Спосіб отримання синтетичних речовин пептидної природи та спосіб нормалізації фізіологічного стану людини та тварин при захворюваннях

1 Спосіб отримання синтетичних речовин пептидної природи, який включає екстракцію тканинних пептидів, дослідження амінокислотних послідовностей по методу Едмана з аналізом амінокислотного складу пептидних фракцій, синтез речовини та тестування и біологічної активності, який відрізняється тим, що амінокислотну Винахід стосується галузі фармації та може бути використаний для синтезу нових біологічно активних речовин з метою створення лікарських препаратів, а також для нормалізації фізіологічного стану людини та тварин Сьогодні ВІДОМО багато способів синтезу біологічно активних сполук на основі дослідження амінокислотних послідовностей реально існуючих пептидів Відомий спосіб отримання синтетичних речовин, які входять до складу природних пептидних комплексів, виділених з кори головного мозку та епіфізу [Хавінсон ВХ.Чалисова И И , Окулов В Б Исследование природных и синтетических цитомедшюв в культуре нервной ткани//Бюл эксперим биол и мед -1998-т 125, №3-С 332-336 ] Спосіб включає виділення природних тканинних пептидів шляхом екстракції, дослідження біологічної активності екстракту, виділення окремих фракцій пептидів, які входять до складу природного комплексу, дослідження амінокіслотних послідовностей цих фракцій, вивчення біологічної активності фракцій, синтез штучних аналогів та проведення ДОКЛІНІЧних ІСПИТІВ, як можливих лікарських препаратів Суттєвим недоліком такою способу є те, що при виділенні окремих фракцій пептидів, такі окремі пептиди втрачають властивості, які були притаманні ЦІЛІЙ пептидній суміші Найбільш бли ПОСЛІДОВНІСТЬ досліджують одночасно для всього екстракту тканинних пептидів, визначають амінокислоти, які домінують у певних положеннях амінокислотної ПОСЛІДОВНОСТІ пептидів та загальну формулу будови речовини для синтезу, включаючи до неї залишки-модифікатори 2 Спосіб нормалізації фізіологічного стану людини та тварин при захворюваннях, які викликані ендогенними або екзогенними чинниками, що включає введення в організм синтетичних речовин пептидної природи, який відрізняється тим, що як синтетичні речовини використовують речовини з запрограмованими властивостями зьким до способу, що заявлено, є спосіб визначення будови пептидзв'язуючої кишені молекул головного коплексу пстосуміспості 1 класу для отримання синтетичних речовин пептидної природи [ Rotzchke О , Falk К Naturally-occunmg peptide antigens derived from the MHC class-1 restricted processing pathway// Immunology Today - 1991 12,N12 -P 447-455] Спосіб включає, кислотну екстракцію тканьових пептидів, розчинення одержаної суміші в полярних розчинах, їх гель-фільтрацію, обернено-фазову хроматографію, дослідження амінокислотних послідовностей по методу Едмана з послідуючим аналізом амінокислотного складу пептидних фракцій та математичне розрахування амінокислотної ПОСЛІДОВНОСТІ пептида з найбільшою питомою вагою у суміші та тестування її біологічної активності Однак, цей метод також не дозволяє аналізувати амінокислотні ПОСЛІДОВНОСТІ В пептидних сумішах, де пептидні фракції входять приблизно в рівних кількостях В основу винаходу покладено завдання отримати синтетичні біологічно активні пептиди з запрограмованими властивостями Поставлене завдання вирішується тим, що в способі отримання синтетичних речовин пептидної природи, який включає екстракцію тканьових пептидів, дослідження амінокислотних послідовностей ю СО 43954 по методу Едмана з послідуючим аналізом амюнкислотшого складу пептидних фракцій, синтез речовини та тестування и біологічної активності, згідно винаходу, амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ досліджують одночасно для всього екстракту тканинних пептидів, визначають амінокислоти, які домінують у певних положеннях амінокислотної ПОСЛІДОВНОСТІ пептидів та загальну формулу будови речовини для синтеза, включаючи до неї залишки-модифікатори Спосіб здійснують слідуючим чином 1 В якості субстрата використовується екстракт тканинних пептидів, огриманний будь-яким відомим чи знов розробленим методом, який володіє чи може володіти корисними властивостями Екстракт тканинних пептидів розчиняють в дистильованій воді та відокремлюють речовини з молекулярною масою більше 10 kD 2 Проба екстракту, який містить пептиди з молекулярною масою менше 10 kD, аналізується методом високо-ефективної рідинної хроматографії для підтвердження пептидної природи речовин, які входять у суміш 3 Аліквота екстракту відбирається для проведення визначення амінокислотної ПОСЛІДОВНОСТІ за методом Едмана 4 Після проведення визначення амінокислотної ПОСЛІДОВНОСТІ (згідно П 3) результати обробляються для визначення амінокислот, які домінують у певних положеннях амінокислотної ПОСЛІДОВНОСТІ пептидів, які входять до суміші, що аналізується 5 На основі визначення домінуючих амінокислот та їх ПОСЛІДОВНОСТІ визначається загальна формула будови синтетичного пептида-аналога 6 Для надання синтетичному пептиду-аналогу корисних властивостей до формули будови синтетичного пептида-аналога включають залишкимодифікатори 7 Досліджують біологічну активність пептидіваналопв чи тестують корисні властивості Приклад Створення синтетичних пептидів-аналогів природного пептидного комплексу нирок Для здійснення способу береться екстракт тканинних пептидів отриманнях з ниркової тканини за методом [10180А Україна МКІ 5 А61 К37/00 Спосіб одержання біологічно активної речовини, що має регенераторну та модулюючу дію /Кайдашев І П , Катрушов О В // Промислова власність -1996 -№3 -С 3 1 76-3 1 77 ] Розчиняють пептидний комплекс в дистильованій воді, яка містить 0,1% трифтороцтової кислоти Не розчинний матеріал видаляють центрифугуванням при ЗОООд протягом 15 хвилин Розчин пептидного комплексу наносять на патрон "Centncon-10" (Amicon, USA) та відсепаровують матеріал з молекулярною вагою більше 10kD Розчин пептидів нирок (М 0,05 6,26 1,27 >0 05 >0 05 7,06 1,27 >0,05 >0,05 >0,05 3,82 0,52 >0 05 0,05 0 , 0 5 > 0 , 0 5 > 0 , 0 5 4,33 1,46 >0,05 6,80 1,55 >0,05 >0,05 6,40 0,95 >0,05 >0,05 >0,05 6,20 0,55 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 8 , 0 7 0 , 6 3 > 0 , 0 5 > 0 , 0 5 > 0 0 5 > 0 , 0 5 60,00 0,65 >0 05 47 30 4 37 0 05 49 60 4 48 0 05 36 60 8 95 >0 05 >0 05 0 05 >0 05 >0 05 >0 05 0 0 5 > 0 0 5 > 0 0 5 0 5 3 2 6 7 0 8 2 139 00 13 50 136 60 12 80 >0 05 150 60 20 70 >0 05 >0 05 136 60 5 90 >0 05 131 00 4 60 >0 05 >0 05 >0 05 >0 05 > 0 0 5 > 0 0 5 > 0 0 5 > 0 0 5 > 0 р Рі р2 Рз Р4 Фагоцитарна ність, % 1 , 0 4 > 0 , 0 5 > 0 р Рі р2 Рз Р4 Гемоглобін, г/л 9 , 1 5 > 0 , 0 5 р Рі р2 Рз Р4 Сегментоядерні нейтрофіли, % 8 0 05 61 16 >0 >0 00 50 05 05 46 70 7 42 >0 05 >0 05 >0 05 62 80 815 >0 05 >0 05 >0 05 >0 05 0 5 > 0 0 5 > 0 0 5 > 0 0 5 > 0 62 80 11 60 > 0 0 5 3 1 7 0 0 7 6 > 0 0 5 > 0 0 5 > 0 0 5 > 0 0 5 0 05 3 40 0 63 >0 05 >0 05 >0 05 4 70 0 98 >0 05 >0 05 >0 05 >0 05 Р2 Рз КонА-РБТЛ, І н Стимуляц Р4 М М Р 5 80 1 93 4 50 1 50 >0 05 7 80 0 90 >0 05 >0 05 7 00 0 79 >0 05 >0 05 >0 05 5 60 0 55 >0 05 >0 05 >0 05 >0 05 1 50 0 20 0 77 0 23 >0 05 0 60 0 86 0 22 >0 05 >0 05 >0 05 1 13 0 35 >0 05 >0 05 >0 05 >0 05 Рі р2 Рз ЛКБ, СЦК Р4 М м р Рі р2 Рз Р4 Примітки тут і далі 1 р - порівняння статистичних показників проведено з інтактними тваринами, 2 рі - порівняння статистичних показників проведено між контрольною групою та дослідними тваринами, 3 Р2-Р4 - порівняння статистичних показників між дослідними тваринами КІЛЬКІСТЬ сегментоядерних нейтрофілів залишалась в межах норми Зростало число еритроцитів без адекватного збільшення гемоглобіну в них Фагоцитарна активність та фагоцитарне число були нижче показників усіх груп Індекс бласттранформацм залишався в межах норми При введенні тваринам пептида PEKDSRK, були виявлені слідуючі зміни Зменшувалась КІЛЬКІСТЬ лейкоцитів відносно контрольної групи Збільшувалась КІЛЬКІСТЬ еритроцитів та вміст гемоглобіну в периферичній крові Фагоцитарна активність та фагоцитарне число зростали в порівнянні з показниками контрольних тварин, індекс бласттрансформацм був найвищий серед усіх груп У тварин, які одержували пептид PEKDLRK, були виявлені слідуючі зміни Знижувалась КІЛЬКІСТЬ лейкоцитів відносно контрольної групи, і ставала вище показників здорових тварин В лейкоформулі спостерігались зрушення в бік збільшення числа сегментоядерних нейтрофілів при низькому рівні лімфоцитів ЦИТОХІМІЧНИЙ коефіцієнт ЛКБ в нейтрофільних лейкоцитах був нижче показників здорових тварин на фоні збільшення фагоцитарної активності Індекс бласттрансформацм перевищував показники інтактних тварин У тварин, які отримували пептид PEKDDRL зменшувалась КІЛЬКІСТЬ лейкоцитів в периферичній крові, на фоні збільшення КІЛЬКОСТІ лімфоцитів КІЛЬКІСТЬ еритроцитів залишалася в межах норми, але зменшувався вміст гемоглобіну в них Індекс бласттрансформацм і фагоцитарна активність нормалізувались 012 0 05 2 40 0 41 0 05 >0 05 >0 05 >0 05 5 40 1 48 >0 05 >0 05 >0 05 >0 05 >0 05 1 05 0 09 >0 05 >0 05 0 05 >0 05 Використання біологічно активних синтетичних речовин пептидної природи може бути здійснено для нормалізації фізіологічного стану людини та тварин ВІДОМІ способи використання біологічно активних речовин для лікування захворювань Використовують в якості продуцентів біологічно активних речовин КЛІТИННІ суспензії [№ 94020324 18 10 93 МКІ5 А61К35/407 Лікарський препарат імунокорегуючої дії на основі клітинної суспензії та спосіб лікування цукрового діабету з використанням цього препарату] Застосовують пептидний препарат тимусу тималін для нормалізації стану імунної системи при туберкульозі легень [№ 6098 А1 149/517 29 12 94 4298215/SU МКІ4 А61К35/26, А61В5/00 Спосіб попередження розвитку туберкульозу легень /Чернушенко КФ , Кочосова Л С , Ільницький І Г , Гончарова С І , Коваленко MM та ін ] Суттєвими недоліками цих способів є введення крім активно діючих речовин баластних речовин, які мають небажані ефекти (токсична, алерпзуюча дія тощо) Найбільш близьким до способу що заявлено, є спосіб лікування синдрому набутого імунодефіціту (ВІЛ-шфекції) з використанням препарату імуноза5 мінної дії [МКІ А61К35/407 Заяв №94061620 від 14 12 93 Лікарський препарат імунозамінної дії на основі клітинної суспензії та спосіб лікування синдрому набугого імунодефщіту (ВІЛ-шфекції) з використанням цього препарату /Смикодуб О І , Марков І С , Пилипчак О М //Промислова власність Офіційний бюлетень-1995-№3-С2 11-2 12], який включає введення біологічного матеріалу імунозаміщуючої дії на грунті клітинної суспензії, виготовленої з нативних або крюконсервованих гемопоетичних клітин ембріональної печінки та/або селезінки, в цій суспензії КІЛЬКІСТЬ ядромісних кліб тин повинно бути 5-200*10 /мл, колонієутворюючих одиниць грануломоноцитарного ряду від 20 до 200*103/мл, кількість бластів від 0,5 до 10*103/мл Лікарський препарат вибирають з сформованого 12 11 43954 тканинного банку з урахуванням індивідуальних 1 Визначають порушення фізіологічного стану показників хворого організма людини та тварин при захворюваннях Однак цей спосіб не дозволяє отримати висо2 Вибирають синтетичні пептиди з запрограку терапевтичну активність внаслідок наявності мованими властивостями, які відповідають визназначної КІЛЬКОСТІ баластних речовин та не забезченим порушенням фізіологічного стану організма печує точності дозування при захворюваннях Суттєвим недоліком цього способу є високий 3 Вводять подібрані синтетичні пептиди в оррівень побічної дії, який обумовлений баластними ганізм відомими шляхами до нормалізації показниречовинами В основу винаходу покладено заків фізіологічного стану організма вдання знизити рівень побічної дії біологічно актиПриклад вних речовин та підвищити їх терапевтичну активМи дослідили зміни показників ПОЛ у тварин з ність аутоімунним нефритом (табл 4) Поставлене завдання вирішується тим, що в При розвитку патології зменшувалось накописпособі нормалізації фізіологічного стану людини чення МДА при високій активності СОД, що свідта тварин в якості синтетичних речовин викорисчило про зниження активності транспортних протовують речовини з запрограмованими властивосцесів в нирках тями, отримані згідно заявленого способу При введенні таким тваринам природ нього комплексу нирок та його синтетичних аналогів Рівень побічної дії біологічно активних речовин (PEKDSRK, PEKDLRK та PEKDDRL) рівень накознижується при використанні, отриманих згідно винапичення МДА в тканинах нирок нормалізувався ходу, синтетичних пептидів внаслідок відсутності в їх складі баластних речовин, а терапевтична активність Активність СОД ще більше підвищувалась у зростає завдяки використання синтетичних пептидів групах, які отримували пептиди PEKDDLRKTa із запрограмованими властивостями, що робить заPEKDDRL, а природний пептидний комплекс нирок стосування пептидів спрямованим на чітко визначені та його синтетичний аналог PEKDSRK знижували порушення фізіологічного стану Способ здійснюють цей показник до нормальних значінь наступним чином Таблиця 4 Зміни перекисного окислення ЛІПІДІВ В тканині нирки при дм пептидного комплексу нирок та його синтетичних аналогів при аутоімунному нефриті у щурів Тварини з аутоімунним нефритом, та введенні пептидів Показники, Статні що досліджувались показники 1 МДА в тканині нирки % накопичення Інтактні тварини Аутоімунний Пептид нефрит PEKDS-RK Пептид PEKDD-RL ппкч-і І II І Г ч П 8 2 3 4 5 6 7 М М Р 77 25 24 60 67 00 14 80 >0 05 179 00 33 80 >0 05 0 05 Рі Р2 Рз Р4 СОД в тканині нирки (Од) Пептид PEKDL-RK м м р Рі р2 Рз Р4 141 90 > 0 05 > 0 05 > 0 05 > 0 05 > 0 1 80 0 04 210 0 55 >0 05 1 90 0 005 >0 05 >0 05 2 29 013 0 05 0 05 >0 05 Нами була досліджена видільна функція нирок у тварин з аутоімунним нефритом (табл 5) 50 23 1 05 90 0 1 6 0 05 > 0 05 > 0 05 > 0 05 13 43954 14 Таблиця 5 Зміни ВИДІЛЬНОЇ функції нирок під дією ППКН та його синтетичних аналогів при аутоімунному нефриті у щурів Тварини з аутоімунним нефритом, та введенні пептидів Показники, що досліджувались Статні показники Інтактні тварини Аутоімунний нефрит Пептид PEKDS-RK Пептид PEKDL-RK Пептид PEKDD-RL ППКН 1 2 3 4 5 6 7 8 Креатинш мкмоль/л М m Р 71 50 4 20 103 70 1 70 66 40 4 20 >0 05 0 05 >0 05 >0 05 77 80 4 00 >0 05 >0 05 >0 05 >0 05 5 65 1 88 10 99 2 77 0 05 >0 05 8 36 2 42 >0 05 >0 05 >0 05 5 29 1 77 >0 05 0 05 >0 05 82 90 4 70 >0 05 0 05 >0 05 >0 05 5 70 2 03 >0 05 0 05 >0 05 >0 05 Рі Р2 Рз Р4 м m Сечовина ммоль/л Р Рі Р2 Рз Р4 При дослідженні стану нирок ми знайшли суттєві зміни показників, що досліджувалися Розвиток аутоімунного нефриту призвів до порушення екскреторної функції нирок - зростала КІЛЬКІСТЬ креатининута сечовини в сироватці крові Введення всіх пептидних препаратів, що досліджувалися, призвело до покращення показників екскреції, але лише в 5 та 6 групах ці зміни були вірогідні (ВІДПОВІДНО, пептид PEKDDRLTa ППКН) В цьому експерименті ми дослідили також показники зміни ваги тіла тварин та коефіцієнтів мас органів, при розвитку аутоімунного нефриту у щурів (табл 6) Зміни маси тіла щурів та коефіцієнтів мас органів при аутоімунному нефриті Таблиця 6 Групи тварин Показники, що До- Статні сліджувались показники Коефіцієнт нирок маси Контрольні тварини Пептид PEKDS-RK Пептид PEKDL-RK Пептид PEKDD-RL 2 1 Інтактні тварини 3 4 5 6 7 М m Р 0 0067 0 0003 0 0069 0 0008 >0 05 0 0072 0 0007 >0 05 >0 05 0 0080 0 0004 >0 05 >0 05 >0 05 0 0069 0 0002 >0 05 >0 05 >0 05 >0 05 ппкч-і І II І Г ч П 8 0 0 0 7 8 0 0 0 1 0 Рз >0 Коефіцієнт тимусу маси м m Р Рі Р2 Рз Р4 0 00082 0 00005 0 00110 0 00001 >0 05 0 00140 0 00005 0 05 0 00150 0 00008 0 Рі Р2 05 0 0 1 1 0 0 0 0 0 3 >0 05 >0 05 >0 05 15 43954 16 Продовження таблиці 6 Коефіцієнт маси нирок М m 0 0037 0 0005 0 0045 0 0010 >0 05 0 0047 0 0005 >0 05 >0 05 0 0085 0 0008 0 05 0 05 >0 05 >0 05 0 05 224 90 13 35 219 65 16 35 >0 05 282 95 24 35 >0 05 135 80 10 20 0 05 0 05 >0 05 >0 05 0 05 Р Рі Р2 Рз Р4 Вага тіла тварини м m Р Рі Р2 Рз Р4 Як показали наші дослідження при розвитку патологічною процесу знижувалась маса тіла щурів та зростали коефіцієнти мас нирок, тимусу та селезінки При введенні таким тваринам природнього пептидного комплексу нирок коефіцієнт маси нирок підвищувався Вага тіла наближувалась до показників здорових тварин При введенні пептида PEKDSRK зростав коефіцієнт маси нирок, тімусу та селезінки відносно контрольних тварин, та вага тіла Пептид PEKDLRK призводив до збільшення коефіцієнт мас нирок, тімусу й селезінки, прицьому зареєстровано зменшення ваги тіла тварин відносно контрольної групи При введенні пептида PEKDDRL збільшувався коефіцієнт маси селезінки, коефіцієнти мас нирок та тимуса залишались на рівні контрольних тварин Вага тіла тварин зменшувалась в незначній мірі відносно контрольної групи Таким чином, у всіх досліджуваних пептидів виявлявся терапевтичний ефект, але в різному ступені Пептид PEKDLRK стимулював бласттрансформацію та фагоцитарну активність нейтрофілів Пептид PEKDSRK підсилював не тільки продукцію еритроцитів, але й процентний вміст гемоглобіну в них, а також стимулював бласттрансформацію і фагоцитарну активність нейтрофільних лейкоцитів Пептид PEKDDRL підсилював продукцію лімфоцитів Як видно знаведених результатів найбільшою терапевтичною активністю володів пептид PEKDDRL, решта пептидів мали проміжний по силі вплив Маса нирок під час розвитку патології та експериментальної терапії суттєво не змінювалась Тільки пептид PEKDLRK істотно впливав на масу тимуса та селезінки, підвищуючи їх З метою підтвердження лабораторного вивчення терапевтичної активності пептидів, що досліджувалися, було проведене гістологічне дослідження тканин нирок Як показало дослідження в тканинах інтактних тварин спостерігалось помірне набухання клубочків, повнокров'я судин дрібного калібру, потовщення стінок окремих артерій, що може бути пов'язано з віковими змінами та впливом наркотичних речовин, які використовували під час забою Розвиток експериментальної патології (аутоі мунного нефриту) призводив до виникнення запально-некротичних змін в паренхімі нирок Велика частина гломерул з некрозом та палінозом капілярних петель Виявлялися ділянки масивної мононуклеарної інфільтрації, особливо навкруги канальців, стінки артерій набухлі, розрихлені з ділянками руйнації базальної мембрани, вени розширені з підвищеним кровонаповненням В гломерулах зустрічаються явища проліферації епітелію з утворенням "напівмісяців", деякі клубочки сегментовано Відмічено численні поля некрозу клітин проксимальних канальців, глибока дистрофія клітин дистальних канальців В багатьох канальцях циліндри Практично відсутня цитоплазма клітин за рахунок клазматозу В області збиральних трубочок, петлі Генле значна лімфопстюцитарна інфільтрація На границі коркової та мозкової речовини спостерігається розширення судин - артерій та вен Зустрічаються пристіночні тромби Стінки артеріол та дрібних артерій незначно інфільтровані мононуклеарами Після введення тваринам пептидного комплексу нирок зникали явища некрозу гломерул та канальців, спостерігали досить чітке розмежування коркової та мозкової речовини, але лишалися ділянки глибоких дистрофічних процесів у вигляді паліново-крапельної дистрофії, склерозу Клубочки помірно кровонаповнені, базальна мембрана практично не змінена Цитоз клубочків 80-90, Зрідка зустрічаються у окремих тварин явища вакуолізацм ендотелію клубочків Відмічено незначну періваскулярну інфільтрацію мононуклеарами Коркова речовина з ознаками повнокров'я Розширені міжканальцеві капіляри В клітинах проксимальних канальців помірні явища зернистої дистрофії, зрідка клазматоз При введенні таким тваринам пептиду PEKDSRK ми спостерігали не чітку межу між корковою та мозковою речовиною, незначну лімфопстюцитарну інфільтрацію у цій зоні, основна маса клубочків була розташована в корковій речовині Клубочки були крупні, більшість з них заповнювала всю капсулу Капілярні петлі клубочків впритул прилягали до зовнішнього листка капсули, майже заглиблюючись в нього, що ускладнює дослідження базальної мембрани Знайдено помірну вакуалізацію ендотелію клубочків В проксимальних канальцях помірні зміни (деякі клітини набряклі, в частині зерниста дистрофія) Спостерігалась помі 17 43954 рна дифузна інфільтрація міжканальцевих просторів мононуклеарами та пстюцитами В зоні розташування дистальних канальців знайдено повнокров'я капілярів, клазматоз в клітинах канальців Після введення пептиду PEKDLRK спостерігали трохи стерту межу між корковою та мозковою речовиною Клубочки займали 2/3-3/4 об'єму капсули, просвіт капсул вільний Базальна мембрана трохи набрякла В проксимальних канальцях незначний набряк клітин, клазматоз апікальної частини Зрідка зустрічаються клубочки з розширеними капілярними петлями, які займають майже всю капсулу В цілому спостерігаються незначні зміни структури нирок У тварин, які отримували пептид PEKDDRL спостерігалися клубочки відносно не 18 змінені Знайдено помірне розширення капілярної мережі, особливо на межі коркової та мозкової речовини Простір дистальних канальців розширений, деякі канальці з ознаками зернистої дистрофії Гістологічна структура практично відповідає картині здорових тварин Отже введення всіх пептидів викликало в різному ступені нормалізацію морфологічної структури нирок, найбільш активними були пептиди PEKDLRK та PEKDDRL Таким чином, синтетичні пептиди, які були отримані запропонованим методом, мали виражену біологічну активність, яка співпадала, а в ряді випадків перевершувала, активність природного пептидного комплекса нирок ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044) 456 - 20 - 90