Антитіло з високою афінністю до рецептора il-4 людини

Реферат: Винахід стосується антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що специфічно зв'язує рецептор інтерлейкіну-4 людини (hIL-4R) (SEQ ID NO: 274), що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга (HCVR) з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO: 162 і варіабельну ділянку легкого ланцюга (LCVR) з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO: 164. UA 102122 C2 (12) UA 102122 C2 UA 102122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Рівень техніки Інтерлейкін-4 (IL-4, також відомий як стимулюючий фактор В-клітин, або BSF-1) спочатку був охарактеризований по своїй здатності стимулювати проліферацію В-клітин у відповідь на низькі концентрації антитіл до поверхневого імуноглобуліну. Було показано, що IL-4 має широкий спектр біологічної активності, включаючи стимулювання росту Т-клітин, мастоцитів, гранулоцитів, мегакаріотів і еритроцитів. IL-4 індукує експресію молекул II класу головного комплексу гістосумісності в дрімаючих В-клітинах і підсилює секрецію ізотипів IgE і IgG1 стимульованими В-клітинами. Біологічна активність IL-4 опосередкована рецепторами поверхні конкретних клітин для IL-4. Альфа рецептор людини IL-4 (hIL-4R) (SEQ ID №:274) описаний, наприклад, у патентах США №№5,599,905, 5,767,065 і 5,840,869. Антитіла до hIL-4R описані в патенті США №5,717,072 і 7,186,809. Способи одержання антитіл, корисних як лікарські препарати для людини, включають виробництво химерних антитіл і гуманізованих антитіл (див., наприклад, патент США 6,949,245). Див., наприклад, WO 94/02602 і патент США 6,596,541, де описані способи створення трансгенних мишей, які не належать до людини, здатних виробляти антитіла людини. Способи використання антитіл до hIL-4R описані в патентах США №№5,714,146; 5,985,280 і 6,716,587. Короткий опис винаходу У першому аспекті даний винахід описує антитіла людини, переважно рекомбінантні антитіла людини, які специфічно зв'язують рецептори інтерлейкіну-4 людини (hIL-4R). Для антитіл людини характерне зв'язування з hIL-4R з високою афінністю і здатність нейтралізувати активність hIL-4. У конкретних здійсненнях даного винаходу антитіла людини можуть блокувати зв'язування комплексу hIL-13/hIL-13R1 з hIL-4R і тим самим інгібувати передачу сигналу через hIL-13. Антитіла можуть бути повнорозмірними (наприклад антитіла IgG1 або IgG4) або включати тільки антигензв'язувальну частину (наприклад фрагмент Fab, F(ab") 2 або scFv) і можуть бути модифіковані з метою впливати на функціональність, наприклад видаляти залишкові ефекторні функції (Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164:1925-1933). У загальному здійсненні даного винаходу розглядається антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, який специфічним чином зв'язує hIL-4R (SEQ ID №:274) з KD близько 300 пМ або менше за даними поверхневого плазмонного резонансу за результатами мономерного або димерного аналізу. У конкретнішому здійсненні антитіло або його антигензв'язувальна ділянка демонструє KD близько 200 пМ або менше, близько 150 пМ або менше, близько 100 пМ або менше, або близько 50 пМ або менше. У різних здійсненнях антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент блокує активність hIL-4 з IC50 близько 100 пМ або менше за результатами вимірювання біологічної активності люциферази. У більш конкретних здійсненнях антитіло або антигензв'язувальний фрагмент демонструє IC50 близько 50 пМ або менше, близько 30 пМ або менше, або близько 25 пМ або менше за результатами вимірювання біологічної активності люциферази STAT6. У різних здійсненнях антитіло або антигензв'язувальний фрагмент блокує активність hIL-13 з IC50 близько 100 пМ або менше, близько 90 пМ або менше, близько 50 пМ або менше, або близько 20 пМ або менше за результатами вимірювання біологічної активності люциферази STAT6. В другому аспекті антитіло даного винаходу містить варіабельну ділянку важкого ланцюга (HCVR), яка вибирається з групи, що включає SEQ ID №: 2, 18, 22, 26, 42, 46, 50, 66, 70, 74, 90, 94, 98, 114, 118, 122, 138, 142, 146, 162, 166, 170, 186, 190, 194, 210, 214, 218, 234, 238, 242, 258 і 262, або його суттєво аналогічну послідовність. У третьому аспекті антитіло даного винаходу містить варіабельну ділянку легкого ланцюга (LCVR), яка вибирається з групи, що включає SEQ ID №: 10, 20, 24, 34, 44, 48, 58, 68, 72, 82, 92, 96, 106, 116, 120, 130, 140, 144, 154, 164, 168, 178, 188, 192, 202, 212, 216, 226, 236, 240, 250, 260 і 264, або його суттєво аналогічну послідовність. В одному здійсненні антитіло або фрагмент антитіла даного винаходу містить пари послідовностей HCVR і LCVR (HCVR/LCVR), які вибираються з групи, що включає SEQ ID №: 2/10, 18/20, 22/24, 26/34, 42/44, 46/48, 50/58, 66/68, 70/72, 74/82, 90/92, 94/96, 98/106, 114/116, 118/120, 122/130, 138/140, 142/144, 146/154, 162/164, 166/168, 170/178, 186/188, 190/192, 194/202, 210/212, 214/216, 218/226, 234/236, 238/240, 242/250, 258/260 і 262/264. У переважному здійсненні антитіло або фрагмент антитіла містить пари послідовностей HCVR/LCVR SEQ ID №: 162/164, 210/212 або 18/20; прикладами антитіл з такими парами послідовностей HCVR/LCVR є антитіла, що позначаються H4H098P (SEQ ID №№:162/164), H4H083P SEQ ID №№:210/212) і H4H095P (SEQ ID №№:18/20). У четвертому аспекті даного винаходу приводяться молекули нуклеїнової кислоти, що 1 UA 102122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кодують HCVR, де молекула нуклеїнової кислоти є нуклеотидною послідовністю, яка вибирається з групи, що включає SEQ ID №: 1, 17, 21, 25, 41, 45, 49, 65, 69, 73, 89, 93, 97, 113, 117, 121, 137, 141, 145, 161, 165, 169, 185, 189, 193, 209, 213, 217, 233, 237, 241, 257 і 261, або її суттєво ідентичну послідовність з гомологією не менше 95 %. У п'ятому аспекті даного винаходу приводяться молекули нуклеїнової кислоти, що кодують LCVR, де молекула нуклеїнової кислоти є послідовністю, яка вибирається з групи, що включає SEQ ID I№: 9, 19, 23, 33, 43, 47, 57, 67, 71, 81, 91, 95, 105, 115, 119, 129, 139, 143, 153, 163, 167, 177, 187, 191, 201, 211, 215, 225, 235, 239, 249, 259 і 263, або її суттєво ідентичну послідовність з гомологією не менше 95 %. В одному здійсненні антитіло даного винаходу містить HCVR і LCVR, кодовані парами нуклеотидної послідовності, які вибираються з групи, що включає SEQ ID №: 1/9, 17/19, 21/22, 25/33, 41/43, 45/47, 49/57, 65/67, 69/71, 73/81, 89/91, 93/95, 97/105, 113/115, 117/119, 121/129, 137/139, 141/143, 145/153, 161/163, 165/167, 169/177, 185/187, 189/191, 193/201, 209/211, 213/215, 217/225, 233/235, 237/239, 241/249, 257/259 і 261/263. У переважному здійсненні винаходу антитіло або фрагмент антитіла містить послідовності HCVR/LCVR, які кодуються послідовностями нуклеїнових кислот, які вибираються з SEQ ID NO:161/163, 209/211 і 17/19. У ще більш переважному здійсненні антитіло або фрагмент антитіла містить HCVR/LCVR, які кодуються послідовностями нуклеїнових кислот SEQ ID NO:161/163. У шостому аспекті даного винаходу приводиться антитіло або антигензв'язувальний фрагмент, що містить HCDR3 і LCDR3, де домен HCDR3 вибирається з групи, що включає SEQ ID №: 8, 32, 56, 80, 104, 128, 152, 176, 200, 224 і 248; а домен LCDR3 вибирається з групи, що включає SEQ ID №:16, 40, 64, 88, 112, 136, 160, 184, 208, 232 і 256. У переважному здійсненні послідовностями HCDR3/LCDR3 є SEQ ID №: 152/160, 8/16 або 200/208. У ще більш переважному здійсненні послідовностями HCDR3 і LCDR3 є SEQ ID №: 152 і 160. У додатковому здійсненні антитіло або фрагмент антитіла додатково містить послідовність HCDR1, яка вибирається з групи, що включає SEQ ID №: 4, 28, 52, 76, 100, 124, 148, 172, 196, 220 і 244, або її суттєво аналогічну послідовність; послідовність HCDR2, яка вибирається з групи, що включає SEQ ID №: 6, 30, 54, 78, 102, 126, 150, 174, 198, 222 і 246, або її суттєво аналогічну послідовність; послідовність HCDR3, яка вибирається з групи, що включає SEQ ID №: 8, 32, 56, 80, 104, 128, 152, 176, 200, 224 і 248, або її суттєво аналогічну послідовність; послідовність LCDR1, яка вибирається з групи, що включає SEQ ID №: 12, 36, 60, 84, 108, 132, 156, 180, 204, 228 і 252, або її суттєво аналогічну послідовність; послідовність LCDR2, яка вибирається з групи, що включає SEQ ID №: 14, 38, 62, 86, 110, 134, 158, 182, 206, 230 і 252, або її суттєво аналогічну послідовність; і послідовність LCDR3, яка вибирається з групи, що включає SEQ ID №: 16, 40, 64, 88, 112, 136, 160, 184, 208, 232 і 256, або її суттєво аналогічну послідовність. У переважному здійсненні антитіло або антигензв'язувальний фрагмент містить послідовності HCDR SEQ ID №: 148, 150 і 152 і послідовності LCDR SEQ ID №: 156, 158 і 160; послідовності HCDR SEQ ID №:4, 6 і 8 і послідовності LCDR SEQ ID №: 12, 14 і 16; і послідовності HCDR SEQ ID №: 196, 198 і 200 і послідовності LCDR SEQ ID №: 204, 206 і 208. У деяких здійсненнях даний винахід пропонує антитіла анти-hIL-4R або його антигензв'язувальні фрагменти, причому послідовності HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3 вибираються з групи, що включає SEQ ID №№: 148/150/152/156/158/160; 4/6/8/12/14/16; і 196/198/200/204/206/208. Прикладами антитіл з такими послідовностями HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3 є антитіла, що позначаються H4H098P (SEQ ID №№:148/150/152/156/158/160), H4H083P (SEQ ID №№:196/198/200/204/206/208) і H4H095P (SEQ ID №№:4/6/8/12/14/16). У сьомому аспекті приводиться антитіло людини або фрагмент антитіла, що містить HCDR3 і LCDR3, де HCDR3 кодується нуклеотидною послідовністю, яка вибирається з групи, що містить SEQ ID №:7, 31, 55, 79, 103, 127, 151, 175, 199, 223 і 247, або суттєво ідентичною послідовністю з гомологією не менше 95 %, а LCDR3 кодується нуклеотидною послідовністю, яка вибирається з групи, що включає SEQ ID №: 15, 39, 63, 87, 111, 135, 159, 183, 207, 231 і 255, або суттєво ідентичною послідовністю з гомологією не менше 95 %. У додатковому здійсненні даного винаходу приводиться антитіло людини або фрагмент антитіла, що містить домен HCDR1, який кодується нуклеотидною послідовністю, яка вибирається з групи, що включає SEQ ID №:3, 27, 51, 75, 99, 123, 147, 171, 195, 219 і 243, або суттєво ідентичною послідовністю з гомологією не менше 95 %; домен HCDR2, який кодується нуклеотидною послідовністю, яка вибирається з групи, що включає SEQ ID №: 5, 29, 53, 77, 101, 125, 149, 173, 197, 221 і 245, або суттєво ідентичною послідовністю з гомологією не менше 95 %; домен HCDR3, який кодується нуклеотидною послідовністю, яка вибирається з групи, що включає SEQ ID №: 7, 31, 55, 79, 103, 127, 151, 175, 199, 223 і 247, або суттєво ідентичною 2 UA 102122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовністю з гомологією не менше 95 %; домен LCDR1, який кодується нуклеотидною послідовністю, яка вибирається з групи, що включає SEQ ID №: 11, 35, 59, 83, 107, 131, 155, 179, 203, 227 і 251, або суттєво ідентичною послідовністю з гомологією не менше 95 %; домен LCDR2, який кодується нуклеотидною послідовністю, яка вибирається з групи, що включає SEQ ID №: 13, 37, 61, 85, 109, 133, 157, 181, 205, 229 і 253, або суттєво ідентичною послідовністю з гомологією не менше 95 %; домен LCDR3, який кодується нуклеотидною послідовністю, яка вибирається з групи, що включає SEQ ID №: 15, 39, 63, 87, 111, 135, 159, 183, 207, 231 і 255, або суттєво ідентичною послідовністю з гомологією не менше 95 %. У переважному здійсненні антитіло або антигензв'язувальний фрагмент містить послідовності HCDR і LCDR, які кодуються нуклеотидними послідовностями SEQ ID №: 147, 149, 151, 155, 157 і 159; 195, 197, 199, 203, 205 і 207; і 3, 5, 7, 11, 13 і 15. У конкретному здійсненні антитіло анти-hIL-4R або антигензв'язувальний фрагмент даного винаходу містить HCVR, що включає амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID №: 162, і LCVR, що включає амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID №: 164, і характеризується KD близько 100 пМ або менше (мономерний субстрат) або 70 пМ або менше (димерний субстрат); KD близько 160 пМ або менше (мономерний субстрат) або 40 пМ або менше (димерний субстрат) при 25C і 37C відповідно; і IC50 близько 10 пМ або менше (25 пМ димерного субстрату) або близько 100 пМ або менше (200 пМ мономерного субстрату), який здатний блокувати активність hIL-4 і hIL-13 з IC50 близько 30 пМ або менше (за результатами вимірювання біологічної активності) і вступає в перехресну реакцію з IL-4R мавпи. У конкретному здійсненні антитіло анти-hIL-4R або антигензв'язувальний фрагмент даного винаходу містить HCVR, що включає амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID №: 18, і LCVR, що включає амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID №: 20, і характеризується KD близько 450 пМ або менше (мономерний або димерний субстрат) і IC 50 близько 40 пМ або менше (25 пМ димерного субстрату) або близько 100 пМ або менше (200 пМ мономерного субстрату), який здатний блокувати активність hIL-4 і hIL-13 з IC50 близько 100 пМ або менше (за результатами вимірювання біологічної активності). У конкретному здійсненні антитіло анти-hIL-4R або антигензв'язувальний фрагмент даного винаходу містить HCVR, що включає амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID №: 210, і LCVR, що включає амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID №: 212, і характеризується KD близько 50 пМ або менше (мономерний субстрат) або 30 пМ або менше (димерний субстрат); KD близько 200 пМ або менше (мономерний субстрат) або 40 пМ або менше (димерний субстрат) при 25C і 37C відповідно; і IC50 близько 10 пМ або менше (25 пМ димерного субстрату) або близько 90 пМ або менше (200 пМ мономерного субстрату), який здатний блокувати активність hIL-4 і hIL-13 з IC50 близько 25 пМ або менше (за результатами вимірювання біологічної активності) і не вступає в перехресну реакцію з IL-4R мавпи. У восьмому аспекті даного винаходу приводиться антитіло або антигензв'язувальний фрагмент антитіла, що специфічним чином зв'язує hIL-4R, з наявністю трьох визначаючих комплементарність ділянок важкого ланцюга і трьох визначаючих комплементарність ділянок легкого ланцюга (HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3), де HCDR1 містить 1 2 3 4 5 6 7 8 1 амінокислотну послідовність формули X -X -X -X -X -X -X -X (SEQ ID №:265), де X =Gly; 2 3 4 5 6 7 8 X =Phe; X =Thr; X =Phe; X =Asp або Arg; X =Asp або Ser; X =Tyr; і X =Ala або Gly; HCDR2 1 2 3 4 5 6 7 8 1 містить амінокислотну послідовність формули X -X -X -X -X -X -X -X (SEQ ID №:266), де X =Ile 2 3 4 5 6 або Leu, X =Ser, X =Gly, Tyr або Arg, X =Ser, Asp або Thr, X =Gly або Ser, X =Gly, Ser або Val, 7 8 1 X =Ser або Asn і X =Thr, Lys або Ile; HCDR3 містить амінокислотну послідовність формули X 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 1 2 X -X -X -X -X -X -X -X -X -X -X -X -X -X -X -X -X (SEQ ID №:267), де X =Ala, X =Lys, 3 4 5 6 7 X =Asp, Glu або Trp, X =Gly або Arg, X =Leu, Thr або Arg, X =Gly, Arg або Ser, X =Ile або Gly, 8 9 10 11 X =Thr, Phe або Tyr, X =Ile, Asp або Phe, X =Arg, Tyr або Asp, X =Pro, Tyr або відсутній, 12 13 14 15 16 X =Arg або відсутній, X =Tyr або відсутній, X =Tyr або відсутній, X =Gly або відсутній, X =Leu 17 18 або відсутній, X =Asp або відсутній і X =Val або відсутній; LCDR1 містить амінокислотну 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 2 послідовність формули X -X -X -X -X -X -X -X -X -X -X (SEQ ID №:268), де X =Gln, X =Asp, Ser 3 4 5 6 7 або Val, X =Ile або Leu, X =Ser, Leu або Asn, X =Asn, Tyr або Ile, X =Trp, Ser або Tyr; X =Ile або 8 9 10 11 відсутній; X =Gly або відсутній; X =Tyr або відсутній; X =Asn або відсутній; і X =Tyr або 1 2 3 відсутній; LCDR2 містить амінокислотну послідовність формули X -X -X (SEQ ID №:269), де 1 2 3 X =Leu, Ala або Val, X =Ala або Gly і X =Ser; і LCDR3 містить амінокислотну послідовність 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 формули X -X -X -X -X -X -X -X -X (SEQ ID №:270), де X =Gln або Met, X =Gln, X =Ala або Tyr, 4 5 6 7 8 9 X =Leu або Asn, X =Gln або Ser, X =Thr, Phe або His, X =Pro, X =Tyr, Ile або Trp і X =Thr. 1 2 У більш конкретному здійсненні HCDR1 містить амінокислотну послідовність формули X -X 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 X -X -X -X -X -X (SEQ ID №:265), де X =Gly; X =Phe; X =Thr; X =Phe; X =Arg; X =Asp або Ser; 7 8 1 2 3 4 5 6 X =Tyr; і X =Ala або Gly; HCDR2 містить амінокислотну послідовність формули X -X -X -X -X -X 3 UA 102122 C2 7 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 8 1 2 3 4 5 6 X -X (SEQ ID №:266), де X =Ile, X =Ser, X =Gly або Tyr, X =Ser або Thr, X =Gly, X =Gly або Ser, 7 8 1 2 3 4 5 X =Asn і X =Thr або Lys; HCDR3 містить амінокислотну послідовність формули X -X -X -X -X 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 1 2 3 X -X -X -X -X -X -X -X -X -X -X -X -X (SEQ ID №:267), де X =Ala, X =Lys, X =Asp або Glu, 4 5 6 7 8 9 X =Gly або Arg, X =Leu або Arg, X =Gly або Ser, X =Ile або Gly, X =Thr або Phe, X =Ile або Asp, 10 11 12 13 14 X =Arg або Tyr, X =Pro або відсутній, X =Arg або відсутній, X =Tyr або відсутній, X =Tyr або 15 16 17 18 відсутній, X =Gly або відсутній, X =Leu або відсутній, X =Asp або відсутній і X =Val або 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 відсутній; LCDR1 містить амінокислотну послідовність формули X -X -X -X -X -X -X -X -X -X 11 1 2 3 4 5 X (SEQ ID №:268), де X =Gln, X =Ser або Val, X =Ile або Leu, X =Leu або Asn, X =Asn або Tyr, 6 7 8 9 10 X =Ser або Tyr; X =Ile або відсутній; X =Gly або відсутній; X =Tyr або відсутній; X =Asn або 11 1 2 3 відсутній; і X =Tyr або відсутній; LCDR2 містить амінокислотну послідовність формули X -X -X 1 2 3 (SEQ ID №:269), де X =Leu, Ala або Val, X =Ala або Gly і X =Ser; і LCDR3 містить амінокислотну 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 послідовність формули X -X -X -X -X -X -X -X -X (SEQ ID №:270), де X =Gln або Met, X =Gln, 3 4 5 6 7 8 9 X =Ala або Tyr, X =Leu або Asn, X =Gln або Ser, X =Thr або His, X =Pro, X =Tyr або Trp і X =Thr. У додатковому більш конкретному здійсненні HCDR1 містить амінокислотну послідовність 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 формули X -X -X -X -X -X -X -X (SEQ ID №:265), де X =Gly; X =Phe; X =Thr; X =Phe; X =Asp 6 7 8 1 2 або Arg; X =Asp; X =Tyr; і X =Ala; HCDR2 містить амінокислотну послідовність формули X -X 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 X -X -X -X -X -X (SEQ ID №:266), де X =Ile або Leu, X =Ser, X =Gly або Arg, X =Ser або Thr, 5 6 7 8 X =Gly або Ser, X =Gly або Val, X =Ser або Asn і X =Thr або Ile; HCDR3 містить амінокислотну 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 послідовність формули X -X -X -X -X -X -X -X -X -X -X -X -X -X -X -X -X -X (SEQ ID 1 2 3 4 5 6 №:267), де X =Ala, X =Lys, X =Asp або Trp, X =Gly або Arg, X =Leu або Thr, X =Arg або Ser, 7 8 9 10 11 X =Ile або Gly, X =Thr або Tyr, X =Ile або Phe, X =Arg або Asp, X =Pro, Tyr або відсутній, 12 13 14 15 16 X =Arg або відсутній, X =Tyr або відсутній, X =Tyr або відсутній, X =Gly або відсутній, X =Leu 17 18 або відсутній, X =Asp або відсутній і X =Val або відсутній; LCDR1 містить амінокислотну 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 2 послідовність формули X -X -X -X -X -X -X -X -X -X -X (SEQ ID №:268), де X =Gln, X =Asp або 3 4 5 6 7 8 Ser, X =Ile або Leu, X =Ser або Leu, X =Tyr або Ile, X =Trp або Ser; X =Ile або відсутній; X =Gly 9 10 11 або відсутній; X =Tyr або відсутній; X =Asn або відсутній; і X =Tyr або відсутній; LCDR2 містить 1 2 3 1 2 амінокислотну послідовність формули X -X -X (SEQ ID №:269), де X =Leu або Val, X =Ala або 3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Gly і X =Ser; і LCDR3 містить амінокислотну послідовність формули X -X -X -X -X -X -X -X -X 1 2 3 4 5 6 (SEQ ID №:270), де X =Gln або Met, X =Gln, X =Ala, X =Leu або Asn, X =Gln або Ser, X =Thr або 7 8 9 Phe, X =Pro, X =Tyr або Ile і X =Thr. У дев'ятому аспекті даного винаходу приводиться антитіло або антигензв'язувальний фрагмент, що містить послідовності HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3 з пари HCVR і LCVR, де послідовності HCVR/LCVR вибираються з групи, що включає SEQ ID №:162/164, 210/212 і 18/20. У більш конкретному здійсненні послідовностями CDR важкого і легкого ланцюгів є послідовності, що містяться в HCVR SEQ ID №:162 і LCVR SEQ ID №:164. У додатковому більш конкретному здійсненні послідовностями CDR важкого і легкого ланцюгів є послідовності, що містяться в HCVR SEQ ID №:18 і LCVR SEQ ID №:20. У ще одному додатковому більш конкретному здійсненні послідовностями CDR важкого і легкого ланцюгів є SEQ ID №:210 і LCVR SEQ ID №:212, що містяться в HCVR. Даний винахід включає антитіла анти-hIL-4R з модифікованою структурою глікозилування. У деяких здійсненнях може виявитися корисним видалити небажані сайти глікозилування або використовувати антитіло без фукозного фрагмента в олігосахаридному ланцюзі, наприклад для посилення функції антитілозалежної клітино-зумовленої цитотоксичності (ADCC) (див. Shield et al. (2002) JBC 277:26733). В інших здійсненнях може здійснюватися модифікація галактозилування, для того щоб змінити комплементзалежну цитотоксичність (CDC). У десятому аспекті даного винаходу приводяться рекомбінантні вектори експресії, що несуть молекули нуклеїнової кислоти даного винаходу, і клітини-хазяїни, у які включаються такі вектори, а також способи готування антитіл або антигензв'язувальних фрагментів даного винаходу, отриманих культивуванням клітин-хазяїнів даного винаходу. Клітиною-хазяїном може бути прокаріотична або еукаріотична клітина, переважною клітиною-хазяїном є клітина E. coli або клітина ссавця, наприклад клітина СНО (з яєчників китайського хом'ячка). В одинадцятому аспекті даного винаходу характеризується сполука, що включає рекомбінантне антитіло людини, що специфічно зв'язує hIL-4R, і прийнятний носій. У дванадцятому аспекті даного винаходу приводяться способи інгібування активності hIL-4 за допомогою приведеного в даному винаході антитіла або його антигензв'язувальної ділянки. В окремих здійсненнях антитіла даного винаходу також блокують зв'язування комплексу hIL13/hIL-13R1 з hIL-4R. В одному зі здійснень спосіб включає взаємодія hIL-4R з антитілом даного винаходу або його антигензв'язувальною ділянкою таким чином, що при цьому відбувається інгібування активності hIL-4 або hIL-4/hIL-13. В іншому здійсненні спосіб включає введення антитіла даного винаходу або його антигензв'язувальної ділянки людині, що страждає на 4 UA 102122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 порушення, яке можна полегшити інгібуванням активності hIL-4 або hIL-4/hIL-13. Таким підлягаючим лікуванню порушенням є будь-яке захворювання або стан, який поліпшується, полегшується, придушується або попереджується за рахунок усунення, інгібування або зниження активності hIL-4 або hIL-4/hIL-13. До пов'язаних з IL-4 порушень, які лікуються антитілами або фрагментами антитіл даного винаходу, належать, наприклад, артрит (у тому числі септичний артрит), герпетиформні захворювання, хронічна ідіопатична уртикарія, склеродерма, гіпертрофічне рубцювання, синдром Уїппла, доброякісна гіперплазія простати, захворювання легень, такі як слабка, помірна або гостра астма, запальні захворювання, наприклад запальні захворювання кишечнику, алергійні реакції, синдром Кавасакі, серпоподібноклітинна анемія, синдром ЧерджаСтросс, дифузійний токсичний зоб, передеклампсія, синдром Шегрена, аутоімунний лімфопроліферативний синдром, аутоімунна гемолітична анемія, стравохід Барретта, аутоімунний увеїт, туберкульоз і нефроз. Інші мети і переваги стануть очевидними при ознайомленні з приведеним нижче докладним описом. Повний опис винаходу Перш ніж почати опис способів, які представляються, необхідно відзначити, що даний винахід не обмежується конкретними способами і викладеними експериментальними умовами, оскільки такі способи й умови можуть змінюватися. Варто також розуміти, що використовувана в даному документі термінологія призначена винятково для опису конкретних здійснень і не носить обмежувального характеру, оскільки охоплення даного винаходу обмежується тільки прикладеною формулою винаходу. Якщо не зазначене інше, усі технічні і наукові терміни, які використовуються в даному документі, мають таке ж значення, що загальновідомо рядовим фахівцям в галузі, до якої належить даний винахід. Хоча на практиці або при перевірці даного винаходу можуть використовуватися будь-які способи і матеріали, аналогічні або ідентичні описаним у даному документі, нижче приводиться опис переважних способів і матеріалів. Визначення Використовуваний у даному документі термін "IL4R людини" (hIL-4R) призначений для позначення рецептора цитокіну людини, який специфічно зв'язує інтерлейкін-4 (IL-4), IL-4Rα (SEQ ID №:274). Термін "людський інтерлейкін-13" (hIL-13) належить до цитокіну, що специфічно зв'язує рецептор IL-13, а "комплекс hIL-13/hIL-13R1" означає комплекс, що утворюється в результаті зв'язування hIL-13 з комплексом hIL-13R1, при цьому комплекс, що виходить, зв'язується з рецептором hIL-4, щоб ініціювати біологічну активність. Використовуваний у даному документі термін "антитіло" призначений для позначення молекул імуноглобуліну, складених з чотирьох поліпептидних ланцюгів, при цьому два важкі (Н) ланцюги і два легкі (L) ланцюги зв'язуються один з одним дисульфідними зв'язками. Кожен важкий ланцюг містить варіабельну ділянку важкого ланцюга (HCVR, або VH) і константну ділянку важкого ланцюга. Константна ділянка важкого ланцюга складається з трьох доменів: CH1, CH2 і CH3. Кожен легкий ланцюг містить варіабельну ділянку легкого ланцюга (LCVR, або VL) і константну ділянку легкого ланцюга. Константна ділянка легкого ланцюга містить один домен (CL1). Ділянки VH і VL можуть підрозділятися на ділянки гіперваріабельності, що називаються визначаючими комплементарність ділянками (CDR), які перемежовуються ділянками з вищим рівнем консервативності, які називаються остовними ділянками (FR). Кожна ділянка VH і VL утворена трьома CDR і чотирма FR, розташованими від аміно-термінального кінця до карбокси-термінального кінця в наступному порядку: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Використовуваний у даному документі термін "антигензв'язувальна ділянка" антитіла (або просто "частина антитіла" або "фрагмент антитіла") позначає один або декілька фрагментів антитіла, які зберігають здатність до специфічного зв'язування з антигеном (наприклад, hIL-4R). Було показано, що антигензв'язувальна функція антитіла може здійснюватися фрагментами всієї послідовності антитіла. До прикладів зв'язувальних фрагментів, включених у термін "антигензв'язувальна ділянка" антитіла, належать (i) фрагмент Fab, моновалентний фрагмент, що складається з доменів VL, VH, CL1 і CH1; (ii) фрагмент F(ab') 2, бівалентний фрагмент, що складається з двох фрагментів F(ab)’, зв'язаних дисульфідним містком у шарнірній ділянці; (iii) фрагмент Fd, що складається з доменів VH і CH1; (iv) фрагмент Fv, що складається з доменів VL і VH окремої ділянки антитіла; (v) фрагмент dAb (Ward et al. (1989) Nature 241:544-546), що складається з домену VH; і (vi) CDR. Більше того, незважаючи на те, що два домени у фрагменті Fv, VL і VH, кодуються різними генами, їх можна об'єднати, використовуючи рекомбінантні технології, за допомогою синтетичного лінкера, що дозволяє побудувати з них 5 UA 102122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 єдиний безупинний ланцюжок, у якому ділянки VL і VH зв'язуються з утворенням моновалентних молекул (відомих як одиночний ланцюг Fv (scFv); див., наприклад, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; і Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Такі одноланцюжкові антитіла також включаються в сферу охоплення терміна "антигензв'язувальна ділянка" антитіла. Сюди ж входять і інші форми одноланцюжкових антитіл, наприклад діантитіла (див., напр., Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:6444-6448). Під використовуваним у даному документі терміном "нейтралізуюче" або "блокуюче" антитіло розуміється антитіло, зв'язування якого з hIL-4R приводить до інгібування біологічної активності hIL-4 і/або hIL-13. Таке інгібування біологічної активності hIL-4 і/або IL-13 може оцінюватися за допомогою вимірювання одного або декількох показників біологічної активності hIL-4 і/або hIL-13, відомих фахівцям у даній галузі, наприклад клітинної активації, індукованої hIL-4 і/або IL-13, і зв'язування hIL-4 з hIL-4R (див. приклади нижче). "CDR" або визначаюча комплементарність ділянка являє собою ділянку гіперваріабельності, що перемежовується ділянками з вищим рівнем консервативності, які називаються "остовними ділянками" (FR). У різних здійсненнях антитіла анти-hIL-4R або запропонованого в даному винаході фрагмента FR можуть бути ідентичні послідовностям зародкових ліній людини або можуть природним або штучним чином модифікуватися. Використовуваний у даному документі термін "поверхневий плазмонний резонанс" належить до оптичного явища, що дозволяє проводити аналіз взаємодій у реальному часі за рахунок детектування змін концентрацій білка в біосенсорній матриці, наприклад за допомогою системи BIACORE™ (Pharmacia Biosensor AB). Терміном "епітоп" позначається антигенний детермінант, що взаємодіє зі специфічним сайтом зв'язування антигену у варіабельній ділянці молекули антитіла, відомій як паратоп. Окремий антиген може містити більше одного епітопу. Епітопи можуть бути конформаційними або лінійними. Конформаційний епітоп утворюється просторово розташованими амінокислотами з різних сегментів лінійного поліпептидного ланцюга. Лінійним називається епітоп, утворений сусідніми амінокислотними залишками в поліпептидному ланцюзі. У певних обставинах епітоп може включати фрагменти сахаридів, фосфорильні групи або сульфонільні групи антигену. Термін "суттєва ідентичність" або "по суті ідентичні" відносно нуклеїнової кислоти або її фрагмента означає, що при оптимальному вирівнюванні відповідних додавань або делецій нуклеотидів щодо іншої нуклеїнової кислоти (або її комплементарного ланцюга) спостерігається ідентичність нуклеотидної послідовності принаймні на рівні 95 %, більш переважно принаймні на рівні приблизно 96 %, 97 %, 98 % або 99 % основ нуклеотидів, що вимірюється за допомогою будь-якого відомого алгоритму ідентичності послідовностей, наприклад FASTA, BLAST або Gap, які обговорюються нижче. Застосовуваний відносно поліпептидів термін "суттєва подібність" або "по суті подібні" означає, що дві пептидні послідовності при їхньому оптимальному вирівнюванні, наприклад за допомогою програм GAP або BESTFIT з врахуванням "ваги" розривів, заданого за умовчанням, демонструють принаймні 95 %-у ідентичність послідовностей, більш переважно принаймні 98 %у або 99 %-у ідентичність послідовностей. Переважно, положення неідентичних залишків відрізняються консервативними заміщеннями амінокислот. "Консервативне заміщення амінокислот" — це таке заміщення, при якому один амінокислотний залишок заміщується іншим амінокислотним залишком, що має бічний ланцюг (групу R) з аналогічними хімічними властивостями (наприклад заряд або гідрофобність). У загальному випадку консервативне заміщення амінокислот не буде приводити до істотних змін функціональних властивостей білка. У випадку якщо дві або більше амінокислотних послідовностей відрізняються одна від одної консервативним заміщенням, відсоток ідентичності послідовності або ступінь аналогічності можна коректувати убік збільшення, для того щоб врахувати консервативний характер заміщення. Способи такого коректування добре відомі фахівцям у даній галузі. Див. наприклад, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. До прикладів груп амінокислот, що мають бічні ланцюги з подібними хімічними властивостями, належать (1) аліфатичні бічні ланцюги: гліцин, аланін, валін, лейцин і ізолейцин; (2) аліфатичні гідроксиловані бічні ланцюги: серин і треонін; (3) бічні ланцюги з амідною групою: аспарагін і глутамін; (4) ароматичні бічні ланцюги: фенілаланін, тирозин і триптофан; (5) бічні ланцюги з властивостями основи: лізин, аргінін і гістидин; (6) бічні ланцюги з властивостями кислоти: аспартат і глутамат; і (7) сірковмісні бічні ланцюги — цистеїн і метіонін. Переважними групами для консервативного заміщення амінокислот є: валін-лейцин-ізолейцин, фенілаланін-тирозин, лізин-аргінін, аланін-валін, глутамат-аспартат і аспарагін-глутамін. В альтернативному варіанті консервативне заміщення являє собою будь-яку зміну, що приводить до позитивного значення в логарифмічній матриці 6 UA 102122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 правдоподібності PAM250, описаній в роботі Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445. "Помірно консервативним" заміщенням називається будь-яка зміна, що приводить до ненегативного значення в логарифмічній матриці правдоподібності PAM250. Подоба послідовностей поліпептидів, що також називають ідентичністю послідовностей, звичайно визначають за допомогою програмного забезпечення для аналізу послідовності. Програма для аналізу білків зіставляє подібні послідовності з використанням показників аналогічності, що задаються для різних заміщень, делецій і інших модифікацій, у тому числі для консервативного заміщення амінокислот. Наприклад, програмне забезпечення GCG містить такі програми як Gap і Bestfit, що можуть використовуватися з параметрами за умовчанням для визначення гомології або ідентичності послідовності між близькоспорідненими поліпептидами, наприклад гомологічними поліпептидами різних видів або організмів між вихідним білком і його мутантом. Див., наприклад, GCG Вір. 6.1. Поліпептидні послідовності можна також зіставляти за допомогою FASTA —програми, включеної в GCG Вір. 6.1, - з використанням параметрів за умовчанням або рекомендованих параметрів. FASTA (наприклад, FASTA2 і FASTA3) забезпечує вирівнювання і визначає відсоток ідентичності послідовностей в ділянках з найбільшим перекриванням між заданою і досліджуваною послідовностями (див. вище Pearson (2000)). Іншим переважним алгоритмом зіставлення послідовності даного винаходу з базою даних, що містить велике число послідовностей різних організмів, є комп'ютерна програма BLAST, особливо blastp або tblastn, що використовує параметри за умовчанням. Див., наприклад, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 і Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389402. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 і Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402. Одержання антитіл людини До методів одержання антитіл людини належать, наприклад, методи, описувані в патенті США 6,596,541, Green et al. (1994) Nature Genetics 7:13-21), у патентах США 5,545,807 і US 6,787,637. Гризуни можуть бути імунізовані за допомогою будь-якого методу, відомого фахівцям в галузі (див., напр., Harlow і Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual 1988 Cold Spring Harbor Laboratory; Malik і Lillehoj (1994) Antibody Techniques, Academic Press, CA). Антитіла даного винаходу переважно одержують з використанням технології VELOCIMMUNE™ (патент США 6,596,541). Трансгенні миші, у яких варіабельні ділянки важкого і легкого ланцюгів ендогенного імуноглобуліну замінюють відповідними варіабельними ділянками людини, стимулюють антигеном, що представляє інтерес, і в миші, яка експресує антитіла, беруть лімфатичні клітини (наприклад В-клітини). Лімфатичні клітини можна зливати з лінією клітин мієломи для одержання іморталізованих ліній клітин гібридоми, і такі лінії клітин гібридоми проходять скринінг і селекцію для ідентифікації тих ліній клітин гібридоми, що продукують антитіла до антигену, що представляє інтерес. ДНК, що кодує варіабельні ділянки важкого і легкого ланцюга антитіла, можна виділити і зв'язати з потрібними ізотипічними константними ділянками важкого і легкого ланцюгів. Такий білок антитіла може продукуватися в клітині, наприклад у клітині СНО. В альтернативному варіанті ДНК, що кодує антиген-специфічні химерні антитіла або варіабельні ділянки легкого і важкого ланцюгів, можна виділити безпосередньо з антиген-специфічних лімфоцитів. ДНК, що кодує варіабельні ділянки важкого і легкого ланцюга антитіла, виділяють і функціонально зв'язують із ДНК, що кодує константні важкі і легкі ланцюги людини. Потім ДНК експресується в клітині, яка здатна експресувати повне антитіло людини. У конкретному застосуванні такою клітиною є клітина СНО. Антитіла можуть використовуватися в терапевтичних цілях для блокування лігандрецепторної взаємодії або інгібування рецепторного компонента взаємодії замість знищення клітин за рахунок фіксації комплементу (комплементзалежна цитотоксичність, CDC) і участі в антитілозалежній клітино-залежній цитотоксичності (ADCC). Константна ділянка антитіла важлива для забезпечення здатності антитіла фіксувати комплемент і опосередковувати клітино-зумовлену цитотоксичність. Тому ізотип антитіла можна вибирати в залежності від того, чи бажано, щоб антитіло опосередковувало цитотоксичність. Імуноглобуліни людини можуть існувати в двох формах, що пов'язане з гетерогенністю шарнірної ділянки. В одній з форм молекула імуноглобуліну містить стабільну чотириланцюжкову конструкцію з вагою приблизно 150-160 кДа, у якій димери утримуються зв'язуючим важкі ланцюги дисульфідним містком. В другій формі димери не зв'язані міжланцюжковим дисульфідним містком, і утворюється молекула з приблизною вагою 75-80 кДа, що включає ковалентно зчленовані легкий і важкий ланцюги (половина антитіла). Ці форми було надзвичайно складно розділити, навіть після афінного очищення. Частота проявів другої форми в різних ізотипах інтактного IgG викликана, крім іншого, структурними розходженнями, 7 UA 102122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 пов'язаними з ізотипом шарнірної ділянки антитіла. Дійсно, заміна однієї амінокислоти в шарнірній ділянці людського IgG4 може суттєво знизити частку другої форми (Angal et al. 1993 Molecular Immunology 30:105) до рівнів, звичайно характерних при використанні шарнірної ділянки людського IgG1. У сферу охоплення даного винаходу входять антитіла, що мають одну або декілька мутацій у шарнірній ділянці, ділянках CH2 або CH3, які можуть бути бажані, наприклад, при продукуванні антитіл для підвищення виходу потрібної форми антитіла. Спочатку виділяли химерні антитіла з високою афінністю, що мають варіабельну ділянку людини і константну ділянку миші. Як описано нижче, антитіла характеризуються і вибираються по потрібних властивостях, у тому числі по афінності зв'язування з hIL-4R, здатності блокувати зв'язування hIL-4 з hIL-4R, і/або селективності стосовно білка людини. Константні ділянки миші заміняють бажаними константними ділянками людини, для того щоб одержати повні антитіла людини, описані в даному винаході, наприклад вихідний або модифікований IgG4 або IgG1 (наприклад SEQ ID №:271, 272, 273). Вибрана константна ділянка можна змінювати в залежності від конкретного здійснення, а властивості високої афінності антиген-зв'язування і необхідна специфічність визначаються варіабельною ділянкою. Епітопне картування і зв'язані з ним технології Для скринінгу антитіл, що зв'язуються з конкретним епітопом, можна проводити стандартний крос-блокінг, подібно до описаного в Harlow і Lane вище. До інших методів належать мутанти сканування аланіну, пептидний блотинг (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:443-63), і аналіз розщеплення пептидів. Крім того, можуть використовуватися такі методи, як вирізання епітопу, екстракція епітопу і хімічна модифікація антигенів (Tomer (2000) Protein Science: 9:487-496). Визначення профілю за допомогою модифікації (MAP), також відоме як визначення профілю антитіл на основі структури антигену (ASAP) являє собою метод класифікації великого числа моноклональних антитіл (mAbs) до того самого антигену відповідно до подібностей профілю зв'язування кожного антитіла з хімічно або ензиматично модифікованими антигенними поверхнями (публікація заявки на патент США, №. 2004/0101920). Кожна категорія може відбивати унікальний епітоп, який або чітко відрізняється від епітопа, представленого в будьякій іншій категорії, або частково перекривається з ним. Подібна технологія дозволяє швидко відділяти генетично ідентичні антитіла, так що їхня ідентифікація може бути сконцентрована на генетично відмінних антитілах. У випадку застосування для скринінгу гібридоми MAP може сприяти ідентифікації рідких клонів гібридоми з потрібними характеристиками. MAP може використовуватися для сортування антитіл hIL-4R даного винаходу в групи антитіл, що зв'язують різні епітопи. До агентів, які використовуються для зміни структури іммобілізованих антигенів, належать ферменти, наприклад протеолітичні ферменти і хімічні реагенти. Антигенний білок може іммобілізуватися на поверхнях чипа біосенсора або полістирольних гранулах. Останні можуть аналізуватися, наприклад, з використанням методу мультиплексного аналізу LUMINEX™ (Luminex Corp., TX). Оскільки LUMINEX™ дозволяє проводити мультиплексний аналіз до 100 різних типів гранул, він забезпечує майже нескінченну антигенну поверхню з різними модифікаціями, що гарантує вище розрізнення профілювання епітопів антитіл у порівнянні з аналізом на біосенсорах. Біспецифічність Антитіла даного винаходу можуть бути моноспецифічними, біспецифічними або мультиспецифічними. Мультиспецифічні антитіла можуть бути специфічні стосовно різних епітопів одного цільового поліпептиду або можуть містити антигензв'язувальні домени, специфічні стосовно декількох цільових поліпептидів. Див., наприклад, Tutt et al. (1991) J. Immunol. 147:60-69. Анти-IL-4R антитіла людини можуть бути зв'язані з іншими функціональними молекулами або ж експресуватися одночасно з ними, наприклад, з іншим пептидом або білком. Наприклад, антитіло або його фрагмент можуть бути функціонально зв'язані (наприклад хімічним зв'язуванням, генетичним злиттям, нековалентною асоціацією або іншим способом) з однією або декількома молекулярними структурами, наприклад з іншим антитілом або фрагментом антитіла, з утворенням біспецифічного або мультиспецифічного антитіла з додатковою специфічністю зв'язування. Терапевтичне застосування і склади препаратів У винаході приводяться терапевтичні препарати, що включають антитіла анти-IL-4R або їх антигензв'язувальні фрагменти, що входять у сферу охоплення даного винаходу. Введення терапевтичних препаратів відповідно до даного винаходу буде здійснюватися в придатних носіях, наповнювачах і інших речовинах, що включаються до складу препаратів, щоб забезпечити більш ефективне перенесення, доставку, переносимість і ін. Множину придатних сполук можна знайти у формулярах, відомих усім фахівцям в галузі фармацевтичної хімії: 8 UA 102122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Rеміngtоn's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. До таких препаратів належать, наприклад, порошки, пасти, мазі, желе, воски, олії, ліпіди, що ліпідвмісні (катіонні або аніонні) везикули (наприклад LIPOFECTIN™), кон'югати ДНК, безводні абсорбційні пасти, емульсії масло-у-воді і вода-в-маслі, емульсії Carbowax (поліетиленгліколі різної молекулярної ваги), напівтверді гелі і напівтверді суміші, що містять Carbowax. Див. також у Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol. 52:238311. Дозу можна змінювати в залежності від віку, росту і ваги пацієнта, що одержує лікування, захворювання, на яке спрямоване лікування, умов, способу введення й ін. При використанні антитіла даного винаходу для лікування різних хвороб і захворювань, пов'язаних з IL-4R, дорослим пацієнтам доцільно уводити внутрішньовенно антитіло даного винаходу, як правило в разовій дозі приблизно від 0,01 до 20 мг на кг маси тіла, більш переважно приблизно від 0,02 до 7 мг, приблизно від 0,03 до 5 мг, або приблизно від 0,05 до 3 мг на кг маси тіла. У залежності від тяжкості стану можна коректувати частоту і тривалість лікування. Відомі різні системи доставки, і вони можуть використовуватися для уведення фармацевтичного препарату даного винаходу, наприклад інкапсуляція в ліпосоми, мікрочастинки, мікрокапсули, рекомбінантні клітини, здатні експресувати мутантні віруси, опосередкований рецепторами ендоцитоз (див., наприклад, Wu et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432). До методів уведення, серед інших, належать черезшкірний, внутрішньом'язовий, внутрішньоочеревинний, внутрішньовенний, підшкірний, інтраназальний, епідуральний і пероральний. Препарат може вводитися будь-яким придатним способом, наприклад уливанням або болюсною ін'єкцією, абсорбцією через епіталіальні або шкірнослизові оболонки (наприклад слизову ротової порожнини, слизову прямої кишки і кишечнику й ін.) і може застосовуватися разом з іншими біологічно-активними агентами. Уведення може бути системним або локальним. Фармацевтичний препарат може також доставлятися у везикулі, зокрема в ліпосомі (див. Langer (1990) Science 249:1527-1533; Treat et al. (1989) у Liposomes in the Therapy of Infectious Disease і Cancer, Lopez Berestein і Fidler (eds.), Liss, New York, стор. 353-365; Lopez-Berestein, там же, стор. 317-327; див. у цілому там же. У визначених ситуаціях фармацевтичний препарат може доставлятися в системі контрольованого вивільнення. В одному зі здійснень може використовуватися насос (див. Langer; Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). В іншому здійсненні можуть використовуватися полімерні матеріали (див. Medical Applications of Controlled Release, Langer і Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974). У ще одному здійсненні система контрольованого вивільнення може розташовуватися в безпосередній близькості від мети препарату, а тому буде потрібно лише деяка частка від системної дози (див., наприклад, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, стор. 115-138, 1984). Інші системи контрольованого вивільнення обговорюються в огляді Langer (1990) Science 249:1527-1533. До ін'єкційних препаратів можуть належати лікарські форми для внутрішньовенних, підшкірних, черезшкірних і внутрішньом'язових ін'єкцій, краплинних уливань і ін. Такі ін'єкційні препарати можна приготувати за допомогою відомих методів. Наприклад, ін'єкційні препарати можна приготувати, зокрема, за допомогою розчинення, суспендування або емульгування описаного вище антитіла або його солі в стерильному водному середовищі або в масляному середовищі, які звичайно застосовуються для ін'єкцій. Як водне середовище для ін'єкцій пропонуються, наприклад, фізіологічний розчин, ізотонічний розчин, що містить глюкозу й інші допоміжні речовини й ін., що можуть використовуватися в поєднанні з відповідним солюбілізуючим агентом, наприклад спиртом (зокрема етанолом), багатоосновним спиртом (наприклад пропіленгліколем, поліетиленгліколем), неіоногенною поверхнево-активною сполукою [наприклад полісорбат 80, НСО-50 (аддукт поліоксіетилену (50 моль) і гідрогенізованої рицинової олії] і ін. Як масляне середовища використовуються, наприклад, кунжутна олія, соєва олія й ін., що можуть застосовуватися в поєднанні із солюбілізуючим агентом, наприклад бензилбензоатом, бензиловим спиртом і ін. Приготовлений у такий спосіб препарат для ін'єкцій переважно фасувати у відповідні ампули. Фармацевтичні препарати для перорального або парентерального введення, описані вище, переважно готувати в лікарських формах з разовою дозою, що підбирається так, щоб у неї вміщалася доза активних інгредієнтів. До таких лікарських форм із разовою дозою належать, наприклад, таблетки, пігулки, капсули, ін'єкції (ампули), супозиторії й ін. Кількість зазначеного антитіла, що міститься в разовій дозі, звичайно складає від 5 до 500 мг на лікарську форму; особливо у формі ін'єкції переважно, щоб кількість зазначеного антитіла складала приблизно від 5 до 100 мг і приблизно від 10 до 250 мг у випадку інших лікарських форм. 9 UA 102122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Монотерапія і комбінаційна терапія. Антитіла і фрагменти антитіл даного винаходу використовуються для лікування захворювань і порушень, які поліпшуються, придушуються або полегшуються при зниженні активності IL-4. До цих порушень належать такі, які характеризуються аномальною або надлишковою експресією IL-4 або аномальною відповіддю клітин хазяїна на продукцію IL-4. До зв'язаних з IL-4 порушень, які лікуються антитілами або фрагментами антитіл даного винаходу, належать, наприклад, артрит (у тому числі септичний артрит), герпетиформні захворювання, хронічна ідіопатична уртикарія, склеродерма, гіпертрофічне рубцювання, синдром Уїппла, доброякісна гіперплазія простати, захворювання легень, такі як астма (слабка, помірна або гостра), запальні захворювання, наприклад запальні захворювання кишечнику, алергійні реакції, синдром Кавасакі, серповидноклітинна анемія, синдром Черджа-Стросс, дифузійний токсичний зоб, передеклампсія, синдром Шегрена, аутоімунний лімфопроліферативний синдром, аутоімунна гемолітична анемія, стравохід Барретта, аутоімунний увеїт, туберкульоз, атопічний дерматит, виразковий коліт, фіброз і нефроз (див. патент США 7,186,809). Винахід включає комбінаційну терапію, при якій антитіло анти-IL-4R або його фрагмент вводяться в поєднанні з другим терапевтичним агентом. Спільне введення і комбінаційна терапія не обмежуються одночасним уведенням, але передбачають схеми лікування, при яких антитіло анти-IL-4R або його фрагмент уводяться принаймні однократно в ході лікування, що включає введення пацієнту принаймні одного іншого лікарського препарату. Другим лікарським препаратом може бути другий антагоніст IL-4, наприклад інше антитіло або його фрагмент або розчинний рецептор цитокіну, антагоніст IgE, антиастматичний лікарський препарат (кортикостероїди, нестероїдні агенти, бета-агоністи, антагоністи лейкотриєну, ксантини, флутиказон, сальметерол, альбутирол), що можуть уводитися за допомогою інгаляції або іншими відповідними методами. В одному з конкретних здійснень антитіло анти-IL-4R або фрагмент антитіла даного винаходу може вводитися з антагоністом IL-1, наприклад рилонасептом або антагоністом IL-13. До складу другого агента можуть входити один або декілька антагоністів рецепторів лейкотриєну, призначених для лікування таких порушень, як алергійні запальні захворювання, наприклад астма й алергії. Прикладами антагоністів рецепторів лейкотриєну є, серед інших, монтелукаст, пранлукаст і зафирлукаст. До складу другого агента може входити інгібітор цитокіну, наприклад один або декілька антагоністів TNF (етанерцепт, ENBREL™), IL-9, IL-5 або IL-17. Даний винахід також передбачає використання будь-якого з описаних у даному документі антитіл анти-IL-4R або антигензв'язувального фрагмента у виробництві лікарського засобу для лікування захворювання або порушення, коли захворювання або порушення поліпшується, полегшується або придушується в результаті усунення, придушення або зниження активності людського інтерлейкіну-4 (hIL-4). До прикладів таких захворювань або порушень належать, серед іншого, артрит, герпетиформні захворювання, хронічна ідіопатична уртикарія, склеродерма, гіпертрофічне рубцювання, синдром Уїппла, доброякісна гіперплазія простати, захворювання легень, астма, запальні захворювання, алергійні реакції, синдром Кавасакі, серповидноклітинна анемія, синдром Черджа-Стросс, дифузійний токсичний зоб, передеклампсія, синдром Шегрена, аутоімунний лімфопроліферативний синдром, аутоімунна гемолітична анемія, стравохід Барретта, аутоімунний увеїт, туберкульоз, нефроз і атопічний дерматит. Приклади Приведені нижче приклади покликані дати рядовим фахівцям в даній галузі повну інформацію й опис того, як варто формулювати і використовувати способи і препарати даного винаходу, і не покликані обмежувати сферу охоплення того, що винахідники розглядають як предмет даного винаходу. Починалися спроби домогтися точності відносно використовуваних показників (наприклад кількостей, температури й ін.), але необхідно враховувати деякі експериментальні помилки і відхилення. Якщо не зазначено інакше, під частинами розуміються вагові частини, молекулярною вагою називають усереднену молекулярну вагу, температура приводиться в градусах Цельсію, а тиск знаходиться на рівні атмосферного або близько до цього рівня. Приклад 1. Одержання антитіл людини до рецептора людини IL-4 Миші VELOCIMMUNE™ (Regeneron Pharmaceuticals, Inc.; патент США № 6,596,541) імунізували IL-4R людини (hIL-4R, SEQ ID №:274) або поєднанням hIL-4R і або білка ДНК IL-4R мавпи (Macaca fascicularis) (mfIL-4R, SEQ ID №:275). Для одержання оптимальної імунної відповіді тваринам потім давали повторні дози кожні 3-4 тижні, і через 10 днів після кожної повторної дози в них відбирали кров для оцінки розвитку анти-антигенної відповіді. Після того як у мишей розвивалася максимальна імунна відповідь, антитіло-експресуючі В 10 UA 102122 C2 5 10 15 20 25 клітини збирали і об'єднували з клітинами мієломи миші, для того щоб утворити гібридоми. Як альтернатива антиген-специфічні антитіла виділяли безпосередньо з ліній В-клітин без злиття з клітинами мієломи, як описано в публікації патенту США 2007/0280945A1, що спеціально включений у дану заявку в силу посилання на нього. З виділених придатних рекомбінантів одержували стабільні CHO клітинні лінії з експресією рекомбінантних антитіл. Функціонально необхідні моноклональні антитіла відбирали шляхом скринінгу кондиціонованого середовища гібридом або трансфекованих клітин на предмет виявлення специфічності, антигензв'язувальної афінності і здатності блокувати зв'язування hIL-4 з hIL-4R (розглядається нижче). Деякі анти-hIL-4R антитіла одержували описаними вище способами, у тому числі, наприклад, антитіла, позначені: H4H083P, H4H094P і H4H095P, H4H098P і H4H099P. Дані приклади антитіл анти-hIL-4R і їхні біологічні характеристики описані більш докладно в наступних прикладах. Приклад 2. Визначення антигензв'язувальної афінності антигену Афінність зв'язування (KD) окремих антитіл стосовно hIL-4R при температурі 25ºC або 37ºC визначали за результатами аналізу біосенсора в реальному часі за допомогою поверхневого плазмонного резонансу (BIACORE™ 2000). Отже, антитіло утримували на поверхні поліклонального анти-hFc антитіла кози, утвореній за допомогою прямого зв'язування з чипом BIACORE™ для формування поверхні зв'язаного антитіла. Різні концентрації (у межах від 50 нМ до 12,5 нМ) мономерних hIL-4R (системи R&D) або димерних hIL-4R-mFc уводили по поверхні зв'язаного антитіла зі швидкістю 10 мкл/хв протягом 2,5 хв. при 25C або 37ºC. Зв'язування антигену з антитілом і дисоціацію зв'язаного комплексу контролювали в реальному часі. Рівноважні константи дисоціації (KD) і константи швидкості дисоціації перевіряли за результатами кінетичного аналізу за допомогою розрахункового програмного забезпечення BIA. Розрахункове програмне забезпечення BIA також використовували для обчислення напівперіоду дисоціації комплексу антиген/антитіло (T 1/2). Результати приведені в таблиці 1. NB: Контроль: повне антитіло людини анти-IL-4R (патент США № 7,186, 809; SEQ ID №№:10 і 12). Таблиця 1 25ºC Антитіло Контроль H4H083P H4H094P H4H095P H4H098P H4H099P 30 35 40 45 мономерні KD T1/2 (пМ) (хв.) 1 100 18 48 361 NB 274 131 94,1 243 NB 37ºC димерні KD T1/2 (пМ) (хв.) 94 186 28 245 NB 302 156 67,6 237 NB мономерні KD T1/2 (пМ) (хв.) 3 970 4 183 87 NB 437 49 157 129 NB димерні KD T1/2 (пМ) (хв.) 114 158 38,1 163 NB 314 116 38,8 158 NB Афінність зв'язування (KD) окремих антитіл по відношенню до IL-4R (mfIL-4R) мавпи (Macaca fascicularis) при температурі 25ºC або 37ºC також визначали за результатами аналізу біосенсора в реальному часі за допомогою описаного вище поверхневого плазмонного резонансу в різних концентраціях (в межах від 100 нМ до 25 нМ) мономерних mfIL-4R-myc-mychis (mfIL-4R-mmh) або димерних mfIL-4R-mFc. Тільки антитіло H4H098P виявило здатність зв'язування як з мономерними, так і з димерними mfIL-4R при 25ºC з KD 552 нМ і 9,08 нМ відповідно. Антитіло H4H098P також зв'язується з димерними mfIL-4R при 37ºC з KD 24,3 нМ. H4H083P характеризувалося надто слабою здатністю зв'язування з димерним mfIL-4R. Афінність зв'язування антиген-антитіло також оцінювали по конкурентному аналізу в розчині на основі ELISA. Так, на 96-ямковий планшет MAXISORP™ спочатку наносили шар 5 мкг/мл авідину протягом ночі з подальшим блокуванням за допомогою BSA протягом 1 години. Покритий авідином планшет потім інкубували з 250 нг/мл біотин-hIL4 протягом 2 годин. Планшет використовували для вимірювання вільного hIL-4R-mFc (димерного hIL-4R) або вільного hIL-4R-myc-myc-his (hIL4R-mmh, мономерного hIL4R) в розчинах для зразків титрування антитіл. Для приготування зразків для титрування антитіл однакову кількість hIL-4RmFc в концентрації 25 пМ або hIL-4R-mmh в концентрації 200 пМ заздалегідь змішували з різними кількостями антитіла в діапазоні концентрацій від 0 до ~10 нМ в послідовних розведеннях, потім проводили годинне інкубування при кімнатній температурі для досягнення рівноваги зв'язування антитіло-антиген. Після досягнення рівноваги розчини переносили на 11 UA 102122 C2 5 покриті hIL-4 планшети для вимірювання вільного hIL-4R-mFc або вільного hIL-4R-mmh. Після закінчення однієї години планшети промивали, і зв'язаний hIL-4R-mFc детектували за допомогою кон'югованого з пероксидазою хріну поліклонального антитіла миші анти-mFc або кон'югованих з пероксидазою хріну поліклональних антитіл кози анти-myc. Визначали значення IC50 (таблиця 2). Таблиця 2 Антитіло Контроль H4H083P H4H094P H4H095P H4H098P H4H099P 10 15 20 IC50 (пМ) 25 пМ hIL-4R-mFc 8,2 9,6 >10 000 40 8,8 >10 000 200 пМ hIL-4R-mFc 87 80 >10 000 90 74 >10 000 Конкурентний аналіз у розчині на основі ELISA також використовувався для визначення перехресної реактивності антитіл до IL-4R мавпи. Антитіло H4H098P демонструє IC50 300 пМ для mfIL-4R-mFc і IC50 20 нМ для mfIL-4R-mmh. Приклад 3. Нейтралізація біологічного ефекту hIL-4 і hIL-13 "in vitro» Для визначення здатності очищених антитіл анти-hIL-4R нейтралізувати опосередковувану hIL-4R клітинну функцію розробили "in vitro" біотест на основі генно-інженерної клітинної лінії HK293, що містить репортери STAT6 людини і STAT6 люциферази. Ступінь інгібування hIL-4Rіндукованої активності люциферази визначали таким чином: клітини висівали на 96-ямкові 4 планшети в концентрації 1 × 10 клітин/ямку в середовищі і інкубували до ранку при 37ºC, 5 % CO2. Білки антитіла з концентрацією в діапазоні від 0 до 20 нМ у послідовних розведеннях додавали до клітин разом з 10 пМ hIL-4 або 40 пМ hIL-13. Потім клітини інкубували при 37C і 5 % CO2 протягом 6 годин. Масштаби клітинної відповіді вимірювали за допомогою люциферазного методу аналізу (Promega Biotech). Результати приведені в таблиці 3. NB: активність люциферази не блокувалася в дослідному режимі, описаному вище. Крім того, H4H098P блокувало опосередковану mfIL-4R клітинну функцію в присутності 360 фМ mfIL-4 з IC50 150 нМ. Таблиця 3 Антитіло Контроль H4H083P H4H094P H4H095P H4H098P H4H099P IC50 (пМ) 10 пМ hIL-4 47 25 NB 98 27 NB 25 12 40 пМ hIL-13 38 19 NB 86 25 11 000 UA 102122 C2 13 UA 102122 C2 14 UA 102122 C2 15 UA 102122 C2 16 UA 102122 C2 17 UA 102122 C2 18 UA 102122 C2 19 UA 102122 C2 20 UA 102122 C2 21 UA 102122 C2 22 UA 102122 C2 23 UA 102122 C2 24 UA 102122 C2 25 UA 102122 C2 26 UA 102122 C2 27 UA 102122 C2 28