Антитіло проти cxcr4 для лікування інфекції віл

Реферат: Винахід належить до виділеного антитіла або його функціонального фрагмента, здатного зв'язуватися з CXCR4, а також індукувати конформаційні зміни гомодимерів CXCR4, та здатних інгібувати реплікацію первинного ізоляту ВІЛ-1 в РВМС, а також до їх застосування для лікування ВІЛ-інфекції та у фармацевтичній композиції. UA 107929 C2 (12) UA 107929 C2 UA 107929 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід належить до нових антитіл, зокрема мишачих моноклональних антитіл, химерних та гуманізованих, здатних специфічно зв'язуватися з хемокіновими рецепторами (CXCR), а також аміно- та нуклеїновокислотних послідовностей, що кодують такі антитіла. Відповідно до одного з аспектів винахід стосується нових антитіл, функціональних фрагментів чи похідних, які здатні специфічно зв'язуватися з CXCR4 та виявляють високу активність проти інфекції вірусом імунодефіциту людини (ВІЛ). Винахід також включає застосування таких антитіл, функціональних фрагментів чи похідних як лікарського засобу для превентивного та/або терапевтичного лікування ВІЛ-інфекції. Хемокіни є невеликими секретованими пептидами, які регулюють міграцію лейкоцитів за напрямком хімічного градієнта (концентрації) ліганду, відомого як хемокіновий градієнт, особливо при імунних реакціях (Zlotnick A. та співавт., 2000). Вони діляться на дві основні підродини, CC та CXC, залежно від розташування їх NH 2-кінцевих цистеїнових залишків, та зв'язуються із G-білок-зв'язаними рецепторами, дві основні підродини яких позначаються як CCR та CXCR. На сьогодні описано більше 50 людських хемокінів та 18 хемокінових рецепторів. Деякі члени сімейства хемокінових рецепторів функціонують як корецептори разом з найважливішим рецептором CD4, полегшуючи проникнення різних штамів ВІЛ типу 1 в клітини, при цьому основними корецепторами є CCR5 та CXCR4. X4-ВІЛ-1, які є тропними до T-клітин, використовують для проникнення в клітини CD4 і CXCR4, тоді як макрофаг-тропні R5 ВІЛ-1 використовують CD4 та CCR5. Штами з подвійною тропністю можуть використовувати як корецептори як CXCR4, так і CCR5. CCR3, CCR2, CCR8, CXCR6, CXCR7, CX3CR1, поміж інших хемокінових рецепторів, можуть функціонувати як корецептори для більш обмеженої підгрупи штамів ВІЛ. SDF-1, природний ліганд CXCR4, а також ліганди CCL3, CCL4, CCL4-L1 та CCL5 для CCR5 є здатними інгібувати злиття клітин та інфекцію різними штамами ВІЛ-1. Ці дані сприяли розробці терапевтичних засобів проти ВІЛ, спрямованих на хемокінові рецептори, яка привела до ® одержання дозволу на проведення випробувань маравіроку (CELSENTRI ), низькомолекулярного антагоніста CCR5, у комбінації з іншими агентами проти ВІЛ-1, на пацієнтах, інфікованих CCR5-тропним ВІЛ-1. Однак, маравірок не застосовується ні на пацієнтах, інфікованих ВІЛ-1 з подвійною тропністю, ані на пацієнтах, інфікованих CXCR4тропним ВІЛ-1 (довідник VIDAL 2009). Таким чином, у медицині існує очевидна потреба в поширенні терапії цього типу, основаної на ідентифікації антагоністів CXCR4, здатних інгібувати реплікацію X4-тропного ВІЛ, на пацієнтів, інфікованих як X4-тропним ВІЛ, так і ВІЛ з подвійною тропністю. Хемокіновий рецептор 4 (також відомий як фузин, CD184, LESTR або HUMSTR) існує у вигляді двох ізоформ, що містять 352 чи 360 амінокислот. Залишок Asn11 глікозилований, залишок Tyr21 модифікований шляхом приєднання сульфатної групи, а Cys 109 та 186 зв'язані за допомогою дисульфідного містка на позаклітинній частині рецептора (Juarez J. та співавт., 2004). Цей рецептор експресується різними видами нормальних тканин, наївними T-клітинами, що не є клітинами пам'яті, регуляторними T-клітинами, B-клітинами, нейтрофілами, ендотеліальними клітинами, первинними моноцитами, дендритними клітинами, природними клітинами-кілерами, CD34+ гематопоетичними стовбуровими клітинами і на низькому рівні в серці, товстому кишечнику, печінці, нирках та головному мозку. CXCR4 відіграє ключову роль у міграції лейкоцитів, B-клітинному лімфопоезі та мієлопоезі. Унікальним лігандом рецептора CXCR4, описаним досі, є фактор-1 стромальних клітин (SDF-1) або CXCL12. SDF-1 секретується у великій кількості в лімфовузлі, кістковому мозку, печінці, легені, і меншою мірою секретується нирками, головним мозком та шкірою. CXCR4 також розпізнається антагоністичним хемокіном, вірусним макрофагальним запальним білком II (vMIP-II), кодованим вірусом людського герпесу III типу. Як згадано раніше, рецептор CXCR4 є найважливішим корецептором для ізолятів ВІЛ-1 (X4тропних вірусів), що мають тропність до T-клітин. Виявлення протидії цьому рецептору повинно дуже ефективно інгібувати реплікацію X4-тропних вірусів. Один з аспектів даного винаходу полягає в створенні мишачих моноклональних антитіл (Mab), що інгібують реплікацію ВІЛ. Винахід охоплює CXCR4-Mab 515H7 (або його фрагменти), яке є здатним зв'язуватися з гомодимерами CXCR4 та виявляє високу активність проти ВІЛінфекції. Винахід також охоплює CXCR4-mab 301ae5 (або його фрагменти), яке є здатним зв'язуватися з гомодимерами CXCR4 і виявляє високу активність проти ВІЛ-інфекції. Несподівано авторам винаходу вдалося створити моноклональні антитіла, здатні зв'язуватися з CXCR4, а також здатні індукувати конформаційні зміни гомодимерів CXCR4 та здатні інгібувати реплікацію первинного ізоляту X4-ВІЛ-1 в PBMC. Більш конкретно, антитіла за 1 UA 107929 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 винаходом також можуть бути здатні інгібувати реплікацію первинного ізоляту X4/R5-ВІЛ-1 в PBMC. Краще, сполука CXCR4 є однією з двох ізоформ CXCR4 людини, вибраною з групи, що складається з: - ізоформи b хемокінового (мотив C-X-C) рецептора 4 (Homo sapiens), що має послідовність, яка представлена в SEQ ID No. 27 під номером доступу в Genbank NP_003458: MEGISIYTSDNYTEEMGSGDYDSMKEPCFREENANFNKIFLPTIYSIIFLTGIVGNGLVILVMGYQKK LRSMTDKYRLHLSVADLLFVITLPFWAVDAVANWYFGNFLCKAVHVIYTVNLYSSVLILAFISLDRYLAIV HATNSQRPRKLLAEKVVYVGVWIPALLLTIPDFIFANVSEADDRYICDRFYPNDLWVVVFQFQHIMVGL ILPGIVILSCYCIIISKLSHSKGHQKRKALKTTVILILAFFACWLPYYIGISIDSFILLEIIKQGCEFENTVHKW ISITEALAFFHCCLNPILYAFLGAKFKTSAQHALTSVSRGSSLKILSKGKRGGHSSVSTESESSSFHSS; - ізоформи a хемокінового (мотив C-X-C) рецептора 4 (Homo sapiens), що має послідовність, яка представлена в SEQ ID No. 28 під номером доступу в Genbank NP_001008540: MSIPLPLLQIYTSDNYTEEMGSGDYDSMKEPCFREENANFNKIFLPTIYSIIFLTGIVGNGLVILVMG YQKKLRSMTDKYRLHLSVADLLFVITLPFWAVDAVANWYFGNFLCKAVHVIYTVNLYSSVLILAFISLDR YLAIVHATNSQRPRKLLAEKVVYVGVWIPALLLTIPDFIFANVSEADDRYICDRFYPNDLWVVVFQFQHI MVGLILPGIVILSCYCIIISKLSHSKGHQKRKALKTTVILILAFFACWLPYYIGISIDSFILLEIIKQGCEFENT VHKWISITEALAFFHCCLNPILYAFLGAKFKTSAQHALTSVSRGSSLKILSKGKRGGHSSVSTESESSS FHSS; - їх альтернативного варіанта транскрипції і сплайсинга або природного варіанта, що має щонайменше 95 % ідентичності з однією із цих ізоформ b чи a, що має SEQ ID No. 27 або 28; і - їх фрагмента, який є здатним специфічно розпізнаватися їх природним лігандом фактором-1 стромальних клітин (SDF-1) - і містить краще щонайменше 100, 150 та 200 амінокислот. CXCR2 вибраний з групи, що складається з: - бета-рецептора інтерлейкіну 8 (Homo sapiens), що має послідовність, яка представлена під номером доступу в Genbank NP_001548 SEQ ID No. 29: MEDFNMESDSFEDFWKGEDLSNYSYSSTLPPFLLDAAPCEPESLEINKYFVVIIYALVFLLSLLGNS LVMLVILYSRVGRSVTDVYLLNLALADLLFALTLPIWAASKVNGWIFGTFLCKVVSLLKEVNFYSGILLLA CISVDRYLAIVHATRTLTQKRYLVKFICLSIWGLSLLLALPVLLFRRTVYSSNVSPACYEDMGNNTANW RMLLRILPQSFGFIVPLLIMLFCYGFTLRTLFKAHMGQKHRAMRVIFAVVLIFLLCWLPYNLVLLADTLM RTQVIQETCERRNHIDRALDATEILGILHSCLNPLIYAFIGQKFRHGLLKILAIHGLISKDSLPKDSRPSFV GSSSGHTSTTL; - його альтернативного варіанта транскрипції і сплайсинга або природного варіанта, що має щонайменше 95 % ідентичності з бета-рецептором інтерлейкіну 8, який має SEQ ID No. 29; і - його фрагмента, який є здатним специфічно розпізнаватися IL-8 та містить краще щонайменше 100, 150 та 200 амінокислот. Винахід також включає спосіб добору сполуки, що виявляє активність проти ВІЛ, або може бути використана для виготовлення композиції для лікування ВІЛ-інфекції, де зазначений спосіб включає стадію: У першому аспекті об'єктом даного винаходу є спосіб створення і добору антитіл за винаходом. Більш конкретно, винахід стосується способу добору антитіла проти CXCR4 або одного з його функціональних фрагментів чи похідних, здатних інгібувати реплікацію ВІЛ, який включає такі стадії: 1) скринінг створених антитіл та добір антитіл, здатних специфічно зв'язуватися з CXCR4; 2) тестування відібраних на стадії (1) антитіл та добір антитіл, здатних зв'язуватися з мононуклеарними клітинами периферичної крові (PBMC), 3) тестування відібраних на стадії (2) антитіл та добір антитіл, здатних зв'язуватися з гомодимером CXCR4, і потім 4) тестування відібраних на стадії (3) антитіл та добір антитіл, здатних інгібувати реплікацію первинних ізолятів X4-тропного ВІЛ-1 в PBMC. В іншому втіленні винахід стосується способу добору антитіла проти CXCR4 або одного з його функціональних фрагментів чи похідних, здатних інгібувати реплікацію ВІЛ, який включає такі стадії: 1) скринінг створених антитіл та добір антитіл, здатних специфічно зв'язуватися з CXCR4; 2) тестування відібраних на стадії (1) антитіл та добір антитіл, здатних зв'язуватися з мононуклеарними клітинами периферичної крові (PBMC), 3) тестування відібраних на стадії (2) антитіл та добір антитіл, здатних зв'язуватися з гомодимером CXCR4, і потім 2 UA 107929 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 4) тестування відібраних на стадії (3) антитіл та добір антитіл, здатних інгібувати реплікацію первинних ізолятів X4-тропного ВІЛ-1 в PBMC та/або здатних інгібувати реплікацію первинних ізолятів X4/R5-тропного ВІЛ-1 в PBMC. Одержання антитіл може бути реалізоване будь-яким способом, відомим фахівцю в даній області, таким як, наприклад, злиття мієломної клітини із клітинами селезінки з імунізованих мишей чи інших видів, сумісних з відібраними мієломними клітинами (Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256: 495-497). Імунізовані тварини можуть включати трансгенних мишей з локусами імуноглобулінів людини, які потім при цьому безпосередньо продукують людські антитіла. Інше можливе втілення може полягати у використанні методів фагового дисплея для скринінгу бібліотек. Стадії (1) та (2) скринінгу можуть бути реалізовані будь-яким способом або способом, відомим фахівцю в даній області. Як необмежуючі приклади можна згадати ELISA, Biacore, імуногістохімію, аналіз вестерн-блоттинг із використанням CXCR4-експресуючих екстрактів клітинних мембран або очищеного CXCR4, аналіз із застосуванням FACS та функціональний скринінг. Кращий спосіб полягає у скринінгу за допомогою FACS-аналізу на CXCR4трансфектантах (стадія 1) та принаймні на PBMC (стадія 2), щоб мати впевненість в тому, що продуковані антитіла будуть також здатні розпізнавати нативну конформацію рецептора CXCR4 на поверхні клітини-мішені. Цей спосіб буде описаний більш докладно в наведених далі прикладах. Стадія (3) скринінгу може бути реалізована будь-яким способом або способом, відомим фахівцю в даній області. Як необмежуючий, але кращий приклад, можна згадати методи вестерн-блотингу та/або імунопреципітації з використанням антитіл, що представляють інтерес, на екстракті мембран з CXCR4-трансфекованих клітин або PBMC. Стадія (4) скринінгу може бути реалізована будь-яким способом або способом, відомим фахівцю в даній області. Як необмежуючий, але кращий приклад, можна згадати спосіб, що полягає в скринінгу антитіл за їх здатністю інгібувати реплікацію первинних ізолятів X4-ВІЛ-1 та/або первинних ізолятів X4/R5-ВІЛ-1 в PBMC з використанням протоколу, описаного Holl та співавт. (J. Immunol. 2004, 173, 6274-83). У кращому втіленні стадії (3) добору способу за винаходом зазначена стадія (3) полягає в оцінці антитіл з використанням BRET-аналізу на клітинах, експресуючих CXCR4-Rluc/CXCR4YFP, та доборі антитіл, здатних інгібувати щонайменше 40 %, краще 45 %, 50 %, 55 %, і найкраще, 60 % сигналу BRET. Відомо, що технологія BRET є репрезентативною технологією димеризації білків (Angers et al., PNAS, 2000, 97: 3684-89). Технологія BRET, використовувана на стадії (3) способу, добре відома фахівцю в даній області і буде докладно розглянута в наведених далі прикладах. Більш конкретно, BRET (резонансне перенесення енергії біолюмінесценції) є безвипромінювальним перенесенням енергії між донором біолюмінесценції (люциферазою Renilla (Rluc)) та акцептором флуоресценції, мутантом GFP (зеленого флуоресцентного білка) або YFP (жовтого флуоресцентного білка). У даному випадку використовували EYFP (посилений жовтий флуоресцентний білок). Ефективність перенесення залежить від орієнтації донора і акцептора та відстані між ними. Так, перенесення енергії може відбуватися, тільки якщо ці дві молекули перебувають у безпосередній близькості (1-10 нм). Цю властивість використовують для розробки аналізів білок-білкових взаємодій. Дійсно, щоб вивчити взаємодію між двома партнерами, здійснюють злиття на генетичному рівні першого з них з люциферазою Renilla, а другого - з жовтим мутантом GFP. Злиті білки, як правило, але не обов'язково, експресують у клітинах ссавців. У присутності свого субстрату (коелентеразину), для якого мембрана є проникною, Rluc випромінює блакитне світло. Якщо мутант GFP розташований відносно Rluc на відстані менше 10 нм, може відбутися перенесення енергії, і можна зареєструвати додатковий жовтий сигнал. Сигнал BRET вимірюють як співвідношення інтенсивності світла, випроміненого акцептором, та інтенсивності світла, випроміненого донором. Таким чином, сигнал BRET буде зростати в міру того, як ці два злиті білки будуть зближатися один з одним, або якщо конформаційна зміна зблизить Rluc та мутант GFP. Якщо BRET-аналіз застосовується в кращому втіленні, то для вимірювання конформаційних змін димерів CXCR4 може бути використаний будь-який інший метод, відомий фахівцю в даній області. Можна згадати, без обмеження, такі технології: FRET (резонансне перенесення енергії флуоресценції), HTRF (гомогенна флуоресценцію з розрізненням за часом), FLIM (візуалізуюча мікроскопія часу життя флуоресценції) або SW-FCCS (однохвильова флуоресцентна кроскореляційна спектроскопія). 60 3 UA 107929 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Можна також використовувати інші класичні технології, такі як ко-імунопреципітація, технологія AlphaScreen, хімічне перехресне зшивання, двогібридна система, афінна хроматографія, ELISA або дальній вестерн-блотинг. У конкретному аспекті способу за винаходом стадія (3) полягає в оцінці антитіл з використанням BRET-аналізу на клітинах, експресуючих одночасно обидві конструкції CXCR4Rluc/CXCR4-YFP, та доборі антитіл, здатних інгібувати щонайменше 40 % сигналу BRET. У другому аспекті об'єктом винаходу є виділені антитіла або один з їх функціональних фрагментів або одне з їх похідних, причому одержані зазначеним способом. Зазначені антитіла або один з їх функціональних фрагментів або одне з їх похідних є здатними специфічно зв'язуватися з людським CXCR4, причому зазначені антитіла також здатні індукувати конформаційні зміни гомодимерів CXCR4. З літератури відомо, що CXCR4-Mab типу, наприклад, клону A120, здатні інгібувати проникнення лабораторного штаму ВІЛ-1 (X4HIV-1 NL4-3) в PBMC (Tanaka R. et al., J. Virol., 2001, 75, 11534-11543). Крім того, також відомо, що CXCR4-Mab здатні інгібувати первинні ізоляти X4ВІЛ-1 у клітинних лініях, експресуючих CXCR4. З іншого боку, ніколи не описувалося антитіло, здатне інгібувати такий вірус в його природному оточенні, тобто не тільки лабораторні віруси або клітинні лінії. У будь-якому випадку, новий та неочевидний аспект винаходу полягає в тому, що CXCR4-Mab здатні інгібувати первинні ізоляти X4-ВІЛ-1 в PBMC. Вираз "функціональні фрагменти і похідні" буде визначений докладно в описі даного винаходу пізніше. Тут має бути зрозуміло, що винахід не стосується антитіл у природній формі, інакше кажучи, що вони не перебувають в їх природному оточенні, але що вони можуть бути виділені або одержані очищенням із природних джерел, або ж одержані з використанням генетичної рекомбінації, або шляхом хімічного синтезу, і що вони можуть, крім того, містити неприродні амінокислоти, як буде описано далі. Більш конкретно, згідно з іншим аспектом винаходу, заявлені виділені антитіла або один з їх функціональних фрагментів або одне з їх похідних, причому зазначені антитіла містять щонайменше одну ділянку, що визначає комплементарність (CDR), вибрану з CDR, які містять амінокислотну послідовність SEQ ID No. 1-6 та 30-33, як визначено за системою нумерації IMGT (база даних з імуногенетики (від англ. ImMunoGeneTics database)). Згідно з першим аспектом винахід стосується виділеного антитіла або його функціонального фрагмента чи похідного, що містить щонайменше одну CDR, вибрану з CDR з послідовностями SEQ ID No. 1-6, як визначено за системою нумерації IMGT, або щонайменше одну CDR, послідовність якої ідентична щонайменше на 80 %, краще на 85 %, 90 %, 95 % та 98 %, після оптимального вирівнювання, з послідовностями SEQ ID No. 1-6. Згідно із другим аспектом винахід стосується виділеного антитіла або його функціонального фрагмента чи похідного, що містить щонайменше одну CDR, вибрану з CDR з послідовностями SEQ ID No. 1, 2 та 30-33, як визначено за системою нумерації IMGT, або щонайменше одну CDR, послідовність якої ідентична щонайменше на 80 %, краще на 85 %, 90 %, 95 % та 98 %, після оптимального вирівнювання, з послідовностями SEQ ID No. 1, 2 та 30-33. "Функціональний фрагмент" антитіла означає, зокрема, такий фрагмент антитіла, як фрагменти Fv, scFv (sc = одноланцюговий), Fab, F(ab') 2, Fab', scFv-Fc або діатіла, або будь-який фрагмент, період напіввиведення якого є збільшеним. Такі функціональні фрагменти будуть викладені докладно в описі даного винаходу пізніше. "Дериватизована сполука" або "похідне" антитіла означає, зокрема, зв'язуючий білок, що складається з пептидного каркаса та щонайменше одного з CDR вихідного антитіла для збереження його здатності розпізнавати CXCR4. Такі дериватизовані сполуки, добре відомі фахівцю в даній області, будуть викладені більш докладно в описі даного винаходу пізніше. Ще краще, винахід включає антитіла, їх дериватизовані сполуки або їх функціональні фрагменти за даним винаходом, особливо химерні або гуманізовані, одержані з використанням генетичної рекомбінації або хімічного синтезу. Відповідно до кращого втілення антитіло за винаходом або його дериватизовані сполуки чи функціональні фрагменти характеризуються тим, що складаються з моноклонального антитіла. Під терміном "моноклональне антитіло" розуміється антитіло, що походить з майже гомогенної популяції антитіл. Більш конкретно, індивідуальні антитіла популяції є ідентичними за винятком нечисленних можливих природних мутацій, які можуть бути виявлені з мінімальним відносним вмістом. Інакше кажучи, моноклональне антитіло є гомогенним антитілом, яке є результатом росту одного клітинного клону (наприклад, гібридоми, еукаріотичної клітини хазяїна, трансфекованої молекулою ДНК, що кодує гомогенне антитіло, прокаріотичної клітини хазяїна, трансфекованої молекулою ДНК, що кодує гомогенне антитіло, і т.д.), і, як правило, 4 UA 107929 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 характеризується наявністю важких ланцюгів одного й тільки одного класу і підкласу та легких ланцюгів тільки одного типу. Моноклональні антитіла є високоспецифічними і спрямовані проти індивідуального антигену. До того ж, на противагу препаратам поліклональних антитіл, які звичайно включають різні антитіла, спрямовані проти різних детермінант або епітопів, кожне моноклональне антитіло спрямоване проти єдиного епітопа даного антигену. Більш конкретно, відповідно до першого кращого втілення винаходу антитіло або його дериватизовані сполуки чи функціональні фрагменти характеризуються тим, що включають легкий ланцюг, який містить щонайменше одну CDR, вибрану з CDR-L1, CDR-L2 і CDR-L3, де: - CDR-L1 містить амінокислотну послідовність SEQ ID No. 1, - CDR-L2 містить амінокислотну послідовність SEQ ID No. 2, - CDR-L3 містить амінокислотну послідовність SEQ ID No. 3. Відповідно до іншого втілення антитіла за винаходом або одна з їх дериватизованих сполук чи один з їх функціональних фрагментів характеризуються тим, що вони включають легкий ланцюг, який містить щонайменше одну із трьох CDR з послідовностями SEQ ID No. 1, 2 чи 3, або щонайменше одну послідовність, ідентичну щонайменше на 80 %, краще на 85 %, 90 %, 95 % та 98 %, після оптимального вирівнювання, з послідовностями SEQ ID No. 1, 2 чи 3. Антитіло за винаходом або один з його функціональних фрагментів чи одне з його похідних також характеризується тим, що включає легкий ланцюг, який містить CDR-L1, CDR-L2 і CDRL3, де CDR-L1 містить амінокислотну послідовність SEQ ID No. 1, CDR-L2 містить амінокислотну послідовність SEQ ID No. 2 і CDR-L3 містить амінокислотну послідовність SEQ ID No. 3. В іншому втіленні антитіло за винаходом або один з його функціональних фрагментів чи одне з його похідних характеризується тим, що включає легкий ланцюг з послідовністю, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID No. 7, або щонайменше одну послідовність, ідентичну щонайменше на 80 %, краще на 85 %, 90 %, 95 % та 98 %, після оптимального вирівнювання, з послідовностями SEQ ID No. 7. У відповідності із другим кращим втіленням винаходу антитіло або його дериватизовані сполуки чи функціональні фрагменти характеризуються тим, що включають легкий ланцюг, який містить щонайменше одну CDR, вибрану з CDR-L1, CDR-L2 і CDR-L3, де: - CDR-L1 містить амінокислотну послідовність SEQ ID No. 1, - CDR-L2 містить амінокислотну послідовність SEQ ID No. 2, - CDR-L3 містить амінокислотну послідовність SEQ ID No. 30. Відповідно до іншого втілення антитіла за винаходом або одна з їх дериватизованих сполук чи один з їх функціональних фрагментів характеризуються тим, що вони включають легкий ланцюг, який містить щонайменше одну із трьох CDR з послідовностями SEQ ID No. 1, 2 чи 30, або щонайменше одну послідовність, ідентичну щонайменше на 80 %, краще на 85 %, 90 %, 95 % та 98 %, після оптимального вирівнювання, з послідовностями SEQ ID No. 1, 2 чи 30. Антитіло за винаходом або один з його функціональних фрагментів чи одне з його похідних також характеризується тим, що включає легкий ланцюг, який містить CDR-L1, CDR-L2 і CDRL3, де CDR-L1 містить амінокислотну послідовність SEQ ID No. 1, CDR-L2 містить амінокислотну послідовність SEQ ID No. 2 і CDR-L3 містить амінокислотну послідовність SEQ ID No. 30. В іншому втіленні антитіло за винаходом або один з його функціональних фрагментів чи одне з його похідних характеризується тим, що включає легкий ланцюг з послідовністю, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID No. 34, або щонайменше одну послідовність, ідентичну щонайменше на 80 %, краще на 85 %, 90 %, 95 % та 98 %, після оптимального вирівнювання, з послідовностями SEQ ID No. 34. Більш конкретно, антитіла за винаходом або одна з їх дериватизованих сполук чи один з їх функціональних фрагментів характеризуються тим, що вони включають важкий ланцюг, який містить щонайменше одну CDR, вибрану з CDR-H1, CDR-H2 і CDR-H3, де: - CDR-H1 містить амінокислотну послідовність SEQ ID No. 4, - CDR-H2 містить амінокислотну послідовність SEQ ID No. 5, - CDR-H3 містить амінокислотну послідовність SEQ ID No. 6. Відповідно до іншого втілення антитіла за винаходом або одна з їх дериватизованих сполук чи один з їх функціональних фрагментів характеризуються тим, що вони включають важкий ланцюг, який містить щонайменше одну із трьох CDR з послідовностями SEQ ID No. 4, 5 чи 6, або щонайменше одну послідовність, ідентичну щонайменше на 80 %, краще на 85 %, 90 %, 95 % та 98 %, після оптимального вирівнювання, з послідовностями SEQ ID No. 4, 5 чи 6. Відповідно до іншого конкретного втілення антитіла або одна з їх дериватизованих сполук чи один з їх функціональних фрагментів характеризуються тим, що вони включають важкий ланцюг, який містить CDR-H1, CDR-H2 і CDR-H3, де CDR-H1 містить амінокислотну послідовність SEQ ID No. 4, CDR-H2 містить амінокислотну послідовність SEQ ID No. 5, і CDR 5 UA 107929 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 H3 містить амінокислотну послідовність SEQ ID No. 6. В іншому втіленні антитіло за винаходом або один з його функціональних фрагментів чи одне з його похідних характеризується тим, що включає важкий ланцюг з послідовністю, яка містить амінокислотну послідовність SEQ ID No. 8, або щонайменше одну послідовність, ідентичну щонайменше на 80 %, краще на 85 %, 90 %, 95 % та 98 %, після оптимального вирівнювання, з послідовностями SEQ ID No. 8. Більш конкретно, антитіла за винаходом або одна з їх дериватизованих сполук чи один з їх функціональних фрагментів характеризуються тим, що вони включають важкий ланцюг, який містить щонайменше одну CDR, вибрану з CDR-H1, CDR-H2 і CDR-H3, де: - CDR-H1 містить амінокислотну послідовність SEQ ID No. 31, - CDR-H2 містить амінокислотну послідовність SEQ ID No. 32, - CDR-H3 містить амінокислотну послідовність SEQ ID No. 33. Відповідно до іншого втілення антитіла за винаходом або одна з їх дериватизованих сполук чи один з їх функціональних фрагментів характеризуються тим, що вони включають важкий ланцюг, який містить щонайменше одну із трьох CDR з послідовностями SEQ ID No. 31, 32 чи 33, або щонайменше одну послідовність, ідентичну щонайменше на 80 %, краще на 85 %, 90 %, 95 % та 98 %, після оптимального вирівнювання, з послідовностями SEQ ID No. 31, 32 чи 33. Відповідно до іншого конкретного втілення антитіла або одна з їх дериватизованих сполук чи один з їх функціональних фрагментів характеризуються тим, що вони включають важкий ланцюг, який містить CDR-H1, CDR-H2 і CDR-H3, де CDR-H1 містить амінокислотну послідовність SEQ ID No. 31, CDR-H2 містить амінокислотну послідовність SEQ ID No. 32 і CDRH3 містить амінокислотну послідовність SEQ ID No. 33. В іншому втіленні антитіло за винаходом або один з його функціональних фрагментів чи одне з його похідних характеризується тим, що включає важкий ланцюг з послідовністю, яка містить амінокислотну послідовність SEQ ID No. 35, або щонайменше одну послідовність, ідентичну щонайменше на 80 %, краще на 85 %, 90 %, 95 % та 98 %, після оптимального вирівнювання, з послідовністю SEQ ID No. 35. Антитіло за винаходом або один з його функціональних фрагментів чи одне з його похідних характеризується тим, що включає легкий ланцюг, який містить CDR-L1, CDR-L2 і CDR-L3, що містять відповідно амінокислотну послідовність SEQ ID No. 1, 2 та 3; і важкий ланцюг, який містить CDR-H1, CDR-H2 і CDR-H3, що містять відповідно амінокислотну послідовність SEQ ID No. 4, 5 та 6. Нарешті, антитіло за винаходом або один з його функціональних фрагментів чи одне з його похідних також може характеризуватися тим, що включає легкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність SEQ ID No. 7, та важкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність SEQ ID No. 8. Антитіло за винаходом або один з його функціональних фрагментів чи одне з його похідних характеризується тим, що включає легкий ланцюг, який містить CDR-L1, CDR-L2 і CDR-L3, що містять відповідно амінокислотну послідовність SEQ ID No. 1, 2 та 30; і важкий ланцюг, який містить CDR-H1, CDR-H2 і CDR-H3, що містять відповідно амінокислотну послідовність SEQ ID No. 31, 32 та 33. І нарешті, антитіло за винаходом або один з його функціональних фрагментів чи одне з його похідних також може характеризуватися тим, що включає легкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність SEQ ID No. 34, та важкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність SEQ ID No. 35. У даному описі терміни "поліпептиди", "поліпептидні послідовності", "пептиди" та "білки, приєднані до сполук, що є антитілами, або до їх послідовностей", є взаємозамінними. Тут має бути зрозуміло, що винахід не стосується антитіл у природній формі, тобто їх не беруть у своєму природному оточенні, а виділяють або одержують очищенням із природних джерел або одержують методом генетичної рекомбінації або хімічним синтезом, і тому вони можуть нести неприродні амінокислоти, які будуть описані нижче. У першому втіленні ділянка, що визначає комплементарність, або CDR означає гіперваріабельні ділянки важких та легких ланцюгів імуноглобулінів згідно з визначенням за Kabat, як визначено Kabat та співавт. (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, th 5 Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991 та пізніші видання). Існують три CDR важкого ланцюга і три CDR легкого ланцюга. Тут термін "CDR" в однині та множині використовуються для вказання, залежно від випадку, однієї чи більше або навіть усіх ділянок, що містять більшість амінокислотних залишків, відповідальних за афінність зв'язування антитіла з антигеном або епітопом, який він розпізнає. У другому втіленні під CDR-ділянками або просто CDR мається на увазі вказівка на 6 UA 107929 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гіперваріабельні ділянки важких та легких ланцюгів імуноглобулінів, які визначені за IMGT. Унікальна система нумерації за IMGT була встановлена для порівняння варіабельних доменів будь-яких антигенних рецепторів, типів ланцюгів або різновидів (Lefranc M.-P., Immunology Today, 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommié, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)). Згідно з унікальною системою нумерації IMGT консервативні амінокислоти завжди мають те саме положення, наприклад, цистеїн 23 (1-й CYS), триптофан 41 (КОНСЕРВАТИВНИЙ TRP), гідрофобна амінокислота 89, цистеїн 104 (2-й CYS), фенілаланін або триптофан 118 (J-PHE або J-TRP). Унікальна система нумерації за IMGT забезпечує стандартизоване визначення границь каркасних областей (FR) (FR1-IMGT: положення 1-26, FR2-IMGT: 39-55, FR3-IMGT: 66-104 та FR4-IMGT: 118-128) та ділянок, що визначають комплементарність: CDR1-IMGT: 27-38, CDR2-IMGT: 56-65 та CDR3-IMGT: 105-117. Оскільки розриви є незайнятими положеннями, довжини CDR-IMGT (показані в дужках та розділені крапками, наприклад [8.8.13]) стають важливою інформацією. Унікальна система нумерації за IMGT використовується для двовимірних (2D) графічних зображень, називаних IMGT Colliers de Perles (перлове намисто) (Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857883 (2002) / Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)), та для тривимірних (3D) структур у базі даних IMGT/3Dstructure-DB (Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids Res., 32, D208-D210 (2004)). Існують три CDR у важкому ланцюзі і 3 CDR у легкому ланцюзі. Термін CDR або CDR у множині використовується тут для того, щоб указати, згідно з даним випадком, одну із цих ділянок або декілька або навіть усі ці ділянки, що містять більшість амінокислотних залишків, відповідальних за афінне зв'язування антитіла з антигеном або епітопом, який він розпізнає. Для більшої ясності необхідно розуміти, що в наведеному далі описі, і більш конкретно в Таблицях 2 та 3, CDR будуть визначені згідно із системою нумерації за IMGT та згідно із системою нумерації за Kabat. Система нумерації за IMGT визначає CDR відповідно до системи IMGT, яка визначена вище, у тої же час система нумерації за Kabat визначає CDR відповідно до системи за Kabat, яка визначена вище. Більш конкретно, стосовно антитіла, позначеного як 515H7, CDR-L1 складається з SEQ ID No. 1 згідно із системою нумерації за IMGT та з SEQ ID No. 9 згідно із системою нумерації за Kabat. Що стосується CDR-L2, то вона складається з SEQ ID No. 2 згідно із системою нумерації за IMGT та з SEQ ID No. 10 згідно із системою нумерації за Kabat. CDR-L3 складається із SEQ ID No. 3 згідно з кожною із двох цих систем нумерації. Що стосується важкого ланцюга, то CDRH1 складається з SEQ ID No. 4 згідно із системою нумерації за IMGT та з SEQ ID No. 11 згідно із системою нумерації за Kabat. CDR-H2 складається з SEQ ID No. 5 згідно із системою нумерації за IMGT та з SEQ ID No. 12 згідно із системою нумерації за Kabat. І нарешті, CDR-H3 складається з SEQ ID No. 6 згідно із системою нумерації за IMGT, тоді як згідно із системою нумерації за Kabat він складається з SEQ ID No. 13. Далі, що стосується антитіла, позначеного як 301ae5, то CDR-L1 складається з SEQ ID No. 1 згідно із системою нумерації за IMGT та з SEQ ID No. 9 згідно із системою нумерації за Kabat. Що стосується CDR-L2, то він складається з SEQ ID No. 2 згідно із системою нумерації за IMGT та з SEQ ID No. 36 згідно із системою нумерації за Kabat. CDR-L3 складається з SEQ ID No. 30 згідно із системою нумерації за IMGT та з SEQ ID No. 37 згідно із системою нумерації за Kabat. Що стосується важкого ланцюга, то CDR-H1 складається з SEQ ID No. 31 згідно із системою нумерації за IMGT та з SEQ ID No. 38 згідно із системою нумерації за Kabat. CDR-H2 складається з SEQ ID No. 32 згідно із системою нумерації за IMGT та з SEQ ID No. 39 згідно із системою нумерації за Kabat. І нарешті, CDR-H3 складається з SEQ ID No. 33 згідно із системою нумерації за IMGT, тоді як згідно із системою нумерації за Kabat він складається з SEQ ID No. 40. "Відсоток ідентичності" між двома послідовностями нуклеїнових кислот або амінокислот у контексті даного винаходу означає відсоток ідентичних нуклеотидів або амінокислотних залишків між двома цими порівнюваними послідовностями, отриманий після оптимального вирівнювання, причому цей відсоток є чисто статистичним, а відмінності між двома цими послідовностями розподілені випадково по всій їх довжині. Порівняння двох нуклеїновокислотних або амінокислотних послідовностей традиційно проводять, порівнюючи ці послідовності після їх оптимального вирівнювання, причому зазначене порівняння може бути проведене по сегментах або з використанням "вікна порівняння". Оптимальне вирівнювання послідовностей для їх порівняння може бути здійснене, на додаток до порівняння вручну, із застосуванням алгоритму локальної гомології Smith та Waterman (1981) (Ad. App. Math. 2: 482), 7 UA 107929 C2 5 10 15 20 25 30 35 із застосуванням алгоритму локальної гомології Neddleman та Wunsch (1970) (J. Moi. Biol., 48: 443), із застосуванням методу пошуку подібності Pearson та Lipman (1988) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444)або із застосуванням комп'ютерного програмного забезпечення, що використовує ці алгоритми (GAP, BESTFIT, FASTA та TFASTA у пакеті програм Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, або навіть із застосуванням для такого порівняння програмного забезпечення BLAST N або BLAST P). Відсоток ідентичності між двома нуклеїновокислотними або амінокислотними послідовностями визначають шляхом порівняння цих двох послідовностей, оптимально вирівняних, при цьому порівнювана нуклеїновокислотна або амінокислотна послідовність може мати вставки або делеції в порівнянні з послідовністю порівняння, для здійснення оптимального вирівнювання між двома цими послідовностями. Відсоток ідентичності розраховують, визначаючи число ідентичних положень, у яких нуклеотидний або амінокислотний залишок буде однаковим у двох цих послідовностях, краще у двох повних послідовностях, шляхом ділення цього числа ідентичних положень на загальне число положень у вікні вирівнювання та множення отриманого результату на 100 для одержання відсотка ідентичності між двома цими послідовностями. Наприклад, можна використовувати програму BLAST "BLAST 2 sequences" (Tatusova et al., "Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol. 1999, Lett. 174: 247-250), доступну на сайті http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, з параметрами за замовчуванням (зокрема, що стосується параметрів "штраф за створення розриву" ("gap open penalty"): 5, та "штраф за довжину розриву" ("extension gap penalty": 2; при цьому вибраною матрицею є, наприклад матриця "BLOSUM 62", запропонована цією програмою); відсоток ідентичності між обома порівнюваними послідовностями обчислюється безпосередньо цією програмою. Що стосується амінокислотної послідовності, яка демонструє щонайменше 80 %, краще 85 %, 90 %, 95 % та 98 % ідентичності з амінокислотною послідовністю порівняння, кращі приклади включають послідовності, що містять послідовність порівняння, деякі модифікації, а саме, делецію, вставку або заміну щонайменше однієї амінокислоти, укорочення або подовження. У випадку заміни однієї або більш ніж однієї розташованих одна за одною або не розташованих одна за одною амінокислот кращими є заміни, у яких замінні амінокислоти замінені на "еквівалентні" амінокислоти. Тут вираз "еквівалентні амінокислоти" означає вказівку на будь-які амінокислоти, що можуть заміняти одну із структурних амінокислот, однак без зміни біологічних активностей відповідних антитіл, і конкретні приклади таких наведені нижче. Ці еквівалентні амінокислоти можна визначити, покладаючись або на їх структурну гомологію з амінокислотами, які вони заміняють, або на результати порівняльних тестувань біологічної активності між різними антитілами, що можуть бути проведені. Як необмежуючий приклад в наведеній нижче Таблиці 1 підсумовані можливі заміни, які можуть бути проведені без великої зміни біологічної активності відповідного модифікованого антитіла, у тих же умовах природно можливі зворотні заміни. 40 Таблиця 1 Вихідний залишок Ala (A) Arg (R) Asn (N) Asp (D) Cys (C) Gln (Q) Glu (G) Gly (G) His (H) Ile (I) Leu (L) Lys (K) Met (M) Phe (F) Pro (P) Ser (S) Thr (T) Заміна (заміни) Val, Gly, Pro Lys, His Gln Glu Ser Asn Asp Ala Arg Leu Ile, Val, Met Arg Leu Tyr Ala Thr, Cys Ser 8 UA 107929 C2 Таблиця 1 Trp (W) Tyr (Y) Val (V) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Tyr Phe, Trp Leu, Ala У конкретному втіленні даний винахід стосується мишачих антитіл або їх дериватизованих сполук чи функціональних фрагментів. Як показано вище, винахід також стосується будь-якої сполуки, що походить з антитіл, описаних у даному винаході. Більш конкретно, антитіло за винаходом або його дериватизовані сполуки чи функціональні фрагменти характеризуються тим, що зазначена дериватизована сполука складається із зв'язуючого білка, що містить пептидний каркас, на який прищеплена щонайменше одна CDR таким чином, що при цьому зберігаються всі властивості розпізнавання, або частина властивостей розпізнавання, обумовлених паратопом вихідного антитіла. Одна чи більше послідовностей з послідовностей CDR, описаних у даному винаході, також може бути представлена на різних імуноглобулінових білкових каркасах. У цьому випадку білкова послідовність уможливлює відтворення пептидного кістяка, сприятливого для фолдингу привитих CDR, дозволяючи їх паратопам зберігати антиген-розпізнавальні властивості. Як правило, фахівцю в даній області відомо, як визначити тип білкового каркаса, на який можна прищепити щонайменше одну з CDR, що походять з вихідного антитіла. Більш конкретно, відомо, що для того, щоб бути вибраними, такі каркаси повинні відповідати величезній кількості критеріїв, які наведені нижче (Skerra A., J. Mol. Recogn., 2000, 13: 167-187): - гарна філогенетична схоронність; - відома просторова структура (наприклад, визначена з використанням кристалографії, спектроскопії ЯМР або будь-якого іншого методу, відомого фахівцю в даній області); - невеликий розмір; - незначна кількість або відсутність посттранскрипційних модифікацій; та/або - легкість в одержанні, експресії та очищенні. Вихідним матеріалом таких білкових каркасів можуть бути, без обмеження, структури, вибрані з: фібронектину і краще домену 10 фібронектину III типу, ліпокаліну, антикаліну (Skerra A., J. Biotechnol., 2001, 74(4): 257-75), білка Z, який походить з домену B білка A Staphylococcus aureus, тіоредоксину A або білків з повторюваним мотивом, таким як "анкіриновий повтор" (Kohl et al., PNAS, 2003, vol. 100, No. 4, 1700-1705), "повтор armadillo", "багатий лейцином повтор" та "тетратрикопептидний повтор". Також слід згадати каркаси, що походять з токсинів, таких як, наприклад, токсини зі скорпіонів, комах, рослин, молюсків і т.д., та білкових інгібіторів нейронної синтази NO (PIN). Прикладом таких гібридних конструкцій, жодним чином їх не обмежуючим, є вставка CDR-H1 (важкий ланцюг) антитіла проти CD4, а саме, 13B8.2, в одну з петель PIN, при цьому одержаний у такий спосіб новий зв'язуючий білок зберігає ті ж зв'язувальні властивості, що й вихідне антитіло (Bes et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2006, 343(1), 334-344). Чисто для ілюстративної мети також можна згадати прищеплювання CDR-H3 (важкий ланцюг) VHH антитіла проти лізоциму на одну з петель неокарциностатину (Nicaise et al., Protein Science, 2004, 13(7): 1882-1891). І нарешті, як описано вище, такі пептидні каркаси можуть містити щонайменше одну з CDR, які походять з вихідного антитіла. Краще, але це не є обов'язковою вимогою, фахівець у даній області вибере щонайменше одну CDR з важкого ланцюга, причому відомо, що остання у першу чергу відповідає за специфічність антитіла. Вибір однієї чи більше релевантних CDR очевидний фахівцю в даній області, який потім буде вибирати відомі придатні методи (Bes et al., FEBS letters, 508, 2001, 67-74). Конкретний аспект даного винаходу стосується способу добору сполуки, що є похідним антитіла за винаходом, причому зазначена дериватизована сполука є здатною інгібувати in vitro та/або in vivo проникнення ВІЛ у клітину і зазначена дериватизована сполука містить пептидний каркас, на який прищеплена щонайменше одна CDR антитіла, який включає такі стадії: a) приведення в контакт in vitro сполуки, до складу якої входить пептидний каркас, на який прищеплена щонайменше одна CDR антитіла, з біологічним зразком, що містить ВІЛ 1 типу та PBMC; і b) добір зазначеної сполуки, якщо зазначена сполука є здатною інгібувати реплікацію ВІЛ-1, і де зазначена щонайменше одна прищеплена CDR вибрана з таких CDR з послідовністю SEQ ID No. 1-6 та 30-33 або з послідовністю, ідентичною щонайменше на 80 %, краще на 85 %, 9 UA 107929 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 90 %, 95 % та 98 %, після оптимального вирівнювання, з послідовністю SEQ ID No. 1-6 та 30-33. Згідно із кращим втіленням даний спосіб може включати на стадії (a) приведення в контакт in vitro сполуки, що містить пептидний каркас, на який прищеплені щонайменше дві або три CDR антитіла. Згідно із ще одним кращим втіленням цього способу, пептидний каркас вибраний з каркасів або зв'язуючих білків, структури яких згадані вище. Очевидно, що ці приклади жодним чином не є обмежуючими, і будь-яку іншу структуру, відому або очевидну фахівцю в даній області, слід розглядати як захищену даною заявкою. Таким чином, даний винахід стосується антитіла або його дериватизованих сполук або функціональних фрагментів, де пептидний каркас вибраний з білків, які a) характеризуються гарною філогенетичною схоронністю, b) жорсткою архітектурою, c) добре відомою просторовою (3-D) молекулярною організацією, d) невеликим розміром та/або e) містять ділянки, які можуть бути модифіковані в результаті делеції та/або вставки без зміни стабільності. Відповідно до кращого втілення антитіло за винаходом або його дериватизовані сполуки чи функціональні фрагменти характеризуються тим, що зазначений пептидний каркас вибраний з 1) каркасів, які походять з фібронектину, краще, домену 10 фібронектину 3 типу, ліпокаліну, антикаліну, білка Z, що походить з домену B білка A Staphylococcus aureus, тіоредоксину A, або 2) білків з повторюваним мотивом, таким як "анкіриновий повтор" (Kohl et al., PNAS, 2003, vol. 100, No. 4, 1700-1705), "повтор armadillo", "багатий лейцином повтор" та "тетратрикопептидний повтор", або 3) білкових інгібіторів нейронної синтази NO (PIN). Інший аспект винаходу стосується функціональних фрагментів антитіла, описаного вище. Більш конкретно, винахід стосується антитіла або його дериватизованих сполук або функціональних фрагментів, де зазначений функціональний фрагмент вибраний із фрагментів Fv, Fab,F(ab')2, Fab', scFv, scFv-Fc та діател або будь-якого фрагмента, період напіввиведення якого є збільшеним, такого як пегіловані фрагменти. Такі функціональні фрагменти антитіла за винаходом складаються, наприклад, із фрагментів Fv, scFv (sc = одноланцюговий), Fab, F(ab') 2, Fab', scFv-Fc або діател чи будь-якого фрагмента, період напіввиведення якого є збільшеним шляхом хімічної модифікації, наприклад, приєднання поліалкіленгліколю, такого як поліетиленгліколь (пегілування) (пегіловані фрагменти позначаються як Fv-ПЕГ, scFv-ПЕГ, Fab-ПЕГ, F(ab') 2-ПЕГ та Fab'-ПЕГ), або шляхом інкорпорування в ліпосому, мікросфери або PLGA (співполімер молочної та гліколевої кислот), причому зазначені фрагменти містять щонайменше одну з характерних CDR за винаходом, яка звичайно особливо здатна до виявлення активності, хоча б часткової, антитіла, з якого вона походить. Краще, зазначені функціональні фрагменти будуть містити або включати часткову послідовність варіабельної області важкого або легкого ланцюга антитіла, з якого вони походять, причому зазначена часткова послідовність є достатньою для збереження тієї ж специфічності зв'язування, що й у антитіла, з якого вона походить, та достатньої афінності, краще щонайменше рівної 1/100, ще краще, щонайменше 1/10 від афінності антитіла, з якого вона походить. Такий функціональний фрагмент буде включати щонайменше п'ять амінокислот, краще 6, 7, 8, 10, 15, 25, 50 або 100 розташованих одна за одною амінокислот з послідовності антитіла, з якого він походить. Краще, ці функціональні фрагменти будуть фрагментами типу Fv, scFv, Fab, F(ab') 2, F(ab'), scFv-Fc або діатілами, які звичайно мають ту ж специфічність зв'язування, що й антитіло, з якого вони походять. Відповідно до даного винаходу фрагменти антитіла за винаходом можуть бути одержані з описаних вище антитіл такими способами, як переварювання ферментами, такими як пепсин або папаїн, та/або шляхом розщеплення дисульфідних містків в результаті хімічного відновлення. Фрагменти антитіл також можуть бути одержані методами генетичної рекомбінації, також відомими фахівцю в даній області, або навіть за допомогою пептидного синтезу, наприклад із застосуванням автоматичних пептидних синтезаторів, наприклад, таких, що випускаються Applied Biosystems, і т.д. Для більшої ясності в наведеній нижче Таблиці 2 підсумовані різні амінокислотні послідовності, що відповідають антитілам за винаходом. 55 10 UA 107929 C2 Таблиця 2 (де Mu = мишаче антитіло) Антитіло Нумерація CDR IMGT Важкий ланцюг CDR-H1 CDR-H2 CDR-H3 CDR-L1 CDR-L2 CDR-L3 515H7 Kabat Легкий ланцюг CDR-L1 CDR-L2 CDR-L3 CDR-H1 CDR-H2 CDR-H3 Варіабельний домен Mu Варіабельний домен Mu IMGT Kabat CDR-H1 CDR-H2 CDR-H3 CDR-L1 CDR-L2 CDR-L3 CDR-H1 CDR-H2 CDR-H3 Варіабельний домен Mu Варіабельний домен Mu 5 10 15 20 7 8 CDR-L1 CDR-L2 CDR-L3 301ae5 SEQ ID No. 1 2 3 4 5 6 9 10 3 11 12 13 1 2 30 31 32 33 9 36 37 38 39 40 34 35 Особливо важливий додатковий аспект антитіл, що є об'єктом даного винаходу, полягає в тому, що вони не проявляють ефекторних функцій, таких як антитілозалежна клітинна цитотоксичність (ADCC) та/або комплементзалежна цитотоксичність (CDC). Більш конкретно, як приклад, антитіла за винаходом або один з їх функціональних фрагментів чи одне з їх похідних не мають афінності до FcγR (I, II або III) або до C1q (1-й компонент системи стандартного комплементу), або до них обох. Для фахівця в даній області це означає в структурному плані, що антитіла за винаходом або один з їх функціональних фрагментів чи одне з їх похідних позбавлені Fc-області або їх Fcобласть не є коректно глікозилованою для здійснення ефекторних функцій. Внаслідок цього антитіла за винаходом краще вибрані з ізотипів IgG4 або IgG2, найкраще, IgG4. Аналогічно, кращими фрагментами є фрагменти, позбавлені ADCC, як наприклад, фрагменти Fv, scFv (sc означає одноланцюговий), Fab, F(ab') 2, Fab', scFv-Fc або діатіла, або будь-який фрагмент, період напіввиведення якого буде збільшений в результаті хімічної модифікації, наприклад, приєднання полі(алкілен)гліколю, такого як полі(етилен)гліколь ("пегілування") (пегіловані фрагменти позначаються Fv-ПЕГ, scFv-ПЕГ, Fab-ПЕГ, F(ab') 2-ПЕГ або Fab'-ПЕГ) ("ПЕГ" означає полі(етилен)гліколь), або шляхом інкорпорування в ліпосому. Більш конкретно, кращим функціональним фрагментом за винаходом, що походить з антитіла 515H7, є scFv, далі позначуваний як фрагмент scFv-Ck 515H7, який містить амінокислотну послідовність SEQ ID No. 54. 11 UA 107929 C2 5 10 15 20 25 Нуклеотидна послідовність, що відповідає зазначеному scFv, містить послідовність SEQ ID No. 55. Інший конкретний аспект даного винаходу стосується химерних антитіл або їх дериватизованих сполук чи функціональних фрагментів, де зазначені антитіла також містять константні області легкого ланцюга і важкого ланцюга, що походять з антитіла виду, гетерологічного миші, а саме людського антитіла. Наступний інший конкретний аспект даного винаходу стосується гуманізованих антитіл або їх дериватизованих сполук чи функціональних фрагментів, де константними областями легкого ланцюга і важкого ланцюга, що походять з людського антитіла, є, відповідно, область лямбда або каппа і гамма-2, або краще, область гамма-4. Антитіло за винаходом також включає химерні або гуманізовані антитіла. Химерне антитіло є антитілом, що містить природну варіабельну область (легкого ланцюга і важкого ланцюга), що походить з антитіла заданого різновиду, у комбінації з константними областями легкого ланцюга і важкого ланцюга антитіла різновиду, гетерологічного зазначеному заданому різновиду. Антитіла або їх химерні фрагменти можуть бути одержані шляхом використання методів генетичної рекомбінації. Наприклад, химерне антитіло буде одержано шляхом клонування рекомбінантної ДНК, що містить промотор та послідовність, яка кодує варіабельну область нелюдського моноклонального антитіла за винаходом, а саме мишачого, та послідовність, яка кодує константну область людського антитіла. Химерне антитіло за винаходом, кодоване одним таким рекомбінантним геном, буде, наприклад, химерною конструкцією "миша-людина", причому специфічність цього антитіла буде визначатися варіабельною областю, що походить з мишачої ДНК, а його ізотип - константною областю, що походить з людської ДНК. Відносно способів одержання химерних антитіл можна послатися на Verhoeyn та співавт. (Bioessays, 8:74, 1988). У наведеній в даному описі нижче Таблиці 3 підсумовані амінокислотні послідовності різних важких та легких ланцюгів химерного антитіла 515H7 (позначеного як c515H7 або C515H7) за винаходом. Таблиця 3 (де c = химерне антитіло) Антитіло c515H7 Повні послідовності (без сигнального пептиду) Важкий ланцюг cvh (G4wt) cvh (G4PRO) cvh (G2 wt) Легкий ланцюг cvl-ck SEQ ID No. 56 57 58 59 VH = варіабельна область важкого ланцюга. wt = дикий тип (від англ. wild type). VL = варіабельна область легкого ланцюга. 30 35 40 45 Нуклеотидні послідовності, що відповідають зазначеним SEQ ID No. 56-58 важких ланцюгів та SEQ ID No. 59 легкого ланцюга антитіла c515H7, відповідають послідовностям SEQ ID No. 60-63 (важкі ланцюги) та SEQ ID No. 64 (легкий ланцюг), відповідно. У кращому втіленні в послідовностях важких ланцюгів делетований C-кінцевий залишок лізину (присутній в оригінальній серії векторів pConPlus від Lonza: pConPlusγ4ΔK, pConPlusγ4PROΔK та pConPlusγ2ΔK). Більше того, важкий ланцюг G4PRO відповідає ізотипу IgG4 людини, що несе мутацію в шарнірній області, щоб не допустити утворення половинок антитіл. Ця мутація є в батьківській конструкції pConPlusγ4PROΔK від Lonza (Angal S, King DJ, Bodmer MW, Turner A, Lawson AD, Roberts G, Pedley B, Adair JR. A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human (IgG4) antibody. Mol. Immunol. (1993), 30(1): 105-108). Більш конкретно, винахід стосується важкого ланцюга химерного антитіла, що містить CDR, гомологічні відповідним CDR антитіла, яке походить з іншого виду ссавців, причому зазначені CDR згідно IMGT складаються з CDR-H1, CDR-H2 і CDR-H3, що містять відповідно послідовності SEQ ID No. 4, 5 та 6. 12 UA 107929 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Більш конкретно, винахід стосується легкого ланцюга химерного антитіла, що містить CDR, гомологічні відповідним CDR антитіла, яке походить з іншого виду ссавців, причому зазначені CDR згідно IMGT складаються з CDR-L1, CDR-L2 і CDR-L3, що містять відповідно послідовності SEQ ID No. 1, 2 та 3. Більш конкретно, винахід стосується химерного антитіла або його дериватизованої сполуки чи функціонального фрагмента, що містить важкі та легкі ланцюги, кожен з яких має CDR, гомологічні відповідним CDR антитіла, яке походить з іншого виду ссавців, причому зазначені CDR згідно IMGT складаються з CDR-H1, CDR-H2 і CDR-H3 важкого ланцюга, що містять відповідно послідовності SEQ ID No. 4, 5 та 6, та CDR-L1, CDR-L2 і CDR-L3 легкого ланцюга, що містять відповідно послідовності SEQ ID No. 1, 2 та 3. В іншому втіленні винахід стосується химерного антитіла або його дериватизованої сполуки чи функціонального фрагмента, що містить варіабельну область важкого ланцюга з послідовністю, яка складається з SEQ ID No. 8, та варіабельну область легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID No. 7. У наступному іншому втіленні винахід стосується химерного антитіла або його дериватизованої сполуки чи функціонального фрагмента, що містить важкий ланцюг з послідовністю, вибраною з групи, що складається з SEQ ID No. 56, 57 або 58, та легкий ланцюг з послідовністю SEQ ID No. 59. У кращому втіленні химерне антитіло c515H7 VH(G4wt) / VL-Ck або його дериватизована сполука або функціональний фрагмент за винаходом містить варіабельну область важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID No. 56, та варіабельну область легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID No. 59. У кращому втіленні химерне антитіло c515H7 VH(G4PRO) / VL-Ck або його дериватизована сполука чи функціональний фрагмент за винаходом містить варіабельну область важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID No. 57 та варіабельну область легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID No. 59. У кращому втіленні химерне антитіло c515H7 VH(G2wt) / VL-Ck або його дериватизована сполука чи функціональний фрагмент за винаходом містить варіабельну область важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID No. 58 та варіабельну область легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID No. 59. Термін "гуманізовані антитіла" означає антитіло, яке містить ділянки CDR, що походять з антитіла не-людського походження, причому інші частини молекули даного антитіла походять із одного (чи більш ніж одного) людського антитіла. До того ж, деякі із залишків сегментів кістяка (називаних FR) можуть бути модифіковані з метою збереження афінності зв'язування (Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536, 1988; Riechmann et al., Nature, 332: 323-327, 1988). Гуманізовані антитіла за винаходом або їх фрагменти можуть бути одержані з використанням методик, відомих фахівцю в даній області (таких як, наприклад, описані в документах Singer et al., J. Immun., 150: 2844-2857, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10: 1-142, 1992; і Bebbington et al., Bio/Technology, 10: 169-175, 1992). Такі гуманізовані антитіла є кращими для застосування їх у способах, що включають встановлення діагнозів in vitro або превентивне та/або терапевтичне лікування in vivo. Фахівцю в даній області також відомі інші методи гуманізації, такі як, наприклад, метод "CDR-прищеплювання" ("CDR Grafting"), описаний PDL (Public Documentation License) у патентах EP 0451261, EP 0682040, EP 0939127, EP 0566647 або US 5530101, US 6180370, US 5585089 та US 5693761. Також можна згадати патенти США 5639641 або 6054297, 5886152 та 5877293. Крім цього, винахід також стосується гуманізованих антитіл, що походять з мишачого антитіла, описаного вище. У кращому способі одержання константними областями легкого ланцюга і важкого ланцюга, що походять з людського антитіла, є, відповідно, область лямбда або каппа і гамма-2, або краще гамма-4. Більш конкретно, винахід стосується важкого ланцюга гуманізованого антитіла, що містить 1) каркасну область, гомологічну відповідній каркасній області важкого ланцюга людського антитіла, та 2) CDR, гомологічні відповідним CDR антитіла, яке походить з іншого виду ссавців, причому зазначені CDR згідно IMGT складаються з CDR-H1, CDR-H2 і CDR-H3, що містять відповідно послідовності SEQ ID No. 4, 5 та 6. В іншому втіленні винахід стосується важкого ланцюга гуманізованого антитіла, що містить варіабельну область із послідовністю, яка складається з SEQ ID No. 64. У наступному іншому втіленні винахід стосується важкого ланцюга гуманізованого антитіла, що містить повну послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID No. 67, 68 та 69. 13 UA 107929 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Більш конкретно, винахід стосується легкого ланцюга гуманізованого антитіла, що містить 1) каркасну область, гомологічну відповідній каркасній області легкого ланцюга людського антитіла, та 2) CDR, гомологічні відповідним CDR антитіла, яке походить з іншого виду ссавців, причому зазначені CDR згідно IMGT складаються з CDR-L1, CDR-L2 і CDR-L3, що містять відповідно послідовності SEQ ID No. 1, 2 та 3. В іншому втіленні винахід стосується легкого ланцюга гуманізованого антитіла, що містить варіабельну область із послідовністю, вибраною з групи, що складається з SEQ ID No. 65, 66, 82 або 83. У наступному іншому втіленні винахід стосується легкого ланцюга гуманізованого антитіла, що містить повну послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID No. 70, 71, 84 або 85. Більш конкретно, винахід стосується гуманізованого антитіла або його дериватизованої сполуки чи функціонального фрагмента, що містить важкі та легкі ланцюги, кожен з яких має 1) каркасні області, гомологічні відповідним каркасним областям людського антитіла, та 2) CDR, гомологічні відповідним CDR антитіла, яке походить з іншого виду ссавців, причому зазначені CDR згідно IMGT складаються з CDR-H1, CDR-H2 і CDR-H3 важкого ланцюга, що містить відповідно послідовності SEQ ID No. 4, 5 та 6, та CDR-L1, CDR-L2 і CDR-L3 легкого ланцюга, що містить відповідно послідовності SEQ ID No. 1, 2 та 3. В іншому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла або його дериватизованої сполуки чи функціонального фрагмента, що містить варіабельну область важкого ланцюга з послідовністю, що складається з SEQ ID No. 64, та варіабельну область легкого ланцюга з послідовністю, вибраною з групи, що складається з SEQ ID No. 65, 66, 82 або 83. У наступному іншому втіленні винахід стосується гуманізованого антитіла або його дериватизованої сполуки чи функціонального фрагмента, що містить важкий ланцюг з послідовністю, вибраною з групи, що складається з SEQ ID No. 67, 68 або 69, та легкий ланцюг з послідовністю, вибраною з групи, що складається з SEQ ID No. 70, 71, 84 або 85. У кращому втіленні гуманізоване антитіло Hz515H7 VH1 D76N (G4wt) / VL2-Ck або його дериватизована сполука чи функціональний фрагмент за винаходом містить важкий ланцюг з послідовністю SEQ ID No. 67 та легкий ланцюг з послідовністю SEQ ID No. 70. В іншому кращому втіленні гуманізоване антитіло Hz515H7 VH1 D76N (G4PRO) / VL2-Ck або його дериватизована сполука чи функціональний фрагмент за винаходом містить важкий ланцюг з послідовністю SEQ ID No. 68 та легкий ланцюг з послідовністю SEQ ID No. 70. В іншому кращому втіленні гуманізоване антитіло Hz515H7 VH1 D76N (G2wt) / VL2-Ck або його дериватизована сполука чи функціональний фрагмент за винаходом містить важкий ланцюг з послідовністю SEQ ID No. 69 та легкий ланцюг з послідовністю SEQ ID No. 70. В іншому кращому втіленні гуманізоване антитіло Hz515H7 VH1 D76N (G4wt) / VL2.1-Ck або його дериватизована сполука чи функціональний фрагмент за винаходом містить важкий ланцюг з послідовністю SEQ ID No. 67 та легкий ланцюг з послідовністю SEQ ID No. 71. В іншому кращому втіленні гуманізоване антитіло Hz515H7 VH1 D76N (G4PRO) / VL2.1-Ck або його дериватизована сполука чи функціональний фрагмент за винаходом містить важкий ланцюг з послідовністю SEQ ID No. 68 та легкий ланцюг з послідовністю SEQ ID No. 71. В іншому кращому втіленні гуманізоване антитіло Hz515H7 VH1 D76N (G2wt) / VL2.1-Ck або його дериватизована сполука чи функціональний фрагмент за винаходом містить важкий ланцюг з послідовністю SEQ ID No. 69 та легкий ланцюг з послідовністю SEQ ID No. 71. В іншому кращому втіленні гуманізоване антитіло Hz515H7 VH1 D76N (G4wt) / VL2.2-Ck або його дериватизована сполука чи функціональний фрагмент за винаходом містить важкий ланцюг з послідовністю SEQ ID No. 67 та легкий ланцюг з послідовністю SEQ ID No. 84. В іншому кращому втіленні гуманізоване антитіло Hz515H7 VH1 D76N (G4PRO) / VL2.2-Ck або його дериватизована сполука чи функціональний фрагмент за винаходом містить важкий ланцюг з послідовністю SEQ ID No. 68 та легкий ланцюг з послідовністю SEQ ID No. 84. В іншому кращому втіленні гуманізоване антитіло Hz515H7 VH1 D76N (G2wt) / VL2.2-Ck або його дериватизована сполука чи функціональний фрагмент за винаходом містить важкий ланцюг з послідовністю SEQ ID No. 69 та легкий ланцюг з послідовністю SEQ ID No. 84. В іншому кращому втіленні гуманізоване антитіло Hz515H7 VH1 D76N (G4wt) / VL2.3-Ck або його дериватизована сполука чи функціональний фрагмент за винаходом містить важкий ланцюг з послідовністю SEQ ID No. 67 та легкий ланцюг з послідовністю SEQ ID No. 85. В іншому кращому втіленні гуманізоване антитіло Hz515H7 VH1 D76N (G4PRO) / VL2.3-Ck або його дериватизована сполука чи функціональний фрагмент за винаходом містить важкий ланцюг з послідовністю SEQ ID No. 68 та легкий ланцюг з послідовністю SEQ ID No. 85. В іншому кращому втіленні гуманізоване антитіло Hz515H7 VH1 D76N (G2wt) / VL2.3-Ck або його дериватизована сполука чи функціональний фрагмент за винаходом містить важкий 14 UA 107929 C2 ланцюг з послідовністю SEQ ID No. 69 та легкий ланцюг з послідовністю SEQ ID No. 85. У наведеній в даному описі нижче Таблиці 4 підсумовані амінокислотні послідовності різних варіабельних доменів важких та легких ланцюгів та повнорозмірного (або повного), відповідно, гуманізованого антитіла 515H7 за винаходом. 5 Таблиця 4 (де Hz = гуманізоване антитіло) Антитіло Hz515H7 Варіабельні домени Повні послідовності (без сигнального пептиду) 10 15 20 25 30 35 Важкий ланцюг VH1 D76N VH1 D76N (G4wt) VH1 D76N (G4PRO) VH1 D76N (G2wt) Легкий ланцюг VL2 VL2.1 VL2.2 VL2.3 VL2-Ck VL2.1-Ck VL2.2-Ck VL2.3-Ck SEQ ID No. 64 65 66 82 83 67 68 69 70 71 84 85 У кращому втіленні в послідовностях важких ланцюгів делетований C-кінцевий залишок лізину (присутній в оригінальній серії векторів pConPlus від Lonza: pConPlusγ4ΔK, pConPlusγ4PROΔK та pConPlusγ2ΔK). Більше того, важкий ланцюг G4PRO відповідає ізотипу IgG4 людини, що несе мутацію в шарнірній області, щоб не допустити утворення половинок антитіл. Ця мутація є в батьківській конструкції pConPlusγ4PROΔK від Lonza (Angal S, King DJ, Bodmer MW, Turner A, Lawson AD, Roberts G, Pedley B, Adair JR. A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human (Igg4) antibody. Mol. Immunol. (1993), 30(1): 105-108). Як приклад, щоб уникнути сумнівів, вираз "VH1" є аналогічним виразам "Варіант 1 VH", "варіант 1 VH", "Вар. 1 VH" або "вар. 1 VH". Необхідно розуміти, що згадані вище як приклад комбінації VH/VL не є обмежуючими. Безсумнівно, фахівець у даній області може, без надмірних витрат та без прикладення винахідницького таланта, перегруповувати усі VH та VL, викладені в даному описі. Новий аспект даного винаходу стосується виділеної нуклеїнової кислоті, яка вибрана з таких нуклеїнових кислот (у тому числі з урахуванням будь-якої виродженості генетичного коду): a) нуклеїнової кислоти, ДНК або РНК, що кодують антитіло або один з його функціональних фрагментів чи одне з його похідних за винаходом; b) нуклеїнової кислоти, яка містить послідовність ДНК, вибрану з групи послідовностей, що складається з SEQ ID No. 14-19 та 41-45; c) нуклеїнової кислоти, яка містить послідовність ДНК, вибрану з групи послідовностей, що складається з SEQ ID No. 20, 21, 46 та 47; d) відповідних РНК нуклеїнових кислот, вибраних з нуклеїнових кислот, які визначені в b) або c); e) нуклеїнових кислот, комплементарних нуклеїновим кислотам, визначеним в a), b) та c); і f) нуклеїнової кислоти, що складається щонайменше з 18 нуклеотидів, здатних гібридизуватися в умовах високої суворості щонайменше з однією з CDR з послідовністю SEQ ID No. 14-19 та 41-45. У наведеній нижче Таблиці 5 підсумовані різні нуклеотидні послідовності, що стосуються антитіл за винаходом. 15 UA 107929 C2 Таблиця 5 (де Mu = мишаче антитіло) Антитіло Нумерація CDR IMGT Важкий ланцюг CDR-H1 CDR-H2 CDR-H3 CDR-L1 CDR-L2 CDR-L3 515H7 Kabat Легкий ланцюг CDR-L1 CDR-L2 CDR-L3 CDR-H1 CDR-H2 CDR-H3 Варіабельний домен Mu Варіабельний домен Mu IMGT Kabat CDR-H1 CDR-H2 CDR-H3 CDR-L1 CDR-L2 CDR-L3 CDR-H1 CDR-H2 CDR-H3 Варіабельний домен Mu Варіабельний домен Mu 5 10 15 20 20 21 CDR-L1 CDR-L2 CDR-L3 301ae5 SEQ ID No. 14 15 16 17 18 19 22 23 16 24 25 26 41 15 42 43 44 45 48 49 50 51 52 53 46 47 Терміни "нуклеїнова кислота", "послідовність нуклеїнової кислоти", "нуклеїновокислотна послідовність", "полінуклеотид", "олігонуклеотид", "полінуклеотидна послідовність" та "нуклеотидна послідовність", використовувані взаємозамінно в даному описі, означають точну послідовність нуклеотидів, модифікованих чи ні, яка визначає фрагмент або область нуклеїнової кислоти, що містить або не містить неприродних нуклеотидів, і є або двухланцюговою ДНК, або одноланцюговою ДНК, або продуктами транскрипції зазначених ДНК. Тут також слід зазначити, що даний винахід не стосується нуклеотидних послідовностей в їх природному хромосомному оточенні, тобто в природному стані. Послідовності за даним винаходом виділені та/або очищені, тобто їх відбирали прямо чи опосередковано, наприклад, шляхом копіювання, після того, як їх оточення було щонайменше частково змінене. Також тут слід згадати виділені нуклеїнові кислоти, одержані методами генетичної рекомбінації з використанням можливостей, наприклад, клітин хазяїна, або одержані хімічним синтезом. Фраза "нуклеїновокислотні послідовності, що демонструють відсоток ідентичності щонайменше 80 %, краще 85 %, 90 %, 95 % та 98 % після оптимального вирівнювання із кращою послідовністю" означає нуклеїновокислотні послідовності, що демонструють у порівнянні з нуклеїновокислотною послідовністю порівняння деякі модифікації, такі як, зокрема, делеція, укорочення, подовження, злиття з утворенням химерної конструкції та/або заміна, особливо, точкові. Краще, щоб вони були послідовностями, які кодують точно такі амінокислотні послідовності, що й послідовність порівняння, причому це пов'язане з виродженістю генетичного коду, або комплементарні послідовності, які здатні специфічно гібридизуватися з послідовностями порівняння, краще в умовах високої суворості, а саме в умовах, визначених 16 UA 107929 C2 5 10 15 20 25 30 35 нижче. Гібридизація в умовах високої суворості означає, що умови, які стосуються температури та іонної сили, вибрані такими, що дозволяють підтримувати гібридизацію між двома комплементарними фрагментами ДНК. Із чисто ілюстративною метою кращі умови високої суворості для стадії гібридизації з метою визначення описаних вище полінуклеотидних фрагментів наведені нижче. Гібридизацію ДНК-ДНК або ДНК-РНК проводять у дві стадії: (1) попередня гібридизація при 42 °C протягом трьох годин у фосфатному буфері (20 мМ, pH 7,5), що містить 5 SSC (1 SSC відповідає розчину 0,15 M NaCl+0,015 M цитрату натрію), 50 % формаміду, 7 % додецилсульфату натрію (SDS), 10 розчин Денхардта, 5 % декстрансульфату і 1 % ДНК із молочка лососевих; (2) первинна гібридизація протягом 20 годин при температурі, що залежить від довжини зонда, (тобто: 42 °C для зонда довжиною більше 100 нуклеотидів) з наступними двома промиваннями протягом 20 хвилин при 20 °C в 2 SSC+2 % SDS, одним промиванням протягом 20 хвилин при 20 °C в 0,1 SSC+0,1 % SDS. Останнє промивання здійснюють в 0,1 SSC+0,1 % SDS протягом 30 хвилин при 60 °C для зонда довжиною більше 100 нуклеотидів. Умови гібридизації високої суворості, описані вище для полінуклеотиду певного розміру, можуть бути адаптовані фахівцем у даній області для олігонуклеотидів більшої та меншої довжини відповідно до методик, описаних в Sambrook, et al. (Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory; 3rd edition, 2001). Винахід також охоплює молекулу виділеної нуклеїнової кислоти, яка вибрана з таких нуклеїнових кислот: a) нуклеїнової кислоти, ДНК або РНК, що кодує важкий ланцюг гуманізованого антитіла або його дериватизованої сполуки чи функціонального фрагмента за винаходом; b) нуклеїнової кислоти, ДНК або РНК, що кодує легкий ланцюг гуманізованого антитіла або його дериватизованої сполуки чи функціонального фрагмента за винаходом; c) нуклеїнової кислоти, ДНК або РНК, що кодує гуманізоване антитіло або його дериватизовану сполуку чи функціональний фрагмент за винаходом; d) нуклеїнової кислоти, комплементарної нуклеїновій кислоті, яка визначена в a), b) або c); e) нуклеїнової кислоти, яка складається щонайменше з 18 нуклеотидів, здатних гібридизуватися в умовах високої суворості щонайменше з важким ланцюгом, що містить нуклеїновокислотні послідовності SEQ ID No. 72 або 75-77; f) нуклеїнової кислоти, яка складається щонайменше з 18 нуклеотидів, здатних гібридизуватися в умовах високої суворості щонайменше з легким ланцюгом, що містить нуклеїновокислотні послідовності SEQ ID No. 73, 74, 86, 87 або 78, 79, 88, 89. У наведеній далі Таблиці 6 підсумовані нуклеотидні послідовності різних варіабельних доменів важких та легких ланцюгів та повнорозмірного (або повного), відповідно, гуманізованого антитіла 515H7 за винаходом. Таблиця 6 (де Hz = гуманізоване антитіло) Антитіло Hz515H7 Варіабельні домени Повні послідовності (без сигнального пептиду) 40 Важкий ланцюг VH1 D76N VH1 D76N (G4wt) VH1 D76N (G4PRO) VH1 D76N (G2wt) Легкий ланцюг VL2 VL2.1 VL2.2 VL2.3 VL2-Ck VL2.1-Ck VL2.2-Ck VL2.3-Ck SEQ ID No. 72 73 74 86 87 75 76 77 78 79 88 89 У наведеній нижче Таблиці 7 підсумовані нуклеотидні послідовності різних важких та легких ланцюгів химерного антитіла 515H7 за винаходом. 17 UA 107929 C2 Таблиця 7 (де c = химерне антитіло) Антитіло c515H7 Повні послідовності (без сигнального пептиду) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Важкий ланцюг cVH (G4wt) cVH (G4PRO) cVH (G2wt) Легкий ланцюг cVL-Ck SEQ ID No. 60 61 62 63 Інакше кажучи, даний винахід стосується виділеної нуклеїнової кислоті, яка вибрана з таких нуклеїнових кислот: a) нуклеїнової кислоти, ДНК або РНК, що кодує антитіло або один з його функціональних фрагментів чи одне з його похідних за винаходом; b) нуклеїнової кислоти, яка містить послідовність ДНК, вибрану з групи послідовностей CDR, що складаються з SEQ ID No. 14-19 та 41-45; c) нуклеїнової кислоти, яка містить послідовність ДНК, вибрану з групи послідовностей варіабельних доменів важких та легких ланцюгів, що складається з SEQ ID No. 20, 21, 46, 47, 72, 73, 74, 86 та 87; d) нуклеїнової кислоти, яка містить послідовність ДНК, вибрану з групи послідовностей важких та легких ланцюгів, що складається з SEQ ID No. 60-63, 75-79, 88 та 89; e) нуклеїнової кислоти, яка містить послідовність ДНК із SEQ ID No. 55; f) відповідних РНК нуклеїнових кислот, вибраних з нуклеїнових кислот, які визначені в b), c), d) або e); g) нуклеїнових кислот, комплементарних нуклеїновим кислотам, визначеним в a), b), c), d) та e); і h) нуклеїнової кислоти, яка складається щонайменше з 18 нуклеотидів, здатних гібридизуватися в умовах високої суворості щонайменше з однією із CDR з послідовністю SEQ ID No. 14-19 та 41-45. Винахід також стосується вектора, що містить нуклеїнову кислоту, яка описана в даному винаході. Винахід, зокрема, стосується клонуючих та/або експресуючих векторів, які містять таку нуклеотидну послідовність. Вектори за винаходом краще містять елементи, які дозволяють здійснювати експресію та/або секрецію нуклеотидних послідовностей у заданій клітині хазяїна. Таким чином, вектор повинен містити промотор, сигнали ініціації та терминації трансляції, а також придатні області регуляції транскрипції. Він повинен стабільно підтримуватися в клітині хазяїна і можливо може мати специфічні сигнали, що обумовлюють секрецію трансльованого білка. Такі різні елементи відбираються і оптимізуються фахівцем у даній області відповідно до використовуваної клітини хазяїна. Із цією метою нуклеотидні послідовності можуть бути вбудовані в вектори, що самореплікуються у вибраному хазяїні, або бути інтегративними векторами вибраного хазяїна. Такі вектори одержують способами, звичайно використовуваними фахівцем у даній області, і одержані клони можуть бути введені в придатного хазяїна стандартними методами, такими як ліпофекція, електропорація, тепловий шок або хімічні методи. Векторами є, наприклад, вектори плазмідного або вірусного походження. Їх використовують для трансформації клітин хазяїна, щоб клонувати або експресувати нуклеотидні послідовності за винаходом. Винахід також включає клітини хазяїна, які є трансформованими вектором або містять вектор, описаний у даному винаході. Клітина хазяїна може бути вибрана поміж прокаріотичних або еукаріотичних систем, таких як бактеріальні клітини, наприклад, але також дріжджові клітини або клітини тварин, а саме клітини ссавців. Також можна використовувати клітини комах або рослин. Винахід також стосується тварин, що відрізняються від людини, які мають трансформовану клітину за винаходом. Інший аспект винаходу стосується способу одержання антитіла за винаходом або одного з його функціональних фрагментів, де зазначений спосіб включає такі стадії: a) культивування клітини хазяїна за винаходом у середовищі та в придатних умовах культивування; і b) виділення зазначеного антитіла або одного з його функціональних фрагментів, одержаних у такий спосіб, з культурального середовища або із зазначених культивованих клітин. Трансформовані клітини за винаходом застосовуються в способах одержання 18 UA 107929 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 рекомбінантних поліпептидів за винаходом. Способи одержання поліпептиду за винаходом в рекомбінантній формі, де в зазначених способах використовують вектор та/або клітину, трансформовану вектором за винаходом, також включені в даний винахід. Краще, щоб клітину, трансформовану вектором за винаходом, культивували в умовах, що дозволяють здійснювати експресію зазначеного вище поліпептиду і виділення зазначеного рекомбінантного пептиду. Як вже було згадано, клітина хазяїна може бути вибрана з прокаріотичних або еукаріотичних систем. Зокрема, можлива ідентифікація нуклеотидних послідовностей за винаходом, які полегшують секрецію в такий прокаріотичній або еукаріотичній системі. Тому вектор за винаходом, що несе таку послідовність, може бути використаний краще для одержання рекомбінантних білків, що підлягають секреції. Безсумнівно, очищення цих рекомбінантних білків, що представляють інтерес, буде полегшене завдяки факту присутності їх у супернатанті клітинної культури, а не усередині клітин хазяїна. Поліпептиди за винаходом також можуть бути одержані хімічним синтезом. Один з таких способів одержання також є об'єктом винаходу. Фахівцю в даній області відомі способи хімічного синтезу, такі як твердофазові методи (див., зокрема Steward et al., 1984, Solid phase peptides synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 2nd ed.) або частково твердофазові методи, методи з використанням конденсації фрагментів або традиційного синтезу в розчині. Поліпептиди, одержані хімічним синтезом та здатні містити відповідні неприродні амінокислоти, також включені в даний винахід. Антитіла або їх дериватизовані сполуки чи функціональні фрагменти, які можуть бути одержані способом за винаходом, також включені в даний винахід. Згідно із ще одним аспектом даний винахід стосується антитіл, описаних вище, які крім усього іншого здатні специфічно зв'язуватися із представником сімейства хемокінових рецепторів людини та/або здатні специфічно інгібувати реплікацію X4-тропного ВІЛ. Згідно із ще одним аспектом, даний винахід стосується антитіл, описаних вище, які крім усього іншого здатні специфічно зв'язуватися із представником сімейства хемокінових рецепторів людини та/або здатні специфічно інгібувати реплікацію X4/R5-тропного ВІЛ. Згідно з новим втіленням винахід стосується антитіл або їх дериватизованих сполук або функціональних фрагментів, що складаються з антитіл, які є біспецифічними в тому розумінні, що вони містять другий мотив, здатний взаємодіяти з будь-яким рецептором, залученим у процес проникнення ВІЛ у клітину, таким як, наприклад, CCR5, CD4, CXCR4 (при цьому даний мотив відрізняється від мотиву антитіла за даним винаходом, тобто націлений на інший епітоп) або CCR3, CCR2, CCR8, CXCR6, CXCR7, CX3CR1. Біспецифічні або біфункціональні антитіла складають друге покоління моноклональних антитіл, у яких дві різні варіабельні області об'єднані в одній молекулі (Hollinger and Bohlen, 1999, Cancer and metastasis, rev. 18: 411-419). Їх застосовність була продемонстрована як у терапевтичній, так і в діагностичній областях у зв'язку з їх здатністю розпізнавати різні молекули на поверхні клітини; такі антитіла можуть бути одержані хімічними методами (Glennie MJ. et al., 1987, J. Immunol., 139, 2367-2375; Repp R. et al., 1995, J. Hemat., 377-382) або соматичними методами (Staerz U.D. and Bevan M.J., 1986, PNAS, 83, 1453-1457; Suresh M.R. et al., 1986, Method Enzymol., 121: 210-228), але також, краще, із застосуванням методів генетичної інженерії, які створюють можливість форсувати гетеродимеризацію і у такий спосіб полегшувати очищення бажаних антитіл (Merchand et al., 1998, Nature Biotech., 16: 677-681). Ці біспецифічні антитіла можуть бути сконструйовані у вигляді цілих IgG, біспецифічних F(ab')2, Fab'-ПЕГ, діател або біспецифічних scFv, а також у вигляді тетравалентного біспецифічного антитіла, у якому для кожного цільового антигену є два сайти зв'язування (Park et al., 2000, Mol. Immunol., 37(18): 1123-30), або сконструйовані у вигляді фрагментів усього, що описане вище. На додаток до економічної переваги, пов'язаної з тим, що виробництво і введення біспецифічного антитіла дешевше, ніж виробництво двох специфічних антитіл, застосування таких біспецифічних антитіл має перевагу, яка полягає в зниженні токсичності лікування. Дійсно, застосування біспецифічного антитіла дає можливість зменшити загальну кількість циркулюючих антитіл та внаслідок цього можливу токсичність. У кращому втіленні винаходу біспецифічні антитіла є бівалентними або тетравалентними антитілами. І нарешті, даний винахід стосується антитіл, описаних вище, або одного з їх функціональних фрагментів чи похідних як лікарського засобу. Винахід також стосується фармацевтичної композиції, що містить як активний інгредієнт сполуку, яка складається з антитіла за винаходом або одного з його функціональних фрагментів чи похідних. Краще, щоб зазначене антитіло було доповнено ексципієнтом та/або 19 UA 107929 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 фармацевтично прийнятним носієм. Винахід також стосується композиції, яка описана вище, як лікарського засобу. У конкретному аспекті винаходу антитіло або один з його функціональних фрагментів чи одне з його похідних інгібує реплікацію первинного ізоляту KON ВІЛ-1 в PBMC з IC90 щонайменше 5 мкг/мл, краще, щонайменше 10 мкг/мл. Даний винахід також включає застосування антитіла або композиції за винаходом для приготування ліків та/або лікарського засобу для попередження або лікування ВІЛ-інфекції. Більш конкретно, як необмежуючий приклад, зазначена ВІЛ-інфекція є X4-тропною ВІЛінфекцією. В іншому втіленні як необмежуючий приклад, зазначена ВІЛ-інфекція є X4/R5-тропною ВІЛінфекцією. Даний винахід також стосується застосування антитіла або його функціонального фрагмента чи похідного, краще гуманізованого, та/або композиції за винаходом для одержання лікарського засобу для інгібування реплікації ВІЛ. У загальному випадку даний винахід стосується застосування антитіла або його функціонального фрагмента чи похідного, краще гуманізованого, та/або композиції за винаходом для одержання лікарського засобу для попередження або лікування викликуваного ВІЛ захворювання. У даному описі "фармацевтичний розріджувач" означає сполуку або комбінацію сполук, що входить у фармацевтичну композицію, яка не викликає побічної реакції і яка, наприклад, полегшує введення активної сполуки, збільшує її тривалість життя та/або ефективність в організмі, збільшує її розчинність у розчині або сприяє її зберіганню. Такі фармацевтичні носії добре відомі і будуть застосовуватися фахівцем у даній області залежно від природи і шляху введення вибраних активних сполук. Краще, такі сполуки будуть уводитися системним шляхом, а саме внутрішньовенним, внутрішньом'язовим, інтрадермальним, внутрішньоочеревинним, підшкірним, інтравагінальним або пероральним шляхом. Ще краще, введення композиції, що містить антитіло за винаходом, буде здійснене шляхом введення декількох доз, розділених однаковими проміжками часу. Шляхи їх введення, режими дозування і оптимальні галенові форми можуть бути визначені відповідно до критеріїв, які звичайно враховуються при встановленні лікування, придатного для пацієнта, таких як, наприклад, вік або маса тіла пацієнта, тяжкість його загального стану, його толерантність до лікування і побічні ефекти, яких він зазнає. Винахід також стосується композиції, яка містить, крім усього іншого, у вигляді комбінованого продукту для застосування шляхом одночасного, роздільного або розтягнутого в часі введення, антитіло проти ВІЛ, або антитіло проти проникнення ВІЛ у клітину, або антитіло проти реплікації ВІЛ, що відрізняється від антитіла, спрямованого проти CXCR4. Відповідно до наступного іншого втілення даний винахід також стосується описаної вище фармацевтичної композиції, яка містить щонайменше другу сполуку проти ВІЛ, вибрану поміж сполук, здатних специфічно інгібувати проникнення в клітину та/або реплікацію ВІЛ, таких як анти-CCR5, анти-CD4 сполуки і анти-CXCR4 сполуки, відмінні від описаних у даному винаході, або будь-яка інша сполука проти ВІЛ, відома фахівцю в даній області. Інше втілення, що доповнює даний винахід, є описаною вище композицією, яка містить, крім усього іншого, у вигляді комбінованого або кон'югованого продукту для застосування шляхом одночасного, роздільного або розтягнутого в часі введення, сполуку проти ВІЛ. "Одночасне застосування" означає введення обох сполук композиції, що містяться в разовій лікарській формі. "Роздільне застосування" означає введення в один й той самий момент часу обох сполук композиції, що містяться в різних лікарських формах. "Розтягнуте в часі застосування" означає послідовне введення обох сполук композиції, кожна з яких міститься в окремій лікарській формі. Звичайно композиція за винаходом суттєво підвищує ефективність лікування ВІЛ. Інакше кажучи, несподівано терапевтичний ефект антитіла за винаходом виявився підвищеним в результаті введення засобу проти ВІЛ. Інша важлива наступна перевага, створювана композицією за винаходом, стосується можливості використання більш низької ефективної дози активного інгредієнта, що дає у такий спосіб можливість уникнути ризиків або знизити ризики появи побічних ефектів, зокрема, ефекту засобу проти ВІЛ. Більше того, ця композиція надає можливість досягнення більш швидкого очікуваного терапевтичного ефекту. "Терапевтичний засіб проти ВІЛ" означає речовину, яка при введенні пацієнтові "лікує або попереджає" реплікацію ВІЛ у пацієнта. Необмежуючі приклади таких засобів включають "антиретровірусні лікарські засоби, такі як інгібітори протеази (PI) ВІЛ, нуклеозидні/нуклеотидні інгібітори зворотної транскриптази (NRTI/NtRTI) ВІЛ, ненуклеозидні інгібітори зворотної 20 UA 107929 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 транскриптази (NNRTI) ВІЛ, інгібітори проникнення ВІЛ у клітину, інгібітори інтегрази ВІЛ". Такі засоби наведені, наприклад, у довіднику ВІДАЛЬ, на сторінках, відведених сполукам, що належать до "сполук проти ВІЛ"; при цьому сполуки проти ВІЛ, згадані шляхом посилання на цей документ, наведені в даному описі як необмежуючі кращі засоби проти ВІЛ. Термін "інгібітор протеази ВІЛ" стосується будь-якої речовини, яка може інгібувати активність протеази ВІЛ. Приклади таких інгібіторів протеази ВІЛ включають саквінавіру мезилат ® ® ® або SQV (Invirase ), індинавір або IDV (Crixivan ), ритонавір або RTV (Norvir ), нелфінавір або ® ® ® ® NFV (Viracept ), ампренавір (Agenerase , Prozei ), лопінавір/ритонавір або LPV/r (Kaletra , ® ® ® ® ® Aluvia ), атазанавір або ATV (Reyataz , Zrivada ), фосампренавір або FPV (Lexiva , Telzir ), ® ® типранавір або TPV (Aptivus ), дарунавір або DRV (Prezista ), без обмеження ними. Термін "нуклеозидний або нуклеотидний інгібітор зворотної транскриптази (NRTI) ВІЛ" стосується речовини, яка є нуклеозидним або нуклеотидним аналогом, що блокує зворотну транскрипцію РНК ВІЛ. Приклади NRTI включають зидовудин або AZT, ZDV ® ® ® (Retrovir/combivir/trixivir ), диданозин або ddi (Videx ), зальцитабін (HIVID ), ставудин або d4T ® ® (Zerit ), ламівудин або 3TC (Epivir/combivir/epzicom/trixivir ), абакавір або ABC ® ® (Ziagen/trixivir/epzicom ), тенофовіру дизопроксилу фумарат або TDF (Viread/atripla/truvada ), ® емтрицитабін або FTC (Emtriva/atripla/truvada ), без обмеження ними. Термін "ненуклеозидний інгібітор зворотної транскриптази (NNRTI) ВІЛ" стосується речовини, яка є ненуклеозидним або ненуклеотидним аналогом, що блокує зворотну ® транскрипцію РНК ВІЛ. Приклади NNRTI включають невірапін або NVP (Viramune ), ефавіренц ® ® ® або EFV (Sustiva/atripla , Stocrin ), делавірдин або DLV (Rescriptor ) та етравірин або ETR ® (Intelence ), без обмеження ними. Термін "інгібітор проникнення ВІЛ у клітину" стосується речовини, яка блокує проникнення ВІЛ у клітину. Приклади інгібіторів проникнення ВІЛ у клітину включають енфувіртид або T20 ® ® ® (Fuzeon ), маравірок або MVC (Celsentri , Celzentry ), без обмеження ними. Термін "інгібітор інтегрази ВІЛ" стосується речовини, яка інгібує активність інтегрази ВІЛ. ® Приклад інгібітору інтегрази включає ралтегравір або RAL (Isentress ), без обмеження ними. Такими агентами, наприклад, є також сполуки, що належать до тих самих класів лікарських засобів, описаних у довіднику ВІДАЛЬ, які зараз проходять клінічні випробування, такі як викривірок, PRO140, TNX-355, AMD070, рацивір, априцитабін, елвуцитабін, флосалвудин (flosalvudine), рилпівірин, елвітегравір, без обмеження ними. Такими агентами, наприклад, також є сполуки, що належать до інших можливих класів лікарських засобів, такі як інгібітори дозрівання (бевіримат), глікозидні аналоги βгалактозилцераміду, агенти, що зв'язують вуглеводи, інгібітори РНКази H, інгібітори генної експресії ВІЛ, стимулятори вивільнення ВІЛ з латентних T-клітин (вальпроєва кислота …), без обмеження ними. В особливо кращому втіленні в зазначеній композиції за винаходом, застосовуваній як комбінований продукт, зазначений засіб проти ВІЛ є хімічно зв'язаним із зазначеним антитілом для одночасного застосування. Для полегшення зв'язування зазначеного засобу проти ВІЛ з антитілом за винаходом між двома цими сполуками можуть бути введені молекули спейсерів, таких як полі(алкілен)гліколь, поліетиленгліколь або амінокислоти; або, в іншому втіленні, можуть бути використані активні похідні зазначених засобів проти ВІЛ, до яких введені функціональні групи, здатні взаємодіяти із зазначеним антитілом. Ці методи зв'язування добре відомі фахівцю в даній області і не будуть більш докладно обговорюватися в даному описі. Також краще, коли зазначене антитіло за винаходом, що утворює зазначений кон'югат, вибране поміж його функціональних фрагментів, а саме фрагментів, у яких відсутній їх Fcкомпонент, таких як scFv-фрагменти. Винахід також стосується композиції, застосовуваної як комбінований продукт, або кон'югату Mab проти CXCR4 та лікарського засобу проти ВІЛ, відповідно до винаходу, які використовуються як лікарський засіб. Краще, щоб зазначена композиція, застосовувана як комбінований продукт, або зазначений кон'югат були доповнені ексципієнтом та/або фармацевтичним розріджувачем. Таким чином, даний винахід стосується застосування антитіла або одного з його функціональних фрагментів чи похідних для виготовлення лікарського засобу для специфічного мічення сполуки, яка є біологічно активною по відношенню до реплікації ВІЛ. Як продемонстровано раніше, CXCR4-mab 515H7 та 301ae5 мають високу активність проти реплікації ВІЛ-1 в PBMC, тому такі антитіла можуть бути використані в скринінг-аналізах для ідентифікації антивірусних засобів-антагоністів CXCR4 для лікування інфекції ВІЛ-1. На першій стадії цих аналізів клітини, експресуючі CXCR4, інкубують з Mab 515H7 та/або 301ae5, і потім 21 UA 107929 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 молекули можна оцінити за їх можливістю інгібувати зв'язування з Mab 515H7 та/або 301ae5. Клітини, використовувані в аналізах цього типу, можуть бути трансфекованими клітинними лініями, такими як CHO(яєчників китайського хом'ячка)-CXCR4, NIH3T3-CXCR4 або CXCR4трансфекованими людськими клітинними лініями, такими як U373-MAGI-CXCR4, людськими клітинними лініями, експресуючими CXCR4, такими як NALM6, або первинними клітинами, такими як PBMC. Метод, використовуваний для скринінгу антагоністів CXCR4, інгібуючих зв'язування Mab 515H7 та/або 301ae5 на CXCR4-експресуючих клітинах, може бути основаним на використанні клітин конкурентним твердофазовим імуноферментним аналізом (ELISA), який описаний Zhao Q. та співавт. (AIDS Research and Human Retroviruses, 2003, 19, pp. 947-955), або викладений у протоколах з використанням методу сортування флуоресцентно-активованих клітин (FACS), наприклад, описаних Juarez J. та співавт. (Leukemia, 2003, 17, pp. 1294-1300). Так, у конкретному аспекті винаходу розглядається спосіб скринінгу та/або ідентифікації молекул як антивірусних засобів-антагоністів CXCR4, який включає стадії: a) добору клітин, експресуючих CXCR4, b) інкубації зазначених клітин з антитілом або одним з його функціональних фрагментів чи похідних за винаходом, і c) оцінки тестованих молекул за їх здатністю інгібувати зв'язування антитіла або одного з його функціональних фрагментів чи похідних з CXCR4, і d) добору молекул, здатних здійснювати зазначене інгібування. В іншому конкретному втіленні можна додати таку стадію (e): e) тестування цих молекул в аналізі реплікації ВІЛ-1. Інші характеристики і переваги даного винаходу будуть зрозумілі далі з опису прикладів та графічних матеріалів, підписи до яких представлені нижче. ПОЯСНЕННЯ ДО ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ На Фіг. 1A та 1B показана стратегія добору на предмет експресії CXCR4 на моноцитах та лімфоцитах. Фіг. 1A: фарбування T-клітин з використанням антитіла CD3-PE (PE позначає фікоеритрин). Фіг. 1B: фарбування моноцитів з використанням антитіла CD14-PE. На Фіг. 2A та 2B показане зв'язування Mab проти CXCR4 515H7 та 301ae5 на моноцитах та T-лімфоцитах. На Фіг. 3A та 3B показане модулювання димеру рецептора CXCR4 під дією SDF-1 та під дією Mab проти CXCR4 515H7 та 301ae5, відповідно, за даними підходу із застосуванням резонансного перенесення енергії біолюмінесценції (BRET) у клітинах HEK293. На Фіг. 4A та 4B та Фіг. 5 показана здатність Mab проти CXCR4 515H7 та 301ae5 інгібувати реплікацію ізоляту KON ВІЛ-1 (X4-тропного вірусу) в PBMC людини. На Фіг. 6A, 6B та 6C показане інгібування SDF-1-індукованого вивільнення кальцію в клітинах CHO-CXCR4 під дією Mab 515H7 (Фіг. 6A), 301ae5 (Фіг. 6B) та c515H7 (Фіг. 6C). На Фіг. 7 та 8 показана здатність Mab проти CXCR4 515H7, c515H7 та 301ae5 інгібувати реплікацію первинних ізолятів MN (Фіг. 7) та 92UG024 (Фіг. 8) X4-тропного вірусу ВІЛ-1 в PBMC людини. На Фіг. 9 показана здатність Mab проти CXCR4 515H7, c515H7 та 301ae5 інгібувати реплікацію первинних ізолятів KON, MN та 92UG024 × 4-тропного вірусу ВІЛ-1 в PBMC людини. На Фіг. 10 та 11 показана здатність Mab проти CXCR4 515H7, c515H7 та 301ae5 інгібувати реплікацію первинного ізоляту 89.6 вірусу ВІЛ-1 з подвійною X4/R5-тропністю в PBMC людини. На Фіг. 12 показаний сприятливий ефект комбінації Mab c515H7 та маравіроку в інгібуванні реплікації первинного ізоляту 89.6 ВІЛ-1 (вірусу з подвійною X4/R5-тропністю) в PBMC людини. На Фіг. 13 показаний сприятливий ефект комбінації Mab c515H7 та маравіроку в інгібуванні реплікації первинного ізоляту UG93067 ВІЛ-1 (вірусу з подвійною X4/R5-тропністю) в PBMC людини. На Фіг. 14 показана здатність Mab проти CXCR4 515H7, c515H7 та 301ae5 інгібувати реплікацію первинного ізоляту KON X4-тропного вірусу ВІЛ-1 в PBMC. Фіг. 15 ілюструє специфічність зв'язування Mab c515H7 за допомогою FACS-аналізу. Фіг. 16 ілюструє вплив Mab з515H7 на гомодимер CXCR4 за даними підходу із застосуванням резонансного перенесення енергії біолюмінесценції (BRET). Фіг. 17: вирівнювання амінокислотних послідовностей варіабельного домену важкого ланцюга 515H7 відносно IGHV3-49*04 та IGHJ4*01 зародкової лінії людини. Амінокислотну послідовність VH 515H7 вирівнюють відносно відібраних послідовностей акцепторного каркаса антитіла людини. Послідовності Вар. 1 VH (VH1) відповідають гуманізованим варіантам VHдоменів 515H7. Єдина зворотна мутація в положенні 76 виділена жирним шрифтом. Фіг. 18: вирівнювання амінокислотних послідовностей легкого ланцюга 515H7 відносно 22 UA 107929 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 IGKV4-1*01 та IGKJ1*01 зародкової лінії антитіла людини. Амінокислотну послідовність VL 515H7 вирівнюють відносно відібраних послідовностей акцепторного каркаса людини. Послідовності Вар. 2.1, Вар. 2.2 та Вар. 2.3 VL відповідають реалізованим гуманізованим варіантам Вар. 2 VL гуманізованого 515H7, при цьому піддані мутації залишки виділені жирним шрифтом. Вар. 2.1 та Вар. 2.2 несуть ще 4 гуманізованих залишки, тоді як Вар. 2.3 містить ще 5 залишків людського антитіла. Фіг. 19: перехресне блокування біотинілованого мишачого антитіла 515H7 химерним 515H7 та різними варіантами гуманізованого 515H7. Активність гуманізованих варіантів 515H7 (Hz515H7) щодо перехресного блокування батьківського мишачого антитіла 515H7 оцінювали з використанням проточної цитометрії, застосовуючи CXCR4-трансфековані NIH3T3-клітини. Активність гуманізованих варіантів порівнювали з химерним 515H7. Перехресна блокувальна активність варіанта VH1 у комбінації з химерною VL (cVL) була дуже схожа з активністю химерної конструкції (A). Що стосується комбінації з варіантом 2 VL, то не було виявлено ніякого зменшення активності для варіанта 1 VH (VH1, варіант без жодних зворотних мутацій) (B). Фіг. 20: інгібування химерним 515H7 та різними варіантами гуманізованого 515H7 зв'язування біотинілованого SDF-1. Здатність гуманізованого варіанта 515H7 (Hz515H7) інгібувати зв'язування SDF-1 оцінювали із застосуванням проточної цитометрії, використовуючи клітинну лінію RAMOS. Інгібуючу здатність гуманізованих варіантів порівнювали з химерним 515H7. Гуманізований варіант Hz515H7 VH1 D76N VL2 мав схожу здатність до інгібування зв'язування SDF-1, як і химерне антитіло. Фрагмент гуманізованого антитіла Hz515 VH1 VL2 був повністю активним в інгібуванні зв'язування SDF-1 із клітинами RAMOS. На Фіг. 21 показане специфічне зв'язування гуманізованих Mab 515H7 (Hz515H7 VH1 D76N VL2, Hz515H7 VH1 D76N VL2.1, Hz515H7 VH1 D76N VL2.2 та Hzz515H7 VH1 D76N VL2.3) з CXCR4 на клітинах NIH3T3-CXCR4. На Фіг. 22 показаний вплив гуманізованих Mab 515H7 (Hz515H7 VH1 D76N VL2, Hz515H7 VH1 D76N VL2.1, Hz515H7 VH1 D76N VL2.2 та Hz515H7 VH1 D76N VL2.3) на гомодимер CXCR4 за даними підходу із застосуванням резонансного перенесення енергії біолюмінесценції (BRET). ПРИКЛАДИ Приклад 1. Одержання моноклональних антитіл (Mab) проти CXCR4 людини Для одержання моноклональних антитіл до CXCR4 мишей Balb/c імунізували, використовуючи рекомбінантні клітини NIH3T3-CXCR4 та/або пептиди, що відповідають позаклітинним N-кінцю і петлям CXCR4. Мишей у віці 6-16 тижнів імунізували однократно антигеном у повному ад'юванті Фрейнда підшкірно (п/ш), потім проводили 2-6 п/ш імунізацій антигеном у неповному ад'юванті Фрейнда. Імунну відповідь реєстрували, беручи кров з ретроорбітального синуса. Скринінг сироватки крові проводили за допомогою ELISA (як описано нижче) і для злиття використовували мишей з більш високими титрами антитіл проти CXCR4. Мишам проводили внутрішньовенну бустер-імунізацію антигеном за дві доби до умертвіння та витягали селезінку. - ELISA Для добору мишей, продукуючих антитіла проти CXCR4, зразки сироватки крові імунізованих мишей тестували за допомогою ELISA. Стисло, мікротитрувальні планшети покривали очищеним N-кінцевим [1-41]-пептидом, кон'югованим з BSA (бичачим сироватковим альбуміном) у концентрації 5 мкг-еквівалентів пептиду/мл (100 мкл/лунку), інкубували при 4 °C протягом ночі, потім блокували 0,5 %-им желатином в PBS (забуференому фосфатом фізіологічному розчині) (250 мкл/лунку). В кожну лунку додавали розведення плазми крові CXCR4-імунізованих мишей та інкубували 2 години при 37 °C. Планшети промивали PBS і потім інкубували з антитілом кози проти мишачого IgG, кон'югованим з HRP (пероксидазою хрону) (Jackson Laboratories), протягом 1 години при 37 °C. Після промивання планшети обробляли субстратом TMB (тетраметилбензидином), реакцію зупиняли через 5 хв, додаючи 1M H 2SO4 (100 мкл/лунку). Мишей, у яких розвилися найвищі титри антитіл проти CXCR4, використовували для одержання антитіл. - Одержання гібридом, продукуючих Mab до CXCR4 Злиття мишачих спленоцитів, виділених з мишей Balb/c, у яких розвилися найвищі титри антитіл проти CXCR4, з лінією мієломних клітин миші Sp2/O проводили, використовуючи ПЕГ. 5 Клітини висівали в кількості приблизно 110 /лунку в мікротитрувальних планшетах, після чого інкубували протягом двох тижнів у селективному середовищі, що містить середовище Ultraculture+2 мМ L-глутаміну + 1 мМ пирувату натрію + 1HAT (гіпоксантин, аміноптерин, тимідин). Далі за допомогою ELISA проводили скринінг лунок на предмет моноклональних IgG антитіл проти CXCR4. Потім гібридоми, секретуючі антитіла, щонайменше двічі піддавали субклонуванню, використовуючи метод граничних розведень, культивували in vitro для 23 UA 107929 C2 5 10 одержання антитіла для подальших аналізів. Приклад 2. Характеристика специфічності зв'язування Mab проти CXCR4 515H7 та 301ae5 (трансфектанта NIH3T3-CXCR4) з використанням FACS-аналізу У цьому експерименті специфічне зв'язування Mab проти CXCR4 515H7 та 301ae5 з CXCR4 людини (hcxcr4) вивчали, використовуючи FACS-аналіз. Клітини NIH3T3 та NIH3T3-hCXCR4-трансфековані клітини інкубували з моноклональними антитілами 515H7 та 301ae5 у концентрації 10 мкг/мл. Потім клітини промивали сумішшю 1 % BSA/PBS/0,01 % NaN3. Далі до клітин додавали Alexa-мічені вторинні антитіла і залишали інкубуватися при 4 °C протягом 20 хв. Потім клітини знову двічі промивали. Після другого промивання проводили FACS-аналіз. Результати цих досліджень зв'язування представлені в наведеній далі Таблиці 8, у якій показано (згідно із середньою інтенсивністю флуоресценції (MFI), отриманою з використанням FACS), що Mab проти CXCR4 515H7 та 301ae5 зв'язуються специфічно із клітинною лінією NIH3T3, трансфекованою CXCR4 людини, тоді як на батьківських NIH3T3-клітинах ніякого розпізнавання немає. 15 Таблиця 8 Клон 515H7 (10 мкг/мл) Клон 301ae5 (10 мкг/мл) 20 25 30 35 40 45 50 55 NIH3T3 (MFI) 16 21 NIH3T3-CXCR4 (MFI) 2752 1367 Приклад 3. Характеристика зв'язування Mab проти CXCR4 515H7 та 301ae5 з мононуклеарними клітинами периферичної крові (PBMC) з використанням FACS-аналізу Крів одержували у вигляді світлого шару кров'яного згустка від здорового донора. По 100 мкл цільної крові інкубували з антитілами проти CXCR4 людини (клони 515H7 та 301ae5) у зазначеній концентрації протягом 20 хвилин при 4 °C. Кров тричі промивали в суміші PBS-BSA (1 %)-NaN3 (0,01 %) та інкубували з міченими Alexa 488 антитілами кози проти IgG людини в розведенні 1:500 (Invitrogen) протягом 20 хвилин при 4 °C. Потім клітини промивали та інкубували з CD14-PE (Caltag) або CD3-PE (Caltag) протягом 10 хвилин при 4 °C і промивали три рази. Лізис еритроцитів здійснювали, використовуючи розчин High-Yield lyse (Caltag), протягом 10 хвилин при кімнатній температурі. Клітини негайно аналізували, використовуючи Facscalibur (проточний цитометр) (Becton-Dickinson). Експресію CXCR4 на моноцитах здійснювали, використовуючи CD14-позитивні клітини, а експресію CXCR4 на T-клітинах здійснювали, використовуючи CD3-позитивні клітини (Фіг. 1). Результати виражені у вигляді антигензв'язуючої здатності (ABC). Як показано на Фіг. 2A та 2B, клони 515H7 та 301ae5 проти CXCR4 людини офарблювали як T-лімфоцити (Фіг. 2A), так і моноцити (Фіг. 2B), вказуючи на те, що Mab 515H7 та 301ae5 здатні розпізнавати природну форму CXCR4, експресовану на клітинній поверхні моноцитів та Tлімфоцитів. Приклад 4. Вплив Mab 515H7 та 301ae5 на гомодимер CXCR4 за даними підходу із застосуванням резонансного перенесення енергії біолюмінесценції (BRET) Цей функціональний аналіз дозволяє оцінити вплив конформаційних змін, індукованих SDF1 та/або зв'язуванням Mab 515H7 з рецептором CXCR4 на рівні гомодимеру CXCR4. Експресуючі вектори для досліджуваних взаємодіючих партнерів конструювали у вигляді векторів, що кодують білки, злиті з відповідним "барвником" (люциферазою Renilla reniformis, Rluc, та жовтим флуоресцентним білком, YFP), застосовуючи традиційні методи молекулярної біології. За дві доби до проведення експериментів із застосуванням BRET проводили тимчасову трансфекцію клітин HEK293 експресуючими векторами, що кодують відповідні партнери для BRET: [CXCR4/Rluc+CXCR4/YFP] з метою вивчення гомодимеризації CXCR4. Через одну добу клітини розміщали в попередньо покритих полілізином білих планшетах 96 MW (багатолункових на 96 лунок; від англ. multi-well plates) у повному культуральному середовищі (DMEM (модифіковане за Дульбекко середовище Ігла), доповненому 10 % FBS (фетальної телячої сироватки)). Спочатку клітини культивували при 37 °C з 5 % CO2, щоб дати клітинам можливість прикріпитися до планшета. Потім клітини протягом ночі піддавали голодуванню, використовуючи по 200 мкл DMEM/лунку. Безпосередньо перед проведенням експерименту із застосуванням BRET DMEM видаляли і клітини швидко промивали PBS. Далі клітини інкубували в PBS у присутності або за відсутності антитіла протягом 10 хв при 37 °C, після чого додавали 5 мкМ коелентеразину H разом з SDF-1 (300 нМ) або без нього в кінцевому об'ємі 50 мкл. Після інкубації протягом наступних 10 хвилин при 37 °C починали вимірювання емісії світла при 485 нм та 530 нм, використовуючи багатомодальний ридер (multilabel reader) Mithras LB940 24 UA 107929 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (Berthold) (1 с/довжина хвилі/лунку, повторення 15 раз при кімнатній температурі). Розрахунки співвідношення BRET проводили, як описано раніше (Angers та співавт., 2000): [(емісія530 нм) - (емісія485 нм)  Cf] / (емісія485 нм), де Cf = (емісія530 нм)/(емісія485 нм), для клітин, експресуючих у таких саме експериментальних умовах тільки злитий з Rluc білок. Спрощення цього виразу показує, що співвідношення BRET відповідає співвідношенню 530/485 нм, отриманому, коли присутні два партнери по BRET, скоригованому з урахуванням співвідношення 530/485 нм, отриманого в тих самих експериментальних умовах, коли в даному аналізі присутній тільки один партнер, злитий з Rluc. Для зручності результати виражають в одиницях міліBRET (mBU); mBU відповідає співвідношенню BRET, помноженому на 1000. SDF1 (300 нм) збільшував приблизно на 20 % сигнал BRET, обумовлений просторовою близькістю адапторного і акцепторного білків, злитих з рецептором CXCR4, це очевидно вказує на утворення гомодимерів CXCR4/CXCR4 або на конформаційні зміни у вже існуючих димерах (Фіг. 3A та B). Mab 515H7 та 301ae5 були здатні модулювати SDF1-індуковані конформаційні зміни гомодимерів CXCR4 (інгібування на 69 % SDF1-індукованого збільшення сигналу BRET для 515H7 та 301ae5, Фіг. 3A та B). Самі Mab 515H7 та 301ae5 також були здатні модулювати просторову близькість CXCR4/CXCR4, що вказує на вплив Mab 515H7 та 301ae5 на конформацію гомодимеру CXCR4/CXCR4. (Фіг. 3A та 3B). Приклад 5. Інгібування реплікації первинного ізоляту KON ВІЛ-1 (X4-тропного вірусу) в PBMC людини під дією Mab проти CXCR4 515H7 та 301ae5 PBMC від нормальних донорів, серонегативних по відношенню до ВІЛ-1, виділяли зі світлих шарів кров'яного згустка або з використанням цитаферезу за допомогою центрифугування в градієнті фікол-гіпак. PBMC активували в присутності PHA (фітогемаглютиніну) у клітинному культуральному середовищі RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute), що містить 25 мМ HEPES (N-2-етансульфонову кислоту), 5 мл пеніциліну (10000 од./мл)-стрептоміцину (10000 мкг/мл), 2 мМ L-глутаміну, доповненому 10 % інактивованої нагріванням FCS, та використовували як клітинні мішені в аналізі нейтралізації протягом одного циклу. Реплікацію ВІЛ-1 у первинних PBMC людини здійснювали, оцінюючи внутрішньоклітинне фарбування вірусного антигену p24 за допомогою FACS-аналізу. Стисло, Mab 515H7, 301ae5 та 12G5 (R&D Systems) у різних розведеннях або культуральне середовище як контроль (RPMI 1640, 10 % FCS, 0,1 % IL-2 (інтерлейкін-2)) (по 25 мкл на одну лунку) інкубували протягом 1 год. при 37 °C разом з розведенням первинного ізоляту KON X-4 ВІЛ-1 (по 25 мкл на одну лунку) у двох повторах. До даної суміші Mab/вірус додавали PHA-активовані PBMC людини (25 мкл/лунку; 6 2010 клітин/мл) в 96-лунковому планшеті (з U-подібним дном, Costar 3599) та культивували протягом 24-36 годин при 37 °C в RPMI 1640, 10 % FCS та 0,1 % IL-2. Вводили контроль, що складається з неінфікованих PBMC у середовищі без Mab. Для детекції ВІЛ-інфікованих PBMC проводили внутрішньоклітинне фарбування вірусного антигену p24 та аналізували методом проточної цитометрії. Клітини фіксували і пермеабілізували, використовуючи набір Cytofix/Cytoperm (Becton Dickinson) відповідно до протоколів виробника, офарблювали флуоресцентним Mab проти p24 (клон KC57-Coulter Beckman), використовуючи розведення 1/160, інкубували протягом 10 хв при 4 °C у темряві. Після промивання в середовищі PBS-3 % FCS PBMC розбавляли в PBS, після чого проводили аналіз методом проточної цитометрії. Процентний вміст p24-позитивних клітин у різних зразках визначали, пропускаючи 20000 подій на одну популяцію живих клітин. Субпопуляції живих клітин аналізували на предмет експресії p24 відносно фонового фарбування неінфікованих клітин. Кількість позитивних щодо антигену p24 клітин одержували після віднімання фонових подій для фіктивно інфікованих клітин. Відсоток нейтралізації визначали як зменшення кількості p24-позитивних клітин у порівнянні з контрольними інфікованими лунками, що не містять Mab. Нейтралізуючий титр визначали як розведення Mab, що забезпечує зниження на 90 % вмісту інфікованих клітин. Mab проти CXCR4 515H7 та 301ae5 порівнювали з Mab 12G5, відомим Mab проти CXCR4 як Mab порівняння для застосування в дослідженні ВІЛ. Як показано на Фіг. 4A та B та 5, Mab проти CXCR4 515H7 та 301ae5 здатні інгібувати реплікацію первинного ізоляту KON ВІЛ-1 в PBMC з IC90, рівним 10 мкг/мл (66 нМ) та 150 мкг/мл (1 мкМ), відповідно, тоді як Mab 12G5 не інгібувало реплікацію первинного ізоляту KON ВІЛ-1 в PBMC (Фіг. 4A). Приклад 6. Опосередкована рецептором CXCR4 мобілізація кальцію із внутрішньоклітинних депо Цей функціональний аналіз був розроблений для реєстрації передачі сигналу за участю рецептора CXCR4 шляхом стимулювання шляху фосфоліпази C, включаючи вивільнення кальцію із внутрішньоклітинних депо ендоплазматичного ретикулума. Клітини CHO-K1, стабільно і конститутивно експресуючі рецептор CXCR4 людини, 25 UA 107929 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 одержували після трансфекції раніше не підданих експериментам клітин CHO-K1 (№ в ATCC (Американська колекція типових культур) CCL-61) експресуючим вектором для ссавців, який несе повну кодуючу послідовність, рецептора CXCR4 людини (№ у базі даних Refseq (Reference Sequence standards) NM_003467). Клітини підрощували в повному культуральному середовищі (DMEM з живильною сумішшю Хема F12, доповненому 5 % фетальної телячої сироватки (FCS) та генетицином (500 мкг/мл)). Клітини розсівали в чорні 96 MW-планшети із щільністю 100000 клітин/лунку у відповідному культуральному середовищі. Клітини піддавали голодуванню протягом ночі перед проведенням експериментів. Клітини навантажують флуоресцентним барвником на кальцій (Fluo-4 No Wash (NW, без промивання), Invitrogen US) у завантажувальному буфері (HBSS (збалансований сольовий розчин Хенкса) 1; HEPES, 20 мМ; пробеніцид (кислота), 25 мМ) протягом 30 хв. при 37 °C, потім протягом 30 хв. при 25 °C. Стимуляцію під дією SDF-1 здійснювали прямим введенням у кожну лунку. В експериментах з вивчення антагонізму безпосередньо в завантажувальний буфер додають 10 мкл розчину Mab щонайменше за 10 хв. до введення SDF-1. Виміри кінетики флуоресценції проводять на мультимодальному флуоресцентному мікропланшетному ридері Mithras LB940 (Berthold), використовуючи такі параметри: для збудження - 485 нм, для емісії - 535 нм, для енергії збудження - 10000 умовних одиниць. Флуоресценцію в кожній лунці реєструють щосекунди протягом 0,1 секунди і протягом періоду часу 20 с перед введенням SDF-1 (базисний сигнал). Потім вводять 20 мкл розчину SDF-1 та проводять реєстрацію даних протягом періоду часу 2 хв. Кожен окремий експеримент виконують у двох повторах. Величини для кожної лунки спочатку коригують, віднімаючи базисну флуоресценцію і флуоресценцію, емітовану контрольною лункою без клітин. Відносні дані виражають як відсоток від максимальної стимуляції, отриманої під дією SDF-1 (100 нМ). SDF-1 (100 нМ) індукував швидке і значне вивільнення внутрішньоклітинного кальцію в рекомбінантних CHO/CXCR4, тоді як для раніше не підданих експериментам клітин CHO-K1 ніякого флуоресцентного сигналу не зареєстровано. Максимальна інтенсивність досягала більше 140 % від базисної флуоресценції і спостерігалася приблизно через 40 с після стимуляції за допомогою SDF-1 (Фіг. 6A, 6B та 6C). Mab 515H7 (133 нМ) (Фіг. 6A) та c515H7 (133 нМ) (Фіг. 6C) викликали сильне інгібування кальцієвого сигналу, індукованого SDF-1 (100 нМ). Mab 301ae5 (133 нм) (Фіг. 6B) викликало часткове інгібування кальцієвого сигналу, індукованого SDF-1 (100 нМ). Приклад 7. Інгібування реплікації первинних ізолятів KON, MN та 92UG024 ВІЛ-1 (X4-тропних вірусів) в PBMC людини під дією Mab проти CXCR4 515H7, c515H7 та 301ae5 Аналіз нейтралізації протягом одного циклу Цей аналіз проводять протягом 36 год. з використанням первинних ізолятів KON, MN та 92UG024, концентрованих та відповідно розведених для можливості детекції 2 % інфікованих CD4 T-лімфоцитів через 2 доби інфекції. По двадцять п'ять мікролітрів розчинів Mab 515H7, c515H7 та 301ae5 у різних розведеннях інкубували протягом 1 год. при 37 °C разом з 25 мкл зразків вірусу. PBMC людини (25 мкл, 20  6 10 клітин/мл) додавали до суміші Mab/вірус в 96-лунковому планшеті (з U-подібним дном, Costar 3599) та культивували протягом 36 год. в RPMI 1640 з 10 % FCS та 20 од./мл IL-2 (R&D Systems, Minneapolis, MN). Через 2 доби культивування проводили детекцію ВІЛ-інфікованих лімфоцитів шляхом внутрішньоклітинного фарбування вірусного Ag (антигену) p24. Клітини фіксували і пермеабілізували, використовуючи як набір Cytofix/Cytoperm, так і набір Perm/Wash (BD Biosciences) відповідно до інструкцій виробника, та офарблювали флуоресцентним анти-p24 Mab (FITC (флуоресцеїнізотіоціанат)або PE-анти-P24, клон KC57; Beckman Coulter/Immunotech, Hialeah, FL), використовуючи розведення 1/160 у розчині Perm/Wash, доданим на 15 хв. при 4 °C. Після промивання в PBS, що містить 3 % FBS, PBMC розбавляли в 300 мкл PBS, після чого проводили аналіз методом проточної цитометрії (LSRII; BD Biosciences) із програмним забезпеченням DIVA (BD Biosciences). Процентний вміст p24-позитивних клітин у різних зразках визначали, пропускаючи 20000 подій на одну популяцію живих клітин, ідентифікованих за параметрами прямого і бічного світлорозсіювання. Субпопуляції живих клітин аналізували, використовуючи набір розчинів для фарбування живих/мертвих клітин (live/dead solution kit, Invitrogen). Кількість p24 Ag-позитивних клітин одержували після віднімання фонових подій для фіктивно інфікованих клітин. Відсоток нейтралізації визначали як зменшення кількості p24-позитивних клітин у порівнянні з контрольними інфікованими лунками, що не містять Mab. Нейтралізуючий титр визначали як концентрацію антитіла (отриману інтерполяцією в діапазоні послідовних розведень, проведених у трьох повторах), що забезпечує зниження на 90 % вмісту інфікованих клітин. 26 UA 107929 C2 Як показано на Фіг. 7, 8 та 9, Mab проти CXCR4 515H7, c515H7 та 301ae5 здатні інгібувати реплікацію первинних ізолятів MN, KON та 92UG024 × 4-ВІЛ-1 в PBMC. Результати для IC (у мкг/мл) підсумовані у Таблиці 9. Таблиця 9 301ae5 515H7 c515H7 KON % інгібування інфікованих клітин 90 80 50 >150 >150 150 15 8 1 20 10 1,5 MN % інгібування інфікованих клітин 90 80 50 >150 150 1 10 1,5