Спосіб консервування гепатоцитів

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано для консервирования клеток, выделенных из тканей. Наиболее близким к заявляемому является способ консервирования гепатоцитов [1], согласно которому изолированные гепа-тоциты инкубируют в среде, содержащей 10-15%-ный диметилсульфоксид (ДМСО), в течение 10-15 мин и замораживают в 3 этапа: на первом этапе - от 2...4°С до -6...-8°С, на втором этапе - от -6...8°С до -30...-35°С и на третьем - до -196°С. Отогрев производят на водяной бане при +41°С. Недостатком способа является низкий уровень морфо-функциональной сохранности гепатоцитов. В основу изобретения поставлена задача создания такого способа консервирования гепатоцитов, в котором изменение состава среды суспендирования и режима замораживания позволило бы уменьшить рилирования митохондрий и целостность плазматической мембраны клеток. Кроме этого, способ проще прототипа, поскольку предусматривает вместо 3-этапного 2-этапное охлаждение клеток. Способ иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. Для выделения гепатоцитов вскрывали брюшную полость анестезированных животных массой 200-300 г, вводили канюлю в воротную вену, надсекали нижнюю полую вену и перфузировали печень со скоростью25-35 мл/мин при температуре 37°С раствором, содержащим 0,25 М сахарозу, 5 мМ КСl, 0,4 Мм КН2РO4. 1,6 MM Na2HPO4, 0,8 мМ МgСl2, 50 мМ трис-НСl, 4 мМ ЭДТА, рН 7,4. После окончания перфузии печень извлекали из брюшной полости, измельчали и подвергали деагрегации с помощью вибрационного устройства в среде перфузии, где ЭДТА заменяли на 2 мМ СаСl2. Полученную суспензию фильтровали через нейлоновый фильтр. Жизнеспособные клетки отделяли путем, дифференциального центрифугирования и суспендировали в среде дезагрегации. Тепатоциты, суспендиро-ванные.в среде, содержащей 250 мМ сахарозы, 5 мМ КСl. 0,4мМ КН2РO4, 1,6 мМ Na2HPO4, 0,8 MM МgСl2, 50 мМ трис - HCl, 2 мМ СаСl2 (рН 7,4), инкубировали при 2-4°С с 10% ДМСО, приготовленным на этой же среде, в течение 10 мин. Консервирование гепатоцитов осуществляли последующей программе: на первом этапе охлаждали от 2°С до -25°С путем погружения конвейеров с суспензией клеток в жидкость, предварительно охлажденную до -25°С, и выдерживали при этой температуре в течение 30 мин. На втором этапе клетки охлаждали до -196°С, погружая контейнеры в жидкий азот. Морфологический анализ суспензии гепатоцитов проводили методом окрашивания 0,2%-ным раствором трипанового синего. Дыхательную активность определяли полярографически. Детоксикационную активность определяли пообразованию р-нитрофенола при инкубации гепатоцитов при 37°С с р-нитроанизолом [2]. В таблице 1 представлены морфо-фунцкциональные характеристики гепатоцитов, консервированных заявляемым способом и по прототипу. Результаты, приведенные в табл. 1, показывают, что использование заявляемого способа позволяет получить консервированные гепатоциты, дыхательная активность которых в 2 раза выше по сравнению с известными. Эффективность окислительного фосфорилирования митохондрий в составе клетки также лучше сохраняется при использовании заявляемого способа. Особенно резкие различия между способами были выявлены при определении коэффициента стимуляции дыхания сукцинатом, который характеризует целостность плазматической мембраны клеток (сукцинат слабо проникает через интактную плазматическую мембрану). Клетки, консервированные заявляемым способом, способны осуществлять детоксикацию ксенобиотиков, что позволяет их использовать для лечения печеночной недостаточности. Пример 2. Способ осуществляли аналогично примеру 1, только изменяли конечную температуру о хлаждения на первом этапе. Из таблицы 2 видно, что оптимальной температурой остановки на первом этапе охлаждения является-20....28°С. При снижении температуры сохранность изолированных гепатоцитов снижается почти на 30%, а при увеличении - на 38%, Пример 3. Способ осуществляли аналогично примеру 1, только изменяли время температурнойостановки. Из таблицы 3 видно, что оптимальное время остановки на первом этапе охлаждения - 20-60 мин. При уменьшении и увеличении времени остановки сохранность изолированных гепатоцитов снижается на 25-30%.