Сконструйований білок cry1ba, активний щодо лускокрилих комах

Реферат: Представлений винахід забезпечує сконструйовані білки СгуlВа (еСгуlВа), які мають покращену розчинність і підвищену токсичність щодо лускокрилих комах-шкідників. Шляхом заміщення щонайменше однієї амінокислоти в домені І білка СгуlВа розроблений сконструйований білок СгуlВа, який має істотно змінені інсектицидні властивості. Додатково розкриті спосіб одержання сконструйованих білків СгуlВа і способи використання послідовностей нуклеїнових кислот еСгуlВа, наприклад, у трансгенних рослинах, для експресії білків еСгуlВ для надання захисту від ушкодження комахами. Розкриті композиції і способи боротьби зі шкідниками. UA 110925 C2 (12) UA 110925 C2 UA 110925 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ІНСЕКТИЦИДНІ БІЛКИ ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ [0001] Даний винахід відноситься до галузей білкової інженерії, молекулярної біології рослин і боротьби зі шкідниками. Більш конкретно, даний винахід відноситься до нових сконструйованих білків Cry1Ва і послідовностей нуклеїнових кислот, чия експресія дає в результаті сконструйовані Cry1Ba білки, та способів одержання і способів застосування сконструйованих Cry1Ba білків і відповідних послідовностей нуклеїнових кислот для боротьби з комахами. ПЕРЕДУМОВИ [0002] Bacillus thuringiensis (Bt) білки Cry (також іменовані δ-ендотоксинами або Cryтоксинами) являють собою білки, які утворюють кристалічний матрикс у Bacillus, що, як відомо, мають інсектицидну активність, коли поглинаються певними комахами. Більше 180 білків голотипу Cry в 58 сімействах були визначені й одержали назву. Різні білки Cry були класифіковані на підставі їхнього спектра активності і гомології послідовності. До 1990 року основні класи були визначені за допомогою їхнього спектра активності (Hofte and Whitely, 1989, Microbiol. Rev. 53:242-255), але зовсім недавно була розроблена нова номенклатура, яка систематично класифікує білки Cry на основі гомології амінокислотної послідовності, а не цільових специфічностей стосовно комах (Crickmore et al. 1998, Microbiol. Molec. Biol. Rev. 62:807-813). [0003] Більшість Cry білків, активних проти лускокрилих комах, формуються в кристалічному матриксі як 130-140 кДа протоксину. У лускокрилих комах лужний pН кишки солюбілізує кристал і потім кишкові протеази обробляють протоксин до токсичних білків приблизно 60-70 кДа. Процесинг протоксину до токсину, як повідомлялося, відбувається шляхом вилучення як N-, так і C-кінцевих амінокислот, причому точне положення процесингу залежить від специфічного Cry білка і відповідних специфічних кишкових соків комахи (Ogiwara et al., 1992, J. Invert. Pathol. 60:121-126). Протеолітична активація Cry протоксину може відігравати істотну роль у визначенні його специфічності. [0004] Була встановлена тривимірна структура для деяких Cry білків. Cry3A білок, який активний стосовно твердокрилих комах, має три структурні домени: N-кінцевий домен I із залишків 58-290 складається з 7 альфа-спіралей, домен II із залишків 291-500 містить три складчасті бета-шари в так названій конформації грецького ключа, і C-кінцевий домен III із залишків 501-644 є бета-сендвічем у так названій конформації типу "jelly roll". Була також установлена тривимірна структура для активного Cry1Aa токсину лускокрилих (Grochulski et al., 1995, J. Mol. Biol. 254:447-464). Cry1Aa токсин також має три домени: N-кінцевий домен I із залишків 33-253, домен II із залишків 265-461 і домен III із залишків 463-609 з додатковим зовнішнім ланцюгом в одному з β-листів, сформованим залишками 254-264. Якщо Cry3A і Cry1Aa структури спроекціювати на інші Cry1 послідовності, то домен I локалізований від приблизно амінокислотного залишку 28 до 260, домен II - із приблизно 260 до 460 і домен III - із приблизно 460 до 600. Див. Nakamura et al., Agric. Biol. Chem. 54(3): 715-724 (1990); Li et al., Nature 353: 815-821 (1991); Ge et al., J. Biol. Chem. 266(27): 17954-17958 (1991); і Honee et al., Mol. Microbiol. 5(11): 2799-2806 (1991); кожна з яких включена в даний документ посиланням. Таким чином, на даний момент відомо, що на основі гомології амінокислотної послідовності всі Bt білки Cry мають подібну тривимірну структуру, яка містить три домени. [0005] На основі структури була сформульована гіпотеза, яка стосується взаємозв'язку структури/функції Cry білків. У цілому, вважається, що домен I, найбільший N-кінцевий домен, у першу чергу відповідає за утворення пор у кишковій мембрані комахи (Gazit & Shai, 1993, Appl. Environ. Microbiol. 57:2816-2820), домен II у першу чергу відповідає за взаємодію з кишковим рецептором, таким чином, визначаючи специфічність токсину (Ge et al., 1991, J. Biol. Chem. 32:3429-3436) і домен III, найбільший C-кінцевий домен, найбільш ймовірно зв'язаний з білковою стабільністю (Li et al. 1991, вище), а також має регуляторний вплив на активність іонного каналу (Chen et al., 1993, PNAS 90:9041-9045). Домен III також був залучений до визначення специфічності (Патент США № 6204246, включений у даний документ посиланням). Обмін доменом III між активними проти лускокрилих токсинами, наприклад, за допомогою in vivo рекомбінації між кодуючими ділянками, може привести до змін у специфічній активності. Експерименти по зв'язуванню з використанням таких гібридів показали, що домен III бере участь у зв'язуванні з передбачуваними рецепторами цільових комах, підтверджуючи, що домен III може мати деякий вплив на специфічність, відіграючи роль у розпізнаванні рецептора. [0006] Частини токсину Bt Cry білків також характеризуються наявністю п'яти консервативних блоків у їхній амінокислотній послідовності (Hofte & Whiteley, вище). Консервативний блок 1 (CB1) містить приблизно 29 амінокислот. Консервативний блок 2 (CB2) 1 UA 110925 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 містить приблизно 67 амінокислот. Консервативний блок 3 (CB3) містить приблизно 48 амінокислот. Консервативний блок 4 (CB4) містить приблизно 10 амінокислот. Консервативний блок 5 (CB5) містить приблизно 12 амінокислот. Послідовності до і після цих п'яти консервативних блоків є високо варіабельними і, таким чином, позначаються як "варіабельні області ” V1-V6. Домен I Bt Cry білка типово містить C-кінцеву частину варіабельної області 1, повний консервативний блок 1, цілу варіабельну область 2, і 52 N-кінцеві амінокислоти консервативного блоку 2. Домен II типово містить приблизно 15 C-кінцевих амінокислот консервативного блоку 2, варіабельну область 3 і приблизно 10 N-кінцевих амінокислот консервативного блоку 3. Домен III типово містить приблизно 38 C-кінцевих амінокислот консервативного блоку 3, варіабельну область 4, консервативний блок 4, варіабельну область 5 і консервативний блок 5. Активні щодо лускокрилих токсини Cry1, серед інших білків Cry, мають варіабельну область 6 із приблизно 1-3 амінокислотами, які лежать у домені III. [0007] Деякі білки Cry, наприклад, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1F і Cry2Ba були експресовані в трансгенних сільськогосподарських рослинах і комерційно використані для боротьби з визначеними шкідниками-лускокрилими комахами. Наприклад, трансгенні гібриди кукурудзи, які експресують білок Cry1Ab, були комерційно доступні протягом 10 років. Білок Cry1Ab у цих гібридах кукурудзи націлений у першу чергу на європейського метелика кукурудзяного (Ostrinia nubilalis), основного лускокрилого шкідника в Кукурудзяному поясі США. [0008] Одне питання, яке виникло щодо широкого використання трансгенних сільськогосподарських культур, що експресують білок Cry, полягає в тому, чи стануть комахишкідники стійкими до білка Cry. Комахи, як було доведено, здатні до розвитку стійкості до продуктів, що містять білок Cry. Стійкість у молі капустяної (Plutella xylostella) й інших шкідників овочів до комерційних Bt-мікробних обприскувань, широко використовуваним в органічному землеробстві, розвинулася в декількох областях світу. Один недавній випадок польової стійкості в популяції совки трав'яної (Spodoptera frugiperda), підданої дії трансгенної кукурудзи, яка експресує білок Cry1F, був зафіксований документально на острові Пуерто-Ріко (Storer et al. 2010. J. Econ. Entomol. 103:1031-1038). Однак у Сполучених Штатах не було випадків невдач, пов'язаних зі стійкими польовими популяціями кукурудзяних або бавовняних шкідників, підданих дії трансгенних сільськогосподарських культур з 1996, коли були уперше впроваджені трансгенні сільськогосподарські культури, які експресують білки Cry. [0009] Промислове насінництво, університетські дослідники і Управління охорони навколишнього середовища США працювали разом над розробкою планів управління, щоб допомогти зменшити виникнення стійкості комах. Вони ґрунтуються, у першу чергу, на стратегії високої дози і стратегії заказників. Стратегія високої дози для європейського метелика кукурудзяного у кукурудзи, наприклад, полягає в застосуванні гібридів кукурудзи, які експресують досить високі рівні білка Cry, щоб знищити навіть частково стійких європейських метеликів кукурудзяних. Гіпотеза, яка лежить в основі цього, полягає в тому, що знищення частково стійких ECB (європейських метеликів кукурудзяних) і попередження їхнього спарювання значно сповільнює розвиток стійкості. Успіх стратегії високої дози залежить частково від специфічної активності Cry-токсину по відношенню до європейського метелика кукурудзяного і того, як багато цього Cry-токсину може бути експресовано в трансгенній рослині кукурудзи. Наприклад, чим вища специфічна активність Cry-токсину по відношенню до шкідника, тим менша кількість Cry-токсину повинна експресуватись в трансгенній рослині для досягнення стратегії високої дози. Завдяки тому, що Cry1Ab є дуже токсичним для личинок європейського метелика кукурудзяного (тобто висока специфічна активність), рівні експресії Cry1Ab, які досягаються в трансгенних рослинах, легко поміщають такі гібриди кукурудзи в категорію високої дози. [0010] Інші можливі шляхи знизити розвиток стійкості включають поступове збільшення вмісту різних білків Cry в тій самій трансгенній сільськогосподарській рослині або заміщення існуючих готових продуктів новими продуктами, які продукують різні білки Cry. Наприклад, як тільки старіє ринок існуючих кукурудзяних гібридів Cry1Ab, можуть бути введені нові продукти, які мають білки Cry, відмінні від Cry1Ab, або інші білки Cry на додаток до Cry1Ab. Переважно білки, які заміщають Cry1Ab, будуть мати таку ж або подібну специфічну активність проти європейського метелика кукурудзяного, як і Cry1Ab. [0011] Одним можливим Cry-токсином для заміщення Cry1Ab може бути Cry1Ba-токсин. Голотипний Cry1Ba-токсин був вперше описаний Brizzard et al. у 1988 (Nuc. Acids Res. 16:27232724). Згодом, були визначені п'ять інших Cry1Ba-токсинів, причому кожний має близько 99 % ідентичність з голотипним токсином. Cry1Ba-токсини, як повідомлялося, мають активність по відношенню до визначених лускокрилих шкідників, таких як білявка капустяна (Pieris brassicae), міль капустяна (Plutella xylostella), єгипетська совка бавовняна (Spodoptera littoralis), совка мала 2 UA 110925 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (Spodoptera exigua) і європейський метелик кукурудзяний (Ostrinia nubilalis). Однак Cry1Ba, як повідомлялося, є більше ніж у 2 рази менш активним щодо кукурудзяного метелика, аніж Cry1Ab (Див., наприклад, патент США № 5628995), і повідомлялося, що він не має активності щодо інших основних кукурудзяних шкідників, наприклад, бавовняної совки (Helicoverpa zea) (Див., наприклад, Karim et al. 2000. Pestic. Biochem. Physiol. 67: 198-216) і NAFTA-популяцій совки трав'яної (Spodoptera frugiperda) (Див., наприклад, Monnerat et al. 2006. Appl. Environ. Microbiol. 72:7029-7035). Однією з причин того, що Cry1Ba є не таким активним як Cry1Ab щодо щонайменше європейського кукурудзяного метелика, може бути його нижча розчинність. Таким чином, існує необхідність покращити специфічну активність Cry1Ba щодо щонайменше європейського кукурудзяного метелика і, по можливості, розширити спектр його активності для підвищення його потенціалу в якості замісника Cry1Ab у трансгенній кукурудзі. [0012] Спектр інсектицидної активності окремого Cry-токсину з Bt може бути досить вузьким, при цьому даний Cry-токсин є активним тільки щодо деяких видів у межах порядку. Наприклад, білок Cry3A відомий як дуже токсичний для колорадського жука, Leptinotarsa decemlineata, але має дуже низьку токсичність або взагалі не токсичний для споріднених жуків у роді Diabrotica (Johnson et al., 1993, J. Econ. Entomol. 86:330-333). До того ж невеликі зміни в амінокислотній послідовності в межах класу білків Cry можуть вплинути на інсектицидну активність. Наприклад, von Tersch et al. (1991, Appl. Environ. Microbiol. 57:349-358) показав, що білки Cry1Ac, варіабельні за сімома амінокислотам, показали істотні відмінності в їхньому спектрі інсектицидної активності. Хоча розглядаються в першу чергу активні щодо лускокрилих токсини, Cry1Ba-токсини, як було також показано, є активними щодо визначених твердокрилих комахшкідників, включаючи колорадського жука (Leptinotarsa decemlineata), листоїда тополиного (Chrysomela scripta) і жука кавового (Hypothenemus hampei). [0013] Специфічність білків Cry є результатом ефективності різних етапів, залучених у виробництво активного білка токсину і його наступної взаємодії з епітеліальними клітинами в середній кишці комахи. Щоб бути інсектицидними, більшість відомих білків Cry повинні спочатку бути поглиненими комахою і протеолітично активуватися для утворення активного токсину. Активація інсектицидних кристалічних білків є багатоетапним процесом. Після потрапляння усередину кристали повинні спочатку бути солюбілізовані в кишці комахи. Після їх солюбілізації білки Cry активуються специфічними протеолітичними відщепленнями. Протеази в кишці комахи можуть відігравати роль у специфічності за допомогою визначення, де піддається процесингу білок Cry. Як тільки Cry білок був солюбілізований і піддався процесингу, він зв'язується зі специфічними рецепторами на поверхні епітелію середньої кишки комахи і згодом інтегрується в ліпідний бішар мембрани щіткової облямівки. Потім утворюються іонні канали, порушуючи нормальну функцію середньої кишки, в результаті зумовлюючи смерть комахи. Існують явні відмінності у властивостях розчинності частин токсину білків Cry. [0014] Визначені білки Cry, активні щодо лускокрилих, були сконструйовані з метою поліпшити специфічну активність або розширити спектр інсектицидної активності. Наприклад, домен специфічності до шовкопряда шовковичного (Bombyx mori) з Cry1Aa поміщали на Cry1Ac, таким чином, надаючи отриманому химерному білку нову інсектицидну активність (Ge et al. 1989, PNAS 86: 4037-4041). Також Bosch et al. 1998 (патент США № 5736131) створив новий активний щодо лускокрилих токсин шляхом заміщення домену III Cry1E доменом III Cry1C, таким чином, отримавши Cry1E-Cry1C гібридний токсин з більш широким спектром активності щодо лускокрилих. [0015] Залишається необхідність у розробці нових і ефективних засобів боротьби зі шкідниками, які забезпечують економічну користь фермерам і які прийнятні для навколишнього середовища. Необхідні білки з істотно зміненими властивостями, такі як сконструйовані білки Cry1Ba даного винаходу, які мають більшу специфічну активність, аніж нативні Cry1Ba білки щодо щонайменше європейського кукурудзяного метелика, основного шкідника кукурудзи в Сполучених Штатах, який може стати стійким до існуючих засобів боротьби з комахами. Крім того, сконструйовані білки Cry1Ba, застосування яких за допомогою трансгенних рослин мінімізує шкоду навколишньому середовищу, являються бажаними. [0016] При збільшенні специфічної активності Cry1Ba щонайменше до європейського метелика кукурудзяного буде необхідно, щоб у рослині маїсу експресувалось менше білка Cry1Ba, таким чином, знижуючи можливі негативні впливи Cry1Ba на рослину. До того ж, збільшена специфічна активність дозволяє застосовувати сконструйований Cry1Ba у стратегії високої дози для ECB. КОРОТКИЙ ОПИС [0017] З урахуванням цих потреб, метою даного винаходу є забезпечити нові сконструйовані білки Cry1Ba (eCry1Ba), які мають по суті змінені властивості, що є поліпшеними у порівнянні з і 3 UA 110925 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 відрізняються від нативних Cry1Ba білків, особливо біохімічні властивості, пов'язані з інсектицидною активністю до лускокрилих шкідників кукурудзи, включаючи без обмеження, таких шкідників як європейський кукурудзяний метелик (ECB; Ostrinia nubilalis), бавовняна совка (CEW; Helicoverpa zea), кукурудзяна південно-західна вогнівка (SWCB; Diatraea grandiosella), очеретяна вогнівка (SCB; Diatraea saccharalis), соєва совка (SBL; Pseudoplusia includens), гусениця оксамитових бобів (VBC; Anticarsia gemmatalis) і т. п. Шляхом заміщення амінокислот у ключових визначених положеннях у нативній Cry1Ba білковій послідовності або Cry1Ba білка дикого типу, як визначено в даному документі, відповідно до даного винаходу, розробляють білок еCry1Ba, який має по суті змінені властивості розчинності і/або інсектицидні властивості у порівнянні з нативним Cry1Ba. Даний винахід додатково відноситься до послідовностей нуклеїнових кислот, які кодують білки eCry1Ba, і до композицій і складів, які містять білки eCry1Ba, здатні інгібувати здібність комах-шкідників виживати, рости і розмножуватися, або обмежувати пов'язане з комахами пошкодження або загибель сільськогосподарських рослин. Даний винахід додатково відноситься до способу одержання білків eCry1Ba і способів застосування білків eCry1Ba, наприклад, в трансгенних рослинах для забезпечення захисту від пошкодження комахами. Істотно змінені властивості білків eCry1Ba даного винаходу забезпечують їхнє застосування в стратегії високої дози щодо щонайменше ECB, потребуючи при цьому рівнів експресії в рослинах кукурудзи, які є легко досяжними. [0018] Нові білки eCry1Ba, описані в даному документі, є високо активними щодо комах. Наприклад, білки eCry1Ba даного винаходу можуть використовуватися для поліпшення боротьби з економічно важливими комахами-шкідниками, такими як ECB або CEW, без негативного впливу на активність щодо інших важливих шкідників кукурудзи, таких як SWCB і SCB. Білки eCry1Ba даного винаходу можуть використовуватися окремо або в комбінації з іншими стратегіями боротьби з комахами для забезпечення максимальної ефективності боротьби зі шкідниками з мінімальним впливом на навколишнє середовище. Трансгенні рослини, що експресують білки eCry1Ba даного винаходу, забезпечують засіб, за допомогою якого рослинники можуть боротися з основними лускокрилими шкідниками сільськогосподарських культур, наприклад, без обмеження, кукурудзи і цукрового очерету. [0019] Відповідно до одного аспекту даний винахід включає сконструйований білок Cry1Ba (eCry1Ba), який містить мутацію в одному або декількох положеннях амінокислот у домені I, за допомогою чого сконструйований білок Cry1Ba має підвищену розчинність і/або інсектицидну активність щодо щонайменше європейського кукурудзяного метелика (Ostrinia nubilalis) у порівнянні з нативним або білком Cry1Ba дикого типу. [0020] В іншому аспекті мутація в одному або декількох положеннях амінокислот розташована в альфа-спіралі 4 або альфа-спіралі 5 домену I. [0021] У додатковому аспекті мутація має місце в положенні амінокислоти, яке відповідає положенню 150, 178, 189 або 199 у SEQ ID NO: 2. [0022] У ще одному аспекті мутація має місце в положенні 150, 178, 189 або 199 у SEQ ID NO: 5. [0023] В іншому аспекті мутація має місце в положенні, яке відповідає амінокислотам 2 і 150; або амінокислотам 2, 150 і 178; або амінокислотам 2, 150 і 189; або амінокислотам 2, 150 і 199 у SEQ ID NO: 5. [0024] У ще одному аспекті мутація має місце по амінокислотам 2 і 150; або амінокислотам 2, 150 і 178; або амінокислотам 2, 150 і 189; або амінокислотам 2, 150 і 199 у SEQ ID NO: 5. [0025] В одному аспекті даний винахід включає сконструйований білок Cry1Ba (eCry1Ba), який містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 6, де X у положенні 2 являє собою будьяку амінокислоту і a) X у положенні 150 являє собою Pro, Phe, Trp або Lys, і X у положенні 189 являє собою Leu і в положенні 199 являє собою Ser; або b) X у положенні 189 являє собою Ser, коли X у положенні 150 являє собою Lys; або c) X у положенні 199 являє собою Lys, коли X у положенні 150 являє собою Lys. [0026] В іншому аспекті білок еCry1Ba даного винаходу містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 або SEQ ID NO: 10. [0027] У ще одному аспекті білок еCry1Ba даного винаходу має активність щодо лускокрилих або твердокрилих комах, зокрема лускокрилих комах. Приклади таких лускокрилих комах включають, але не обмежуючись ними, наступні: європейський кукурудзяний метелик, кукурудзяна південно-західна вогнівка, очеретяна вогнівка, бавовняна совка, соєва совка і гусениця оксамитових бобів. [0028] Даний винахід також включає інші варіантні білки Cry1Ba (vCry1Ba), де тирозин (Tyr) або гістидин (His) у положенні 150 (Y150 або H150) заміщений амінокислотою, відмінною від Tyr 4 UA 110925 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 або His. В одному аспекті амінокислота, яка заміщена Y150 або H150, являє собою Lys, Phe, Trp, Pro, Thr, Leu, Ala, Val, Ser, Arg, Gly або Asp. [0029] В іншому аспекті даний винахід включає білок vCry1Ba, який містить SEQ ID NO: 3. [0030] У ще одному аспекті даний винахід включає білок vCry1Ba, де Tyr або His у положенні 150 заміщений амінокислотою, відмінною від Tyr або His і також має валін (Val) у положенні 81 (V81), заміщений амінокислотою, відмінною від Val; або аланін (Ala) у положенні 155 (A155) і метіонін (Met) у положенні 178 (M178), заміщені амінокислотами, відмінними від Ala або Met, відповідно. В іншому аспекті Val у положенні 81 (V81) заміщений триптофаном (Trp) (V81W). У ще одному аспекті варіантний білок Cry1Ba даного винаходу містить SEQ ID NO: 11. [0031] В одному аспекті даний винахід включає білок vCry1Ba з Y150, заміщеним іншою амінокислотою і, де Ala у положенні 155 (A155) заміщений аспарагіновою кислотою (Asp) (A155D) і Met у положенні 178 (Met178) заміщений серином (Ser) (M178S). В іншому аспекті варіантний білок Cry1Ba даного винаходу містить SEQ ID NO: 12. [0032] Білки vCry1Ba даного винаходу мають інсектицидну активність щодо лускокрилих або твердокрилих комах, зокрема лускокрилих комах. До таких лускокрилих комах відносяться без обмеження європейський метелик кукурудзяний, кукурудзяна південно-західна вогнівка, очеретяна вогнівка, бавовняна совка, соєва совка і гусениця оксамитових бобів. Однак такі білки vCry1Ba можуть не мати підвищеної активності у порівнянні з білком Cry1Ba дикого типу щодо таких шкідників. [0033] В іншому аспекті даний винахід включає нуклеїнову кислоту, яка кодує сконструйований білок Cry1Ba (eCry1Ba) даного винаходу або варіантний білок Cry1Ba (vCry1Ba) даного винаходу. [0034] Даний винахід також включає химерний ген, який містить гетерологічну промоторну послідовність, функціонально пов'язану з нуклеїновою кислотою, яка кодує білок еCry1Ba або білок vCry1Ba. Даний винахід також включає рекомбінантний вектор, який містить такий химерний ген. Додатково, даний винахід включає трансгенну, яка не належить людині, клітинухазяїна, яка містить такий химерний ген. Трансгенна клітина-хазяїн відповідно до цього аспекту даного винаходу включає без обмеження бактеріальну клітину або рослинну клітину. Така трансгенна рослинна клітина може бути клітиною маїсу або клітиною цукрового очерету. [0035] Даний винахід додатково забезпечує трансгенну рослину, яка містить таку рослинну клітину. Білки eCry1Ba або білки vCry1Ba є придатними для експресії в будь-якій трансгенній рослині, де чутливі комахи-шкідники являються проблемою. Інший аспект даного винаходу включає потомство рослини, яке містить нуклеїнову кислоту даного винаходу від будь-якого покоління трансгенної рослини і частину рослини для розмноження, яка містить нуклеїнову кислоту даного винаходу від будь-якого покоління трансгенної рослини. В іншому аспекті трансгенна рослина являє собою рослину маїсу або рослину цукрового очерету. У ще одному аспекті частина рослини для розмноження являє собою насіння, орган вегетативного розмноження або живець. [0036] Даний винахід також включає інсектицидну композицію, яка містить ефективну для боротьби з комахами кількість білка eCry1Ba або білка vCry1Ba за даним винаходом і додатково прийнятний сільськогосподарський носій. Такі сільськогосподарські носії можуть бути, наприклад, придатними для розбризкування сполука або трансгенна рослина. [0037] В іншому аспекті даний винахід забезпечує спосіб одержання білка eCry1Ba або білка vCry1Ba, активного щодо комах, який включає: (a) одержання клітини-хазяїна, яка містить химерний ген, який сам по собі містить гетерологічну промоторну послідовність, функціонально пов'язану з нуклеїновою кислотою даного винаходу; і (b) експресію нуклеїнової кислоти в трансгенній клітині-хазяїні, яка дає в результаті щонайменше один білок, активний щодо комах. [0038] У додатковому аспекті даний винахід забезпечує спосіб одержання стійкої до комах трансгенної рослини, який включає введення нуклеїнової кислоти даного винаходу в рослину, таким чином створюючи трансгенну рослину, де нуклеїнова кислота спричиняє експресію білка eCry1Ba або білка vCry1Ba у трансгенній рослині в ефективній кількості для боротьби з комахами. У ще одному аспекті комахи є лускокрилими або твердокрилими комахами. До таких лускокрилих комах відносяться без обмеження європейський кукурудзяний метелик, кукурудзяна південно-західна вогнівка, очеретяна вогнівка, бавовняна совка, соєва совка і гусениця оксамитових бобів. [0039] В іншому аспекті даний винахід включає спосіб одержання сконструйованого білка Cry1Ba (eCry1Ba), який включає a) визначення білка Cry1Ba, який має домен I; b) заміщення щонайменше однієї нативної амінокислоти на ділянці в домені I щонайменше однією іншою амінокислотою; і c) одержання білка eCry1Ba, виробленого таким чином, що eCry1Ba має підвищену розчинність і/або інсектицидну активність щодо щонайменше європейського 5 UA 110925 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 кукурудзяного метелика у порівнянні з нативним білком Cry1Ba або Cry1Ba дикого типу. У ще одному аспекті нативна амінокислота розташована в альфа-спіралі 4 або альфа-спіралі 5 домену I. [0040] У ще одному аспекті даний винахід включає спосіб боротьби з лускокрилою комахою, який включає приведення в контакт комахи з ефективною кількістю білка eCry1Ba або білка vCry1Ba даного винаходу. Відповідно до іншого аспекту до таких лускокрилих комах відносяться без обмеження європейський кукурудзяний метелик, кукурудзяна південно-західна вогнівка, очеретяна вогнівка, бавовняна совка, соєва совка і гусениця оксамитових бобів. [0041] Переважно, білок еCry1Ba або білок vCry1Ba доставляється комахам перорально. В одному аспекті білки доставляються перорально через трансгенну рослину, яка містить послідовність нуклеїнової кислоти, що експресує білок eCry1Ba або vCry1Ba даного винаходу. [0042] Даний винахід додатково забезпечує спосіб боротьби з комахами, де трансгенна рослина, яка містить нуклеїнову кислоту, що кодує білок еCry1Ba або білок vCry1Ba, додатково містить другу послідовність нуклеїнової кислоти або численні послідовності нуклеїнових кислот, які кодують щонайменше одну іншу пестицидну діючу речовину. В одному аспекті друга послідовність нуклеїнової кислоти кодує білок Cry, відмінний від білків eCry1Ba або vCry1Ba даного винаходу, таких, які кодують вегетативний інсектицидний білок, таких як ті, котрі розкриті в патентах США №№ 5849870 і 5877012, що включені в даний документ посиланням, або тих, котрі кодують шлях для продукції небілкової пестицидної діючої речовини. В іншому аспекті даного винаходу друга інсектицидна діюча речовина являє собою білок Vip3. [0043] Ще один аспект даного винаходу являє собою забезпечення способу, який забезпечує рослинника поліпшеним засобом боротьби з європейським кукурудзяним метеликом, кукурудзяною південно-західною вогнівкою, вогнівкою очеретяною, бавовняною совкою, соєвою совкою і гусеницею оксамитових бобів, який включає доставку або продаж рослиннику трансгенних сіянців, що містять нуклеїнову кислоту, яка кодує білок еCry1Ba, що має мутацію в одному або декількох положеннях амінокислот у домені I, де білок еCry1Ba має підвищену розчинність або інсектицидну активність щодо щонайменше європейського кукурудзяного метелика у порівнянні з нативним білком Cry1Ba. В іншому аспекті трансгенні сіянці являють собою насіння, органи вегетативного розмноження або живці. [0044] Інші аспекти і переваги даного винаходу стануть очевидними фахівцям даної галузі техніки після вивчення наступного опису даного винаходу і необмежуючих прикладів. КОРОТКИЙ ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ [0045] Фіг. 1 показує вирівнювання амінокислотних послідовностей відомих нативних білків Cry1Ba. Амінокислоти в положенні 150 виділені жирним шрифтом. [0046] Фіг. 2 показує вирівнювання амінокислотних послідовностей нативного повнорозмірного Cry1Ab і Cry1Ba. Домени I і II і альфа-спіралі 4 і 5 домену I показані стрілками. КОРОТКИЙ ОПИС ПОСЛІДОВНОСТЕЙ У ПЕРЕЛІКУ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ [0047] SEQ ID NO: 1 являє собою кодуючу послідовність нативного повнорозмірного cry1Ba. [0048] SEQ ID NO: 2 являє собою амінокислотну послідовність нативного повнорозмірного білка Cry1Ba. [0049] SEQ ID NO: 3 являє собою мутований повнорозмірний Cry1Ba. [0050] SEQ ID NO: 4 являє собою cry1Ba-T25 кодуючу послідовність. [0051] SEQ ID NO: 5 являє собою білок Cry1Ba-T25 дикого типу. [0052] SEQ ID NO: 6 являє собою білок eCry1Ba-X150. [0053] SEQ ID NO: 7 являє собою білок eCry1Ba-T2AY150K. [0054] SEQ ID NO: 8 являє собою білок eCry1Ba-T2AY150KM178S. [0055] SEQ ID NO: 9 являє собою білок eCry1Ba-T2AY150KL189S. [0056] SEQ ID NO: 10 являє собою білок eCry1Ba-T2AY150KS199K. [0057] SEQ ID NO: 11 являє собою варіантний Cry1Ba-TM21. [0058] SEQ ID NO: 12 являє собою варіантний Cry1Ba-TM90. [0059] SEQ ID NO: 13 являє собою оптимізовану для маїсу послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує білок eCry1Ba-T2AY150KL189S. [0060] SEQ ID NOs:14-41 являють собою праймери, придатні в даному винаході. [0061] SEQ ID NO: 42 являє собою процесований нативний Cry1Ba. [0062] SEQ ID NO: 43 являє собою варіантний Cry1Ba-TM69. [0063] SEQ ID NO: 44 являє собою варіантний Cry1Ba-TM61. ВИЗНАЧЕННЯ [0064] Для ясності деяким висловам, використаним в описі, дані визначення, які представлені нижче: 6 UA 110925 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 [0065] "Активність" білка eCry1Ba даного винаходу означає, що білки eCry1Ba функціонують як перорально активні засоби боротьби з комахами, мають токсичний ефект або здатні порушувати або обмежувати харчування комахи, що може викликати або не викликати смерть комахи. Коли білок еCry1Ba даного винаходу доставляється комасі, це приводить, як правило, до смерті комахи, або комаха не харчується від джерела, яке робить білок еCry1Ba доступним для комахи. [0066] "Зв'язаний з / функціонально зв'язаний" відноситься до двох послідовностей нуклеїнових кислот, які зв'язані фізично або функціонально. Наприклад, зазначено, що промотор або регуляторна ДНК-послідовність є "зв'язаною з" ДНК-послідовністю, яка кодує РНК або білок, якщо дві послідовності функціонально зв'язані або розташовані так, що регуляторна ДНК-послідовність буде впливати на рівень експресії кодуючої або структурної ДНКпослідовності. [0067] "Химерний ген" або "химерний конструкт" являє собою рекомбінантну послідовність нуклеїновою кислоти, у якій промотор або регуляторна послідовність нуклеїнової кислоти функціонально зв'язана або асоційована з послідовністю нуклеїнової кислоти, яка кодує мРНК, або яка експресується як білок так, що регуляторна послідовність нуклеїнової кислоти здатна регулювати транскрипцію або експресію асоційованої нуклеїнової кислоти, яка кодує послідовність. Регуляторна послідовність нуклеїнової кислоти химерного гена в нормі не є функціонально пов'язаною з асоційованою послідовністю нуклеїнової кислоти, яка знаходиться в природі. [0068] "Кодуюча послідовність" являє собою послідовність нуклеїнової кислоти, яка транскрибується в РНК, таку як мРНК, рРНК, тРНК, мяРНК, смислова РНК або антисмислова РНК. Переважно РНК потім транслюється в організмі з продукуванням білка. [0069] "Боротися" з комахами означає інгібувати, за допомогою токсичного ефекту, здатність комах-шкідників виживати, рости, харчуватися і/або розмножуватися, або обмежувати пов'язане з комахами ушкодження або загибель сільськогосподарських рослин. "Боротися" з комахами може означати або не означати знищення комах, хоча переважно означає знищення комах. [0070] Як використовується в даному документі, вислів "кукурудза" означає Zea mays або маїс і включає всі сорти рослин, які можна вивести з кукурудзою, включаючи вид дикого маїсу. [0071] "Відповідний" у контексті даного винаходу означає, що коли амінокислотні послідовності білків Cry1B вирівнюються одна з одною, амінокислоти, які "відповідають" визначеним пронумерованим положенням у даному винаході, є тими, котрі збігаються з цими положеннями в нативному Cry1Ba-токсині (SEQ ID NO: 2), але які не обов'язково знаходяться в тих же пронумерованих положеннях щодо конкретної амінокислотної послідовності Cry1Ba даного винаходу. Наприклад, метіонін у положенні 1 процесованого білка Cry1Ba (SEQ ID NO: 42) буде збігатися з метіоніном у положенні 22 повнорозмірного Cry1Ba (SEQ ID NO: 2). Отже, за даним винаходом, амінокислота 129 у SEQ ID NO: 42 "відповідає" номеру амінокислоти 150 у SEQ ID NO: 2. [0072] "Доставляти" токсин означає, що токсин приходить у контакт із комахою, даючи в результаті токсичний ефект та забезпечує боротьбу з комахою. Токсин може бути доставлений багатьма загальноприйнятими способами, наприклад, перорально, шляхом прийому усередину комахою, або шляхом контакту з комахою за допомогою експресії в трансгенній рослині, складеної білкової композиції(ій), придатної для розбризкування білкової композиції(ій), основи з принадою або будь-якою іншою визнаною в галузі техніки системою доставки токсину. [0073] "Ефективна для боротьби з комахами кількість" означає, таку концентрацію токсину, яка інгібує за допомогою токсичного ефекту здатність комах виживати, рости, харчуватися і/або розмножуватися або обмежує пов'язане з комахами ушкодження або загибель сільськогосподарських рослин. "Ефективна для боротьби з комахами кількість" може знищувати або не знищувати комах, хоча переважно означає знищення комах. [0074] "Сконструйований білок Cry1Ba" (eCry1Ba) даного винаходу відноситься до білка отриманого з Cry1Ba, який має щонайменше одну мутацію в домені I, що, як відомо, не зустрічається в природі в Cry1Ba білку. Білок еCry1Ba не зустрічається в природі і, шляхом втручання людини, містить амінокислотну послідовність, яка не є ідентичною білку, для якого відомо, що він існує в Bacillus thuringiensis. Білки Cry1Ba, які були сконструйовані за даним винаходом, мають істотно змінені і поліпшені властивості у порівнянні з нативними білками Cry1Bа. Зокрема, білки eCry1Ba даного винаходу мають підвищену розчинність і/або інсектицидну активність щодо щонайменше європейського кукурудзяного метелика у порівнянні з нативним Cry1Ba, Cry1Ba дикого типу або варіантними білками Cry1Bа даного винаходу. 7 UA 110925 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [0075] "Сконструйований ген cry1Ba" (ecry1Ba) відповідно до даного винаходу відноситься до нуклеїнової кислоти, яка містить кодуючу послідовність білка eCry1B. Сконструйований ген cry1Ba може бути отриманий з нативного гена cry1Ba або із синтетичного гена cry1Ba. [0076] "Касета експресії", як використовується в даному документі, означає послідовність нуклеїнової кислоти, здатну управляти експресією конкретної послідовності нуклеїнової кислоти в прийнятній клітині-хазяїні, яка містить промотор, функціонально зв'язаний з послідовністю нуклеїнової кислоти інтересу, що функціонально зв'язана із сигналами термінації. Вона також типово містить послідовності, необхідні для правильної трансляції послідовності нуклеїнової кислоти. Касета експресії, яка містить послідовність нуклеїнової кислоти інтересу, може бути химерною, що означає, що щонайменше один з її компонентів є гетерологічним стосовно щонайменше одного з її інших компонентів. Касета експресії може також бути такою, котра зустрічається в природі, але яка була отримана в рекомбінантній формі, придатній для гетерологічної експресії. Однак, як правило, касета експресії є гетерологічною стосовно хазяїна, тобто, конкретна послідовність нуклеїнової кислоти касети експресії не зустрічається в природі в клітині-хазяїні і повинна була бути введена в клітину-хазяїна або попередник клітини-хазяїна за допомогою явища трансформації. Експресія послідовності нуклеїнової кислоти в касеті експресії може бути під контролем конститутивного промотора або індуцибельного промотора, який ініціює транскрипцію, тільки коли клітина-хазяїн піддається деякому конкретному зовнішньому стимулу. У випадку багатоклітинного організму, такого як рослина, промотор може також бути специфічним для конкретної тканини, або органа, або стадії розвитку. [0077] "Ген" являє собою визначену ділянку, розташовану всередині геному і яка, крім вищезгаданої кодуючої послідовності нуклеїнової кислоти, містить інші, у першу чергу, регуляторні послідовності нуклеїнових кислот, відповідальні за контроль експресії, тобто транскрипції і трансляції кодуючої ділянки. Ген може також містити інші 5' і 3' нетрансльовані послідовності і послідовності термінації. Додаткові елементи, які можуть бути присутніми, являють собою, наприклад, інтрони. [0078] "Ген інтересу" відноситься до будь-якого гена, який при перенесенні в рослину додає рослині необхідну характеристику, таку як стійкість до антибіотика, стійкість до вірусу, стійкість до комахи, стійкість до захворювання або стійкість до інших шкідників, гербіцидну стійкість, поліпшену харчову цінність, підвищену ефективність у виробничому процесі або змінену репродуктивну здатність. "Ген інтересу" може також бути геном, який переноситься до рослин для одержання комерційно коштовних ферментів або метаболітів у рослині. [0079] Як використовується в даному документі, вислів "рослинник" означає фізичну або юридичну особу, яка зайнята сільським господарством, вирощуючи живі організми, такі як сільськогосподарські рослини для їжі або сировинних матеріалів. [0080] "Кишкова протеаза" являє собою протеазу, яка виявляється в природі в травному тракті комахи. Ця протеаза звичайно бере участь у перетравленні поглинених білків. [0081] "Гетерологічна" послідовність нуклеїнової кислоти являє собою послідовність нуклеїнової кислоти, яка в природі не зв'язана з клітиною-хазяїном, у яку вона введена, включаючи множинні копії, які не зустрічаються в природі, послідовності нуклеїнової кислоти, яка зустрічається в природі. [0082] "Гомологічна" послідовність нуклеїнової кислоти являє собою послідовність нуклеїнової кислоти, зв'язану в природі з клітиною-хазяїном, у яку її вводять. [0083] "Гомологічна рекомбінація" являє собою реципрокний обмін фрагментів нуклеїнової кислоти між гомологічними молекулами нуклеїнової кислоти. [0084] "Інсектицидна" визначається як токсична біологічна активність, здатна боротися з комахами, переважно шляхом їхнього знищення. [0085] "Виділена" молекула нуклеїнової кислоти або "виділений" білок являє собою молекулу нуклеїнової кислоти або білок, який за допомогою втручання людини існує окремо від його нативного оточення і, отже, не є продуктом природи. Виділена молекула нуклеїнової кислоти або виділений білок можуть існувати в очищеній формі або можуть існувати в ненативному оточенні, такому як, наприклад, рекомбінантна клітина-хазяїн. Наприклад, нативний білок Cry, який зустрічається в природі в Bacillus thuringiensis, не є виділеним, але такий самий білок Cry у трансгенному штамі Bacillus thuringiensis або трансгенній рослині є виділеним. [0086] "Нативний" білок Cry1Ba, як використовується в даному документі, відноситься до приблизно білка вагою 140 кДа Bacillus thuringiensis (Bt), активного щодо твердокрилих або лускокрилих, наприклад SEQ ID NO: 2, а також будь-якого процесованого низькомолекулярного білка, отриманого з нативного білка Cry1Ba, який має амінокислотну послідовність, яка виявляється в природі. Низькомолекулярний білок може бути отриманий за допомогою 8 UA 110925 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 протеазного відщеплення сайтів розпізнавання протеази нативного білка Cry1Ba, які зустрічаються в природі, або за допомогою другого кодона ініціації трансляції в тій самій рамці, що і кодон ініціації трансляції, кодуючий нативний білок Cry1Ba, наприклад M22 у SEQ ID NO: 2. Амінокислотна послідовність нативного білка Cry1Ba і низькомолекулярних білків, отриманих з нього, може бути виявлена в білку, який зустрічається в природі в Bt. Наприклад, шість нативних білків Cry1Ba отримали назву і мають наступні інвентарні номери Genbank, Cry1Ba1=CAA29898; Cry1Ba2=CAA65003; Cry1Ba3=AAK63251; Cry1Ba4=AAK51084; Cry1Ba5=ABO20894; Cry1Ba6=ABL60921. Вирівнювання послідовностей шести нативних білків Cry1Ba показано на Фіг. 1. Нативний білок Cry1Ba може кодуватися нативною нуклеотидною послідовністю Bt, як представлено в SEQ ID NO: 1 або синтетичною кодон-оптимізованою нуклеотидною послідовністю. [0087] "Молекула нуклеїнової кислоти" або "послідовність нуклеїнової кислоти" являє собою лінійний сегмент одно- або дволанцюгової ДНК або РНК, який може бути виділений з будь-якого джерела. У контексті даного винаходу молекула нуклеїнової кислоти або послідовність нуклеїнової кислоти є переважно сегментом ДНК. [0088] "Рослина" являє собою будь-яку рослину на будь-якій стадії розвитку, зокрема насіннєву рослину. [0089] "Рослинна клітина" являє собою структурну і фізіологічну одиницю рослини, яка містить протопласт і клітинну стінку. Рослинна клітина може бути у формі виділеної окремої клітини або культивованої клітини, або як частина високо організованої одиниці, такої як, наприклад, тканина рослини, орган рослини або ціла рослина. [0090] "Рослинна клітинна культура" означає культури рослинних одиниць, таких як, наприклад, протопласти, клітини клітинної культури, клітини тканин рослин, пилок, пилкові трубки, насіннєві зачатки, зародкові мішки, зиготи і зародки на різних стадіях розвитку. [0091] "Рослинний матеріал" відноситься до листя, стебел, коренів, квітів або частин квітки, фруктів, пилку, яйцеклітин, зигот, насіння, органів вегетативного розмноження, живців, клітинних або тканинних культур або будь-якої іншої частини або продукту рослини. [0092] "Орган рослини" являє собою окрему і візуально структуровану і диференційовану частину рослини, таку як корінь, стебло, листок, квіткову бруньку або зародок. [0093] "Тканина рослини", як використовується в даному документі, означає групу рослинних клітин, організованих у структурну і функціональну одиницю. Мається на увазібудь-яка тканина рослини in planta або в культурі. Цей вислів включає, але не обмежується ними, цілі рослини, органи рослини, насіння рослини, тканинну культуру і будь-яку групу рослинних клітин, організованих у структурні і/або функціональні одиниці. Застосування цього вислову відносно або за відсутності будь-якого специфічного типу тканини рослини, які наведені вище, або іншим способом включені в це визначення, не призначено виключати будь-який інший тип тканини рослини. [0094] "Промотор" являє собою нетрансльовану ДНК-послідовність, розташовану вище кодуючої ділянки, яка містить сайт зв'язування для РНК-полімерази й ініціює транскрипцію ДНК. Промоторна ділянка може також включати інші елементи, які діють як регулятори генної експресії. [0095] "Сіянець" являє собою будь-який рослинний матеріал, який використовується з метою розмноження рослини. Наприклад, без обмеження, насіння й живці або органи вегетативного розмноження, є сіянцями кукурудзи і цукрового очерету відповідно. [0096] "Протопласт" являє собою виділену рослинну клітину без клітинної стінки або лише з частиною клітинної стінки. [0097] "Регуляторні елементи" відносяться до послідовностей, які беруть участь в управлінні експресією послідовності нуклеїнової кислоти. Регуляторні елементи включають промотор, функціонально зв'язаний з послідовністю нуклеїнової кислоти інтересу і сигналами термінації. Вони також звичайно включають послідовності, необхідні для правильної трансляції послідовності нуклеїнової кислоти. [0098] Як використовується в даному документі, "специфічна активність" відноситься до кількості білка, необхідного для одержання інсектицидного ефекту. Отже, якщо перший білок має більш високу специфічну активність, аніж другий білок, то це означає, що необхідна менша кількість першого білка в порівнянні з другим білком для одержання інсектицидного ефекту на таку ж частину комах. [0099] "Розчинність", як використовується в даному документі, відноситься до кількості нативного Cry1Ba-токсину, Cry1Ba дикого типу або eCry1Ba-токсину або vCry1Ba-токсину, яка може розчинитися в конкретній рідині, наприклад, буфері, воді або кишковому соку комахи за однакових навколишніх умов. Таким чином, як використовується в даному документі, те, що 9 UA 110925 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 eCry1Ba-токсин має "підвищену розчинність" або "підвищення розчинності" у порівнянні з нативним або Cry1Ba-токсином дикого типу означає, що даний об'єм рідини може містити більшу кількість eCry1Ba-токсину, аніж нативний Cry1Ba-токсин або Cry1Ba-токсин дикого типу за таких самих умов. Відповідно до даного винаходу нативні Cry1Ba і Cry1Ba дикого типу токсини мають низьку розчинність і визначені eCry1Ba-токсини мають високу розчинність відносно один одного. [00100] "Трансформація" являє собою процес введення гетерологічної нуклеїнової кислоти в клітину-хазяїна або організм. Зокрема, "трансформація" означає стійку інтеграцію ДНКмолекули в геном організму інтересу. [00101] "Трансформований / трансгенний / рекомбінантний" відноситься до організмухазяїна, такого як бактерія або рослина, до якого була введена гетерологічна молекула нуклеїнової кислоти. Молекула нуклеїнової кислоти може бути стійко інтегрована в геном хазяїна, або молекула нуклеїнової кислоти може також бути присутня як позахромосомна молекула. Така позахромосомна молекула може бути автореплікованою. Трансформовані клітини, тканини або рослини розуміються як такі, що включають не тільки кінцевий продукт процесу трансформації, але також їх трансгенне потомство. "Нетрансформований", "нетрансгенний" або "нерекомбінантний" хазяїн відноситься до організму дикого типу, наприклад, бактерії або рослини, який не містить гетерологічну молекулу нуклеїнової кислоти. [00102] "Варіантний білок Cry1Ba (vCry1Ba)” являє собою ненативний мутантний білок, який має більш низьку специфічну активність щодо щонайменше європейського кукурудзяного метелика у порівнянні з білком Cry1Ba дикого типу даного винаходу. [00103] Білок "Cry1Ba дикого типу" являє собою ненативний мутований білок, який має подібні інсектицидні властивості, такі як специфічна активність, щодо таких комах, як кукурудзяна південно-західна вогнівка, очеретяна вогнівка або європейський кукурудзяний метелик, або біохімічні властивості, такі як розчинність, як у нативного Cry1Ba. [00104] Нуклеїнові кислоти позначаються їхніми основами за допомогою наступних стандартних скорочень: аденін (A), цитозин (C), тимін (T) і гуанін (G). Амінокислоти позначаються аналогічним чином за допомогою наступних стандартних скорочень: аланін (Ala; A), аргінін (Arg; R), аспарагін (Asn; N), аспарагінова кислота (Asp; D), цистеїн (Cys; C), глутамін (Gln; Q), глутамінова кислота (Glu; E), гліцин (Gly; G), гістидин (His; H), ізолейцин (Ile; I), лейцин (Leu; L), лізин (Lys; K), метіонін (Met; M), фенілаланін (Phe; F), пролін (Pro; P), серин (Ser; S), треонін (Thr; T), триптофан (Trp; W), тирозин (Tyr; Y) і валін (Val; V). ДОКЛАДНИЙ ОПИС [00105] Даний винахід відноситься до нових сконструйованих білків Cry1Ba (eCry1Ba), які мають істотно змінені властивості, поліпшені у порівнянні з і відмінні від нативних білків Cry1Ba, зокрема біохімічні властивості, пов'язані з інсектицидною активністю щодо лускокрилих шкідників кукурудзи, до яких відносяться, без обмежень, європейський кукурудзяний метелик (ECB; Ostrinia nubilalis), бавовняна совка (CEW; Helicoverpa zea), кукурудзяна південно-західна вогнівка (SWCB; Diatraea grandiosella), очеретяна вогнівка (SCB; Diatraea saccharalis), соєва совка (SBL; Pseudoplusia includens), гусениця оксамитових бобів (VBC; Anticarsia gemmatalis) і т. п. Шляхом мутування амінокислот у ключових визначених положеннях у нативній послідовності білка Cry1Ba відповідно до даного винаходу розроблений білок еCry1Ba, який має істотно змінену розчинність і/або інсектицидні властивості у порівнянні з нативним Cry1Ba або Cry1Ba дикого типу, як визначено в даному документі. Послідовності нуклеїнових кислот, які кодують білки eCry1Ba, можуть використовуватися, наприклад, у трансгенних сільськогосподарських рослинах, щоб викликати експресію білків eCry1Ba для боротьби з комахами-шкідниками, такими як європейський кукурудзяний метелик (ECB; Ostrinia nubilalis), бавовняна совка (CEW; Helicoverpa zea), кукурудзяна південно-західна вогнівка (SWCB; Diatraea grandiosella), очеретяна вогнівка (SCB; Diatraea saccharalis), соєва совка (SBL; Pseudoplusia includens), гусениця оксамитових бобів (VBC; Anticarsia gemmatalis) і т. п. [00106] В одному варіанті здійснення даний винахід включає сконструйований білок Cry1Ba (eCry1Ba), який містить мутацію в одному або декількох положеннях амінокислот у домені I, за допомогою чого білок еCry1Ba має підвищену розчинність і/або інсектицидну активність щодо щонайменше європейського кукурудзяного метелика у порівнянні з нативним білком або білком Cry1Ba дикого типу. [00107] В іншому варіанті здійснення мутація в одному або декількох положеннях амінокислот розташована в альфа-спіралі 4 або альфа-спіралі 5 домену I. Дослідження структурно-функціонального взаємозв'язку визначених білків Cry, таких як Cry1Aa, Cry1Ab, і Cry1Ac, включали мутагенез альфа-спіралей 4 і 5 домену I (Saraswathy et al. 2004, Electron. J. Biotech. 7: 178-188). Результати цих експериментів зв'язують альфа-спіралі 4 і 5 з утворенням 10 UA 110925 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 іонного каналу і провідністю. Неясно, чи буде будь-яка мутація або комбінація мутацій у домені I білка Cry, зокрема Cry1Ba, впливати на розчинність і специфічну активність. Отже, на домен I білка Cry1Ba, зокрема, у положеннях в альфа-спіралі 4 або 5, був націлений мутаційний аналіз для визначення того, чи може буту підвищена розчинність і/або чи може бути збільшена специфічна активність нативного білка Cry1Ba щодо цільової комахи, до якої відноситься європейський кукурудзяний метелик (ECB), кукурудзяна південно-західна вогнівка (SWCB), очеретяна вогнівка (SCB), бавовняна совка (CEW), соєва совка (SBL) і гусениця оксамитових бобів (VBC), а також інші. На основі вирівнювання послідовностей альфа-спіраль 4 Cry1Ba містить амінокислоти 143-163 у SEQ ID NO: 2. Альфа-спіраль 5 створює основну частину консервативного блоку 1 і містить амінокислоти 176-199 у SEQ ID NO: 2. Шість відомих нативних білків Cry1Ba відрізняються лише однією амінокислотою в альфа-спіралі 4 у положенні 150. Чотири з шести мають тирозин (Tyr; Y) у положенні 150 та інші два мають гістидин (His; H) у положенні 150. У даному винаході показано, що амінокислота в положенні 150 відіграє ключову роль у токсичності білка Cry1Ba, і що мутації в альфа-спіралі 4 і альфа-спіралі 5 можуть впливати на розчинність білка, специфічну активність щодо конкретного шкідника і збільшення в спектрі активності Cry1Ba. [00108] В іншому варіанті здійснення даний винахід включає мутації в положенні амінокислоти, яке відповідає положенню 150, 178, 189 або 199 у SEQ ID NO: 2. У ще одному варіанті здійснення мутація має місце в положенні 150, 178, 189 або 199 у SEQ ID NO: 5. [00109] У ще одному варіанті здійснення даний винахід включає мутації в Cry1Ba у положенні, яке відповідає амінокислотам 2 і 150; або амінокислотам 2, 150 і 178; або амінокислотам 2, 150 і 189; або амінокислотам 2, 150 і 199 у SEQ ID NO: 5. В іншому варіанті здійснення мутація має місце на амінокислотах 2 і 150; або амінокислотах 2, 150 і 178; або амінокислотах 2, 150 і 189; або амінокислотах 2, 150 і 199 у SEQ ID NO: 5. [00110] В одному варіанті здійснення даний винахід включає сконструйований білок Cry1Ba (eCry1Ba), який містить амінокислотну послідовністьSEQ ID NO: 6, де Xaa у положенні 2 являє собою будь-яку амінокислоту, і a) Xaa у положенні 150 являє собою Pro, Phe, Trp або Lys, і Xaa у положенні 189 являє собою Leu і в положенні 199 являє собою Ser; або b) Xaa у положенні 189 являє собою Ser, якщо Xaa у положенні 150 являє собою Lys; або c) Xaa у положенні 199 являє собою Lys, якщо Xaa у положенні 150 являє собою Lys. [00111] В іншому варіанті здійснення даний винахід включає білок еCry1Ba, який містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 або SEQ ID NO: 10. [00112] У ще одному варіанті здійснення білок еCry1Ba даного винаходу має активність щодо лускокрилих або твердокрилих комах, зокрема, щодо лускокрилих комах. Приклади таких лускокрилих комах включають, без обмежень, наступні: європейський кукурудзяний метелик, кукурудзяна південно-західна вогнівка, очеретяна вогнівка, бавовняна совка, соєва совка і гусениця оксамитових бобів. Сконструйовані білки Cry1Ba даного винаходу також мають активність щодо гусениці бавовняної совки, комахи-шкідника, для якого нативний Cry1Ba є неактивним. [00113] У ще одному варіанті здійснення даний винахід включає білок еCry1Ba, який має щонайменше в 3 рази вищу специфічну активність, аніж нативний білок Cry1Ba щодо щонайменше європейського кукурудзяного метелика. [00114] В іншому варіанті здійснення даний винахід також включає варіантні білки Cry1Ba (vCry1Ba), де тирозин (Tyr) або гістидин (His) у положенні 150 (Y150 або H150) заміщений амінокислотою, відмінною від Tyr або His. В одному аспекті амінокислота, яка заміщена Y150 або H150, являє собою Lys, Phe, Trp, Pro, Thr, Leu, Ala, Val, Ser, Arg, Gly або Asp. [00115] В іншому варіанті здійснення даний винахід включає мутований білок Cry1Ba, який містить SEQ ID NO: 3. [00116] У ще одному варіанті здійснення даний винахід включає білок vCry1Ba, де Tyr або His у положенні 150 (Y150 або H150) заміщений амінокислотою, відмінною від Tyr або His і також має валін (Val) у положенні 81 (V81), заміщений амінокислотою, відмінною від Val; або аланін (Ala) у положенні 155 (A155) і метіонін (Met) у положенні 178 (M178) заміщені амінокислотами, відмінними від Ala або Met, відповідно. В іншому варіанті здійснення Val у положенні 81 (V81) заміщений триптофаном (Trp) (V81W). У ще одному варіанті здійснення даний винахід включає варіантний білок Cry1Ba, який містить SEQ ID NO: 11. [00117] В одному варіанті здійснення даний винахід включає білок vCry1Ba з Tyr у 150 (Y150), заміщеним будь-якою іншою амінокислотою, і де Ala у положенні 155 (A155) заміщений аспарагіновою кислотою (Asp) (A155D), і Met у положенні 178 (M178) заміщений серином (Ser) (M178S). В іншому варіанті здійснення даний винахід включає білок vCry1Ba, який містить SEQ ID NO: 12. 11 UA 110925 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [00118] Білки vCry1Ba, включені в даний винахід, мають інсектицидну активність щодо лускокрилої або твердокрилої комахи. До таких лускокрилих комах відносяться без обмеження європейський кукурудзяний метелик, кукурудзяна південно-західна вогнівка, очеретяна вогнівка, бавовняна совка, соєва совка і гусениця оксамитових бобів. Активність білків vCry1Ba як правило менша, ніж у білка Cry1Ba дикого типу даного винаходу. Одна перевага таких варіантних білків Cry1Ba полягає в їхній користі в ситуаціях, де не потрібна висока специфічна активність. Фахівець у даній галузі техніки установить інші застосування і переваги таких варіантних білків Cry1Ba. [00119] Властивості для боротьби з комахами у білків eCry1Ba і білків vCry1Ba даного винаходу додатково проілюстровані в Прикладах 2, 4, 5, 6 і 9. [00120] В одному варіанті здійснення даний винахід включає нуклеїнову кислоту, яка кодує білок еCry1Ba даного винаходу або кодує білок vCry1Ba даного винаходу. В іншому варіанті здійснення нуклеїнова кислота містить SEQ ID NO: 13. [00121] Даний винахід також включає химерний ген, який містить гетерологічну промоторну послідовність, функціонально зв'язану з нуклеїновою кислотою, яка кодує білок еCry1Ba або білок vCry1Ba. В одному варіанті здійснення гетерологічний промотор вибирають із групи, яка включає промотор убіквітину маїсу, вірус цестрових (cmp), TrpA кукурудзи, актин рису, 5' UTR ген 9 бактеріофага T3, металотіонеїн (mtl) маїсу, сахароза-синтетазу 1 кукурудзи, алкогольдегідрогеназу 1 кукурудзи, світлоуловлюючий комплекс кукурудзи, білок теплового шоку кукурудзи, малу субодиницю RuBP карбоксилази гороху, опінсинтази Ti плазміду, нопалінсинтази Ti плазміду, халкон-ізомеразу петунії, багатий гліцином білок 1 боба, пататин картоплі, лектин, 35S CaMV і малу субодиницю S-E9 RuBP-карбоксилази. [00122] Даний винахід також включає рекомбінантні вектори, які містять послідовності нуклеїнових кислот даного винаходу. Такі вектори включають, без обмеження, плазмідний, космідній, фагмідний вектор, вектор на основі штучної хромосоми, фага або вірусу. У таких векторах послідовності нуклеїнових кислот переважно включені в касети експресії, які містять регуляторні елементи для експресії послідовностей нуклеїнових кислот у клітині-хазяїні, здатній експресувати послідовності нуклеїнових кислот. Такі регуляторні елементи звичайно включають промотор і сигнали термінації і переважно також включають елементи, які дозволяють здійснюватися ефективній трансляції поліпептидів, що кодуються послідовностями нуклеїнових кислот даного винаходу. Вектори, які містять послідовності нуклеїнових кислот, звичайно здатні до реплікації в конкретних клітинах-хазяїнах, переважно як позахромосомні молекули, і отже, використовуються для ампліфікації послідовностей нуклеїнових кислот даного винаходу в клітинах-хазяїнах. В одному варіанті здійснення клітини-хазяїни для таких векторів являють собою мікроорганізми, такі як бактерії, включаючи без обмеження E. coli, Bacillus thuringiensis, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus cereus, Agrobacterium або Pseudomonas. В іншому варіанті здійснення клітини-хазяїни для таких рекомбінантних векторів являють собою ендофіти або епіфіти. В іншому варіанті здійснення клітина-хазяїн для таких векторів являє собою еукаріотичну клітину, таку як рослинна клітина. Приклади таких рослинних клітин, включених у даний винахід, включають, без обмеження, наступні: клітини сорго, пшениці, соняшника, томата, картоплі, капустяної культури, бавовнику, рису, сої, цукрового буряка, цукрового очерету, тютюну, ячменю, олійного рапсу або кукурудзи. [00123] В іншому варіанті здійснення такі вектори є вірусними векторами і придатні для реплікації послідовностей нуклеїнових кислот у конкретних клітинах-хазяїнах, наприклад, клітинах комах або рослинних клітинах. Рекомбінантні вектори також використовують для трансформації послідовностей нуклеїнових кислот даного винаходу в клітини-хазяїни, за допомогою чого послідовності нуклеїнових кислот стійко інтегруються в ДНК таких клітинхазяїнів. В одному варіанті здійснення такі клітини-хазяїни являють собою прокаріотичні клітини. В іншому варіанті здійснення такі клітини-хазяїни являють собою еукаріотичні клітини, такі як рослинні клітини. В іншому варіанті здійснення рослинні клітини являють собою клітини кукурудзи. [00124] В одному варіанті здійснення даний винахід включає трансгенні рослини, які містять нуклеїнову кислоту даного винаходу, що кодує білок еCry1Ba або білок vCry1Ba за даним винаходом. Білки eCry1Ba або білки vCry1Ba придатні для експресії в будь-якій трансгенній рослині, де становлять проблему чутливі до нього комахи-шкідники. Такі трансгенні рослини включають, без обмеження, однодольні рослини і дводольні рослини. В одному варіанті здійснення однодольні рослини включають кукурудзу, пшеницю, овес, рис, ячмінь, цукровий очерет, сорго, газонну траву і пасовищні рослини. В іншому варіанті здійснення дводольні рослини включають сою й інші бобові, бавовник, соняшник, капустяні культури й інші овочі, цукровий буряк, тютюн і олійний рапс. 12 UA 110925 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [00125] В іншому варіанті здійснення даний винахід включає потомство рослини від будьякого покоління трансгенної рослини, де потомство містить нуклеїнову кислоту даного винаходу. [00126] У ще одному варіанті здійснення даний винахід включає частину рослини для розмноження від будь-якого покоління трансгенної рослини, де частина рослини для розмноження містить нуклеїнову кислоту даного винаходу. У ще одному варіанті здійснення частину рослини для розмноження даного винаходу вибирають із групи, яка включає насіння, орган вегетативного розмноження й живець. [00127] В іншому варіанті здійснення даний винахід включає біологічний зразок із трансгенної рослини даного винаходу, де біологічний зразок містить білок еCry1Ba даного винаходу, і білок еCry1Ba здатний боротися з комахами-шкідниками. Приклади таких біологічних зразків включають без обмеження будь-яку похідну кукурудзи, яка містить білок, таку як кукурудзяне борошно або кукурудзяний крохмаль, який містить білок еCry1Ba, де білок еCry1Ba продовжує виконувати інсектицидну функцію, яку він мав у трансгенній рослині кукурудзи, з якої був отриманий біологічний зразок. [00128] Даний винахід також включає інсектицидну композицію, яка містить білок eCry1B або vCry1Ba за даним винаходом і прийнятний сільськогосподарський носій. В одному варіанті здійснення сільськогосподарський носій може бути рідиною, порошком або трансгенною рослиною, наприклад, без обмеження, рослиною кукурудзи або рослиною цукрового очерету. [00129] В іншому варіанті здійснення даний винахід включає спосіб одержання білка eCry1B або білка vCry1Ba, який являється активним щодо комах та включає: (a) одержання клітинихазяїна, яка містить химерний ген, що сам по собі містить гетерологічну промоторну послідовність, функціонально зв'язану з нуклеїновою кислотою даного винаходу; і (b) експресію нуклеїнової кислоти в трансгенній клітині-хазяїні, яка дає в результаті щонайменше один білок даного винаходу, активний щодо комах. В іншому варіанті здійснення комахи являють собою лускокрилих комах або твердокрилих комах. У ще одному варіанті здійснення лускокрилих комах вибирають із групи, яка включає європейського кукурудзяного метелика, кукурудзяну південно-західну вогнівку, очеретяну вогнівку, бавовняну совку, соєву совку і гусеницю оксамитових бобів. [00130] У ще одному варіанті здійснення даний винахід включає спосіб одержання стійкої до комах трансгенної рослини, яка включає введення касети експресії, що містить нуклеїнову кислоту даного винаходу, у рослину з одержанням, таким чином, трансгенної рослини, де касета експресії викликає експресію білка даного винаходу в кількості, яка робить рослину стійкою до комах. В іншому варіанті здійснення комахи є лускокрилими або твердокрилими комахами. До таких лускокрилих комах, включених до даного винаходу, відносяться без обмеження європейський кукурудзяний метелик, кукурудзяна південно-західна вогнівка, очеретяна вогнівка, бавовняна совка, соєва совка і гусениця оксамитових бобів. [00131] В іншому варіанті здійснення даний винахід включає спосіб одержання білка eCry1Ba, який включає a) визначення білка Cry1Ba, який має домен I; b) заміщення щонайменше однієї нативної амінокислоти на ділянці в домені I щонайменше однією іншою амінокислотою; і c) одержання білка eCry1Ba, отриманого таким чином, в якому eCry1Ba має підвищену розчинність і/або інсектицидну активність щодо щонайменше європейського кукурудзяного метелика у порівнянні з нативним білком Cry1Ba. В іншому варіанті здійснення білок Cry1Ba являє собою Cry1Ba1, який має інвентарний номер GenBank CAA29898, Cry1Ba2 (CAA65003), Cry1Ba3 (AAK63251), Cry1Ba4 (AAK51084), Cry1Ba5 (ABO20894) або Cry1Ba6 (ABL60921). У ще одному варіанті здійснення нативна амінокислота в Cry1Ba розташована в альфа-спіралі 4 або альфа-спіралі 5 домену I. У ще одному варіанті здійснення амінокислота знаходиться в положенні, яке відповідає положенню 150, 178, 189 або 199 у SEQ ID NO: 2. У ще одному варіанті здійснення амінокислота знаходиться в положенні 150, 178, 189 або 199 у SEQ ID NO: 5. У ще одному варіанті здійснення амінокислота в Cry1Ba знаходиться в положенні, яке відповідає амінокислотам 2 і 150; або амінокислотам 2, 150 і 178; або амінокислотам 2, 150 і 189; або амінокислотам 2, 150 і 199 у SEQ ID NO: 5. В іншому варіанті здійснення амінокислота знаходиться в положеннях 2 і 150; або положеннях 2, 150 і 178; або в положеннях 2, 150 і 189; або в положеннях 2, 150 і 199 у SEQ ID NO: 5. [00132] У ще одному варіанті здійснення даний винахід включає спосіб боротьби з комахами, який включає доставку комахам або приведення в контакт комах з ефективною кількістю білка eCry1Ba або білка vCry1Ba даного винаходу. Відповідно до цього варіанта здійснення комахи є лускокрилими комахами або твердокрилими комахами. До таких лускокрилих комах відносяться без обмеження європейський кукурудзяний метелик, кукурудзяна південно-західна вогнівка, очеретяна вогнівка, бавовняна совка, соєва совка і 13 UA 110925 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гусениця оксамитових бобів. Переважно, білок еCry1Ba або білок vCry1Ba доставляється комахам перорально. В іншому варіанті здійснення білок доставляється перорально за допомогою трансгенної рослини, яка містить послідовність нуклеїнової кислоти, що експресує білок eCry1B або білок vCry1Ba даного винаходу. [00133] Даний винахід додатково включає спосіб боротьби з комахами, в якому трансгенна рослина даного винаходу додатково містить другу послідовність нуклеїнової кислоти або групи послідовностей нуклеїнових кислот, які кодують другу пестицидну діючу речовину. В одному варіанті здійснення другі послідовності нуклеїнових кислот є послідовностями, які кодують білок Cry, відмінний від білка eCry1Ba або білка vCry1Ba даного винаходу, послідовностями, які кодують токсин-вегетативний інсектицидний білок, розкритий у патентах США №№ 5849870 і 5877012, включених у даний документ посиланням, або послідовностями, які кодують шляхи для продукції небілкової діючої речовини. В іншому варіанті здійснення друга послідовність нуклеїнової кислоти кодує білок Vip3. Фахівець у даній галузі техніки встановить, що багато різних інсектицидних діючих речовин можуть використовуватися в комбінації з білком eCry1Ba або vCry1Ba даного винаходу. [00134] В іншому варіанті здійснення даний винахід включає спосіб забезпечення рослинника поліпшеним засобом боротьби щонайменше з європейським кукурудзяним метеликом, який включає постачання або продаж рослиннику трансгенних сіянців, що містять нуклеїнову кислоту, яка кодує білок еCry1Ba, що має мутацію в одному або декількох положеннях амінокислот у домені I, білок еCry1Ba, що має підвищену розчинність і/або інсектицидну активність щодо щонайменше європейського кукурудзяного метелика у порівнянні з нативним білком Cry1Ba. В іншому варіанті здійснення трансгенну частину рослини для розмноження вибирають із групи, яка включає насіння, орган вегетативного розмноження й живець. [00135] У додаткових варіантах здійснення послідовності нуклеїнових кислот даного винаходу можуть бути додатково модифіковані за допомогою включення випадкових мутацій технікою, відомою як in vitro рекомбінація або ДНК-перестановка. Ця техніка описана в Stemmer et al., Nature 370:389-391 (1994) і патенті США № 5605793, які включені в даний документ посиланням. Мільйони мутантних копій послідовності нуклеїнової кислоти одержують на основі вихідної послідовності нуклеїнової кислоти даного винаходу і відбирають варіанти з поліпшеними властивостями, такими як збільшена інсектицидна активність, посилена стійкість або інша специфічність, або діапазони цільових комах-шкідників. Спосіб включає утворення мутованої дволанцюгової полінуклеїнової кислоти з матричної дволанцюгової полінуклеїнової кислоти, яка містить послідовність нуклеїнової кислоти за даним винаходом, де матрична дволанцюгова полінуклеїнова кислота була розщеплена на дволанцюгові випадкові фрагменти необхідного розміру, і включає етапи додавання до отриманої популяції дволанцюгових випадкових фрагментів однієї або декількох одно- або дволанцюгових олігонуклеїнових кислот, де зазначені олігонуклеїнові кислоти містять область ідентичності й область гетерологічності з дволанцюговою матричною полінуклеїновою кислотою; денатурації отриманої суміші дволанцюгових випадкових фрагментів і олігонуклеїнових кислот в одноланцюгові фрагменти; інкубації отриманої популяції одноланцюгових фрагментів з полімеразою за умов, які приводять до відпалу зазначених одноланцюгових фрагментів на зазначених областях ідентичності з утворенням пар відпалених фрагментів, де зазначені ділянки ідентичності достатні для того, щоб один член пари затравлював реплікацію іншого, таким чином, формуючи мутовану дволанцюгову полінуклеїнову кислоту; і повторення другого і третього етапів протягом щонайменше двох додаткових циклів, де отримана суміш на другому етапі додаткового циклу включає мутовану дволанцюгову полінуклеїнову кислоту з третього етапу попереднього циклу, і додатковий цикл утворює додаткову мутовану дволанцюгову полінуклеїнову кислоту. У переважному варіанті здійснення концентрація окремого виду дволанцюгового випадкового фрагмента в популяції дволанцюгових випадкових фрагментів складає менше 1 % за вагою загальної ДНК. У ще одному варіанті здійснення матрична дволанцюгова полінуклеїнова кислота містить щонайменше приблизно 100 видів полінуклеїнових кислот. В іншому переважному варіанті здійснення розмір дволанцюгових випадкових фрагментів складає від близько 5 п. н. до 5 т. п. н. У ще одному додатковому варіанті здійснення четвертий етап способу включає повторення другого і третього етапів протягом щонайменше 10 циклів. Експресія послідовностей нуклеїнових кислот у гетерологічних мікробних хазяїнах [00136] Як біологічні засоби боротьби з комахами інсектицидні білки eCry1Ba одержують шляхом експресії послідовностей нуклеїнових кислот у гетерологічних клітинах-хазяїнах, здатних експресувати послідовності нуклеїнових кислот. У першому варіанті здійснення одержують клітини B. thuringiensis, які містять модифікації послідовності нуклеїнової кислоти 14 UA 110925 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 відповідно до даного винаходу. Такі модифікації включають мутації або делеції існуючих регуляторних елементів, таким чином, приводячи до зміненої експресії послідовності нуклеїнової кислоти або включення нових регуляторних елементів, які контролюють експресію послідовності нуклеїнової кислоти. В іншому варіанті здійснення додаткові копії однієї або декількох послідовностей нуклеїнових кислот додають до клітин Bacillus thuringiensis або шляхом вставки в хромосому, або шляхом введення позахромосомно реплікованих молекул, які містять послідовності нуклеїнових кислот. [00137] В іншому варіанті здійснення щонайменше одну з послідовностей нуклеїнових кислот даного винаходу вводять у придатну касету експресії, яка містить промотор і сигнал термінації. Експресія послідовності нуклеїнової кислоти є конститутивною, або використовується промотор, індуцибельний у відповідь на різні типи стимулів для ініціації транскрипції. У кращому варіанті здійснення клітина, у якій експресується білок, являє собою мікроорганізм, такий як вірус, бактерії або гриб. В одному варіанті здійснення вірус, такий як бакуловірус, містить послідовність нуклеїнової кислоти даного винаходу у своєму геномі і експресує великі кількості відповідного інсектицидного білка eCry1Ba або білка vCry1Ba після інфікування придатних еукаріотичних клітин, що придатні для реплікації вірусу й експресії послідовності нуклеїнової кислоти. Інсектицидний білок, отриманий таким чином, використовують як інсектицидний засіб. Альтернативно, бакуловіруси, сконструйовані з включенням послідовності нуклеїнової кислоти, використовують для інфікування комах in vivo і знищення їх або шляхом експресії інсектицидного білка, або шляхом комбінації вірусної інфекції й експресії інсектицидного білка. [00138] Бактеріальні клітини є також хазяїнами для експресії послідовностей нуклеїнових кислот даного винаходу. У кращому варіанті здійснення використовуються непатогенні симбіотичні бактерії, які здатні жити і реплікуватися усередині тканин рослини, так звані ендофіти, або непатогенні симбіотичні бактерії, які здатні колонізувати філосферу або ризосферу, так звані епіфіти. Такі бактерії включають бактерії родів Agrobacterium, Alcaligenes, Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Clavibacter, Enterobacter, Erwinia, Flavobacter, Klebsiella, Pseudomonas, Rhizobium, Serratia, Streptomyces і Xanthomonas. Симбіотичні гриби, такі як Trichoderma і Gliocladium, також є можливими хазяїнами для експресії послідовностей нуклеїнових кислот за даним винаходом з тією ж метою. [00139] Техніки для цих генетичних маніпуляцій є спеціальними для різних доступних хазяїнів і відомі в даному рівні техніки. Наприклад, вектори експресії pKK223-3 і pKK223-2 можуть використовуватися для експресії гетерологічних генів у E. coli або в транскрипційному, або трансляційному злитті під дією tac або trc промотора. Для експресії оперонів, які кодують множинні ORF (відкриті рамки зчитування), найпростішою процедурою є вставка оперона у вектор, такий як pKK223-3, при транскрипційному злитті, що дозволяє використовувати споріднений сайт зв'язування рибосоми гетерологічних генів. Техніки для надекспресії в грампозитивному виді, такому як Bacillus, також відомі в даному рівні техніки і можуть використовуватися в контексті даного винаходу (Quax et al. B: Industrial Microorganisms:Basic and Applied Molecular Genetics, Eds. Baltz et al., American Society for Microbiology, Washington (1993)). Альтернативні системи для надекспресії основані, наприклад, на дріжджових векторах і включають застосування Pichia, Saccharomyces і Kluyveromyces (Sreekrishna, B:Industrial microorganisms:basic and applied molecular genetics, Baltz, Hegeman, and Skatrud eds., American Society for Microbiology, Washington (1993); Dequin & Barre, Biotechnology L2:173-177 (1994); van den Berg et al., Biotechnology 8:135-139 (1990)). Трансформація рослини [00140] В одному варіанті здійснення щонайменше один з інсектицидних білків eCry1B або білків vCry1Ba даного винаходу експресується у вищому організмі, наприклад, рослині. У даному випадку трансгенні рослини, які експресують ефективні кількості білків eCry1Ba або vCry1Ba, захищають самі себе від комах-шкідників. Коли комаха починає харчуватися на такій трансгенній рослині, вона також ковтає експресований білок eCry1Ba або vCry1Ba. Це буде утримувати комаху від додаткового прокусування тканини рослини або може навіть завдавати шкоди або знищувати комаху. Послідовність нуклеїнової кислоти даного винаходу вводять у касету експресії, яка потім переважно стійко інтегрується в геном зазначеної рослини. В іншому варіанті здійснення послідовність нуклеїнової кислоти включена в непатогенний вірус, який самореплікується. Рослини, трансформовані відповідно до даного винаходу, можуть бути однодольними або дводольними і включають, але не обмежуючись ними, кукурудзу, пшеницю, ячмінь, жито, солодку картоплю, боби, горох, цикорій, салат-латук, качанову капусту, кольорову капусту, броколі, турнепс, редис, шпинат, спаржу, цибулю, часник, перець, селеру, гарбуз великоплідний, гарбуз звичайний, коноплі, цукіні, яблуко, грушу, айву, диню, сливу, вишню, 15 UA 110925 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 персик, нектарин, абрикос, полуницю, виноград, малину, ожину, ананас, авокадо, папайю, манго, банан, сою, томат, сорго, цукровий очерет, цукровий буряк, соняшник, рапс, конюшину, тютюн, моркву, бавовник, люцерну, рис, картоплю, баклажан, огірок, арабідопсис і деревні рослини, такі як хвойні і листяні дерева. [00141] Як тільки бажана послідовність нуклеїнової кислоти була трансформована в конкретний вид рослини, вона може розмножуватися в цьому виді або переноситися в інші сорти того ж виду, особливо, включаючи комерційні сорти, за допомогою традиційних методик селекції. [00142] Послідовність нуклеїнової кислоти за даним винаходом може бути експресована в трансгенних рослинах, таким чином, викликаючи біосинтез відповідного білка eCry1Ba або vCry1Ba у трансгенних рослинах. Таким способом створюють трансгенні рослини з посиленою стійкістю до комах. Для їхньої експресії в трансгенних рослинах послідовності нуклеїнових кислот даного винаходу можуть потребувати інших модифікацій або оптимізації. Хоча в багатьох випадках гени з мікробних організмів можуть бути експресовані в рослинах при високих рівнях без модифікації, низький рівень експресії в трансгенних рослинах може бути результатом мікробних послідовностей нуклеїнових кислот, які мають кодони, що не є найбільш бажаними в рослинах. В галузі техніки відомо, що всі організми мають специфічні переваги для використання кодона, і кодони послідовностей нуклеїнових кислот, описаних у даному винаході, можуть бути змінені для відповідності уподобанням рослини, при збереженні амінокислот, які кодуються таким чином. Крім того, висока експресія в рослинах краще досягається від кодуючих послідовностей, які містять щонайменше приблизно 35 % GC, бажано більше ніж близько 45 %, більш бажано більше ніж близько 50 %, і найбільш бажано більше ніж близько 60 %. Мікробні послідовності нуклеїнових кислот, які мають низький вміст GC, можуть слабо експресуватись в рослинах із-за існування ATTTA мотивів, які можуть дестабілізувати трансткрипти, і AATAAA мотивів, які можуть викликати неприйнятне поліаденілювання. Хоча переважні генні послідовності можуть бути належним чином експресовані як в однодольних, так і дводольних видах рослин, послідовності можуть бути модифіковані з урахуванням специфічних кодонових переваг і переваг вмісту GC однодольних або дводольних, так як було показано, що ці переваги відрізняються (Murray et al. Nucl. Acids Res. 17:477-498 (1989)). До того ж послідовності нуклеїнових кислот піддаються скринінгу на існування неприйнятних сайтів сплайсингу, які можуть викликати процесинг транскрипта. Усі зміни, які необхідно зробити в послідовностях нуклеїнових кислот, такі як ті, які описані вище, здійснюють за допомогою добре відомих методик сайт-направленого мутагенезу, ПЦР і конструювання штучних генів за допомогою способів, описаних в опублікованих патентних заявках EP 0 385 962 (для Monsanto), EP 0 359 472 (для Lubrizol) і WO 93/07278 (для Ciba-Geigy). [00143] В одному варіанті здійснення даного винаходу кодуючу послідовність eCry1Ba одержують відповідно до процедури, розкритої в патенті США № 5625136, включеному в даний документ посиланням. У цій процедурі застосовують переважні для маїсу кодони, тобто один кодон, який найчастіше кодує таку амінокислоту в маїсі. Переважний для маїсу кодон для конкретної амінокислоти може бути отриманий, наприклад, із відомих генних послідовностей маїсу. Частота використання кодона в маїсі для 28 генів з рослин маїсу представлена в Murray et al., Nucleic Acids Research 17:477-498 (1989), опис якого включено в даний документ посиланням. Синтетична послідовність, створена з кодонами, оптимізованими для маїсу, представлена в SEQ ID NO: 13. [00144] Таким способом послідовності нуклеїнових кислот можуть бути оптимізовані для експресії в будь-якій рослині. Установлено, що вся або будь-яка частина генної послідовності може бути оптимізованою або синтетичною. Тобто синтетичні або частково оптимізовані послідовності можуть також бути використані. [00145] Для ефективної ініціації трансляції послідовності, які прилягають до ініціюючого метіоніну, можуть вимагати модифікації. Наприклад, вони можуть бути модифіковані шляхом включення послідовностей, відомих як ефективні в рослинах. Joshi запропонував прийнятний консенсус для рослин (NAR 15:6643-6653 (1987)) і Clonetech пропонує додатковий консенсусний ініціатор трансляції (каталог 1993/1994, сторінка 210). Ці консенсуси придатні для застосування з послідовностями нуклеїнових кислот даного винаходу. Послідовності вбудовуються в конструкції, які містять послідовності нуклеїнових кислот, до і включаючи ATG (у той самий час залишаючи другу амінокислоту немодифікованою) або альтернативно до і включаючи GTC, наступну за ATG (з можливістю модифікації другої амінокислоти трансгена). [00146] Експресія послідовностей нуклеїнових кислот у трансгенних рослинах управляється промоторами, які функціонують у рослинах. Вибір промотору буде змінюватися залежно від тимчасових і просторових потреб для експресії, а також у залежно від цільового виду. Таким 16 UA 110925 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 чином, експресія послідовностей нуклеїнових кислот за даним винаходом в листках, у стеблах або стовбурах, у початках, у суцвіттях (наприклад, колосся, мітелки, стрижні початків кукурудзи і т. п.), у коренях і/або в сіянцях є переважною. У багатьох випадках, однак, необхідний захист від більше ніж одного типу комахи-шкідника, і таким чином, бажана експресія в ряді тканин. Хоча багато промоторів із дводольних, як було показано, є функціональними в однодольних і навпаки, в ідеалі вибирають промотори дводольних для експресії в дводольних, і промотори однодольних для експресії в однодольних. Однак немає обмеження щодо джерела походження промоторів: досить, щоб вони були функціональними при управлінні експресією послідовностей нуклеїнових кислот у необхідній клітині. [00147] Промотори, які експресуються конститутивно, включають промотори з генів, які кодують актин або убіквітин, і 35S і 19S промотори CaMV. Послідовності нуклеїнових кислот даного винаходу можуть також експресуватись під контролем промоторів, які є хімічно регульованими. Це дозволяє інсектицидним білкам eCry1Ba або варіантним білкам Cry1Ba синтезуватися тільки коли сільськогосподарські рослини обробляються індикуючими хімічними речовинами. Переважна технологія для хімічної індукції генної експресії докладно описана в опублікованій заявці EP 0 332 104 (для Ciba-Geigy) і патенті США № 5614395. Переважний промотор для хімічної індукції являє собою промотор PR-1a тютюну. [00148] Іншою категорією промоторів є ті, які є індукованими пораненням. Були описані численні промотори, які експресуються в місцях поранення, а також у місцях фітопатогенної інфекції. В ідеалі, такий промотор повинен бути активний тільки локально в місцях інфекції, і, таким чином, інсектицидні білки eCry1B або варіантні білки Cry1Ba накопичуються тільки в клітинах, які мають потребу в синтезі інсектицидних білків eCry1Ba або варіантних білків Cry1Ba для знищення комахи-шкідника, який впроваджується. Промотори цього виду включають ті, які описані Stanford et al. Mol. Gen. Genet. 215:200-208 (1989), Xu et al. Plant Molec. Biol. 22:573-588 (1993), Logemann et al. Plant Cell 1:151-158 (1989), Rohrmeier & Lehle, Plant Molec. Biol. 22:783792 (1993), Firek et al. Plant Molec. Biol. 22:129-142 (1993), і Warner et al. Plant J. 3:191-201 (1993). [00149] Специфічні для тканини або переважні для тканини промотори, придатні для експресії генів білка eCry1Ba або варіантного білка Cry1Ba у рослинах, зокрема, кукурудзі, є такими, які управляють експресією в корені, серцевині, листку або пилку, зокрема, корені. Такі промотори, наприклад, такі, які виділені з PEPC або trpA, розкриті в патенті США № 5625136 або MTL, розкриті в патенті США № 5466785. Обидва патенти США включені в даний документ посиланням у їхньому повному обсязі. [00150] Додаткові переважні варіанти здійснення являють собою трансгенні рослини, які експресують послідовності нуклеїнових кислот способом індукції пораненням або індукції патогенною інфекцією. [00151] На додаток до промоторів, різноманітні термінатори транскрипції є також доступними для застосування при конструюванні химерного гена за допомогою генів білка eCry1Ba або варіантного білка Cry1Ba даного винаходу. Термінатори транскрипції відповідають за термінацію транскрипції за межами трансгена і його правильне поліаденілювання. Прийнятні термінатори транскрипції і такі, відомі як функціонуючі в рослинах, включають термінатор 35S CaMV, термінатор tml, термінатор нопалін-синтази, термінатор rbcS E9 гороху й інші, відомі в рівні техніки. Вони можуть використовуватися як в однодольних, так і в дводольних. Будь-який доступний термінатор, відомий як функціонуючий в рослинах, може використовуватися в контексті даного винаходу. [00152] Різні інші послідовності, можуть бути введені в касети експресії, описані в даному винаході. Вони включають послідовності, які, як було показано, підсилюють експресію, такі як інтронні послідовності (наприклад, з Adhl і bronzel) і вірусні лідерні послідовності (наприклад, з TMV, MCMV і AMV). [00153] Переважним є націлювання експресії послідовностей нуклеїнових кислот даного винаходу в різні клітинні локалізації в рослині. У деяких випадках локалізація в цитозолі може бути бажаною, тоді як в інших випадках, локалізація в деякій субклітинній органелі може бути переважною. Субклітинна локалізація кодованих трансгеном ферментів забезпечується за допомогою методик, добре відомих у даному рівні техніки. Як правило, ДНК, яка кодує цільовий пептид з відомого націленого на органелу генного продукту, піддається маніпуляції і зливається вище послідовності нуклеїнової кислоти. Багато таких послідовностей, що націлюють, відомі для хлоропласта, і показано їхнє функціонування в гетерологічних конструкціях. Експресія послідовностей нуклеїнових кислот даного винаходу також націлена на ендоплазматичний ретикулум або на вакуолі клітин-хазяїнів. Методики для досягнення цього добре відомі в даному рівні техніки. 17 UA 110925 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [00154] Вектори, придатні для трансформації рослин, описані в іншому місці в цьому описі. Для опосередкованої Agrobacterium трансформації бінарні вектори або вектори, які несуть щонайменше одну T-ДНК граничну послідовність, є придатними, тоді як для прямого переносу генів є придатним будь-який вектор, і лінійна ДНК, яка містить тільки конструкцію інтересу, може бути переважною. У випадку прямого переносу генів може використовуватися трансформація одним видом ДНК або котрансформація (Schocher et al. Biotechnology 4:1093-1096 (1986)). Як для прямого переносу генів, так і для опосередкованого Agrobacterium переносу, трансформацію звичайно (але не обов'язково) здійснюють із селективним маркером, який може забезпечувати стійкість до антибіотика (канаміцину, гігроміцину або метотрексату) або гербіциду (баста). Вектори трансформації рослин, які містять гени білка eCry1Ba або варіантного білка Cry1Ba даного винаходу, можуть також містити гени, наприклад, фосфоманоза-ізомеразу (pmi), яка забезпечує позитивну селекцію трансгенних рослин, як розкрито в патентах США №№ 5767378 і 5994629, включених у даний документ посиланням, або фосфінотрицин-ацетилтрансферазу (pat), яка забезпечує стійкість до гербіциду фосфінотрицину (глюфозинату). Вибір селективного маркера, однак, не є ключовим для даного винаходу. [00155] В іншому варіанті здійснення послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує білок eCry1Ba або білок vCry1Ba даного винаходу, безпосередньо трансформують у геном пластиди. Головна перевага пластидної трансформації полягає в тому, що пластиди, як правило, здатні експресувати бактеріальні гени без істотної оптимізації кодона, і пластиди здатні до експресії множинних відкритих рамок зчитування під контролем одного промотора. Технологія пластидної трансформації широко описана в патентах США №№ 5451513, 5545817 і 5545818, у PCT заявці WO 95/16783 і в McBride et al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91, 7301-7305. Базова методика для трансформації хлоропластів включає введення ділянок клонованої пластидної ДНК, фланкуючої селективний маркер разом з геном інтересу, у придатну цільову тканину, наприклад, використовуючи біолістику або трансформацію протопласта (наприклад, трансформацію, опосередковану хлоридом кальцію, або ПЕГ -опосередковану трансформацію). Фланкуючі ділянки 1-1,5 т. п. н., названі направляючими послідовностями, полегшують гомологічну рекомбінацію з пластидним геномом і, таким чином, забезпечують заміщення або модифікацію специфічних ділянок пластому. Спочатку, точкові мутації в генах 16S рРНК і rps12 хлоропласта, які забезпечують стійкість до спектиноміцину і/або стрептоміцину, використовують як селективні маркери для трансформації (Svab, Z., Hajdukiewicz, P., і Maliga, P. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87, 8526-8530; Staub, J. M., і Maliga, P. (1992) Plant Cell 4, 39-45). Це приводило до стабільних гомопластидних трансформантів з частотою приблизно один на 100 бомбардувань цільових листків. Присутність сайтів клонування між цими маркерами забезпечувала створення націленого на пластиду вектора для введення чужорідних генів (Staub, J. M., і Maliga, P. (1993) EMBO J. 12, 601-606). Істотні підвищення частоти трансформації одержують шляхом заміщення рецесивних генів рРНК або r-білка стійкості до антибіотика на домінантний селективний маркер, бактеріальний ген aadА, який кодує знешкоджуючий спектиноміцин фермент, аміноглікозид-3'- аденілтрансферазу (Svab, Z., і Maliga, P. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 913-917). Раніше цей маркер був успішно використаний для трансформації з високою частотою пластидного геному зеленої водорості Chlamydomonas reinhardtii (Goldschmidt-Clermont, M. (1991) Nucl. Acids Res. 19:4083-4089). Інші селективні маркери, придатні для пластидної трансформації, відомі в даному рівні техніки і включені в обсяг даного винаходу. Як правило, необхідно приблизно 15-20 циклів клітинного поділу після трансформації для досягнення гомопластидного стану. Пластидна експресія, при якій гени вставляються за допомогою гомологічної рекомбінації в усі з декількох тисяч копій кільцевого пластидного геному, присутні у кожній рослинній клітині, користується перевагою аномальної кількості копій у порівнянні з генами, експресованими в ядрі, щоб забезпечити рівні експресії, які можуть легко перевищити 10 % від загального розчинного білка рослин. У переважному варіанті здійснення послідовність нуклеїнової кислоти даного винаходу вставляють у націлений на пластиду вектор і трансформують у геном пластиди бажаної рослини-хазяїна. Одержують рослини гомопластичні щодо пластидних геномів, які містять послідовність нуклеїнової кислоти даного винаходу, і вони переважно здатні до високої експресії послідовності нуклеїнової кислоти. Комбінації діючих речовин для боротьби з комахами [00156] Білки eCry1Ba або vCry1Ba даного винаходу можуть використовуватися в комбінації з іншими білками Cry Bt або іншими пестицидними діючими речовинами для підвищення цільового спектра шкідників. Крім того, застосування білків eCry1Ba або vCry1Ba даного винаходу в комбінації з іншими білками Cry Bt або іншими пестицидними діючими речовинами 18 UA 110925 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 іншої природи має особливу користь для запобігання і/або керування стійкістю комах. Інші інсектицидні діючі речовини включають, наприклад, лектини, α-амілазу, пероксидазу і холестерол-оксидазу. Гени Вегетативного Інсектицидного Білка, такі як vip1A(a) і vip2A(a) або vip3, також придатні в даному винаході. В одному варіанті здійснення білок еCry1Ba, позначений eCry1Ba-T2AY150KL189S (SEQ IDNO: 9), комбінують з білком Vip3A у трансгенній рослині. Трансгенна рослина проявляє комбінований спектр інсектицидної активності, зв'язаний як з eCry1Ba, так і з Vip3. У ще одному варіанті здійснення трансгенна рослина являє собою рослину кукурудзи або рослину цукрового очерету. [00157] Така коекспресія більше ніж однієї інсектицидної діючої речовини в одній трансгенній рослині може бути досягнута шляхом генетичного конструювання щодо рослини, щоб вона містила і експресувала всі необхідні гени в так званому молекулярному пакеті. Альтернативно, рослина, Батько 1, може бути генетично сконструйована для експресії генів даного винаходу. Друга рослина, Батько 2, може бути генетично сконструйована для експресії додаткової діючої речовини для боротьби з комахою. Шляхом схрещування Батька 1 з Батьком 2 одержують потомство рослини, яке експресує усі гени, введені в Батьків 1 і 2. Наприклад, без обмеження, Батько 1 може містити кодуючу послідовність eCry1Ba, і Батько 2 може містити кодуючу послідовність Vip3A. Деякий з нащадків схрещування Батька 1 з Батьком 2 буде містити як кодуючу послідовність eCry1Ba, так і кодуючу послідовність Vip3A. [00158] Трансгенне насіння даного винаходу може також бути оброблене інсектицидним покриттям для насіння, як описано в патентах США №№ 5849320 і 5876739, включених у даний документ посиланням. У випадку, коли інсектицидне покриття для насіння і трансгенне насіння даного винаходу є активними щодо однієї і тієї ж цільової комахи, комбінація є придатною (і) у способі для підвищення активності білка eCry1Ba даного винаходу щодо цільової комахи і (ii) у способі профілактики розвитку стійкості до білка eCry1Ba даного винаходу шляхом забезпечення другого механізму дії щодо цільової комахи. Таким чином, даний винахід забезпечує спосіб підвищення активності щодо цільової комахи або профілактики розвитку стійкості в цільової комахи, наприклад, кукурудзяного жука, який включає нанесення інсектицидного покриття для насіння на трансгенне насіння, яке містить один або кілька білків eCry1Ba даного винаходу. Такі хімічні обробки можуть включати інсектициди, фунгіциди або нематоциди. Приклади таких інсектицидів включають, без обмеження, динотефуран, такий як тіаметоксам, імідаклоприд, ацетаміприд, нітенпірам, нідинотефуран, хлорфенапір, тебуфенпірад, тебуфенозид, метоксифенозид, галофенозид, триазамат, авермектин, спіносад, фіпринол, ацефат, фенаміфос, діазинон, хлорпірифос, хлорпірифон-метил, малатіон, карбарил, алдикарб, карбофуран, тіодикарб і оксаміл. Навіть якщо інсектицидне покриття для насіння є активним щодо іншої комахи, то інсектицидне покриття для насіння є придатним для розширення діапазону боротьби з комахами, наприклад, шляхом додавання інсектицидного покриття для насіння, яке має активність щодо лускокрилих комах, до трансгенного насіння даного винаходу, яке має активність щодо твердокрилих комах, при цьому покрите трансгенне насіння забезпечує боротьбу як з лускокрилими, так і з твердокрилими комахами-шкідниками. ПРИКЛАДИ [00159] Даний винахід буде додатково описано з посиланням на наступні докладні приклади. Ці приклади представлені лише для цілей ілюстрації, і не мається на увазі, що вони є обмежуючими, якщо інше не зазначено. Стандартні методики рекомбінантної ДНК і молекулярного клонування, використані в даному документі, є добре відомими в даному рівні техніки й описані в J. Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d Ed., Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001); T. J. Silhavy, M. L. Berman, і L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) і Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, New York, John Wiley and Sons Inc., (1988), Reiter, et al., Methods in Arabidopsis Research, World Scientific Press (1992), і Schultz et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers (1998). Приклад 1. Застосування ПЦР для мутування кодуючих послідовностей Cry1Ba [00160] Полімеразна ланцюгова реакція (ПЦР) являє собою повторюваний, ферментативний, який використовує затравку, синтез послідовності нуклеїнової кислоти. Ця процедура є добре відомою і широко використовуваною фахівцями в даній галузі техніки (Дивися Mullis, патенти США №№ 4683195, 4683202 і 4800159; Saiki, Randall K., Stephen Scharf, Fred Faloona, Kary B. Mullis, Glenn T. Horn, Henry A. Erlich, Norman Arnheim [1985] "Enzymatic Amplification of β-Globin Genomic Sequences and Restriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle Cell Anemia, " Science 230:1350-1354.). ПЦР ґрунтується на ферментативній ампліфікації ДНК фрагмента інтересу, який фланкований двома праймерами олігонуклеїнової кислоти, що гібридизуються з протилежними ланцюгами цільової послідовності. Праймери орієнтовані 3' 19 UA 110925 C2 5 10 15 кінцями, спрямованими один до одного. Повторювання циклів температурної денатурації матриці, відпал праймерів до їхніх комплементарних послідовностей і подовження відпалених праймерів за допомогою ДНК полімерази приводять до ампліфікації сегмента, визначеного 5' кінцями ПЦР праймерів. Оскільки подовжений продукт кожного праймера може служити як матриця для інших праймерів, кожен цикл власне кажучи подвоює кількість ДНК фрагмента, отриманого в попередньому циклі. Це приводить до експоненціального нагромадження специфічного цільового фрагмента аж до декількох мільйонів разів за кілька годин. Шляхом використання термостабільної ДНК полімерази, такої як Taq полімераза, яку виділяють з термофільної бактерії Thermus aquaticus, процес ампліфікації може бути цілком автоматизований. [00161] Кодуючі послідовності мутантного Cry1Ba, описані в наступних прикладах, були сконструйовані, використовуючи QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (набір QuickChange для сайт-направленого мутагенезу) (Stratagene, Ла-Хойя, Каліфорнія) відповідно до інструкцій виробника, і різні комбінації ілюстративних праймерів показані у Таблиці 1. Фахівець у даній галузі техніки установить на підставі даної заявки, що інші пари праймерів можуть використовуватися, щоб мутувати будь-яку кодуючу послідовність Cry1Ba. Таблиця 1 Праймери, використані для створення мутованої кодованої послідовності, яка кодує білки eCry1Ba. Назва праймера YG152 YG153 YG154 YG155 YG156 YG157 Послідовність праймера SEQ ID NO: 5'-agaagtgttcttnnsacccaatatatagctttagaacttg-3' 5'-tatatattgggtsnnaagaacacttctcgttcttgcatc-3' 5'-agaagtgttcttaagacccaatatatagctttagaacttg-3' 5'-tatatattgggtcttaagaacacttctcgttcttgcatc-3' 5'-agaagtgttctttggacccaatatatagctttagaacttg-3' 5'-tatatattgggtccaaagaacacttctcgttcttgcatc-3' SEQ ID NO:14 SEQ ID NO:15 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:19 YG160 YG161 YG162 5'-atatgtttaaacatgacttcaaataggaaaaatgagaatgaa-3' 5'-atatgtttaaacatggatctattaccagatgctcgtattg-3' 5'-atatggcgcgcctatctttctaaatcatattctgcttcgaagg-3' SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:21 SEQ ID NO:22 YG163 YG164 YG165 YG166 5'-aattccatggcgtcaaataggaaaaatgagaatgaaattataaatgc-3' 5'-aattccatggatctattaccagatgctcgtattg-3' 5'-aattccatggaggatagcttgtgtatagccgagg-3' 5'-aattgagctcttatctttctaaatcatattctgcttcgaagg-3' SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:24 SEQ ID NO:25 SEQ ID NO:26 YG171 YG172 YG175 YG176 YG179 YG180 YG183 YG184 YG186 YG188 YG189 YG190 YG191 YG192 YG193 5'-agttttctttggggtgaattatggccccgc-3' 5'-taattcaccccaaagaaaactataaaaactagc-3' 5'-caatatatagatttagaacttgattttcttaatg-3' 5'-aagttctaaatctatatattgggtataaagaac-3' 5'-ttacacctatccttattgagagatgcctctc-3' 5'-tctcaataaggataggtgtaaatttgcagcttg-3' 5'-agaacgagaagtgaacttaagacccaatatatagc-3' 5'-acccaatatatagatttagaacttgattttcttaatgcg-3' 5'-gaagttccattattgccggtatatgctcaagctgc-3' 5'-tttcttaataagatgccgcttttcgcaattagaaacc-3' 5'-aagcggcatcttattaagaaaatcaagttctaaagctatatattggg-3' 5'-ctttttggtaaggaatttgggcttacatcgcagg-3' 5'-cccaaattccttaccaaaaagagaggcatctctcaat-3' 5'-ccattattgagcgtatatgctcaagctgcaaatttacacc-3' 5'-agcatatacgctcaataatggaacttcttggtttctaattgcg-3' SEQ ID NO:27 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:29 SEQ ID NO:30 SEQ ID NO:31 SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:33 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:35 SEQ ID NO:36 SEQ ID NO:37 SEQ ID NO:38 SEQ ID NO:39 SEQ ID NO:40 SEQ ID NO:41 Приклад 2. Визначення токсичності мутантів Cry1Ba 20 UA 110925 C2 5 10 15 20 25 30 [00162] Активність мутантних білків Cry1Ba (описаних нижче) щодо комах-шкідників, які включають європейського кукурудзяного метелика (Ostrinia nubilalis), очеретяну вогнівку (Diatraea saccharalis), кукурудзяну південно-західну вогнівку (Diatraea grandiosella), бавовняну совку (Helicoverpa zea), соєву совку (Pseudoplusia includens), гусеницю оксамитових бобів (Anticarsia gemmatalis) і колорадського жука (Leptinotarsa decemlineata), визначають за допомогою способу зараження поверхні. Коротко, штучний раціон для конкретного виду наливають у 24-ямкові планшети для тканинної культури або малі чашки Петрі. Кожна лунка має площу поверхні приблизно 2 см2. Рідини, які містять мутантні білки Cry1Ba, наносять на поверхню раціону в кожній лунці. Після того, як рідина абсорбується і висихає, випробувані личинки поміщаються в кожну лунку, і потім планшет герметично закривають. Активність сконструйованого білка Cry1Ba порівнюють з нативним або Cry1Ba дикого типу і записують у вигляді відсотка смертності або відносної активності. Приклад 3. Мутації в положенні 150 у повнорозмірному Cry1Ba. [00163] Оскільки шість нативних білків Cry1Ba відрізняються тільки однією амінокислотою в альфа-спіралі 4, наприклад, 4/6 мають тирозин (Y150) і 2/6 мають гістидин (H150) (дивися Фігуру 1), то аналіз початкового мутагенезу досліджував вплив положення амінокислоти 150 в альфаспіралі 4 на інсектицидну активність повнорозмірного Cry1Ba. [00164] Нативну повнорозмірну кодуючу послідовність cry1Ba (SEQ ID NO: 1) клонували в pUC18-отриманий біфункціональний вектор Bt/E. coli під контролем Cry1Ac промотора. Використовуючи цю повнорозмірну кодуючу послідовність як матрицю, мутантні білки Cry1Ba створювали шляхом випадкового заміщення тирозину (Tyr) у положенні 150 іншими амінокислотами, використовуючи QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, ЛаХойя, Каліфорнія) відповідно до інструкцій виробника і праймери YG152-YG157 Таблиці 1. Усі мутантні білки Cry1Ba досліджували щодо ECB, використовуючи спосіб, описаний у Прикладі 2. [00165] Дані, представлені в Таблиці 2, показують, що положення 150 у повнорозмірному білку Cry1Ba відіграє важливу роль у модулюванні щонайменше токсичності ECB. Деякі з мутацій знижували специфічну активність ECB у порівнянні з нативним Cry1Ba. Cry1Ab, білок з високою специфічною активністю щодо ECB, має аргінін (Arg) у положенні, яке відповідає Y150 послідовності Cry1Ва (положення 131 Cry1Ab послідовності; див. Фігуру 2A). Цікаво, що Y150R мутант Cry1Ba мав тільки половину активності нативного білка Cry1Ba, використаного в експерименті. Мутації, які зберігали або дещо збільшували активність у порівнянні з нативним Cry1Ba, включали Y150K, Y150F, Y150W і Y150P. Мутантні білки Cry1Ba, які мали більш низьку активність у порівнянні з нативним Cry1Ba, були позначені як варіантні білки Cry1Ba. Таблиця 2 Результати біоаналізу ECB Cry1Ba-Y150X мутанта. Позначення мутанта M4 M18 M7 M26 M12 M14 M15 M23 M28 M38 M9 M24 Нативний Cry1Ba Порожній вектор (контроль) Амінокислота в положенні 150 K F W P T L A V S R G D Y Відносна смертність ECB ++++ +++ +++ +++ ++ ++ ++ ++ ++ + + +/+++ 35 Приклад 4. Токсичність укороченого Cry1Ba у порівнянні з повнорозмірним Cry1Ba [00166] На підставі того, що відомо в даному рівні техніки, не ясно, на які точно протеолітичні сайти в Cry1Ba спрямовані кишкові протеази комах. Отже, послідовність активного токсину залишається не ясною. Для цього прикладу сайти розщеплення для 21 UA 110925 C2 5 10 15 20 протоксину Cry1Ba передбачили на основі вирівнювання послідовностей з Cry1Ab (див. Фігуру 2), чиї сайти розщеплення були встановлені. Використовуючи цю інформацію, були сконструйовані вектори, які експресують укорочені варіанти Cry1Ba. [00167] Укорочений фрагмент cry1Ba клонували за допомогою ПЦР у вектор pCIB5634 або pET28a, використовуючи повнорозмірну нативну кодуючу послідовність cry1Ba (SEQ ID NO: 1) як матрицю і праймери YG160 і YG162 або YG163 і YG166 відповідно. Отриманий за допомогою ПЦР фрагмент кодує укорочений білок, який містить амінокислоти 1-647 у SEQ ID NO: 2. Однак у ході початкового клонування укороченої кодуючої послідовності cry1Ba у вектори вводили мутацію, за допомогою чого треонін у положенні 2 (T2) заміщається аланіном (Ala; A) (T2A мутація). Визначили, що ця T2A мутація не має негативного впливу на інсектицидну активність у порівнянні з нативним Cry1Ba і, отже, її використовували в усіх наступних експериментах з мутаціями. Цей T2A мутант був позначений T25 Cry1Ba дикого типу. [00168] Інший укорочений фрагмент cry1Ba клонували за допомогою ПЦР у вектор pCIB5634 або pET28a, використовуючи кодуючу послідовність T25 як матрицю і праймери YG161 і YG162 або YG164 і YG166 відповідно. Отриманий за допомогою ПЦР фрагмент кодує білок, укорочений на N-кінці і C-кінці (SEQ ID NO: 42), який містить амінокислоти 22-647 у SEQ ID NO: 2 і був позначений T7. [00169] Результати вестерн-блоттинга показують, що укорочений T25Cry1Ba (який містить амінокислоти 1-647) як у pCIB5634, так і pET28a векторах був більш стабільним, аніж укорочений T7 Cry1Ba-токсин у будь-якому векторі. Результати біоаналізу (Таблиця 3) показали, що T25-токсин дикого типу був у 15 разів більш активним, аніж T7-конструкт і в 3 рази більш активним, аніж повнорозмірний білок Cry1Ba. Отже, додаткові мутанти Cry1Ba були сконструйовані з використанням укороченого T25 Cry1Ba дикого типу. 25 Таблиця 3 Активність укороченого стосовно повнорозмірного Cry1Ba щодо ECB. Клон T25 T7 FL-Cry1Ba Контрольний вектор 30 35 40 Амінокислоти 1-647 22-647 1-1228 Активність відносно повнорозмірного Cry1Ba 3,0 0,2 1,0 0,0 Приклад 5. Ефекти мутування Y150 в укороченому Cry1Ba. [00170] Мутації в положенні амінокислоти 150, які не зменшували інсектицидну активність, включаючи Y150K, Y150F, Y150W і Y150P, повнорозмірного білка Cry1Ba, випробували в укороченому T25 Cry1Ba-токсині. Y150K, Y150F, Y150W і Y150P мутації одержували, як описано вище, використовуючи праймери YG152-YG157. [00171] Створення цих мутацій в укороченому T25 білку приводить до результатів, які відрізняються від повнорозмірного білка Cry1Ba. Наприклад, мутація Y150P в укороченому T25 токсині цілком зводить нанівець активність ECB. Однак така ж мутація в повнорозмірному Cry1Ba не мала негативного впливу на активність ECB (див. Приклад 3). Дивно, що всі мутації, крім мутації Y150K, знижували активність T25 щодо ECB деякою мірою (Таблиця 4). Усі відомі нативні білки Cry1Ba мають або гістидин (H), або тирозин (Y) у положенні 150. Мутація Y150K істотно змінювала біологічні властивості мутанта eCry1Ba-Y150K у порівнянні як з нативним Cry1Ba "H150-типу", так і з нативним Cry1Ba "Y150-типу". Мутант Y150K був у 3 рази більш активним, аніж білок Cry1Ba з гістидином (His) у положенні 150. 22 UA 110925 C2 Таблиця 4 Активність процесованих Y150X мутантів. Позначення мутанта TM9 TM5 TM15 TM27 TM2 T25 (дикий тип) Порожній вектор (контроль) 5 10 15 20 25 30 Амінокислота в положенні Активність ECB відносно T25 150 P 0,00 F 0,25 H 0,58 W 0,75 K 1,60 Y 1,00 0,00 [00172] Кожний з мутантних T25 білків Cry1Ba був досліджений на предмет його розчинності. Розчинність білків корелювала з інсектицидною активністю. Наприклад, білок eCry1Ba-Y150K був більш розчинним, аніж T25-Cry1Ba дикого типу і будь-які інші мутантні білки. Отже, ці дані показують, що зміна амінокислоти в положенні 150 має великий вплив на розчинність і інсектицидну активність укороченого білка Cry1Ba. Наприклад, мутування тирозину (Tyr) у положенні 150 до лізину (Lys) істотно підвищує розчинність і специфічну активність укороченого Cry1Ba-токсину щодо ECB у порівнянні з укороченим Cry1Ba-токсином (T25) дикого типу. Білок еCry1Ba-Y150K (TM2) був використаний для додаткових експериментів по мутаційному аналізу. Приклад 6. Конструювання та випробування додаткових мутантів eCry1Ba [00173] Cry1Ab має високу специфічну активність щодо ECB. Отже, вирівнювання послідовностей було проведено між Cry1Ab і T25-білком Cry1Ba, щоб допомогти визначити ключові положення амінокислот в альфа-спіралі 4 або 5, які можуть бути важливими для активності або розчинності Cry1Ba. Вирівнювання послідовностей між Cry1Ab і Cry1Ba показано на Фігурі 2. Порівняння структурних ознак Cry1Ab і Cry1Ba показано в Таблиці 8 у Прикладі 10 нижче. Додатковий мутаційний аналіз був проведений на визначених ключових положеннях амінокислот для визначення того, чи будуть мутації на додаток до Y150K мутації додатково підвищувати специфічну активність цього білка eCry1Ba. TM2 кодуючу послідовність (SEQ ID NO: 4) використовували як матрицю для додаткового сайт-направленого мутагенезу. Мутації були створені, як описано вище, використовуючи YG171-YG193 праймери, перераховані в Таблиці 1. [00174] Одинадцять мутантів досліджували на предмет активності щодо європейського кукурудзяного метелика. Таблиця 5 показує результати біоаналізів. З 11 досліджених мутантів, дві мутації, L189S і S199K, підвищували специфічну активність мутанта TM2-Y150K відносно ECB, специфічна активність якого підвищилася щонайменше в 3 рази в порівнянні з Cry1Ba дикого типу (T25). Вони були позначені як сконструйовані білки Cry1Ba (eCry1Ba). Дві мутації, V81W і M178S/A155S, мали таку ж активність, що і TM2, і два мутанти, M178P і R170S, мали меншу активність, аніж TM2. Ці мутанти класифікували як варіантні білки Cry1Ba (vCry1Ba). Чотири мутації, V148E/A155D, A155K, A163K і A163K/L188P, цілком зводили нанівець активність, указуючи на те, що ці положення є критичними для щонайменше активності щодо ECB. 23 UA 110925 C2 Таблиця 5 Активність мутантів TM2-Cry1Ba у порівнянні з Cry1Ba дикого типу. Клон T25 TM2 TM21 TM60 TM33 TM88 TM90 TM69 TM61 TM70 TM78 TM82 TM83 5 10 15 20 25 30 35 Мутації T2A (дикий тип) Y150K Y150K/V81W Y150K/V148E/A155D Y150K/L189S Y150K/M178S Y150K/M178S/A155S Y150K/M178P Y150K/R170S Y150K/A155K Y150K/A163K Y150K/A163K/L188P Відносна активність 1,0 2,0 1,0 0,0 3,0 2,0 1,0 0,5 0,5 0,0 0,0 0,0 Y150K/S199K 3,0 SEQ ID NO: SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:43 SEQ ID NO:44 SEQ ID NO:10 Спектр білка eCry1Ba [00175] Мутант TM33 (eCry1Ba-T2AY150KL189S) був досліджений щодо деяких інших лускокрилих комах, включаючи очеретяну вогнівку (SCB; Diatraea saccharalis), кукурудзяну південно-західну вогнівку (SWCB; Diatraea grandiosella), бавовняну совку (CEW, Helicoverpa zea), гусеницю оксамитових бобів (VBC; Anticarsia gemmatalis) і соєву совку (SBL, Pseudoplusia includens, зараз іменована Chrysodeixis includens) за допомогою біоаналізів синтетичного раціону на обробленій поверхні. Смертність личинок оцінювали через приблизно 4-6 днів у залежності від випробуваного виду комах. [00176] Нативний Cry1Ba, як повідомлялося, був активним щодо очеретяної вогнівки, вогнівки кукурудзяної південно-західної і соєвої совки і не мав активності щодо бавовняної совки. До того ж, деякі публікації дозволяють припустити, що штами Вt, які містять білок Cry1Bтипу, мають активність щодо гусениці оксамитових бобів (Bobrowski et al. 2001. Brazil. J. Microbol. 32:105-109), але з цієї публікації не ясно, чи обумовлена ця активність білком Cry1Ba, чи деякими іншими білками, експресованими у випробуваному штамі Bt. Інші публікації (наприклад, Monnerat et al. 2007. Biological Control 41:291-295) показують, що Cry1B, присутній у штамах Bt, вносить невеликий вклад у токсичність таких штамів стосовно личинок VBC. [00177] Результати біоаналізу мутанта eCry1Ba-T2AY150KL189S показали, що цей білок, як і нативний білок Cry1Ba, є активним щодо очеретяної вогнівки, вогнівки кукурудзяної південнозахідної і соєвої совки. На відміну від нативного білка Cry1Ba, білок еCry1Ba був дуже активним щодо гусениці оксамитових бобів. На диво, білок еCry1Ba також мав деяку активність щодо бавовняної совки, комахи, до якої нативний Cry1Ba не має активності. Активність білка eCry1Ba щодо гусениці оксамитових бобів і бавовняної совки є іншим свідченням того, що eCry1Ba являється, власне кажучи, відмінним від нативного білка Cry1Ba. [00178] Оскільки нативний Cry1Ba, як відомо, є активним щодо як лускокрилих, так і твердокрилих комах, то білок еCry1Ba TM33 був досліджений щодо твердокрилої комахи, колорадського жука (CPB; Leptinotarsa decemlineata). Біоаналізи проводили з використанням новонароджених личинок CPB і стандартного аналізу з використанням синтетичного раціону, як описано вище в Прикладі 2. Як уже відомо в даному рівні техніки, нативний білок Cry1Ba був активним щодо CPB. Мутант Cry1Ba дикого типу, T25, також був активним. На диво T33 білок еCry1Ba не був активним щодо CPB. Отже, хоча мутації в T33 підвищують специфічну активність щодо щонайменше європейського кукурудзяного метелика, ці мутації виключали активність щодо твердокрилої комахи, колорадського жука, що являється ще одним свідченням того, що властивості білків eCry1Ba є, власне кажучи, відмінними від нативних білків Cry1Ba і Cry1Ba дикого типу. Використовуючи цей підхід, фахівцю в даній галузі техніки буде зрозуміло, що мутація амінокислот у домені I, зокрема, альфа-спіралі 4 і альфа-спіралі 5, забезпечує спосіб зміни спектра активності Cry1Ba. 24 UA 110925 C2 5 10 15 [00179] Мутанти, описані вище, були досліджені щодо відмінностей у властивостях розчинності з використанням стандартних способів, відомих у даному рівні техніки. Коротко, клітинний осад після центрифугування з індукованих культур E. coli, експресуючих мутанти Cry1Ba і Cry1Ba дикого типу, були оброблені в реагенті для екстракції білка BugBuster™ (Novagen, Inc) інгібіторами протеази і лізоназою відповідно до інструкцій виробника. Клітинні лізати і розчинні фракції після центрифугування клітинних лізатів були проаналізовані на SDSPAGE і вестерн-блоттингу з використанням антитіла кролика до Cry1Ba і на вестерн-блоті кількісно визначили білок Cry1Ba за допомогою AlphaImager (Cell Biosciences). Хоча мутант Cry1Ba і T25 дикого типу показали подібний рівень експресії білка в клітинних лізатах, кількість білка, присутнього у розчинних фракціях, на диво, дуже відрізнялася між мутантами і диким типом. Для порівняння розчинності мутантні білки Cry1Ba, присутні у розчинних фракціях, були нормалізовані відносно Cry1Ba дикого типу. Результати в Таблиці 6 показують, що мутанти eCry1Ba мали в діапазоні від 1,5 до 2,1 разів більше розчинного білка eCry1Ba, аніж білка Cry1Ba T25 дикого типу в такій самій кількості рідини за таких самих умов навколишнього середовища. "SP" у Таблиці 6 означає розчинний білок; і "TP" означає загальний білок. Таблиця 6 Порівняння розчинності білків eCry1Ba і білка Cry1Ba T25 дикого типу. Клон T25 (дикий тип) TM33 TM2 TM83 20 25 30 35 40 45 Мутації Відсоток SP/TP T2A T2A, Y150K, L189S T2A, Y150K T2A, Y150K, S199K 52 76 86 107 Ступінь збільшення в порівнянні з диким типом (T25) 1,0 1,5 1,7 2,1 Приклад 7. Побудова гена ecry1B, оптимізованого для маїсу [00180] Оптимізована для маїсу нуклеотидна послідовність (mocry1Ba-TM33), яка кодує мутантний білок Cry1Ba TM33 (eCry1Ba-T2A:Y150K:L189S), була створена, як описано в патенті США № 6051760, включеному в даний документ посиланням. Кодуюча послідовність mocry1BaTM33 представлена в SEQ ID NO: 13. Амінокислотна послідовність еCry1Ba-T2A:Y150K:L189S представлена в SED ID NO: 9. Приклад 8. Трансгенний маїс і цукровий очерет, експресуючі білок еCry1Ba [00181] Два вектори трансформації рослин сконструйовані для введення кодуючої послідовності mocry1Ba-TM33 у маїс: (a) перший вектор (18320), який включає дві касети експресії, де перша касета експресії містить промотор убіквітину маїсу (ZmUbiInt) (Christensen et al. 1992 PMB 18: 675), функціонально зв'язаний з кодуючою послідовністю TM33, додатково функціонально зв'язаною з 3' кінцевою послідовністю термінаціі транскрипції і поліаденілювання нопалін-синтази, позначену як ZmUbi:mocry1Ba-TM33:NOS, і друга касета експресії містить 35S:pat:NOS; і (b) другий вектор (18319), який включає дві касети експресії, де перша касета експресії містить MTL промоторну послідовність (Патент США № 6018099), функціонально зв'язану з TM33 кодуючою послідовністю, додатково функціонально зв'язаною з 3' кінцевою послідовністю термінації транскрипції і поліаденілювання нопалін-синтази, позначену як MTL:mocry1Ba-TM33:NOS, і друга касета експресії містить 35S:pat:NOS. Усі вектори в цьому прикладі містять ген pat, кодуючий фосфінотрицин-ацетилтрансферазу (PAT), яка надає стійкість до гербіциду фосфінотрицину для добору трансгенних подій. [00182] Обидва вектори окремо трансформують у маїс. Agrobacterium-трансформацію незрілих зародків маїсу проводять, головним чином, як описано в Negrotto et al., 2000, Plant Cell Reports 19: 798-803. Для цього прикладу усі компоненти середовищ є, головним чином, такими, як описано в Negrotto et al., вище. Однак, різні компоненти середовищ, відомі в даному рівні техніки, можуть бути замінені. [00183] Коротко, штам Agrobacterium LBA4404 (pSB1), який містить плазміду для трансформації рослин, вирощують на твердому середовищі YEP (дріжджовий екстракт (5 г/л), пептон (10 г/л), NaCl (5 г/л), 15 г/л агару, pН 6,8), протягом 2-4 днів при 28 °C. Приблизно 0,8 × 109 Agrobacterium суспендують у середовищах для інфікування LS, доповнених 100 мкM As (Negrotto et al., вище). Бактерії попередньо індукують у цьому середовищі протягом 30-60 хвилин. 25 UA 110925 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 [00184] Незрілі зародки з придатного генотипу вирізають з 8 – 12 денних початків у рідке середовище для інфікування LS+100 мкM As. Зародки промивають один раз свіжим середовищем для інфікування. Потім додають розчин Agrobacterium і зародки перемішують на вортексі протягом 30 секунд і дозволяють осісти з бактеріями протягом 5 хвилин. Зародки потім переносять стороною щитка вгору на середовище LSAs і культивують у темряві протягом двохтрьох днів. Після цього, від 20 до 25 зародків на чашку Петрі переносять у середовище LSDc, доповнене цефотаксимом (250 мг/л) і нітратом срібла (1,6 мг/л) і культивують у темряві при 28 °C протягом 10 днів. [00185] Незрілі зародки, що продукують ембріогенний калюс, переносять на середовище LSD1M0. 5S. Культури піддають добору на цьому середовищі протягом близько 6 тижнів з етапом пересіву через приблизно 3 тижні. Калюси, які вижили, переносять на середовище Reg1, доповнене манозою. Після культивування при світлі (режим 16 годин світла / 8 годин темряви) зелені тканини переносять на середовище Reg2 без регуляторів росту і інкубують протягом приблизно 1-2 тижнів. Паростки переносять в ящики GA-7 Magenta (Magenta Corp, Чикаго, Іллінойс), які містять середовище Reg3, і вирощують при світлі. Через приблизно 2-3 тижні рослини досліджують на присутність гена pat і кодуючої послідовності mocry1Ba-TM33. Позитивні за результатами ПЦР аналізу рослини переносять у теплицю і досліджують на стійкість щонайменше до європейського метелика кукурудзяного. Трансформація цукрового очерету [00186] Вектор для трансформації рослини (72581), який містить дві касети експресії, конструювали для введення кодуючої послідовності mocry1Ba-TM33 у цукровий очерет. Перша касета експресії містить промотор Ubi361 маїсу (PCT/US10/37683), функціонально зв'язаний з кодуючою послідовністю TM33, додатково функціонально зв'язаною з 3' кінцевою послідовністю термінації транскрипції і поліаденілювання Ubi361 маїсу (PCT/US10/37683), позначеною як prZmUbi361-3:mocry1Ba-TM33:tZmUbi361. Друга касета експресії містить промотор убіквітину маїсу (ZmUbiInt) (Christensen et al. 1992 PMB 18: 675), функціонально зв'язаний з кодуючою послідовністю pmi, додатково функціонально зв'язаною з 3' кінцевою послідовністю термінації транскрипції і поліаденілювання нопалін-синтази (nos). Кодуюча послідовність pmi кодує фосфоманоза-ізомеразу (PMI), яка дозволяє трансгенному цукровому очерету утилізувати манозу і функціонує як селективний маркер для трансформації. Вектор 72581 був трансформований у цукровий очерет із застосуванням Agrobacterium-трансформації. Трансгенні рослини цукрового очерету досліджували щодо новонародженої очеретяної вогнівки, як описано вище. Приклад 9. Інсектицидна активність трансгенних рослин маїсу і цукрового очерету [00187] Відбирали зразки рослин по мірі їхнього пересаджування із ящиків GA-7 Magenta у ґрунт. Добір зразків полягав у відрізанні двох невеликих шматків листка (приблизно 2-4 см у довжину) і розміщенні кожного в невелику чашку Петрі або багатолункові планшети. Негативними контролями були або трансгенні рослини, які являлися ПЦР-негативними щодо гена mocry1Ba-TM33 із того ж експерименту, або з нетрансгенних рослин (розміру, подібного з випробуваними рослинами), які вирощували в теплиці або фітотроні. [00188] Зразки листя від кожної рослини заразили придатною цільовою комахою-шкідником шляхом розміщення приблизно 10 личинок першого віку на кожен шматочок листка. Чашки Петрі або багатолункові планшети потім щільно закрили. [00189] Через приблизно 3-4 дні після зараження збирали дані. Відсоток смертності личинок розраховували разом з візуальною інтенсивністю ушкодження листка. Порушення харчування оцінювали як високе, помірне, низьке або було відсутнє, і присвоювали чисельне значення 3, 2, 1 або 0 відповідно. У таблицях нижче “+” указує на те, що смертність була > 80 % і що ушкодження листка було 0-1. [00190] Результати, показані в Таблиці 7, указують на те, що трансгенні рослини маїсу, які містять ген moTM33 і експресують мутантний білок eCry1Ba-T2A:Y150K:L189S, є інсектицидними щонайменше до європейського метелика кукурудзяного. Хоча обидва конструкти давали трансгенні події, які були дуже активними щодо щонайменше ECB, як правило, трансгенні рослини з промотором zmUbi, управляючим експресією кодуючої послідовності TM33, давали більш високі рівні білка eCry1Ba, аніж трансгенні рослини, які містять промотор MTL. Концентрація білка еCry1Ba знаходилася в діапазоні від 460 до 681 мкг/мг розчинного білка для конструкта 18319 і від 509 до 2984 мкг/мг розчинного білка для конструкта 18320. 26 UA 110925 C2 Таблиця 7 Активність трансгенного маїсу, який експресує білки eCry1Ba Конструкт Подія маїсу 9A 23A 38A 40A 52A 57A 28A 29B 34C 42A 46A 48B 18319 18320 5 Активність ECB + + + + + + + + + + + + Концентрація eCry1Ba (мкг/мг розчинного білка) 648 676 624 460 681 618 1839 2818 2984 1625 1010 509 [00191] Результати, показані в Таблиці 8, указують на те, що трансгенні рослини цукрового очерету, які експресують мутантний білок eCry1Ba-T2A:Y150K:L189S, є інсектицидними стосовно очеретяної вогнівки. Таблиця 8 Активність трансгенного цукрового очерету, який експресує eCry1Ba і Vip3 Подія 72581-1A 72581-2A 72581-3A 72581-4A 72581-5A Контроль 10 SCB + + + + Приклад 10. Структура білка Cry1Ba. [00192] Таблиця 9 показує взаємовідношення між трьома доменами Cry1Ab і Cry1Ba з їх відповідними варіабельними ділянками і консервативними блоками. Амінокислоти, які містяться в кожному домені, консервативному блоці і варіабельній ділянці, показані для обох білків. Таблиця 9 Порівняння структури Cry1Ab і Cry1Ba. ДОМЕН I Cry1Ab (Фігура 2) 1-32 33-152 153-182 183-202 203-254 ДІЛЯНКА V1 V1 CB1 V2 CB2 27 Cry1Ba (SEQ ID NO: 2) 1-47 48-171 172-201 202-221 222-270 UA 110925 C2 II 255-269 270-452 453-462 463-500 501-520 521-531 532-596 597-606 607-610 611-1155 V3 CB3 III 5 10 V4 CB4 V5 CB5 V6 Протоксин 271-288 289-480 481-490 491-528 529-548 549-559 560-624 625-634 635-638 639-1228 [00193] Варто розуміти, що приклади і варіанти здійснення, описані в даному документі, представлені лише з ілюстративними цілями, і що різні модифікації або зміни в їхньому висвітленні можуть бути запропоновані фахівцям у даній галузі техніки, і що вони включені в сутність і галузь дії даної заявки й обсяг прикладеної формули винаходу. [00194] Усі публікації і патентні заявки, згадані в даному описі, являються такими, які вказують на рівень кваліфікації фахівців у даній галузі техніки, до якої відноситься даний винахід. Усі публікації і патентні заявки включені в даний документ посиланням у тому ступені, що передбачається, якби кожна окрема публікація або патентна заявка була зокрема й окремо зазначена як включена за допомогою посилання. 28