Спосіб консервування тромбоцитів

Изобретение относится к криобиологии. Наиболее близким к заявляемому является способ консервирования тромбоцитов путём замораживания их со скоростью 37 град./мин до -196°С под защитой 0,5 Μ (4,6 %) глицерина и последующего отогрева на водяной бане при +37°С [1]. Недостатком способа консервирования тромбоцитов под защитой глицерина является снижение устойчивости тромбоцитов к гипотоническому шоку (18±2 %). Задачей изобретения является создание такого способа консервирования тромбоцитов, в котором изменение режима замораживания и концентрации криопротектора или замена его другими позволили бы повысить устойчивость клеток к гипотоническому шоку и за счет этого обеспечить сохранность функциональной полноценности. Для решения этой задачи в способе консервирования тромбоцитов, включающем замораживание их до 196°С в защитной среде, содержащей криопротектор глицерин согласно изобретению глицерин берут в концентрации 5-7 % или используют криопротектор 1,2-пропандиол в концентрации 2-3 %, а замораживание осуществляют сначала со скоростью 1-2 град/мин до температуры кристаллизации защитной среды, далее со скоростью 0,4-0,6 град/мин до (-6) - (7)°С и затем со скоростью 5-10 град/мин до (-80) - (-196)°С. Пример 1. Концентрат тромбоцитов получали методом дифференцированного центрифугирования крови, заготовленной в пластихатные контейнеры "Гемакон". Из 500 мл крови получали один тромбоконцентрат (ТК), содержащий 0,6-0,8.1011 тромбоцитов в 20-25 мл плазмы. Непосредственно перед замораживанием готовили растворы криопротекторов на аутологической плазме с рН 6,5. При необходимости объединяли 3-4 ТК от доноров, идентичных по группе крови и резус-принадлежности. Перед замораживанием к суспензии ТК медленно, постоянно перемешивания, со скоростью 0,3 мл/мин добавляли равный объем криопротектора глицерина или 1,2-пропандиола в разных концентрациях. Время экспозиции тромбоцитов в защитном растворе при 20-22°С - 30 мин. Затем клеточную взвесь реализовали в контейнеры и помещали в камеру программного охлаждающего устройства УОП 6 6.000.000 производства ОП ИПКиКАН УССР. Замораживание осуществляли со скоростью 2,0°/мин до температуры замораживания защитного раствора, при которой инициировалось льдообразование внеклеточной воды, с этого момента со скоростью 0,5°/мин до -6°С, затем 7°/мин до -196°С, погружали в жидкий азот. Отогрев производили в водяной бане при 37°С. Образцы из контейнеров переводили в пластикатные мешки, 30-40 мин термостатировали при 37°С, затем 10 мин центрифугировали, надосадок удаляли и к оставшимся тромбоцитам осторожно приливали аутологическую плазму с температурой 37°С. Для оценки сохранности гемостатической функции деконсервированных тромбоцитов исследовали их агрегационную активность под воздействием АДФ, реакцию на гипотонический шок и ретрактильную активность. В каждом опыте проводили 5 повторов, в которых анализировали по 7 контейнеров. Статическую обработку проводили по методу Фишера-Стьюдента. Результаты исследований приведены в таблицах 1-8. Оптимальная концентрация глицерина 5-7,5 %, 1,2-пропандиола - 2,3 % (табл. 1). Пример 2. Способ осуществляли аналогично примеру 1. Концентрация глицерина в ТК-5 %, 1,2-пропандиола - 2,5 %. Скорость охлаждения до температуры кристаллизации варьировали (таблица 2). Оптимальная скорость охлаждения на 1 этапе - 1-2° мин. Пример 3. Способ осуществляли как в примере 1, концентрация криопротекторов глицерина и 1,2-ПД 5 % и 2 %, соответственно, конечную температур у 1-го этапа варьировали (таблица 3). Оптимальной конечной температурой І этапа является температура кристаллизации, которая лежит в пределах от -1,0 до -1,5°С. При охлаждении тромбоцитов на I этапе до температуры ниже точки кристаллизации защитного раствора создается начальное переохлажденное состояние внеклеточного раствора, в результате кристаллизации происходит разогрев всей суспензии до этой температуры, не выдерживается оптимальная скорость охлаждения, как следствие, ухудшение сохранности гомостатической функции, а также уменьшение их количества, снижение показателей ретракции, реакции на гипотонический шок. Пример 4. Способ осуществляли аналогично примеру 1. Концентрация глицерина в ТК 5 % 1,2-ПД - 2,5 %. Варьировали скорость охлаждения от температуры кристаллизации до -6°С (таблица 4). Из представленных данных следуе т, что оптимальные скорости охлаждения на 2 этапе 0,4-0,6°/мин. Пример 5. Способ осуществляли аналогично примеру 1. Концентрация глицерина 5 %, 1,2-ПД - 2,5 %. Варьировали конечную температуру 2 этапа охлаждения (таблица 5). Оптимальная конечная температура 2 этапа (-6) - (-7)°С. Пример 6. Способ осуществляли аналогично примеру 1. Концентрация глицерина 5 %, 1,2-ПД - 2,5 %. Варьировали скорость 3 этапа, конечная температура которого была -196°С. Оптимальная скорость 3 этапа - 510°/мин (таблица 6). Пример 7. Способ осуществляли аналогично примеру 1. Концентрация глицерина 5 %, 1,2-ПД - 2,5 %. Варьировали конечную температуру 3 этапа. Оптимальная конечная температура 3 этапа (-80) - (-196)°С (таблица 7). Пример 8. Способ осуществляли аналогично примеру 1 и по прототипу (таблица 8). Данные сохранности тромбоцитов в зависимости от способа консервирования говорят о том, что в случае консервирования заявляемым способом показатели реакции на гипотонический шок, ретракции и агрегации достоверно выше, чем в прототипе.