з відсутність методів систематичного хіміко-токсикологічного аналізу. Найближчим аналогом до запропонованої корисної моделі є спосіб визначення антидіабетичних засобів похідних сульфонілсечовини в біологічних об'єктах (печінка) [4], який включає ізолювання похідних сульфонілсечовини з тканин печінки триразовим настоюванням ацетоном, трикратну екстракцію токсикантів з кислих водних вилучень (рН 2,0) хлороформом, очищення одержаних екстрактів методом ТШХ (система розчинників хлороформ - ацетон (9:1), елюент етанол, загальні та специфічні проявники), виявлення токсикантів методами ТШХ та УФспектрофотометрії, а також їх кількісне визначення методом УФ-спектрофотометрії. Недоліком вищенаведеного способу визначення похідних сульфонілсечовини є застосування ацетону як екстрагенту для їх ізолювання з об'єктів біологічної природи, обіг якого підлягає контролю, оскільки він є прекурсором; відсутність запропонованих методів для очищення первинних вилучень від органічних домішок; застосування не селективної для похідних сульфонілсечовини загальної для лікарських речовин кислотного характеру системи розчинників хлороформ-ацетон (9:1) та застосування не селективного УФспектрофотометричного методу для виявлення та кількісного визначення похідних сульфонілсечовини в одержаних екстрактах з біологічних об'єктів. Задачею корисної моделі є розробка способу визначення гліклазиду в біологічних об'єктах, придатного для судово-токсикологічних досліджень направленого характеру, одержання вільних від біогенних домішок та співекстрактивних речовин вилучень з біологічних об'єктів. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб визначення гліклазиду в біологічних об'єктах включає ізолювання гліклазиду з біологічних об'єктів підкисленим органічним розчинником, очищення первинних вилучень та екстрактів, одержаних з цих біологічних об'єктів, від біогенних домішок та співекстрактивних речовин, виявлення та кількісне визначення гліклазиду в екстрактах з біологічних об'єктів, згідно з корисною моделлю, що ізолювання гліклазиду з біологічних об'єктів проводять ацетонітрилом, підкисленим 6 Μ розчином кислоти хлоридної до рН 3,0 з подальшим фільтруванням, очищенням одержаного вилучення від домішок білкової природи 2,5 % розчином натрію сульфату та н-гексаном від органічних співекстрактивних речовин з подальшим екстрагуванням гліклазиду з кислого середовища хлороформом; виявлення даної речовини в хлороформному екстракті та додатковим очищенням даного екстракту від співекстрактивних речовин методом ТШХ з використанням як систем розчинників етилацетату та суміші метиленхлорид-етилацетат-кислота ацетатна льодяна (50:50:1), а також специфічних реагентів 1 % розчину ваніліну та 5 % розчину хлоралгідрату; виявлення та кількісне визначення гліклазиду в метанольних елюатах методом ВЕРХ. Переваги способу, що запропонований у порівнянні з найближчим аналогом полягають в тому, що для ізолювання гліклазиду з тканин печінки застосовують більш доступні та дешеві розчинники; одержані вилучення з біологічного матеріалу є більш чистими та вільними від біогенних домішок та співекстрактивних речовин; запропоновані методики виявлення та кількісного визначення гліклазиду є більш чутливими, селективними та специфічними, які загалом значно покращують якість проведення судово-токсикологічних досліджень при отруєнні гліклазидом. Корисна модель ілюструється прикладом. Приклад 1. 50 г подрібненої печінки поміщали у колбу об'ємом 500 мл, додавали 3 мл метанол-метиленхлоридного (1:1) розчину гліклазиду, що містить 20,0 мг речовини, перемішували, витримували протягом 24 год. за кімнатної температури, додавали 50 мл ацетонітрилу, підкисленого 6 Μ розчином кислоти хлоридної до рН 3,0 (за універсальним індикатором), настоювали протягом 30 хв при періодичному контролі рН середовища та фільтрували через фільтр марки "червона стрічка" у колбу об'ємом 100 мл. Операцію настоювання біологічного матеріалу підкисленим ацетонітрилом проводили тричі. Одержані вилучення об'єднували та переносили у колбу об'ємом 1000 мл, що містила 300 мл 2,5 % розчину натрію сульфату. Вміст колби ретельно перемішували, підкислювали 6 Μ розчином кислоти хлоридної до рН 3,0 фільтрували через фільтр марки "червона стрічка" у ділильну 1 UA 123009 U 5 10 15 20 25 30 35 колбу та двічі по 100 мл екстрагували н-гексаном по 10 хв з використанням механічного струшувача. Після розшарування вміст колби переносили у ділильну лійку та відділяли органічний шар, який у подальшому не досліджували. Одержані водно-ацетонітрильні вилучення об'єднували, поміщали у ділильну колбу та тричі по 100 мл екстрагували хлороформом по 10 хв з використанням механічного струшувача. Після розшарування вміст колби переносили у ділильну лійку, органічний шар відділяли, фільтрували через паперовий фільтр з вмістом 5,0 г безводного натрію сульфату. Одержані хлороформні екстракти об'єднували, упарювали в потоці теплого повітря до об'єму 25 мл та використовували для досліджень. Виявлення гліклазиду в одержаному екстракті проводили методом ТШХ на хроматографічних пластинках Merck silica gel 60 F254 (Німеччина) розміром 10×10 см з використанням етилацетату, як загальної для похідних сульфонілсечовини системи розчинників, а також суміші метиленхлорид-етилацетат-кислота ацетатна льодяна (50:50:1), як індивідуальної для гліклазиду системи розчинників, а також специфічних реагентів: 1 % розчину ваніліну та 5 % розчину хлоралгідрату. Перед елююванням хроматографічні пластинки попередньо відмивали метанолом та активували в сушильній шафі при температурі 110-120 °C протягом 0,5 год. Висушену хроматографічну пластинку ділили на три частини, на лінію старту якої у вигляді точки в зону 1 та 2 наносили 10 мкл (1 мкг/мл) стандартних розчинів гліклазиду та кофеїну. У зону 3 смугою завтовшки 2 см наносили ¼ частини хлороформного екстракту гліклазиду, одержаного з тканин печінки. При обробці 2-ої та 3-ої зон хроматографічної пластинки 1 % розчином ваніліну або 5 % розчином хлоралгідрату на хроматографічній пластинці візуалізувалися індивідуальні плями зі значеннями Rf, співставними зі стандартним зразком гліклазиду (таблиця 1). При цьому, в першому випадку забарвлення плями має бути темно-синім, а в другому - коричневим. Очищення екстракту проводили методом ТШХ на хроматографічних пластинках Merck silica gel 60 F254 (Німеччина) розміром 10×10 см. Хроматографічну пластинку ділили на три частини, на лінію старту якої у вигляді точки в зону 1 наносили 10 мкл (1 мкг/мл) стандартного розчину гліклазиду. У зони 2 і 3 смугою завтовшки 2 см наносили ¼ частини хлороформного екстракту гліклазиду, одержаного з тканин печінки. Після хроматографування в етилацетаті пластинку сушили, а зони 1 і 2 обробляли специфічними проявниками: 1 % розчином ваніліну або 5 % розчином хлоралгідрату. У необробленій проявником зоні 3, в області відповідного гліклазиду значення Rf з пластинки скальпелем знімають шар сорбенту площею 3×1 см, який поміщали в скляний флакон, що містить 10 мл метилового спирту, струшували протягом 5 хв і фільтрували через фільтр марки "червона стрічка". Одержаний елюат використовували для ВЕРХ досліджень. Таблиця 1 Параметри хроматографічної рухливості досліджуваних речовин Система Етилацетат Метиленхлоридетилацетат-кислота ацетатна льодяна (50:50:1) Стандартна речовина гліклазиду 0,48±0,01 Хлороформний екстракт 0,48±0,03 0,66±0,01 0,65±0,03 Кофеїн* 0,15 0,26 Примітка: * - хроматографічна система вважається придатною, якщо на хроматограмі чітко видно пляму кофеїну 40 45 Виявлення гліклазиду в метанольному елюаті та його кількісне визначення проводили методом ВЕРХ з УФ-детектуванням на рідинному хроматографі "Міліхром-А-02" з УФдетектуванням (ЗAT "Еконова", Новосибірськ). Для розділення речовин використовували обернено-фазову колонку Prontosil-120-5-C18-AQ розміром 2×75 мм, зерніння 5 мкм ("Bischoff Analysetechnik und Gerate GmbH", Німеччина). Градієнтне елюювання виконували шляхом змішування двох елюентів: елюент А - [0.2М LiClO4 - 0.005М НСlО4], елюент Б - ацетонітрил кваліфікації "для ВЕРХ". Швидкість рухомої фази - 100 мкл/хв. Температура термостата колонки - 35 °C. УФ-спектрофотометричне детектування проводили одночасно при 8 довжинах хвиль: 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280 і 300 нм. Аналіз та обробку хроматограм здійснювали програмою "Аналітика-Chrom". Правильність методики періодично контролювали шляхом 2 UA 123009 U 5 10 15 хроматографування контрольного багатокомпонентного розчину, що складається з бромід-іона, уридину, кофеїну, прозерину, м-нітроаніліну, п-нітроаніліну і трифтазину. Виявлення гліклазиду здійснювали за часом утримування. На фігурах 1 та 2 наведено хроматограми метанольного розчину стандартного зразка гліклазиду та метанольного елюату, одержаного з тонкого шару. Піки речовин на відповідних хроматограмах мають бути співвідносними за часом утримування (tR=7,80). Для кількісного визначення гліклазиду будували градуювальний графік (фігура 3) залежності площі піку метанольного розчину стандартного зразка гліклазиду від концентрації (мкг/мл), визначеної за довжини хвилі 230 нм. Лінійність наведеного градуювального графіку в координатах (S, ум. од) - (С, мкг/мл) має бути в інтервалі 0,1-20,0 мкг/мл. Методом лінійної регресії виведено рівняння градуювальної прямої залежності площі піка (у) від концентрації (х) загального вигляду: у = bх + а. Метрологічні характеристики одержаної градуювальної залежності наведено в таблиці 2. Таблиця 2 Метрологічні характеристики градуювальної залежності площі піку від концентрації r 0,9999 20 25 b 0,0089 а -5 9,6710 Sb -5 1,7853510 Sa 0,00014 b 0,00036 a -5 4,5910 Методом найменших квадратів розраховували коефіцієнти регресії градуювального графіка: S=0,0089С +0,0001, де S - площа піку, ум. од.; С - концентрація речовини, мкг/мл. Встановлено, що вільний член рівняння градуювального графіка при визначенні значущості істотно не відрізняється від нуля. Це обумовлює перехід рівняння до вигляду: у = bх. Тому, для визначення концентрації гліклазиду в об'єктах дослідження застосовують рівняння вигляду: S=0,0089С Результати кількісного визначення гліклазиду в екстрактах, одержаних з тканин печінки, наведено в таблиці 3. Таблиця 3 Метрологічні характеристики ізолювання гліклазиду з тканин печінки (n=5, Р=0,95) x 30 35 40 45 s 17,48 1,06 x -1  1,32 sx 4,7410 7,53 RSD, % 6,06 Таким чином, застосування розроблених умов для ізолювання гліклазиду з біологічних об'єктів ацетонітрилом підвищує доступність та рентабельність заявленого способу; використання методу ТШХ, 2,5 % розчину натрію сульфату та н-гексану сприяють одержанню вільних від біогенних домішок та співекстрактивних речовин вилучень з біологічних об'єктів; застосування методів ТШХ та ВЕРХ роблять заявлений спосіб більш чутливим, селективним та специфічним. Джерела інформації: 1. Мохорт, Т.В. Эффективность сахароснижающей терапии с использованием Диабетона MR (новые результаты исследования ADVANCE) / Т.В. Мохорт // Медицинские новости. - 2012. № 4. - с. 56-60. 2. Пекарева, Е.В. Положительные эффекты гликлазида MB в терапии сахарного диабета 2 типа / Е.В. Пекарева // Эндокринология. - 2012. - № 5. -С. 48-52. 3. Pharmacological and pharmaceutical profile of Gliclazide: A Review / A. Sarkar, T. Tiwari, P. Bhasin, M. Mitra // J. Applied Pharmaceutical Science. - 2011. - Vol. 01 (09). - P. 11-19. 4. Ибрагимова Μ.Μ. К вопросу химико-токсикологического анализа гликлазида и метформина при их совместном применении // Астана медициналык, журналы. - 2014. - № 2. С. 152-158. 3 UA 123009 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 15 Спосіб визначення гліклазиду в біологічних об'єктах включає ізолювання гліклазиду з біологічних об'єктів підкисленим органічним розчинником, очищення первинних вилучень та екстрактів, одержаних з цих біологічних об'єктів, від біогенних домішок та співекстрактивних речовин, виявлення та кількісне визначення гліклазиду в екстрактах з біологічних об'єктів, який відрізняється тим, що ізолювання гліклазиду з біологічних об'єктів проводять ацетонітрилом, підкисленим 6 Μ розчином кислоти хлоридної до рН 3,0 з подальшим фільтруванням, очищенням одержаного вилучення від домішок білкової природи 2,5 % розчином натрію сульфату та н-гексаном від органічних співекстрактивних речовин з подальшим екстрагуванням гліклазиду з кислого середовища хлороформом; виявлення даної речовини в хлороформному екстракті та додатковим очищенням даного екстракту від співекстрактивних речовин методом ТШХ з використанням як систем розчинників етилацетату та суміші метиленхлорид-етилацетаткислота ацетатна льодяна (50:50:1), а також специфічних реагентів 1 % розчину ваніліну та 5 % розчину хлоралгідрату; виявлення та кількісне визначення гліклазиду в метанольних елюатах методом ВЕРХ. 4 UA 123009 U Комп’ютерна верстка В. Мацело Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5