Екстракт циклогексенону з antrodia camphorata

1. Сполука, що має формулу (1) CH3 CH3 R3 C2 2 (19) 1 3 97135 4 21. Спосіб за п. 15, який відрізняється тим, що клітини раку печінки походять з лінії клітин Нер 3В або Нер G2. 22. Спосіб пригнічення росту клітин раку передміхурової залози, який відрізняється тим, що включає введення сполуки за п. 1 або п. 7. 23. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що сполука виділена з Antrodia camphorata. 24. Спосіб за п. 23, який відрізняється тим, що сполука виділена з органічних екстрактів Antrodia camphorata. 25. Спосіб за п. 24, який відрізняється тим, що органічний розчинник вибраний з групи, що складається із спиртів, естерів, алканів і алкілгалогенідів. 26. Спосіб за п. 25, який відрізняється тим, що органічний розчинник являє собою етанол. 27. Спосіб за п. 23, який відрізняється тим, що сполука виділена з водних екстрактів Antrodia camphorata. 28. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що клітини раку передміхурової залози походять з лінії клітин LNCaP або DU145. 29. Сполука за п. 1 або 7, яка відрізняється тим, що демонструє антиоксидантну активність. 30. Фармацевтична композиція для пригнічення росту клітин пухлини, яка відрізняється тим, що містить активну дозу сполуки за п. 1 і фармацевтично прийнятний носій, де клітини пухлини вибирають з групи, яка включає рак молочної залози, рак печінки і рак передміхурової залози. 31. Фармацевтична композиція для пригнічення росту клітин пухлини, яка відрізняється тим, що містить активну дозу сполуки за п. 7 і фармацевтично прийнятний носій, де клітини пухлини вибирають з групи, яка включає рак молочної залози, рак печінки і рак передміхурової залози. 1. Галузь винаходу Даний винахід стосується нової сполуки, зокрема екстракту, що виділений з Antrodia camphorata і очищений, та її застосування з метою пригнічення росту пухлини. 2. Рівень техніки Antrodia camphorata (Ніу Чанг-Жи, Niu ChangZhi) також має назву Чанг-Жи ("Chang-Zhi"), Ніу Чанг-Ку ("Niu Chang-Ku"), Ред-Чанг ("Red-Chang"), Ред Чанг-Чіх ("Red Chang-Chih"), Чанг-Ку ("ChangKu"), камерний гриб камфори і так далі, являє собою ендемічний вид, що виростає на внутрішній прогнилій деревній серцевині стінки сіна (висушеної трави) Сіnnаmоmum kanehirae в горах Тайваню на висоті 450-2000 м. Плоди Antrodia camphorata ростуть усередині стовбура дерева. Сіно (висушена трава) Cinnamoum kanehirai розповсюджена переважно в гірських областях Тао-юаня, Нан-Тоу і внесена до переліку рідкісних і цінних рослин завдяки своїй нечисленності та внаслідок незаконного знищення. Отже, Antrodia camphorata у природі стала навіть рідкісною рослиною. Оскільки швидкість росту Antrodia camphorata в природі надзвичайно повільна, її сезон зростання з червня до жовтня, то ціна на Antrodia camphorata є дуже високою. [0001] Плоди Antrodia camphorata - багаторічні, безчерешкові, пробкоподібні або деревні, з різною зовнішньою формою, наприклад, вони можуть бути схожими на пластинку, дзвін, підкову або вежу. На початку росту вони є пласкими на поверхні деревини. Далі ободок переднього краю піднімається для утворення пластинки або сталактитів. Верхні шари Antrodia camphorata блискучі, від коричневого до темно коричневого кольору, з неочевидними зморшками, пласкими і тупими краями. Нижні шари оранжево-червоні або частково жовті з порами по всій поверхні. [0002] Крім того, Antrodia camphorata виділяє сильний запах сасафраса (аромат камфори), рос лина набуває блідого жовтувато-коричневого кольору після висушування на сонці і має виражений гіркий смак. У традиційній тайській медицині Antrodia camphorata звичайно використовують для детоксикації, з метою захисту печінки і для лікування раку. Antrodia camphorata, подібно до звичайних їстівних і лікарських грибів, багата на численні поживні речовини, в тому числі полісахариди (такі як -глюкозан), тритерпеноїди, супероксиддисмутазу (СОД), аденозин, білки (імуноглобуліни), вітаміни (наприклад, вітамін В, нікотинова кислота), мікроелементи (такі як кальцій, фосфор, германій та інші), нуклеїнову кислоту, аглютинін, амінокислоти, стероїди, лігніни і стабілізатори артеріального тиску (наприклад, антодієва кислота), тощо. Вважають, що вказані біологічно активні інгредієнти виявляють сприятливу дію, наприклад, протипухлинний ефект, підсилення імунітету, протиалергічну дію, пригнічення аглютинації тромбоцитів, противірусний, антибактеріальний, антигіпертензивний ефект, зниження рівня глюкози в крові, зниження рівня холестерину, гепатопротекторну дію та інші. [0003] Тритерпеноїди являють собою найбільш вивчений компонент серед численних композицій Antrodia camphorata. Тритерпеноїди - сукупна назва природних сполук, які містять 30 атомів вуглецю і мають пентациклічну або гексациклічну структуру. Antrodia camphorata має гіркий смак завдяки вмісту тритерпеноїдів. Три нових тритерпеноїди ергостанового типу (антцин А, антцин В, антцин С) були виділені Cherng et al. з плодів Antrodia camphorata (Cherng, I. H., and Chiang, H. С. 1995. Three new triterpenoids from Antrodia cinnamomea. J. Nat. Prod. 58:365-371). Cherng із співавт. за допомогою етанолу екстрагували з плодів Antrodia camphorata три нових сполуки, які назвали жанкуєвою кислотою А, жанкуєвою кислотою В і жанкуєвою кислотою (Chen, С. Н., and Yang, S. W. 1995. New steroid acids from Antrodia cinnamomea, - a 5 fungus parasitic on Cinnamomum micranthum. J. Nat. Prod. 58:1655-1661). Крім того, Cherng із співавт. також виявили три інших нових тритерпеноїди з плодів Antrodia camphorata, що являють собою похідні сполуки лактону сесквітерпену і 2 біфеніл4,7-диметокси-5-мети-1,3-бензодіоксол та 2,2',5,5'тетраметокси-3,4,3',4'-бі-метилендіокси-6,6'диметилбіфенілу (Chiang, Н. С, Wu, D. P., Cherng, I. W., and Ueng, С. Н. 1995. А sesquiterpene lactone, phenyl and biphenyl compounds from Antrodia cinnamomea. Phytochemistry. 39:613-616). У 1996 p. чотири нових тритерпеноїда ергостанового типу (антцини Е і F та метилантцинати G і Н) були виділені Cherng із співавт. такими ж аналітичними способами (Cherng, І. Н., Wu, D. P., and Chiang, H. С. 1996. Triterpenoids from Antrodia cinnamomea. Phytochemistry. 41:263-267). А два ергостанподібних стероїди, жанкуєві кислоти D і Е разом з трьома ланостаподібними тритерпенами - 15альфа-ацетил-дегідросульфуренова кислота, дегідроубурикоєва кислота та дегідросульфуренова кислота, - були виділені Yang et al. (Yang, S. W., Shen, Y. C, and Chen, С. Н. 1996. Steroids and triterpenoids of Antrodia cinnamomea - a fungus parasitic on Cinnamomum micranthum. Phytochemistry. 41:1389-1392). Пошуки справжніх активних інгредієнтів, що демонструють протипухлинний ефект, все ще знаходяться в стадії експерименту і потребують роз'яснення, хоча існують повідомлення про наявність протипухлинних ефектів екстрактів Antrodia camphorata (наприклад, посилання, що згадувалися вище). Вказані дані внесуть вагомий внесок у розвиток сприятливих ефектів при лікуванні раку, якщо буде знайдено точний склад композиції з протипухлинною дією. КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ [0004] 3 метою ідентифікації протипухлинних сполук з екстрактів Antrodia camphorata, сполука формули (1) була виділена і очищена в даному винаході, де X і Y можуть являти собою кисень або сірку, кожен з R1, R2 і Я3 являє собою атом водню, метил або (СН2)m-СН3, та m = 1-12, n = 1-12. [0005] Переважна сполука загальної формули (1) являє собою 4-гідрокси-2,3-диметокси-6-мети5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триєніл)циклогекс-2-енон, як показано у формулі (2), з молекулярною формулою С24Н38О4, у вигляді блідо жовтого порошку з молекулярною масою 390. 97135 6 [0006] Сполуки, що мають структуру формули (1) і формули (2), очищують за допомогою водної екстракції або екстракції органічними розчинниками Antrodia camphorata. Використовувані органічні розчинники включають, не обмежуючись ними, спирти, наприклад метанол, етанол або пропанол, естери, наприклад етилацетат, алкани, наприклад гексан, або алкілгалогеніди, наприклад хлорметан, хлоретан. Серед них, спирт є переважним, а особливо переважним є етанол. [0007] Сполуки, які можна застосовувати за даним винаходом, можуть пригнічувати ріст пухлинних клітин, тобто, їх можна застосовувати у вигляді лікарської композиції з метою лікування раку і підсилення терапевтичного ефекту. Сполуки за даним винаходом можна застосовувати в клітинах раку, включаючи рак молочної залози, рак печінки і рак передміхурової залози, в результаті чого відбувається уповільнення росту клітин раку, причому пригнічується проліферація клітин раку і зменшується ризик розвитку злоякісної пухлини. Таким чином, їх можна застосовувати з метою лікування раку, наприклад, раку молочної залози, раку печінки і раку передміхурової залози, тощо. [0008] З іншого боку, сполуки формули (1) та/або формули (2) у даному винаході можна вводити в лікарські композиції для лікування раку молочної залози, раку печінки і раку передміхурової залози з метою пригнічення росту ракових клітин. Лікарські композиції містять не тільки сполуки формули (1) та/або формули (2), але також фармацевтично прийняті носії. Носії включають, не обмежуючись ними, допоміжні речовини, наприклад воду, наповнювачі, наприклад сахарозу або крохмаль, зв'язувальні агенти, наприклад похідні целюлози, розчинники, дезінтегранти, підсилювачі абсорбції або підсолоджувачі. Фармацевтичну композицію за даним винаходом можна одержати шляхом змішування сполук формули (1) та/або формули (2) як мінімум з одним носієм за допомогою традиційних способів, відомих у галузі фармацевтичної технології, таку композицію можна приготувати, не обмежуючись ними, у вигляді порошку, таблеток, капсул, пігулок, гранул або у вигляді рідкого препарату. [0009] Крім того, оскільки сполуки за даним винаходом володіють антиоксидантною активністю, вони можуть являти собою ідеальні добавки для здорового харчування, напоїв і дієт, медичних продуктів і косметичних засобів, вони також сприятливі для здоров'я людини завдяки їх здатності запобігати серцево-судинним захворюванням або мутації клітин. [0010] Даний винахід далі пояснюється в наступному описі ілюстративних варіантів і прикладах. Однак, не слід вважати, що приклади, наведені нижче, обмежують даний винахід, 7 передбачається, що фахівці в даній галузі можуть легко внести свої модифікації, і подібні модифікації будуть в дусі даного винаходу і в межах формули винаходу, що додається до даного винаходу. ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ІЛЮСТРАТИВНИХ ВАРІАНТІВ |0011] Міцелії, плоди Antrodia camphorata або їх суміш спочатку екстрагують водою або органічними розчинниками з метою одержання водного екстракту або органічного екстракту Antrodia camphorata з використанням способів, які добре відомі з рівня техніки. Використовувані органічні розчинники включають, не обмежуючись ними, спирти, наприклад метанол, етанол або пропанол, естери, наприклад етилацетат, алкани, наприклад гексан, або алкілгалогеніди, наприклад хлорметан, хлоретан. Серед них, спирт є переважним, а особливо переважним є етанол. [0012] Водні або органічні екстракти Antrodia camphorate піддавали високоефективній рідкій хроматографії (ВЕРХ) з метою виділення та очищення. Кожну фракцію відновлювали і випробовували на протиракову активність. Аналізували склад фракцій з вираженою протираковою дією і далі досліджували проти різних клітин пухлини. Згаданий вище підхід в подальшому використовували для ідентифікації нових сполук, формули (1) і формули (2), що пригнічували ріст деяких пухлинних клітин, дані сполуки не були знайдені раніше у складі Antrodia camphorate, а також про них не повідомляли в попередніх публікаціях. [0013] Як приклад для даного винаходу нижче наводиться пояснення щодо сполуки 4-гідрокси2,3-диметокси-6-мети-5(3,7,11-триметил-додека2,6,10-триєніл)-циклогекс-2-енон формули (2). Протиракова дія 4-гідрокси-2,3-диметокси-6-мети5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триєніл)циклогекс-2-енону була оцінена при проведенні кількісного аналізу 3-(4,5-диметилтіазол-2-іл)-2,3дифенілтетразолію броміду (МТТ) відповідно до моделі скринінгу протипухлинних лікарських засобів Національного Інституту Раку (НІР), в ході якого досліджують частоту виживання клітин, з використанням ліній клітин, наприклад раку молочної залози, раку печінки і раку передміхурової залози, тощо. Згадані вище випробування довели, що 4гідрокси-2,3-диметокси-6-мети-5(3,7,11-триметилдодека-2,6,10-триєніл)-циклогекс-2-енон зменшив частоту виживання ліній клітин (MCF-7 і MDA-MB231) раку молочної залози, ліній клітин (Hep ЗВ і Hep G2) раку печінки і ліній клітин (LNCaP і DU145) раку передміхурової залози, в той же час демонструючи відносно низькі значення концентрації напівпригнічення (ІС50). Ріст пухлинних клітин раку молочної залози, раку печінки і раку передміхурової залози пригнічує 4-гідрокси-2,3-диметокси-6мети-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триєніл)циклогекс-2-енон, який, таким чином, можна використовувати з метою лікування раку, наприклад раку молочної залози, раку печінки і раку передміхурової залози, тощо. Деталі прикладів описані нижче. 97135 8 Приклад 1 Виділення 4-гідрокси-2,3-диметокси-6-мети5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триєніл)циклогекс-2-енону [0014] 100 г міцелію, плодів Antrodia camphorata або їх суміші вміщують в колбу. Відповідну кількість води і спирту (70-100% спиртового розчину) додають в колбу і перемішують при 20-25 °С як мінімум протягом 1 години. Розчин фільтрують крізь мембранний фільтр з розміром отворів 0,45 мкм, фільтрат збирають у вигляді екстракту. [0015] Фільтрат Antrodia camphorata піддають аналізу за допомогою високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ). Розділення здійснюють на колонці RP18, рухома фаза складається з метанолу (А) і 0,1-0,5 % оцтової кислоти (В), умови градієнту: 0-10 хвилин, 95 % ~ 20 % В, 10-20 хвилин, 20 % ~ 10 % В, 20-35 хвилин, 10 % ~ 10 % В, 35-40 хвилин, 10 % ~ 95 % В, при швидкості потоку 1 мл/хв. Колонку елюенту контролюють за допомогою детектору в УФ-видимій області. [0016] Фракції з часом утримання 25-30 хвилин, концентрують з метою одержання продукту 4гідрокси-2,3-диметокси-6-мети-5(3,7,11-триметилдодека-2,6,10-триєніл)-циклогекс-2-енону у вигляді блідо-жовтого порошку. Аналіз 4-гідрокси-2,3диметокси-6-мети-5(3,7,11-триметил-додека2,6,10-триєніл)-циклогекс-2-енону продемонстрував молекулярну формулу С24Н38О4, з молекулярною масою 390, температурою плавлення 48~52°С. Дослідження ЯМР-спектрів показало на1 ступні дані: Н-ЯМР (CDCl3)  (проміле) = 1,51; 1,67; 1,71; 1,75; 1,94; 2,03; 2,07; 2,22; 2,25; 3,68; 13 4,05; 5,07 і 5,14; С-ЯМР(СОСl3)  (проміле) = 12,31; 16,1; 16,12; 17,67; 25,67; 26,44; 26,74; 27,00; 39,71; 39,81; 4,027; 43,34; 59,22; 60,59; 120,97; 123,84; 124,30; 131,32; 135,35; 135,92; 138,05; 160,45 і 197,12. [0017] Хімічну структуру 4-гідрокси-2,3диметокси-6-мети-5(3,7,11-триметил-додека2,6,10-триєніл)-циклогекс-2-енону порівнювали з базою даних хімічних сполук, при цьому не було знайдено подібних доступних структур. Вказані дані підтвердили, що 4-гідрокси-2,3-диметокси-6мети-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триєніл)циклогекс-2-енон являє собою нову сполуку, про яку раніше не повідомлялося. Приклад 2 Дослідження тривалості протиракової дії на рак молочної залози in vitro [0018] Модель скринінгу протипухлинних лікарських засобів Національного Інституту Раку пристосовували з метою перевірки протиракової дії сполуки з Прикладу 1 за даним винаходом. Виділену сполуку 4-гідрокси-2,3-диметокси-6-мети5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триєніл)циклогекс-2-енон, що одержана у Прикладі 1, додають у середовище для культивування клітин раку молочної залози людини, MCF-7 або MDAMB-231, з метою дослідження виживання пухлинних клітин. Вказане випробування може бути проведене за допомогою кількісного аналізу 3-(4,5диметилтіазол-2-іл)-2,3-дифенілтетразолію броміду (МТТ), що звичайно застосовують з метою визначення проліферації клітин, відсотку життєздат 9 97135 них клітин і цитотоксичності. МТТ являє собою жовтий барвник, який може поглинатися живими клітинами і відновлюватися до фіолетово-синіх кристалів формазану за допомогою сукцинаттетразолію редуктази в мітохондріях. Таким чином, утворення формазану можна використовувати з метою оцінки і визначення частоти виживання клітин. [0019] Клітини раку молочної залози людини, MCF-7 і MDA-MB-231, окремо вирощують у середовищі, що містить ембріональну сироватку теляти, протягом 24 годин. Проліферовані клітини промивають один раз буферним розчином натрію фосфату (БРНФ), потім обробляють 1х трипсинЕДТА та центрифугують при 1200 об/хв протягом 5 хвилин. Супернатант відкидають, і осад клітини повторно суспендують в 10 мл свіжого середовища для культивування, злегка струшуючи. Клітини розміщають на 96-лунковому планшеті. Додають етанольні екстракти Antrodia camphorata (контрольна група, всі екстракти Antrodia camphorata без очищення) до кожної з 96 лунок в наступних концентраціях: 30; 10; 3; 1; 0,3; 0,1 і 0,03 мкг/мл, відповідно, а 4-гідрокси-2,3-диметокси-6-мети5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триєніл)циклогекс-2-енон (експериментальна група) додають до кожної з 96 лунок в наступних концентраціях: 30; 10; 3; 1; 0,3; 0,1 і 0,03 мкг/мл, відповідно. Клітини інкубують при 37 °С в інкубаторі, що містить 5 % СО2, протягом 48 годин. МТТ додають у концентрації 2,5 мкг/мл в кожну лунку в темряві, реакція відбувається протягом 4 годин, з наступним додаванням 100 мл лізисного буферу для зупинки реакції. Показання планшету зчитують за допомогою програми для імуноферментного твердофазного аналізу (ELISA) на довжині хвилі 570 нм з метою визначення частоти виживання клітин. Також обчислювали показники концентрації напівпригнічення (ІС50), які наведені у табл. 1 Таблиця 1 10 чином, 4-гідрокси-2,3-диметокси-6-мети-5(3,7,11триметил-додека-2,6,10-триєніл)-циклогекс-2-енон з Antrodia camphorata можна використовувати з метою пригнічення росту клітин раку молочної залози. Приклад 3 Додаткове дослідження in vitro ад'ювантної терапії клітин раку молочної залози [0021] Експеримент також здійснювали у відповідності до програми скринінгу протипухлинних лікарських засобів Національного Інституту Раку на моделі in vitro. Клітини раку молочної залози людини, MCF-7 і MDA-MB-231, окремо вирощують у середовищі, що містить ембріональну сироватку теляти, протягом 24 годин. Проліферовані клітини промивають один раз буферним розчином натрію фосфату (БРНФ), потім обробляють 1х трипсинЕДТА та центрифугують при 1200 об/хв протягом 5 хвилин. Супернатант відкидають, і осад клітини повторно суспендують в 10 мл свіжого середовища для культивування, злегка струшуючи. Клітини розміщають на 96-лунковому планшеті після додавання 0,0017 мкг/мл таксолу та обробки таксолом протягом 72 годин. Додають 4-гідрокси-2,3диметокси-6-мети-5(3,7,11-триметил-додека2,6,10-триєніл)-циклогекс-2-енон, одержаний у Прикладі 1, відповідно, до кожної з 96 лунок в наступних концентраціях: 0 мкг/мл (контрольна група); 30; 10; 3; 1; 0,3; 0,1 і 0,03 мкг/мл (експериментальна група). Клітини інкубують при 37 °С в інкубаторі, що містить 5 % СО2, протягом 48 годин. МТТ додають у концентрації 2,5 мкг/мл в кожну лунку в темряві (реакція відбувається протягом 4 годин), з наступним додаванням 100 мл лізисного буферу для зупинки реакції. Показання планшета зчитують за допомогою програми для імуноферментного твердофазного аналізу (ELISA) на довжині хвилі 570 нм з метою визначення частоти виживання клітин. Також обчислювали показники концентрації напівпригнічення (ІС50), які наведені у табл. 2. Результати дослідження тривалості пригнічення росту клітин раку молочної залози Зразки ІС50(мкг/мл) Контрольна група (екстракт Antrodia camphorata) MCF-7 11,132 MDA-MB-231 25,812 Експериментальна група (формула 2) MCF-7 0,852 MDA-MB-231 1,031 [0020] Відповідно до результатів, наведених в табл. 1, 4-гідрокси-2,3-диметокси-6-мети-5(3,7,11триметил-додека-2,6,10-триєніл)-циклогекс-2-енон є потужним інгібітором росту лінії клітин раку молочної залози людини. Показники ІС50 4-гідрокси2,3-диметокси-6-мети-5(3,7,11-триметил-додека2,6,10-триєніл)-циклогекс-2-енону для MCF-7 і MDA-MB-231 становлять 0,852 мкг/мл і 1,031 мкг/мл, відповідно, вони є значно нижчими за показники всіх екстрактів Antrodia camphorata. Таким Таблиця 2 Результати комбінованої обробки із застосуванням таксолу in vitro для клітин раку молочної залози Зразки Контрольна група MCF-7 (0,0017 мкг/мл таксолу) MDA-MB-231 (0,0017 мкг/мл таксолу) Експериментальна група MCF-7 (0,0017 мкг/мл таксолу+ формула 2) MDA-MB-231 (0,0017 мкг/мл таксолу + формула 2) Результати Частота виживання клітин (%) 65 ±1 76+3 ІС50 (мкг/мл) 0,009 0,011 [0022] Відповідно до результатів, наведених в табл. 2, показники ІС50 4-гідрокси-2,3-диметокси-6мети-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триєніл)циклогекс-2-енону для MCF-7 і MDA-MB-231 зменшилися до 0,009 мкг/мл і 0,011 мкг/мл, відповідно, 11 після застосування таксолу. Таким чином, вказані результати підтверджують, що пригнічуючу активність 4-гідрокси-2,3-диметокси-6-мети-5(3,7,11триметил-додека-2,6,10-триєніл)-циклогекс-2енону з Antrodia camphorata можна використовувати з метою пригнічення росту клітин раку молочної залози, а при комбінованому застосуванні з таксолом виявляється краща протипухлинна синергічна активність по відношенню до пухлини. Приклад 4 Дослідження тривалості протиракової дії на рак печінки in vitro [0023| Модель скринінгу протипухлинних лікарських засобів Національного Інституту Раку адаптували з метою перевірки протиракової дії сполуки з Прикладу 1 за даним винаходом. Виділену сполуку 4-гідрокси-2,3-диметокси-6-мети5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триєніл)циклогекс-2-енон, що одержана у Прикладі 1, додають у середовище для культивування клітин раку печінки людини, Hep 3В або Hep G2, з метою дослідження виживання пухлинних клітин. [0024] Клітини раку печінки людини, Hep 3В і Hep G2, окремо вирощують у середовищі, що містить ембріональну сироватку теляти, протягом 24 годин. Проліферовані клітини промивають один раз буферним розчином натрію фосфату (БРНФ), потім обробляють їх трипсин-ЕДТА та центрифугують при 1200 проміле протягом 5 хвилин. Супернатант відкидають, і осад клітини повторно суспендують в 10 мл свіжого середовища для культивування, злегка струшуючи. Клітини розміщають на 96-лунковому планшеті. Додають етанольні екстракти Antrodia camphorata (контрольна група, всі екстракти Antrodia camphorata без очищення,) до кожної з 96 лунок в наступних концентраціях: 30; 10; 3; 1; 0,3; 0,1 і 0,03 мкг/мл, відповідно, а 4-гідрокси-2,3-диметокси-6-мети-5(3,7,11триметил-додека-2,6,10-триєніл)-циклогекс-2-енон (експериментальна група) додають до кожної з 96 лунок в наступних концентраціях: 30; 10; 3; 1; 0,3; 0,1 і 0,03 мкг/мл, відповідно. Клітини інкубують при 37 °С в інкубаторі, що містить 5 % СО2, протягом 48 годин. МТТ додають у концентрації 2,5 мкг/мл в кожну лунку в темряві, реакція відбувається протягом 4 годин, з наступним додаванням 100 мл лізисного буферу для зупинки реакції. Показання планшету зчитують за допомогою програми для імуноферментного твердофазного аналізу (ELISA) на довжині хвилі 570 нм з метою визначення частоти виживання клітин. Також обчислювали показники концентрації напівпригнічення (ІС50), які наведені у табл. 3. 97135 12 Таблиця 3 Результати дослідження тривалості пригнічення росту клітин раку печінки Зразки Контрольна група (всі екстракти Antrodia camphorata) Hep 3В Hep G2 Експериментальна група (формула 2) Hep 3В Hep G2 ІС50(мкг/мл) 5,121 18,631 0,005 1,679 [0025] Відповідно до результатів, наведених в табл. 3, 4-гідрокси-2,3-диметокси-6-мети-5(3,7,11триметил-додека-2,6,10-триєніл)-циклогекс-2-енон є потужним інгібітором росту лінії клітини раку печінки людини. Показники ІС50 4-гідрокси-2,3диметокси-6-мети-5(3,7,11-триметил-додека2,6,10-триєніл)-циклогекс-2-енону для Hep 3В і Hep G2 становлять 0,005 мкг/мл і 1,679 мкг/мл, відповідно, вони є значно нижчими за показники всіх екстрактів з Antrodia camphorata. Таким чином, 4-гідрокси-2,3-диметокси-6-мети-5(3,7,11триметил-додека-2,6,10-триєніл)-циклогекс-2-енон з Antrodia camphorata можна використовувати з метою пригнічення росту клітин раку печінки. Приклад 5 Додаткове дослідження in vitro ад'ювантної терапії клітин раку печінки [0026] Експеримент також здійснювали у відповідності до програми скринінгу протипухлинних лікарських засобів Національного Інституту Раку на моделі in vitro. Клітини раку печінки людини, Hep 3В і Hep G2 і MDA-MB-231, окремо вирощують у середовищі, що містить ембріональну сироватку теляти, протягом 24 годин. Проліферовані клітини промивають один раз буферним розчином натрію фосфату (БРНФ), потім обробляють 1х трипсинЕДТА та центрифугують при 1200 об/хв протягом 5 хвилин. Супернатант відкидають, і осад клітини повторно суспендують в 10 мл свіжого середовища для культивування, злегка струшуючи. Клітини Hep 3В обробляють 0,0043 мкг/мл ловастатину протягом 72 годин, а клітини Hep G2 обробляють з 0,0017 мкг/мл таксолу протягом 72 годин перед розміщенням на 96-лунковому планшеті. Додають 4-гідрокси-2,3-диметокси-6-мети-5(3,7,11триметил-додека-2,6,10-триєніл)-циклогекс-2-енон, одержаний у Прикладі 1, відповідно, до кожної з 96 лунок в наступних концентраціях: 0 мкг/мл (контрольна група); 30; 10; 3; 1; 0,3; 0,1 і 0,03 мкг/мл (експериментальна група). Клітини інкубують при 37 °С в інкубаторі, що містить 5 % СО2, протягом 48 годин. МТТ додають у концентрації 2,5 мкг/мл в 13 97135 кожну лунку в темряві, реакція відбувається протягом 4 годин, з наступним додаванням 100 мл лізисного буферу для зупинки реакції. Показання планшета зчитують за допомогою програми для імуноферментного твердофазного аналізу (ELISA) на довжині хвилі 570 нм з метою визначення частоти виживання клітин. Також обчислювали показники концентрації напівпригнічення (ІС50), які наведені у табл. 4. Таблиця 4 Результати обробки із застосуванням ловастатину і таксолу in vitro до клітин раку печінки Зразки Контрольна група Hep ЗВ (0,0043 мкг/мл ловастатину) Hep G2 (0,0017 мкг/мл таксолу) Експериментальна група Hep 3В (0,0043 мкг/мл ловастатину + формула 2) Hep G2 (0,0017 мкг/мл таксолу + формула 2) Результати Частота виживання клітин (%) 61+3 81±2 ІС50 (мкг/мл) 14 хвилин. Супернатант відкидають, і осад клітини повторно суспендують в 10 мл свіжого середовища для культивування, злегка струшуючи. Клітини розміщають на 96-лунковому планшеті. Додають етанольні екстракти Antrodia camphorata (контрольна група, всі екстракти Antrodia camphorata без очищення) або 4-гідрокси-2,3-диметокси-6-мети5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триєніл)циклогекс-2-енон (експериментальна група) до кожної з 96 лунок в наступних концентраціях: 30; 10; 3; 1; 0,3; 0,1 і 0,03 мкг/мл, відповідно. Клітини інкубують при 37 °С в інкубаторі, що містить 5 % СО2, протягом 48 годин. МТТ додають у концентрації 2,5 мкг/мл в кожну лунку в темряві (реакція відбувається протягом 4 годин), з наступним додаванням 100 мл лізисного буферу для зупинки реакції. Показання планшету зчитують за допомогою програми для імуноферментного твердофазного аналізу (ELISA) на довжині хвилі 570 нм з метою визначення частоти виживання клітин. Також обчислювали показники концентрації напівпригнічення (ІС50), які наведені у табл. 5. Таблиця 5 0,002 0,008 [0027] Відповідно до результатів, наведених в табл. 4, показники ІС50 4-гідрокси-2,3-диметокси-6мети-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триєніл)циклогекс-2-енону для клітин раку печінки Hep 3В і Hep G2 зменшилися до 0,002 мкг/мл і 0,008 мкг/мл, відповідно, з додатковою синергічною активністю ловастатину і таксолу. Таким чином, вказані результати підтверджують, що пригнічуючу активність 4-гідрокси-2,3-диметокси-6-мети-5(3,7,11триметил-додека-2,6,10-триєніл)-циклогекс-2енону з Antrodia camphorata можна використовувати з метою пригнічення росту клітин раку печінки, а при комбінованому застосуванні з таксолом виявляється краща протипухлинна синергічна активність по відношенню до пухлини. Приклад 6 Дослідження тривалості протиракової дії на рак передміхурової залози in vitro [0028] Модель скринінгу протипухлинних лікарських засобів Національного Інституту Раку пристосовували з метою перевірки протиракової дії сполуки з Прикладу 1 за даним винаходом. Виділену сполуку 4-гідрокси-2,3-диметокси-6-мети5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триєніл)циклогекс-2-енон, що одержана у Прикладі 1, додають у середовище для культивування клітин раку передміхурової залози людини, LNCaP або DU-145, з метою дослідження виживання пухлинних клітин. [0029] Клітини раку передміхурової залози людини, LNCaP і DU-145, окремо вирощують у середовищі, що містить ембріональну сироватку теляти, протягом 24 годин. Проліферовані клітини промивають один раз буферним розчином натрію фосфату (БРНФ), потім обробляють 1х трипсинЕДТА та центрифугують при 1200 об/хв протягом 5 Результати дослідження тривалості пригнічення росту клітин раку передміхурової залози Зразки Контрольна група (всі екстракти Antrodia camphorata) LNCaP DU-145 Експериментальна група (формула 2) LNCaP DU-145 ІС50(мкг/мл) 11,491 41,392 2,378 1,812 [0030] Відповідно до результатів, наведених в табл. 5, 4-гідрокси-2,3-диметокси-6-мети-5(3,7,11триметил-додека-2,6,10-триєніл)-циклогекс-2-енон є потужним інгібітором росту лінії клітини раку передміхурової залози людини. Показники ІС50 4гідрокси-2,3-диметокси-6-мети-5(3,7,11-триметилдодека-2,6,10-триєніл)-циклогекс-2-енону для LNCaP і DU-145 становлять 2,378 мкг/мл і 1,812 мкг/мл, відповідно, вони є значно нижчими за показники всіх екстрактів Antrodia camphorata. Таким чином, 4-гідрокси-2,3-диметокси-6-мети-5(3,7,11триметил-додека-2,6,10-триєніл)-циклогекс-2-енон можна використовувати з метою пригнічення росту клітин раку передміхурової залози. Приклад 7 Додаткове дослідження in vitro ад'ювантної терапії клітин раку передміхурової залози [0031] Експеримент також здійснювали у відповідності до програми скринінгу протипухлинних лікарських засобів Національного Інституту Раку на моделі in vitro. Клітини раку передміхурової залози людини, LNCaP і DU-145, окремо вирощують у середовищі, що містить ембріональну сироватку теляти, протягом 24 годин. Проліферовані клітини промивають один раз буферним розчином натрію фосфату (БРНФ), потім обробляють 1х 15 97135 трипсин-ЕДТА та центрифугують при 1200 проміле протягом 5 хвилин. Супернатант відкидають, і осад клітини повторно суспендують в 10 мл свіжого середовища для культивування, злегка струшуючи. Клітини LNCaP обробляють 0,0017 мкг/мл таксолу протягом 72 годин, а клітини DU-145 обробляють 0,0043 мкг/мл таксолу протягом 72 годин перед розміщенням на 96-лунковому планшеті. Додають 4-гідрокси-2,3-диметокси-6-мети-5(3,7,11триметил-додека-2,6,10-триєніл)-циклогекс-2-енон, одержаний у Прикладі 1, відповідно, до кожної з 96 лунок в наступних концентраціях: 0 мкг/мл (контрольна група); 30; 10; 3; 1; 0,3; 0,1 і 0,03 мкг/мл (експериментальна група). Клітини інкубують при 37 °С в інкубаторі, що містить 5 % СО2, протягом 48 годин. МТТ додають у концентрації 2,5 мкг/мл в кожну лунку в темряві, реакція відбувається протягом 4 годин, з наступним додаванням 100 мл лізисного буферу для зупинки реакції. Показання планшета зчитують за допомогою програми для імуноферментного твердофазного аналізу (ELISA) на довжині хвилі 570 нм з метою визначення частоти виживання клітин. Також обчислювали показники концентрації напівпригнічення (ІС50), які наведені у табл. 6. Таблиця 6 Результати комбінованої обробки із застосуванням таксолу in vitro щодо клітин раку печінки Зразки Контрольна група Hep 3B (0,0017 мкг/мл таксолу) Hep G2 (0,0043 мкг/мл таксолу) Експериментальна група Hep 3B (0,0017 мкг/мл таксолу+ формула 2) Hep G2 (0,0043 мкг/мл таксолу + формула 2) Результати Частота виживання клітин (%) 56+3 70±2 ІС50 (мкг/мл) 0,961 0,515 [0032] Відповідно до результатів, наведених в табл. 6, показники ІС50 4-гідрокси-2,3-диметокси-6мети-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триєніл)циклогекс-2-енону щодо клітин раку передміхурової залози людини MCF-7 і MDA-МВ-231 зменшилися до 0,961 мкг/мл і 0,515 мкг/мл, відповідно, після комбінованої обробки із застосуванням таксолу. Таким чином, вказані результати підтверджують, що пригнічуючу активність 4-гідрокси-2,3диметокси-6-мети-5(3,7,11-триметил-додека2,6,10-триєніл)-циклогекс-2-енону з Antrodia camphorata можна застосовувати з метою пригнічення росту клітин раку передміхурової залози, а при комбінованому застосуванні з таксолом виявляється краща протипухлинна синергічна активність по відношенню до пухлини. Приклад 8 Дослідження антиоксидантної активності in vitro [0033] Людський ліпопротеїн низької щільності 2+ (ЛПНЩ), окиснений іоном міді (Сu ), широко застосовують з метою оцінки антиоксидантної актив 16 ності зразків, що досліджуються. Антиоксиданту активність зразка визначають за допомогою оцінки вмісту дієну ЛПНЩ після окиснення і виражають в тролокс еквівалентах (Trolox), з використанням стандартної кривої, що обчислена за допомогою стандартів аналога вітаміну Е (тролоксу), розчинного у воді (показник 1 антиоксидантної активності в еквівалентах тролоксу виражений в термінах 2 мМ тролоксу). [0034] Спочатку одержують наступні розчини: подвійна порція дистильованої води (група негативного контролю), 5 мМ буферного розчину натрію фосфату (БРНФ), 1 мкм і 2 мкм розчину тролоксу (група позитивного контролю) та 40 г/мл 4гідрокси-2,3-диметокси-6-мети-5(3,7,11-триметилдодека-2,6,10-триєніл)-циклогекс-2-енону, виділеного у Прикладі 1. Концентрацію холестерину ЛПНЩ (ЛПНЩ-Х) визначають за допомогою способу ферментної реакції, де суміш розбавляють і доводять до мітки 0,1-0,25 мг/мл 5 мМ БРНФ. До кожної лунки кварцового 96-лункового планшету додають 100 мкл ЛПНЩ, далі додають вищезгаданий тролокс та виділену сполуку з Прикладу 1. 250 мкл стандартизованого окиснювача CuSO4 додають з метою індукування окиснення при кінцевій концентрації 5 мкМ в кожній лунці. Показання планшету зчитують за допомогою програми для імуноферментного твердофазногоаналізу (ELISA) на довжині хвилі 232 нм, при температурі 37 °С протягом 12 годин. Час відбору зразків - 15 хвилин. Результати наведені у табл. 7. Таблиця 7 Результати дослідження вивчення антиоксидантної активності in vitro Зразки Негативний контроль Н2О (Tlag0) Позитивний контроль 1 мкМ тролоксу 2 мкМ тролоксу Експериментальна група 40 мкг/мл, формула 2 Tlag(хв) Tlag(хв) Показники активності 185 266 344 81 159 0,48 1,00 439 208 1,30 Примітка 1: Тривалість латентної фази (Tlag, хв) визначають як перетин латентної фази з фазою розповсюдження оптичної густини на довжині хвилі 234 нм. Tlag(хв) визначають як різницю часу між Tlag і Tlag0 для кожного зразка. Примітка 2: Вважається, що сполука виявляє антиоксидантну дію, якщо показник антиоксидантної активності перевищує 0,5. [0035] Відповідно до результатів, наведених в табл. 7 показник антиоксидантної активності 4гідрокси-2,3-диметокси-6-мети-5(3,7,11-триметил 17 додека-2,6,10-триєніл)-циклогекс-2-енону становить 1,3, що є значно вищим за показник стандарту 0,5. Таким чином, сполуки за даним винаходом володіють антиоксидантною активністю, і їх можна застосовувати як добавки для оздоровчого харчу Комп’ютерна верстка Л. Литвиненко 97135 18 вання, напоїв і дієт, медичних продуктів і косметичних засобів, вони також дуже сприятливі для здоров'я людини завдяки їх здатності запобігати серцево-судинним захворюванням або мутації клітин. Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601