Спосіб одержання наночасток гідроксилапатиту стронцію для профілактики і лікування підвищеної стертості зубів

Реферат: Спосіб одержання наночасток гідроксилапатиту стронцію для профілактики і лікування підвищеної стертості зубів, що включає гідроліз та хімічне осадження 0,5М розчину гідрофосфату калію K2НРО4 об'ємом 60 мл в реакційній суміші з розчинною сіллю лужного металу у присутності лугу КОН при кімнатній температурі та інтенсивному перемішуванні, зістарювання одержаного осаду протягом 4 діб, відокремлення від маточного розчину фільтруванням, промивання дистильованою водою, висушування на повітрі протягом 24 годин, перетирання у ступці та випал у муфельній печі при заданій температурі протягом 2 годин, крім того, як розчинну сіль використовують стронцієвмісні солі (нітрат стронцію Sr(NO 3), хлорид стронцію SrCl2, ацетат стронцію Sr(CH3 COO)2. UA 81538 U (12) UA 81538 U UA 81538 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Запропонована корисна модель належить до галузі медицини, а саме до розробки засобів профілактики та лікування підвищеної стертості зубів шляхом отримання новітніх хімічних наносполук на основі гідроксилапатиту. Незважаючи на достатню увагу вітчизняних і закордонних вчених щодо профілактики і лікування підвищеної стертості зубів зазначена проблема на сьогодні залишається актуальною. Актуальність проблеми обумовлена тим, що при підвищеній стертості зубів відбуваються зміни не тільки висоти коронкової частини зубів, а також у скронево-нижньощелепному суглобі, що приводить до змін у міостатичних рефлексах, а саме головне, відбувається зменшення висоти центральної оклюзії та зміни морфології самих зубів у товщині емалевого шару і структурі емалі (Рубаненко В.В., Дворник В.Μ., 1999-2001; Малюченко М.М., 2001; Біда В.І., 2003; Леус, Π.Α., 2007; Баля Г.М, 2008; Wiegand A, Kuhn M, Sener В, Roos Μ, Attin T, 2009). Пошуки можливості відновлення структури емалі, яка втрачена за рахунок функції, профілактика її втрати або призупинка патологічного процесу на рівні його виявлення є найбільш перспективним і актуальним направленням в розробці стоматологічних матеріалів. Найбільш поширеним у мінералізованих тканинах та близькими до мінерального складу кісткової тканини є гідроксилапатит (ГАП). Емаль зубів містить близько 75 % ГАП (Орловский В.П. Гидроксилапатитовая структура. / Орловский В.П., Суханова Г.Е., Ежова Ж.Α., Родичева Г.В. Журнал Всесоюзного химического общества, 1991. Том XXXVI. №6. - с. 683-689). Іони кальцію у гідроксилапатиті здатні заміщуватися близькими за властивостями хімічними елементами Ва, Mg, Sr. Такі заміщення називаються ізоморфними. Важливу роль у складі біологічного гідроксилапатиту відіграють неорганічні компоненти, а саме катіони натрію, кальцію, стронцію. Ці елементи впливають на такі характеристики кісткового мінералу, як кристалічність, механічні властивості, поведінку при порушенні. Зменшення частинок до нанометрових розмірів призводить до прояву в них так званих "квантових розмірних ефектів", коли розміри досліджуваних об'єктів порівнянні з довжиною де-бройлевської хвилі електронів, фононів і екситонів. У медицині часто використовуються матеріали на основі гідроксилапатиту. Можливості наноматеріалів обумовлені як особливостями окремих часток, так і колективними діями, які залежать від характеру взаємодії між ними. Головна характеристика наночасток - структура та дисперсність, які залежать від способу їх отримання (Гусев А.И. Нанокристаллические материалы / А.И. Гусев, А.А. Ремпель. - М.: ФИЗМАТ ЛИТ, 2000. - 224с.). Однією з головних причин зміни фізичних і хімічних властивостей малих частинок у міру зменшення їх розмірів є зростання відносної частки "поверхневих" атомів, що знаходяться в інших умовах (координаційне число, симетрія локального оточення і т.п.), ніж атоми всередині об'ємної фази. З енергетичної точки зору зменшення розмірів частки призводить до зростання ролі поверхневої енергії. Все вищевикладене є підставою для підвищеного інтересу до наночасток, які можливо застосовувати в стоматологічних цілях, зокрема для підвищення щільності або покращення міцності емалі для опору дії фізичного навантаження, яке виникає на жувальних або апроксимальних поверхнях зубів. Відомі роботи присвячені дослідженню унікальних фізичних властивостей наночасток, що виникають за рахунок поверхневих або квантово-розмірних ефектів [Gleiter Η. Nanostruct. Mater. / Η. Gleiter-1992. - V. 1. - P. 1. Siegel R.W. Nanostruct. Mater. / R.W. Siegel - 1993. - V. 3. - № 1-6. P. 1. Ремпель Α.Α., Гусев А.И., Мулюков Р.Р., Амирханов Η. Μ. //Металлофизика и новейшие технологии.-1996. - Т. 18. - № 7. - С. 14]. Відомі публікації щодо використання сполук стронцію в лікуванні остеопорозу його вплив на структуру кісткової тканини та її мінеральну щільність (Шуба Н.М., Борткевич О.П., Воронова Т.Д. Стронцію ранелат: нові можливості в лікуванні остеопорозу / Український ревматологічний журнал. - 2007.- № 4 (30)). Відомо, що іони стронцію здатні заміняти кальцій у кістковій тканині, а стронцієвмісні препарати сприяють збільшенню щільності кісткової тканини і з успіхом використовуються для лікування остеопорозу (J. Mater. Chem., 2008, DOI: 10.1039/b804140g). Відомі публікації щодо використання солей стронцію як додатків у зубних пастах та ополіскувачів порожнини рота (Parkinson CR. А comparative in vitro study investigating the occlusion and mineralization properties of commercial toothpastes in a four-day dentin disc model. / Parkinson CR., Willson RJ. // J. Clin. Dent. - 2011.- V.22, N 3. - P. 74-81; Schiff T. Clinical efficacy in reducing dentin hypersensitivity of a dentifrice containing 8,0 % arginine, calcium carbonate, and 1450 ppm fluoride compared to a dentifrice containing 8 % strontium acetate and 1040 ppm fluoride under consumer usage conditions before and after switch-over. / Schiff T, Mateo LR., Delgado E, Cummins D, Zhang YP, DeVizio W. // J Clin Dent. - 2011.- V.22, Ν 4.-Ρ. 128-38; Mason S. A comparative clinical study investigating the efficacy of a dentifrice containing 8 % strontium acetate and 1040 ppm fluoride in a silica base and a control dentifrice containing 1450 ppm fluoride in a silica base to provide 1 UA 81538 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 immediate relief of dentin hypersensitivity. /Mason S, Hughes N, Sufi F, Bannon L, Maggio B, North M, Holt J. // J Clin Dent.-2010.- V.21, N 2.- P.42-8). Відомий спосіб одержання наноструктурних металевих та біметалевих частинок для використання в різних галузях техніки та медицини, який полягає в отриманні наноструктурних металевих і біметалічних частинок шляхом відновлення іонів металу в системі зворотних міцел. (Пат. RU2147487, MПKB22F9/24. Способ получения наноструктурных металлических частиц/ Егорова Е.М., Ревина А.А.(). - № 99114319/02; заявл. 01.07.1999; опубл. 20.04.2000). Відомий також спосіб одержання наночастинок у гідроксилапатиті (Пат. RU2404818, МПК A61L27/12, В82В3/00.Способ создания наночастиц в биоцементе - гидроксилапатите / Государственное учебно-научное учреждение Научно-исследовательский институт механики Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова (RU), Третьяков Ю.Д., Кузнецов В.И., Коршунов А.Б., Путляев В.И., Голубцов И.В., Иванов А.Н., Ковальков В.К. (RU). № 2009111397/15; заявл. 30.03.2009; опубл. 27.11.2010), в якому одержаний при кімнатній температурі гідроксилапатит піддавали дії рентгенівського випромінювання з поглиненою дозою випромінювання, що дорівнює 16,1±0,5 кГр, і подальшого двомісячного старіння при кімнатній температурі. Відомий також спосіб одержання наночастинок у гідроксилапатиті (Пат. RU 2409392, МПК A61L27/00, В82В3/00. Способ создания наночастиц в биоцементе - гидроксилапатите / Государственное учебно-научное учреждение Научно-исследовательский институт механики Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова (RU), Третьяков Ю.Д., Кузнецов В.И., Коршунов А.Б., Путляев В.И., Голубцов И.В., Иванов А.Н., Ковальков В.К. (RU). № 2009111398/15; заявл. 30.03.2009; опубл. 20.01.2011, в якому одержаний при кімнатній температурі гідроксилапатит піддавали дії гальмівного випромінювання, що генерується в гідроксилапатиті швидкими електронами, що випускаються радіоізотопним джерелом 90Sr+90Υ, в інтервалі поглинених доз випромінювання від 3,3 до 66 радій. Найбільш близьким до запропонованої корисної моделі за технічною суттю та результатом, який може бути досягнутий, тому його вибрано за прототип, є спосіб одержання наночасток гідроксилапатиту кальцію (Третьяков Ю.Д. Влияние анионов NO 3, СН3СОО , Сl на морфологию кристаллов гидроксилапатита кальция / Ю.Д. Третьяков, А.А. Степук, А.Г. Вересов // Доклады академии наук.-2007. - Т.412. - №2. - С. 211-215). Спосіб включає синтез гідроксилапатиту кальцію Са10(РО4)6(ОН)2 методом гідролізу та осадження 0.5М розчину гідрофосфату калію K2НРО4 об'ємом 60 мл повільним додаванням (по 2мл/хв.) 40 мл 0,5М розчину солі кальцію Са Х 2 (де Х= кислотним аніонам СН3 СОО , СІ , ΝΟ3 ) при інтенсивному перемішуванні при кімнатній температурі. Кількість вихідних речовин розраховували виходячи із співвідношення V (СА) / V (Р) = 1,67. Задане значення рН 10 розчину підтримували за допомогою лугу KОН (марки х.ч.) 10 СаХ 2+6 K2НРО4+8 KОН=Са10(Р04)6(ОН)2+20KХ+6Н2О. Одержаний осад зістарювали протягом 4 діб, потім відокремлювали від маточного розчину шляхом фільтрування на паперовому фільтрі, промивали дистильованою водою і висушували на повітрі протягом 24 годин, потім перетирали у агатовій ступці. Для огрублення кристалів гідроксилапатиту кальцію, порошок випалювали у муфельній печі при заданій температурі (500°, 700°, 900°, 1100 °C) протягом 2 годин. Рентгенографічне дослідження отриманих зразків проводили на дифрактометрі (ДРОН ЗМ)(НПО "Буревестник") з використанням Сu Kа-випромінення (середньої довжини хвилі λ=1.54 Å, нікелевий β-фільтр). Реєстрацію проводили у покроковому режимі на інтервалі кутів 20=24°-27° для дослідження профілів дифракційних піків. Дослідження мікроструктури одержаного порошку проводили на скануючому електронному мікроскопі з автоемісійним джерелом LEO SUPRA 50VP ("Carl Zeiss" / Германия). ІЧ (інфрачервоні) - спектри поглинання зразків фіксували на спектрометрі Spectrum One ("Perkin Elmer", USA) у діапазоні 400-4000 см із кроком сканування 4 см . Зразки пресували у пігулки d=13 мм з бромистим калієм, тиск ручного преса 7 метричних тонн, із розрахунку 1 мг порошку на 150 мг KВr. Проте одержаний відомим способом гідроксилапатит кальцію має недостатній ступінь ефективності при лікуванні підвищеної стертості зубів за рахунок недостатньої резорбції наночасток до кристалічної решітки емалі зубів. В основу корисної моделі поставлена задача розробити спосіб одержання наночасток гідроксилапатиту стронцію для профілактики і лікування підвищеної стертості зубів на основі гідроксилапатиту кальцію шляхом хімічного модифікування гідроксилапатиту досягти одержання порошку гідроксилапатиту стронцію з мінімальними розмірами первинних часток з високим ступенем агрегації та резорбції наночасток до кристалічної решітки емалі зубів, забезпечити 2 UA 81538 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 підвищення щільності емалевого шару та ступеня ефективності лікування та профілактики підвищеної стертості зубів. Поставлену задачу вирішують розробкою способу одержання наночасток гідроксилапатиту стронцію для профілактики і лікування підвищеної стертості зубів, що включає гідроліз та хімічне осадження 0,5 М розчину гідрофосфату калію K2НРО4 об'ємом 60 мл в реакційній суміші з розчинною сіллю лужного металу у присутності лугу KОН при кімнатній температурі та інтенсивному перемішуванні, зістарювання одержаного осаду протягом 4 діб, відокремлення від маточного розчину фільтруванням, промивання дистильованою водою, висушування на повітрі протягом 24 годин, перетирання у ступці та випал у муфельній печі при заданій температурі протягом 2 годин, який, згідно з корисною моделлю, як розчинну сіль використовують стронцієвмісні солі (нітрат стронцію Sr(NO3), хлорид стронцію SrCl2, ацетат стронцію Sr(CH3 COO)2. Стронцій - елемент головної підгрупи другої групи, п'ятого періоду періодичної системи хімічних елементів Д.І.Менделєєва, з атомним номером 38, позначається символом Sr - м'який, пластичний лужноземельний метал сріблясто-білого кольору. Має високу хімічну активність, на повітрі швидко реагує з киснем та вологою з утворенням жовтої оксидної плівки SrO. По масі, в геохімічних процесах, він є супутником кальцію. Стронцій у своїх з'єднаннях завжди проявляє валентність +2, тому близький до кальцію і барію, займаючи проміжне положення між ними. Природний стронцій є складовою частиною мікроорганізмів, рослин та тварин. Накопичення стронцію різними організмами залежить не тільки від їх виду, особливостей, але і від співвідношення в середовищі стронцію з іншими елементами, головним чином з Са і Р, а також від адаптації організмів до певного геохімічного середовища. У морській воді міститься (0,1 мг/л), в ґрунтах (0,035 мас%). Стронцій є аналогом кальцію, тому він найбільш ефективно відкладається у кістковій тканині, особливо в організмі дітей до 4 років, коли відбувається активне формування кісткової тканини. У м'яких тканинах затримується близької %. У кістковій тканині людини основна кількість стронцію ранелату абсорбується на поверхні кристалів гідроксиалпатиту і лише в незначній мірі заміщає Са2 + в цих кристалах в новоствореній кістці. Не змінює характеристики кристалізації кісткової тканини. Комбіновані ефекти розподілу стронцію в кістковій тканині і підвищена, за даними рентгенографії, абсорбція стронцію в порівнянні з Са2+, призводять до підвищення мінеральної щільності кісткової тканини, яка вимірюється шляхом двофотонної рентгенівської абсорбціометрії. Солі та сполуки стронцію малотоксичні та можуть впливати на метаболізм кісткової тканини. Наночастки, похідні стронцію і споріднені до іонів кальцію, можуть абсорбуватися на поверхні апатиту або заміщувати даним аніоном фосфат або гідроксидіон в решітці гідроксіапатиту, тобто вбудовуватися в самі призми. Вперше, як слідовий елемент, розповсюджений у гео- та біосфері, стронцій був ідентифікований у видобутках свинцевих шахт населеного пункту Strontian у Шотландії наприкінці XVIII ст. Елемент стронцій виявили в мінералі стронціаніті (SrCO 3), знайденому у 1764 у свинцевому руднику поблизу шотландської села Строншіан, що дало згодом назву новому елементу. Присутність в цьому мінералі оксиду нового металу було встановлено майже через 30 років Адером Кроуфордом і Вільямом Крюйкшенком. Стронцій виділено в чистому вигляді сером Гемфрі Деві у 1808 електролізом. У 1990-х pp. (за підтримки французького фармацевтичного гіганту "Sender", який зареєстрував у 2003 р. стронцію ранелат під торговою маркою Protelos) почалися експериментальні, а потім і клінічні дослідження ефектів стронцію ранелату за умов дієти із стандартним вмістом кальцію, які виявили їх потенційну спроможність у лікуванні остеопорозу. Запропонований спосіб одержання наночасток гідроксилапатиту стронцію Sr 10(РО4)6(ОН)2 для профілактики і лікування підвищеної стертості зубів виконують наступним чином за схемою: 10 SrX2+6 К2НРО4+8 КОН= Sr10(PO4)6(OH)2 +20KX+6Н2О В ємкість з 0,5 М розчином гідрофосфату калію (K2 НРО4) об'ємом 60 мл повільно (по 2 мл/хв.) додають 40 мл 0,5М розчину солі стронцію SrX2 (де X =СН3 СОО-, СІ-, NO3-) та інтенсивно перемішують при кімнатній температурі з наступним відділенням одержаного продукту. Задане значення рН 10 розчину підтримували за допомогою KОН (х.ч.). Одержаний осад зістарювали протягом 4 діб, потім відокремлювали від маточного розчину шляхом фільтрування на скляному фільтрі, багатократно промивали дистильованою водою (до повного вилучення розчинних солей) і висушували на повітрі протягом 24 годин. Потім одержаний осад розтирали у агатовій ступці. Для переведення залишків аморфної фази гідроксил апатиту стронцію в кристалічну, порошок випалювали у муфельній печі при температурі 500 °C протягом 2 годин. Кількість вихідних речовин розраховували виходячи із співвідношення V (Sr) / V (Ρ) = 1,67. 3 UA 81538 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Для встановлення фазового складу отриманого порошку проводили рентгенографічне дослідження на дифрактометрі ДРОН - 7М за умов: Сu Kа, U=30kV, I=20 mA, 2Q=0,004 град, D=3 сек. Дослідження мікроструктури одержаного порошку проводили на скануючому електронному мікроскопі MIRA 3 Tescan. Аналіз зразків показав, що внаслідок випалювання порошку при температурах вище як 5000 ºС, розмір кристалів збільшується. За даними рентгенофазового аналізу при синтезі гідроксилапатиту із різних стронцієвих солей в всіх випадках одержували в якості основного продукту SrГАП. Приклад. В ємкість з 0,5 М розчином гідрофосфату калію (K2 НРО4) об'ємом 60 мл повільно (по 2 мл/хв.) додають 40 мл 0,5М розчину нітрату стронцію Sr(NO 3)2 та інтенсивно перемішують при кімнатній температурі з наступним відділенням одержаного продукту. Кількість вихідних речовин розраховували виходячи із співвідношення V (Sr) / V (Ρ) = 1,67. Задане значення рН 10 розчину підтримували за допомогою KОН (х.ч.). Одержаний осад (Sr 10(РО4)6(ОН)2) зістарювали протягом 4 діб. Потім одержаний осад відокремлювали від маточного розчину фільтруванням на скляному фільтрі. Багаторазово промивали дистильованою водою (до повного вилучення розчинних солей) і висушували на повітрі протягом 24 годин. Потім одержаний осад розтирали у агатовій ступці. Наступне рівняння реакції ілюструє приклад: 10Sr(NO3)2+6K2НРО4+8КОН  Sr10(PO4)6(OH)2 (аморфний) + 20KNO3+6Н2О. Для переведення залишків аморфної фази гідроксилапатиту стронцію в кристалічну, порошок випалювали у муфельній печі при температурі 500 °C протягом 2 годин. Sr10(PO4)6(OH)2 (аморфний) 500 °C  Sr10(PO4)6(OH)2 (кристалічний) Визначення фазового складу отриманого порошку проводили за допомогою рентгенографічного дослідження на дифрактометрі ДРОН - 7М за умов: Cu Ka, U=30kV, І=20 mA, 2Q=0,004 град, D=3 сек. Дослідження мікроструктури одержаного порошку проводили на скануючому електронному мікроскопі MIRA 3 Tescan. Аналіз зразків показав, що внаслідок випалювання порошку при температурах вище як 5000 ºС, розмір кристалів збільшується. Наступні рівняння реакцій демонструють способи одержання гідроксилапатиту з використанням різних стронцієвмісних солей: 10Sr(NO3)2+6K2НРО4+8KОН  Sr10(PO4)6(OH)2+20KNO3+6H2O; 10SrCl2+6K2НРО4+8KОН  Sr10(PO4)6(OH)2 + 20KСl+6Н2О; 10Sr(CH3 СОО)2+6K2НРО4+8KОН  Sr10(PO4)6(OH)2 + 20(CH3 СОО)2+6Н2О За даними рентгенофазового аналізу при синтезі гідроксилапатиту із різних стронцієвих солей в всіх випадках одержували як основний продукт SrГАП. Як стронцієвмісні солі у запропонованому способі були використані нітрат стронцію Sr(NO 3), хлорид стронцію SrCl2, ацетат стронцію Sr(CH3 COO)2. Вибір даних солей обумовлений досить значною розчинністю їх у воді. Нітратний аніон можна віднести до немодифікованих аніонів, так як він не має можливості вбудовуватися в структуру гідроксилапатиту і не схильний до гідролізу. Всупереч цьому, ацетатний іон гідролізується і зменшує кислотність середовища, пов'язує іони стронцію з утворенням іонного асоціату (іонні пари). Хлоридіон вважається модифікуючим: він має можливість заміщувати гідроксигрупи в кристалах гідроксилапатиту з утворенням стронцієвого хлор апатиту. Таким чином були синтезовані порошки гідроксилапатиту з розмірами первинних наночастинок 19,8-25 нм та з високим ступенем агрегації. Звертає на себе увагу різниця в морфології кристалів стронцієвого гідроксилапатиту, отриманого із нітрату стронцію та інших солей стронцію запропонованим способом. Вона змінюється в залежності від природи вихідних аніонів стронцієвих солей (хлорид, нітрат, ацетат): пластинки, голчасті та рівноосьові частки, що можна пояснити різними видами взаємодії аніонів вихідних солей з гідроксилапатитом. Наночастки синтезовані із нітрату стронцію у вигляді призм розміром від 30 нм та паличкоподібних наночасток розміром від 34 нм отриманих методом осадження із хлориду стронцію (Фіг. 1, 2, 3). На фіг. 1 розміщена мікрофотографія наночасток кристалів стронцієвого гідроксил апатиту, одержаного методом осадження із нітрату стронцію. На фіг. 2 наведено рентгенограму зразка гідроксилапатиту стронцію, отриманого з нітрату стронцію. На фіг. 3 розміщена мікрофотографія наночасток кристалів стронцієвого гідроксилапатиту, одержаного методом осадження із хлориду стронцію. Таким чином, виходячи з вищевикладеного, можна зробити висновок, що запропонований спосіб одержання наночасток гідроксилапатиту стронцію для профілактики і лікування 4 UA 81538 U 5 10 15 20 25 підвищеної стертості зубів відповідає поставленій задачі одержання порошку гідроксилапатиту стронцію з мінімальними розмірами первинних часток з високим ступенем агрегації та резорбції наночасток до кристалічної решітки емалі зубів, за рахунок чого забезпечує підвищення щільності емалевого шару та ступеня ефективності лікування і профілактики підвищеної стертості зубів. На основі запропонованого способу розроблений протокол дослідження зразків зубів з підвищеною стертістю для оцінки проникнення і фіксації наночасток на поверхні емалі зуба. Використання запропонованого способу в стоматологічній практиці дозволить підвищити ступінь ефективності лікування і профілактики підвищеної стертості зубів за рахунок включення в комплекс лікувальних заходів у вигляді аплікацій, мазей та гелів. Запропонований спосіб впроваджений на кафедрі пропедевтики ортопедичної стоматології ВДНЗУ "Українська медична стоматологічна академія" та роботі товариства з обмеженою відповідальністю "Нано Технології в Медицині" м. Київ. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб одержання наночасток гідроксилапатиту стронцію для профілактики і лікування підвищеної стертості зубів, що включає гідроліз та хімічне осадження 0,5 М розчину гідрофосфату калію K2НРО4 об'ємом 60 мл в реакційній суміші з розчинною сіллю лужного металу у присутності лугу КОН при кімнатній температурі та інтенсивному перемішуванні, зістарювання одержаного осаду протягом 4 діб, відокремлення від маточного розчину фільтруванням, промивання дистильованою водою, висушування на повітрі протягом 24 годин, перетирання у ступці та випал у муфельній печі при заданій температурі протягом 2 годин, який відрізняється тим, що як розчинну сіль використовують стронцієвмісні солі (нітрат стронцію Sr(NO3), хлорид стронцію SrCl2, ацетат стронцію Sr(CH3 COO)2. 5 UA 81538 U 6 UA 81538 U Комп’ютерна верстка М. Ломалова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 7