Протираковий злитий протеїн

Реферат: Винахід стосується злитого протеїну, що містить: домен (а), який включає функціональний фрагмент послідовності розчинного протеїну hTRAIL, причому даний фрагмент починається амінокислотою в позиції не нижче, ніж hTRAIL 95, або послідовність, що має принаймні 70 % ідентичність до функціонального фрагмента, і домен (b), що являє собою послідовність антиангіогенного ефекторного пептиду, який є інгібітором рецептора фактора росту і вибраний з групи фрагментів фактора росту, що містять фрагмент VEGF SEQ ID NO: 17, фрагмент PDGF SEQ ID NO:. 22 і фрагмент EGF SEQ ID NO:. 23; при цьому послідовність домену (b) приєднана в точці С - кінця або точці N - кінця домену (а). Даний злитий протеїн може бути застосованим для лікування онкологічних захворювань. UA 108778 C2 (12) UA 108778 C2 UA 108778 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід відноситься до області терапевтичних злитих протеїнів, зокрема, рекомбінантних злитих протеїнів. Більш конкретно, винахід відноситься до злитих протеїнів, що містять фрагмент послідовності розчинного людського протеїну TRAIL в поєднанні з послідовністю антиангіогенного пептиду, до фармацевтичних композицій, що їх містять, їх застосування в терапії, зокрема, в якості протиракових речовин, і до полінуклеотидних послідовностей, що кодують злиті протеїни, векторів експресії, які включають полінуклеотидні послідовності, і до клітин-хазяїнів, що містять зазначені вектори експресії. Протеїн TRAIL, що належить до сімейства цитокінів (ліганд, що викликає апоптоз, який має відношення до фактору некрозу пухлини), також відомий як Apo2L (Apo2-ліганд), є потужним активатором апоптозу в пухлинних клітинах і в клітинах, інфікованих вірусами. TRAIL є лігандом, що виникає в організмі природним шляхом. Протеїн TRAIL, його амінокислотна послідовність, яка кодує послідовності ДНК, та системи експресії протеїну, були вперше розкриті в EP0835305A1. Протеїн TRAIL проявляє свою протиракову активність, зв'язуючись з проапоптотичними поверхневими TRAIL рецепторами 1 і 2 (TRAIL-R1/R2) і забезпечуючи наступну активацію цих рецепторів. Дані рецептори, відомі також як DR4 і DR5 (рецептор загибелі 4 і рецептор загибелі 5), належать до сімейства рецептора TNF (фактора некрозу пухлини) і піддаються гіперекспресії з боку різних типів ракових клітин. Активація даних рецепторів може індукувати зовнішній сигнальний шлях апоптозу, незалежно від супресорного гена р53, який, завдяки активованій каспазі-8, призводить до активації виконавчих каспаз і тим самим - до деградації нуклеїнових кислот. Каспаза-8, вивільнена після активації TRAIL, може також спричинювати вивільнення Bid протеїну і тим самим - непряму активацію мітохондріального шляху, при цьому Bid протеїн, переміщаючись до мітохондрії, де він стимулює вивільнення цитохрому С, таким чином, опосередковано посилює апоптотичний сигнал від рецепторів загибелі . TRAIL вибірково впливає на пухлинні клітини, по суті, не викликаючи апоптозу в здорових клітинах, які стійкі до цього протеїну. Таким чином, в силу свого величезного потенціалу, TRAIL був визнаний протираковим засобом, який впливає на широкий діапазон різних типів пухлинних клітин, в тому числі гематологічних злоякісних новоутворень і щільних пухлин, і в той же час щадним по відношенню до нормальних клітин, і таким, що має відносно невеликі побічні ефекти. Протеїн TRAIL представляє собою протеїн мембранного типу II, що має довжину з 281 амінокислот, при цьому його позаклітинна область, яка включає амінокислотні залишки 114-281, після розщеплення протеазами утворює розчинну молекулу sTRAIL розміром 20 кДа, яка також є біологічно активною. Обидві форми TRAIL і sTRAIL здатні запустити апоптоз через взаємодію з рецепторами TRAIL, присутніми на клітинах-мішенях. Сильна протипухлинна активність і дуже низька системна токсичність розчинної частини молекули TRAIL була продемонстрована із застосуванням тестування клітинних ліній. Крім того, клінічні дослідження людини на рекомбінантний людський розчинний TRAIL (rhTRAIL), що має амінокислотну послідовність, відповідну амінокислотам 114-281 з hTRAIL, відомий під назвою INN dulanermin (дуланермін), показали його хорошу переносимість та відсутність токсичності, що обмежує дозування. Як нещодавно було розкрито відносно рекомбінантного мутанта з кільцевою перестановкою генів, що має відношення до 122-281hTRAIL, наприклад, в патентному документі EP 1688498, фрагмент TRAIL, коротший за 114 - 281, здатний зв'язуватися з мембранними рецепторами загибелі і індукувати апоптоз через ці рецептори, Відома на сьогоднішній день інформація про токсичний вплив рекомбінаногого протеїну TRAIL на клітини печінки, цілком ймовірно, пов'язана з наявністю модифікації, тобто маркувань полігістидину, при цьому, немарковані TRAIL не виявляють системної токсичності. Проте, в ході подальших наукових досліджень і розробок виявилося, що багато ракових клітин також проявляють первинну або надбану стійкість до TRAIL (див., наприклад, WO2007/022214). Хоча механізм стійкості до TRAIL до кінця не вивчений, вважається, що вона може проявлятися на різних рівнях TRAIL-індукованого шляху апоптозу, починаючи від рівня рецепторів на поверхні клітини, завершаючи рівнем виконавчих каспаз в межах сигнального шляху. Така стійкість обмежує корисність застосування TRAIL в якості протипухлинного засобу. Крім того, в клінічних дослідженнях пацієнтів дійсна ефективність TRAIL в якості монотерапевтичного засобу виявилася низькою. Щоб подолати таку низьку ефективність і стійкість пухлин до TRAIL, були розроблені різні комбіновані лікувальні методики із застосуванням радіо-і хіміотерапевтичних засобів, у результаті яких досягався синергічний апоптотичний ефект. (WO2009/002947; A. Almasan and A. Ashkenazi, Cytokine Growth Factor Reviews (Про цитокінові фактори росту) 14 (2003) 337-348; RK Srivastava, Neoplasis (Неоплазія), 1 UA 108778 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Vol 3, No 6, 2001, 535-546, Soria JC et al., J. Clin. Oncology (Клінічна онкологія), Vol 28, No 9 (2010), p. 1527-1533). Використання rhTRAIL для лікування раку в поєднанні з вибраними звичайними хіміотерапевтичними препаратами (паклітаксел, карбоплатин) і моноклональними анти-VEGF - антитілами описані в документі WO2009/140469. Проте, таке поєднання обов'язково супроводжується добре відомими недоліками, що властиві традиційній хіміотерапії або променевій терапії. Крім того, TRAIL терапія не була позбавлена проблеми, яка полягала у низькій стабільності TRAIL і його швидкому виведенні з організму після прийому. Однією з проблем у терапії раку є також інгібування пухлинного ангіогенезу. Ангіогенез (неоваскуляризація) є патологічним, необмеженим у часі процесом розвитку нових кровоносних судин, які постачають пухлину киснем і живильними речовинами. Ангіогенез є необхідною умовою для росту і розповсюдження пухлини та сприяння утворенню її метастазів. В терапії раку відомий позитивний ефект інгібування ангіогенезу пухлини. Були зроблені спроби клінічного застосування речовин, які інгібують або регулюють процес ангіогенезу як для терапії раку, так і додаткової терапії раку. Відомі такі інгібітори ангіогенезу: ендогенні, тобто такі, що природно присутні в організмі людини, і численні екзогенні антиангіогенні речовини. Серед них є відомі інгібітори ангіогенезу, що нагадують протеїн, в тому числі протеолітичні фрагменти ендогенних протеїнів. В якості прикладів можуть бути згадані такі протеїнові інгібітори ангіогенезу, як ангіостатин (фрагмент плазміногену), ендостатин (С-кінцевий фрагмент колагену XVIII), кальретикулін, вазостатин фрагмент кальретикуліну, фрагмент пролактину, фрагмент металопротеїнази 2, або тумстатин фрагмент колагену IV (Cao Y. Angiogenesis modulates adipogenesis and obesity. (Ангіогенез модулює адипогенез і ожиріння) J Clin Invest. 2007;117(9):2362–2368, Folkman J. Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery (Ангіогенез: організуючі принципи відкриття нових ліків)? Nat Rev Drug Discov. 2007;6:273–286). Наприклад, тумстатин являє собою пептид розміром 28 кДа - фрагмент колагену типу IV, здатний зв'язуватися з інтегріном αvβ3 та запобігати ангіогенезу шляхом інгібування проліферації ендотеліальних клітин. Крім того, тумстатин самостійно інгібує активацію кінази фокальної адгезії(FAK) і фосфатидилинозитол-3-кінази PI3 і протеїнкінази PKB/Akt (ПКБ / Акт). Антиангіогенна активність може також спричинюватися інгібуванням проангіогенних протеїнів, таких як чинник росту ендотелію судин (VEGF), який діє через рецептори, розташовані на судинному ендотелію, і який є основним стимулятором неоангіогенезу. У клінічному лікуванні, у тому числі лікуванні раку, в якості факторів антиангіогенезу вже були застосовані певні речовини, спрямовані проти VEGF, наприклад, моноклональні антитіла бевацизумаб і ранібізумаб. Також відомі інші проангіогенні фактори, що стимулюють проліферацію та міграцію ендотеліальних клітин незалежно від рецепторів, розташованих на ендотелію, до яких відносяться, наприклад, цитокіни, такі як тромбоцитарний фактор росту PDGF і епідермальний фактор росту EGF, TNF і ангіопоетин. У процесі ангіогенезу також бере участь фермент амінопептидаза N (APN/CD13), яка являє собою трансмембранну металопротеазу. Відомо, що гальмування цього ферменту може призводити до інгібування пухлинного процесу. Відома деяка кількість природних і синтетичних інгібіторів амінопептидази N. (Bavouis B., Dauzonne D., Aminopeptidase-N/CD13 (EC 3.4.11.2) inhibitors: chemistry, biological evaluations, and therapeutic prospects (Інгібітори амінопептидази N/CD13 (EC 3.4.11.2): хімічні, біологічні дослідження і терапевтичні перспективи.) Medical Research Review, 2006, 26, (1), 88-130). Природні інгібітори речовини APN/CD13 в основному включають до свого переліку речовини, що виробляються мікроорганізмами. В якості представника, серед інших можуть бути названі бестатин, куркумін і апігенін. Було також виявлено, що короткий пептид, що містить мотив CNGRC, здатний ефективно зв'язуватися з CD13 (Arap et al., Science, 279:377-380, 1998). Багато які з антиангіогенних речовин в даний час знаходяться на різних стадіях дослідження, включаючи клінічні випробування. Проте, відомі терапії, спрямовані на інгібування ангіогенезу, мають багато добре відомих недоліків. Наприклад, користь від застосування моноклонального антитіла бевацизумабу при лікуванні раку молочної залози нещодавно була поставлена під сумнів. Багато антиангіогенних препаратів демонструють, наприклад, дуже короткий період напіврозпаду, низьку розчинність, незадовільну біодоступність і токсичні побічні ефекти. Безпека антиангіогенних препаратів має особливе значення через їх тривале застосування і відсутність селективності терапії. Велика потреба в ефективній терапії і природа онкологічних захворювань вимагають спрощеної процедури реєстрації такої групи препаратів, тому неможливо знати всі побічні ефекти і недоліки препарату. Хоча, на відміну від 2 UA 108778 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 хіміотерапевтичних заходів, які спрямовані на всі швидко проліферуючі клітини, антиангіогенні препарати, спрямовуються на різних етапах формування кровоносних судин, що призводить до зниження токсичності терапії. Тим не менш, все ще існує необхідність протиракової терапії, направленої на інгібуванні ангіогенезу, але такої, яка при цьому забезпечувала б селективність відносно пухлинних клітин. Отже, існує потреба в нових протиракових антиангіогенних способах лікування з поліпшеними токсикологічними характеристиками. Побудований злитий протеїн, що містить послідовності інгібітора ангіогенезу вазостатину і TRAIL114-281, що зв'язані з сайтом розщеплення лінкера металопротеази, був описаний у роботі A.I. Guo et al in Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology (Китайський журнал біохімії і молекулярної біології) 2008, vol. 24(10), 925-930, як такий, що характеризується ефектом індукування апоптозу в пухлинних клітинах. Побудований злитий протеїн, що містить послідовності інгібітора ангіогенезу кальретикуліну і TRAIL114-281, був описаний у CN1609124A як такий, що проявляє ефект індукування апоптозу в пухлинних клітинах. CN 1256347C розкриває злитий протеїн, що складається з кініногену D5 60-148 114-281 і TRAIl 114-281. Побудований злитий протеїн, що містить послідовності інгібітора ангіогенезу кіностатину, вазостатину і канстатину, приєднані до N-або С-кінця TRAIL114-281, зв'язаного з лінкером, кодуючим GGGSGGSG, згадується в роботі Feng Feng-Yi “Phase and Clinical Trial of Rh-Apo2L and Apo2L-Related Experimental Study", ("Фазові і клінічні випробування експериментальних досліджень, що мають відношення до Rh-Apo2L і Apo2L"), Ph.D. degree thesis, Chinese Peking Union Medical, 2006-10-01; http://www.lw23.com/lunwen_957708432. Побудований злитий протеїн, що містить послідовності Тумстатин 183-230 інгібітора ангіогенезу тумстатину і TRAIL114-281, був описаний як такий, що забезпечує індукцію апоптозу клітин раку підшлункової залози, в роботі N.Ren і співавторів в академічному журналі Другого військового медичного університету (N.Ren et al, Academic Journal of Second Military Medical University 2008, vol. 28(5), 676-478). Патентний документ US2005/244370 і відповідна міжнародна публікація WO2004/035794 розкривають конструкцію TRAIL95-281 як ефекторного домену, з’єднаного пептидним лінкером з позаклітинною частиною іншого члена лігандів сімейства TNF CD40, як з клітинною поверхнею, що зв’язується з доменом. Встановлено, що активація конструкції відбувається через зв’язок з її частиною CD40 Даний винахід забезпечує вирішення поставленої технічної задачі, пропонуючи нові злиті протеїни, які містять домен, отриманий з TRAIL, і короткий домен ефекторниого пептиду, що має антиангіогенну активність, але не містить фрагментів TRAIL, при цьому ефекторний пептид посилює або доповнює функцію TRAIL. Протеїни, згідно винаходу, вибірково спрямовані до ракових клітин, де окремі елементи протеїну проявляють свою функцію, зокрема, ефекторні пептиди інгібують ангіогенез пухлини. Доставка протеїнів за винаходом в пухлинне середовище дозволяє мінімізувати токсичність відносно здорових клітин в організмі, в тому числі і побічні ефекти, а також скоротити частоту введення препаратів. Крім того, цільова терапія із застосуванням протеїнів згідно з винаходом дозволяє уникнути проблеми низької ефективності відомих раніше неспецифічних антиангіогенних терапевтичних способів, спричинюваної низькою проникністю кровоносних судин. Крім того, виявилося, що в багатьох випадках злиті протеїни за даним винаходом є більш ефективними, ніж розчинний TRAIL і його варіанти, включаючи фрагмент послідовності. Досі відомі ефекторні пептиди, застосовані в злитому протеїні за даним винаходом, не використовувалися в медицині в такій функції через несприятливу кінетику швидкої деградації під дією неспецифічних протеаз або через накопичення в організмі, викликане відсутністю правильної послідовності активації шляхів, які необхідні щоб забезпечити належну дію ефекторного пептиду у цільовому сайті. Включення ефекторного пептиду в злитий протеїн забезпечує його селективну доставку до місця їх бажаної дії. Крім того, приєднання ефекторного пептиду збільшує масу протеїну, що призводить до більш тривалого періоду напіврозпаду і збільшення часу утримання протеїну в пухлині, а також підвищує його ефективність. Крім того, в багатьох випадках, нові злиті протеїни також пересилюють резистентність відносно подолати опір TRAIL. Опис фігур Далі винахід описується детально з посиланнями фігури ілюстративного матеріалу. На фіг. 1 представлено схематичне зображення структури злитих протеїнів за винаходом відповідно до Прикладів 1, 2, 3, 4, 5 і 6. 3 UA 108778 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 На фіг. 2 представлено схематичне зображення структури злитих протеїнів за винаходом відповідно до Прикладів 7, 8, 9, 10 і 11. На фіг. 3 представлено схематичне зображення структури злитих протеїнів за винаходом відповідно до Прикладів 12, 13, 14 і 15. На фіг. 4 показані спектри кругового дихроїзму для rhTRAI95-281 і злитих протеїнів, що відповідають Прикладам 1, 4, 5, 9 та 14, експресованих в специфічній еліптичності. На фіг. 5 представлено зміни обсягу пухлини (у % від початкової стадії) у мишей Crl: CD1Foxn1nu, хворих на рак товстої кишки HCT116, що одержали лікування злитими протеїнами за винаходом, відповідними Прикладам 1, 4, 5 і 9 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL 114-281. На фіг. 6 представлені значення показників уповільнення росту пухлини (% TGI) у мишей Crl: nu CD1-Foxn1 1, хворих на рак товстої кишки HCT116, що одержали лікування злитими протеїнами за винаходом, відповідними Прикладам 1, 4, 5 і 9 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL 114-281. На фіг. 7 представлено зміну обсягу пухлини (у % від початкової стадії) у мишей Crl:CD1Foxn1nu, хворих на рак легені A549, що одержали лікування злитими протеїнами за винаходом, відповідними Прикладу 1 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL 114-281. На фіг. 8 представлені значення показників уповільнення росту пухлини (% TGI) у мишей Crl: nu CD1-Foxn1 1, хворих на рак легені A549, що одержали лікування злитими протеїнами за винаходом, відповідними Прикладу 1 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL 114-281. На фіг. 9 представлено схематичне зображення структури злитих протеїнів за винаходом відповідно до Прикладів 16, 17, 18 і 19. На фіг. 10 представлено зміни обсягу пухлини (у % від початкової стадії) у мишей Crl: CD1Foxn1nu, хворих на рак товстої кишки HCT116, що одержали лікування злитими протеїнами за винаходом, відповідними Прикладам 5, 4, 9 і 1 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL 114-281. На фіг. 11 представлені значення показників уповільнення росту пухлини (% TGI) у мишей nu Crl: CD1-Foxn1 1, хворих на рак товстої кишки HCT116, що одержали лікування злитими протеїнами за винаходом, відповідними Прикладам 5, 4, 9 і 1 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL 114-281. На фіг. 12 представлено зміни обсягу пухлини (у % від початкової стадії) у мишей Crl:SHOscid hr Prkdc Hr , хворих на рак товстої кишки HCT116, що одержали лікування злитими протеїнами за винаходом, відповідними Прикладам 6 і 11 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL 114-281. На фіг. 13 представлені значення показників уповільнення росту пухлини (% TGI) у мишей scid hr Crl:SHO-Prkdc Hr , хворих на рак товстої кишки HCT116, що одержали лікування злитими протеїнами за винаходом, відповідними Прикладам 6 і 11 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL 114-281. На фіг. 14 представлено зміни обсягу пухлини (у % від початкової стадії) у мишей Crl:SHOscid hr Prkdc Hr , хворих на рак товстої кишки Colo205, що одержали лікування злитими протеїнами за винаходом, відповідними Прикладам 6 і 19 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL 114-281. На фіг. 15 представлені значення показників уповільнення росту пухлини (% TGI) у мишей scid hr Crl:SHO-Prkdc Hr , хворих на рак товстої кишки Colo205, що одержали лікування злитими протеїнами за винаходом, відповідними Прикладам 6 і 19 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL 114-281. На фіг. 16 представлено зміни обсягу пухлини (у % від початкової стадії) у мишей Crl:SHOscid hr Prkdc Hr , хворих на рак товстої кишки SW620, що одержали лікування злитими протеїнами за винаходом, відповідними Прикладам 6 і 11 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL 114-281. На фіг. 17 представлені значення показників уповільнення росту пухлини (% TGI) у мишей scid hr Crl:SHO-Prkdc Hr , хворих на рак товстої кишки SW620, що одержали лікування злитими протеїнами за винаходом, відповідними Прикладам 6 і 11 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL 114-281. На фіг. 18 представлено зміну обсягу пухлини (у % від початкової стадії) у мишей Cby.Cgfoxn1(nu)/J, хворих на рак легені A549, що одержали лікування злитим протеїном за винаходом, відповідним Прикладу 1 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL 114-281. На фіг. 19 представлені значення показників уповільнення росту пухлини (% TGI) у мишей Cby.Cg-foxn1(nu)/J, хворих на рак легені A549, що одержали лікування злитим протеїном за винаходом, відповідним Прикладу 1 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL 114-281. На фіг. 20 представлено зміну обсягу пухлини (у % від початкової стадії) у мишей Crl:SHOscid hr Prkdc Hr , хворих на рак легені NCI-H460, що одержали лікування злитим протеїном за винаходом, відповідним Прикладу 6 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL 114-281. 4 UA 108778 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 На фіг. 21 представлені значення показників уповільнення росту пухлини (% TGI) у мишей scid hr Crl:SHO-Prkdc Hr , хворих на рак легені NCI-H460, що одержали лікування злитим протеїном за винаходом, відповідним Прикладу 6 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL 114-281. На фіг. 22 представлено зміну обсягу пухлини (у % від початкової стадії) у мишей Crl:SHOscid hr Prkdc Hr , хворих на рак легені A549, що одержали лікування злитим протеїном за винаходом, відповідним Прикладам 5, 6, 11 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL 114-281. На фіг. 23 представлені значення показників уповільнення росту пухлини (% TGI) у мишей scid hr Crl:SHO-Prkdc Hr , хворих на рак легені A549, що одержали лікування злитим протеїном за винаходом, відповідним Прикладам 5, 6, 11 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL 114-281. На фіг. 24 представлено зміну обсягу пухлини (у % від початкової стадії) у мишей Crl:SHOscid hr Prkdc Hr , хворих на рак легені NCI-H460-Luc2, що одержали лікування злитим протеїном за винаходом, відповідним Прикладу 5 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL 114-281. На фіг. 25 представлені значення показників уповільнення росту пухлини (% TGI) у мишей scid hr Crl:SHO-Prkdc Hr , хворих на рак легені NCI-H460-Luc2, що одержали лікування злитим протеїном за винаходом, відповідним Прикладу 5 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL 114281. На фіг. 26 представлено зміну обсягу пухлини (у % від початкової стадії) у мишей Crl:SHOscid hr Prkdc Hr , хворих на рак легені A549, що одержали лікування злитими протеїнами за винаходом, відповідними Прикладам 5 і 1 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL 114-281. На фіг. 27 представлені значення показників уповільнення росту пухлини (% TGI) у мишей scid hr Crl:SHO-Prkdc Hr , хворих на рак легені A549, що одержали лікування злитими протеїнами за винаходом, відповідними Прикладам 5 і 1 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL 114-281. На фіг. 28 представлено зміну обсягу пухлини (у % від початкової стадії) у мишей Crl:SHOscid hr Prkdc Hr , хворих на рак печінки PLC/PRF/5, що одержали лікування злитими протеїнами за винаходом, відповідними Прикладам 6 і 11 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL 114-281. На фіг. 29 представлені значення показників уповільнення росту пухлини (% TGI) у мишей scid hr Crl:SHO-Prkdc Hr , хворих на рак печінки PLC/PRF/5, що одержали лікування злитими протеїнами за винаходом, відповідними Прикладам 6 і 11 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL 114-281. На фіг. 30 представлено зміну обсягу пухлини (у % від початкової стадії) у мишей Crl:SHOscid hr Prkdc Hr , хворих на рак печінки HepG2, що одержали лікування злитими протеїнами за винаходом, відповідними Прикладам 6 і 19 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL 114-281. На фіг. 31 представлені значення показників уповільнення росту пухлини (% TGI) у мишей scid hr Crl:SHO-Prkdc Hr , хворих на рак печінки HepG2, що одержали лікування злитими протеїнами за винаходом, відповідними Прикладам 6 і 19 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL 114-281. На фіг. 32 представлено зміну обсягу пухлини (у % від початкової стадії) у мишей Crl:SHOscid hr Prkdc Hr , хворих на рак підшлункової залози PANC-1, що одержали лікування злитим протеїном за винаходом, відповідним Прикладу 11 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL 114281. На фіг. 33 представлені значення показників уповільнення росту пухлини (% TGI) у мишей scid hr Crl:SHO-Prkdc Hr , хворих на рак підшлункової залози PANC-1, що одержали лікування злитим протеїном за винаходом, відповідним Прикладу 11 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL 114-281. На фіг. 34 представлено зміну обсягу пухлини (у % від початкової стадії) у мишей Crl:SHOscid hr Prkdc Hr , хворих на людську саркому матки множинної лікарської стійкості MES-SA/Dx5, що одержали лікування злитими протеїнами за винаходом, відповідними Прикладам 6 і 19 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL 114-281. На фіг. 35 представлені значення показників уповільнення росту пухлини (% TGI) у мишей scid hr Crl:SHO-Prkdc Hr , хворих на людську саркому матки множинної лікарської стійкості MESSA/Dx5, що одержали лікування злитими протеїнами за винаходом, відповідними Прикладам 6 і 19 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL 114-281. Детальний опис винаходу Винахід відноситься до злитого протеїну, що містить: домен (а), який є функціональним фрагментом послідовності розчинного протеїну hTRAIL , при цьому даний фрагмент починається амінокислотою у позиції не нижче, ніж hTRAIL 95, або до гомологу зазначеного функціонального фрагмента, який має, щонайменше, 70% ідентичність послідовності, і домен (b), що є послідовністю антиангіогенного ефекторного пептиду, при цьому послідовність домену (b) приєднана в точці C закінчення і / або точці N закінчення домену (а). 5 UA 108778 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 за умови, що виключаються злиті протеїни у яких ефекторній пептид вибраний з групи, що складається з кальретикуліну, тумстатину 183-230, кініногену D5, вазостатину, кініностатину і канстатину. Термін "функціональний розчинний фрагмент послідовності розчинного hTRAIL" слід розуміти як назву, що вказує на будь-який фрагмент розчинного hTRAIL, який здатний індукувати апоптотичний сигнал у клітинах ссавців після зв'язування з рецепторами на поверхні клітин. Кваліфікованому фахівцю слід взяти до уваги, що наявність щонайменше 70% гомології TRAIL - послідовності відома з рівня техніки даної області. Слід розуміти, що доменом (b) ефекторного пептиду в злитому протеїну за даним винаходом не є ані протеїн hTRAIL, ані частина або фрагмент протеїну hTRAIL. Термін "пептид" у контексті даного винаходу слід розуміти як молекулу, сконструйовану з безлічі амінокислот, з'єднаних разом за допомогою пептидного зв'язку. Таким чином, термін "пептид" у контексті даного винаходу включає в себе поняття олігопептидів, поліпептидів і протеїнів. У даному винаході амінокислотні послідовності пептидів будуть представлені звичайним способом, прийнятним для рівні техніки, в напрямку від точки N закінчення (N-кінця) пептиду в бік точки С його закінчення (C-кінця). Таким чином, будь-яка послідовність має свою точку N закінчення з лівого боку і точку С закінчення з правого боку її лінійного зображення. Злитий протеїн за винаходом містить, принаймні, один домен (b) ефекторного пептиду, приєднаний в точці С закінчення або в точці N закінчення домену (а). В одному з конкретних прикладів здійснення винаходу домен (а) являє собою фрагмент послідовності hTRAIL, що починається амінокислотою з діапазону від hTRAIL 95 до hTRAIL 121, включно, та закінчується амінокислотою hTRAIL 281. Зокрема, домен (а) може бути вибраний з групи, що складається з послідовностей, відповідних hTRAIL 95-281, hTRAIL 119-281, hTRAIL 120-281 і hTRAIL 121-281. Для кваліфікованого спеціаліста в даній області техніки є очевидним той факт, що hTRAIL 95-281, hTRAIL 119-281, hTRAIL 120-281 і hTRAIL 121-281 являють собою фрагмент людського протеїну TRAIL, що починається амінокислотою, маркованою числом 95, 119, 120 і 121, відповідно, в відомій послідовності hTRAIL (SEQ ID NO: 16), розміщеній (депонованій) в ГенБанку (GenBank) с реєстраційним номером P50591. В іншому конкретному прикладі здійснення домен (а) являє собою гомолога функціонального фрагмента послідовності розчинного протеїну hTRAIL, що починається в положенні амінокислоти не нижче hTRAIL 95 і закінчується в положенні амінокислоти hTRAIL 281, послідовність якого, принаймні на 70%, переважно на 85%, ідентична вихідній послідовності. У конкретних варіантах даного прикладу здійснення домен (а) являє собою гомолога фрагмента, вибраного з групи, що складається з послідовностей, відповідних hTRAIL 95-281, hTRAIL 114-281, hTRAIL 116-281, hTRAIL 120-281, hTRAIL 121-281 і hTRAIL 122-281. Слід розуміти, що гомолог фрагмента hTRAIL є варіацією / модифікацією амінокислотної послідовності даного фрагмента, при цьому, щонайменше, одна амінокислота змінена, включаючи 1 амінокислоту, 2 амінокислоти, 3 амінокислоти, 4 амінокислоти, 5 амінокислот, 6 амінокислот і не більше 15% амінокислот, при цьому фрагмент модифікованої послідовності зберігає функціональні ознаки послідовності hTRAIL, тобто здатність зв'язуватися з рецепторами загибелі на клітинній поверхні і індукувати апоптоз у клітинах ссавців. Модифікація амінокислотної послідовності може включати, наприклад, заміщення, делецію, скорочення та / або додавання амінокислот. Переважно, гомолог фрагмента hTRAIL, що має модифіковану послідовність, демонструє модифіковану афінність до рецепторів загибелі DR4 (TRAIL-R1) або DR5 (TRAIL-R2) у порівнянні з нативним фрагмент hTRAIL. Термін "модифікована афінність" відноситься до підвищеної афінності та / або афінності із зміненою селективністю рецептора. Переважно, гомолог фрагмента hTRAIL, що має модифіковану послідовність, проявляє віщу афінність до рецепторів загибелі DR4 і DR5, у порівнянні з нативним фрагментом hTRAIL. Особливо переважним є той факт, що гомолог фрагмента hTRAIL, який має модифіковану послідовність, проявляє більш високу афінність до рецептора загибелі DR5, у порівнянні з рецептором загибелі DR4, тобто підвищену селективність DR5/DR4. Також переважним є те, що гомолог фрагмента hTRAIL, який має модифіковану послідовність, проявляє підвищену селективність відносно рецепторів загибелі DR4 і / або DR5 залежно від афінності до рецепторів DR1 (TRAIL-R3), та / або DR2 (TRAIL-R4). 6 UA 108778 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Модифікації hTRAIL, результатом яких є підвищення ступеня спорідненості (афінності) та / або селективності відносно рецепторів загибелі DR4 і DR5, відомі кваліфікованим фахівцям в даній галузі техніки, наприклад, з публікації Tur V, van der Sloot AM, Reis CR, Szegezdi E, Cool RH, Samali A, Serrano L, Quax WJ. DR4-selective tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) variants obtained by structure-based design. (Варіанти DR4-селективного апоптозіндукуючого ліганду (TRAIL), що має відношення до фактору некрозу пухлини, отримані на основі структурного конструювання) J. Biol. Chem. 2008 Jul 18; 283 (29) :20560-8, в якій описана мутація D218H, що володіє підвищеною селективністю по відношенню до DR4, або з публікації Gasparian ME, Chernyak BV, Dolgikh DA, Yagolovich AV, Popova EN, Sycheva AM, Moshkovskii SA, Kirpichnikov MP. Generation of new TRAIL mutants DR5-A and DR5-B with improved selectivity to death receptor 5, Apoptosis. (Генерування нових TRAIL мутантів DR5-А і DR5-B з поліпшеною селективністю відносно рецептора загибелі 5, апоптоз.) 2009 Jun; 14 (6) :778-87, в якій описана мутація D269H із зниженим показником афінності до DR4. Мутанти hTRAIL, які призводять до збільшеної афінності до одного з рецепторів DR4 і DR5, порівняно з рецепторами DR1 і DR2, і підвищеної афінності до рецептора DR5, в порівнянні з DR4, описані також в патентних документах WO2009077857 і WO2009066174. Підходящими мутаціями є одна або декілька мутацій в позиціях нативного hTRA (I) L, вибраних з групи, що складається з 131, 149, 159, 193, 199, 201, 204, 204, 212, 215, 218 і 251 зокрема, мутації, що залучають заміщення амінокислоти основною амінокислотою, такою як лізин, гістидин і аргінін, або такою амінокислотою, як глютамінова кислота або аспарагінова кислота. Зокрема, можуть бути зазначені одна або декілька мутацій, вибрані з групи, що складається з G131R, G131K, R149I, R149M, R149N, R149K, S159R, Q193H, Q193K, N199H, N199R, K201H, K201R, K204E, K204D, K204L, K204Y, K212R, S215E, S215H, S215K, S215D, D218Y, D218H, K251D, K251E і K251Q, як описано в патентній публікації WO2009066174. Прийнятними мутаціями є також одна або декілька мутацій в позиціях нативного hTRA, вибраних з групи, що складається з 195, 269 і 214, зокрема, мутацій, які передбачають заміщення амінокислоти основною амінокислотою, такою як лізин, гістидин і аргінін. Зокрема, можуть бути зазначені одна або декілька мутацій, вибраних з групи, що складається з D269H, E195R, і T214R, як описано в патентній публікації WO2009077857 В конкретному прикладі здійснення домен (а), який являється гомологом фрагмента hTRAIL, вибирають із мутанта D218H нативної послідовності TRAIL, як описано в WO2009066174 або мутанта Y189N - R191K - Q193R - H264R - I266R - D269H нативної послідовності TRAIL, як описано в раб оті Gasparian ME, Chernyak BV, Dolgikh DA, Yagolovich AV, Popova EN, Sycheva AM, Moshkovskii SA, Kirpichnikov MP., Generation of new TRAIL mutants DR5-A and DR5-B with improved selectivity to death receptor 5, Apoptosis. (Генерування нових TRAIL-мутантів DR5-A і DR5-B з покращеною селективністю до рецептора 5 загибелі. Апоптоз). 2009 Jun;14(6):778-87. Домен (b) може бути, зокрема, вибраний з наступної групи: - інгібітори рецепторів для факторів росту, вибраних з рецепторів VEGF, PDGF і EGF; - Тумстатин або його фрагменти, крім фрагмента 183-230, а також - інгібітори амінопептидази N (CD13). В групі інгібіторів рецепторів для факторів росту ефекторний пептид домену (b) може бути фрагментом людського судинного ендотеліального фактора росту VEGF, який конкурентно зв'язує рецептор VEGF з природним лігандом, при цьому сам позбавлений ангіогенної активності. Як наслідок, ангіогенна активність VEGF блокується, більше не існує стимуляції формування нових кровоносних судин, і зростання пухлини пригнічується. Ефекторним пептидом з вказаної вище групи є, наприклад, пептид, який інгібує сигнальний шлях VEGF і, зокрема, 7-амінокислотний фрагмент людського VEGF, що представлено послідовністю SEQ ID NO: 17 у доданому списку послідовностей. Вважається, що пептид, який містить послідовність гептапептиду VEGF, включену в злитий протеїн за винаходом, має ефективно усувати ракові клітини шляхом інгібування процесу ангіогенезу. Крім того, у групі інгібіторів рецепторів для факторів росту ефекторним пептидом домену (b) може бути фрагмент тромбоцитарного фактору росту PDGF, який конкурентно зв'язує рецептор PDGF з природним лігандом, при цьому сам позбавлений ангіогенної активності. Як наслідок, ангіогенна активність PDGF блокується, більше не існує стимуляції формування нових кровоносних судин, і зростання пухлини пригнічується. Зокрема, таким ефекторним пептидом є 19-амінокислотний пептид - фрагмент ліганду PDGF, представлений послідовністю SEQ ID NO: 22 у доданому списку послідовностей. 7 UA 108778 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Вважається, що пептид, який містить послідовність протеїнового фрагмента тромбоцитарного фактору росту PDGF, включену в злитий протеїн за винаходом, має ефективно усувати ракові клітини шляхом інгібування процесу ангіогенезу. Крім того, у групі інгібіторів рецепторів для факторів росту антиангіогенним ефекторним пептидом домену (b) може бути пептидний фрагмент епідермального фактору росту EGF, який конкурентно зв'язує рецептор EGF з природним лігандом, при цьому сам позбавлений ангіогенної активності. Як наслідок, ангіогенна активність EGF блокується, більше не існує стимуляції формування нових кровоносних судин, зростання пухлини пригнічується. Таке блокування пептидів Gly Leu Arg Ser Lys Leu Glu і Arg Gly Leu Leu Arg Ser Glu, здатних зв'язуватися з рецептором EGF без активації внутрішньоклітинної кінази і блокувати EGR активність, відоме, наприклад, з патентного документу EP0641358. Зокрема, такий ефекторний пептид - фрагмент ліганду EGF, показано послідовністю SEQ ID NO: 23 у доданому списку послідовностей. Вважається, що пептид, який містить послідовність епідермального фактору росту EGF, включену в злитий протеїн за винаходом, має ефективно усувати ракові клітини шляхом інгібування процесу ангіогенезу. У групі тумстатину і його фрагментів ефекторним пептидом домену (b) може бути 25амінокислотний протеїновий фрагмент тумстатин (фрагмент I), представлений послідовністю SEQ ID NO: 18 у доданому списку послідовностей. Ефекторним пептидом вказаної вище групи є також інший 18-амінокислотний протеїновий фрагмент тумстатин (фрагмент II), представлений послідовністю SEQ ID NO: 19 у доданому списку послідовностей. Антиангіогенним ефекторним пептидом домену (b) може бути також комбінація пептидних фрагментів тумстатину, зокрема фрагменту I і фрагменту II, розташованих поруч один з одним у будь-якому порядку. В одному з прикладів здійснення винаходу домен (b) являє собою комбінацію типу фрагмент I / фрагмент II (SEQ ID NO: 18/SEQ ID NO: 19) або комбінацією типу фрагмент II / фрагмент I (SEQ ID NO:19/SEQ ID NO: 18 ). Вважається, що пептид, який містить послідовність протеїнового фрагмента I / II тумстатину, включену в злитий протеїн за винаходом, має ефективно усувати ракові клітини шляхом інгібування процесу ангіогенезу. Група інгібіторів амінопептидази N/CD13, які зв'язують з ферментом амінопептидазу N/CD13, з метою забезпечення її активності, буде включати в себе короткі пептиди, що містять мотиви NGR або RGD. Пептиди, в тому числі мотиви NGR, які ефективно зв’язуються з амінопептидазою N, описані, наприклад, у роботі Arap et al., Science, 279:377-380, 1998. На позаклітинному домені амінопептидази N також присутній фрагмент, який має афінність до мотиву RGD. Обидва мотиви (RGD і NGR) зв'язуються як антагоністи з факторами, що залучені у процес неоваскуляризації. Таким чином, цілком імовірно, що мотив RGD, який нагадує мотив NGR, буде зв'язуватися з амінопептидазою N і діяти як її інгібітор (Friedlander et al. Definition of two angiogenic pathways by distinct αv integrins.(Визначення двох ангіогенних шляхів окремими αv інтегрінами) Science (Washington DC), 270: 1500-1502, 1995; Pasqualini et al Aminopeptidase N is a receptor for tumor-homing peptides and a target for inhibiting angiogenesis. (Амінопептидаза N як рецептор для пептидів пухлини самонаведення і мішень для інгібування ангіогенезу)Cancer Res. 2000 Feb 1;60(3):722-7). У групі інгібіторів амінопептидази N/CD13 антиангіогенним ефекторним пептидам домену (b) може бути 5-амінокислотний пептид, зв’язаний з CD13, як показано послідовністю №21 у доданому переліку послідовностей. Вважається, що пептид, який містить послідовність протеїнового фрагмента, що зв’язує з амінопептидазою N/CD13, включену в злитий протеїн за винаходом, має ефективно усувати ракові клітини шляхом інгібування процесу ангіогенезу. Злиті протеїни за винаходом можуть містити більше одного домену (b) ефекторного пептиду, зокрема, два або три домени (b). В одному з прикладів здійснення злитий протеїн за даним винаходом містить два однакових або різних ефекторних доменів (b), вибраних з SEQ IDNO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 і SEQ ID NO: 23, причому ефекторні домени (b) розташовані поруч один з одним. В іншому прикладі здійснення злитий протеїн за даним винаходом містить два однакових або різних ефекторних доменів (b), вибраних з SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 і SEQ ID NO: 23, при цьому ефекторні домени (b) розташовані на N-кінці і / або С-кінці домену (а). У одному з прикладів здійснення злитий протеїн за даним винаходом містить три ефекторні домени . 8 UA 108778 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Наприклад, злитий протеїн за винаходом містить пептид, похідний від VEGF (SEQ ID NO: 17), розміщений на N-кінці домену (a), а на C-кінці домену (a) розташовані фрагмент I тумстатину (SEQ ID NO: 18) і фрагмент II тумстатину (SEQ ID NO: 19), розміщені поруч один з одним. В окремих прикладах здійснення злитого протеїну за винаходом ефекторним пептидом являється пептид, що має антиангіогенну активність, вибраний з групи, до складу якої входять SEQ ID NO: 17 (гептипептид, похідний від VEGF), SEQ ID NO: 18 (фрагмент I (амінокислоти 7498) протеїну тумстатину), SEQ ID NO: 19 (фрагмент II (амінокислоти 197-214) протеїну тумстатину), SEQ ID NO: 20 (пептид, що зв’язується з CD13), SEQ ID NO: 21 (пептид, що зв’язується з CD13), SEQ ID NO: 22 (фрагмент PDGF) і SEQ ID NO: 23 (фрагмент EGF). Після зв'язування з TRAIL-рецепторами, присутніми на поверхні ракових клітин, злитий протеїн надаватиме подвійної дії. Домен (а), що є функціональним фрагментом TRAIL або його гомологом із збереженням функціональності, буде проявляти свою відому агоністичного активність - тобто зв'язуватися з рецепторами загибелі на поверхні клітини і здійснювати активацію зовнішнього шляху апоптозу. Після інтерналізації злитого протеїну, що містить антиангіогенний пептид, домен (b), потенційно, зможе надавати внутрішньоклітинного впливу паралельно з діяльністю домену TRAIL. Таким чином, протиракова активність TRAIL може бути посилена шляхом активації інших елементів і механізмів, - таких як стеричне інгібування зв'язування природних лігандів VEGF, PDGF та EGF, інгібування ангіогенезу і неоваскуляризації, інгібування активації фосфатидилинозитол-3-кінази, протеїнкінази В (PKB / Akt) або опосередкованої стимуляції гіперекспресії TRAIL через кіназу Akt і шлях NFk. В одному з варіантів здійснення винаходу домен (а) і домен (b) зв'язані між собою, принаймні, одним доменом (с), що містить послідовність сайту розщеплення, розпізнаного протеазами, присутніми в клітинному середовищі, особливо в пухлинній клітині. З'єднання домену (а) з доменом (b), принаймні, одним доменом (с) означає, що між доменами (а) і (b) можуть бути присутніми більше одного домену (с), зокрема, один або два доменів (с). Протеазний сайт розщеплення може бути вибраний з наступного переліку, що включає: - послідовність, розпізнану металопротеазою MMP, зокрема, (Pro Leu Gly Leu Ala Gly Glu Pro/PLGLAGEP), позначену як SEQ ID NO: 24, або (Pro Leu Gly Ile Ala Gly Glu /PLGIAGE), позначену як SEQ ID NO: 55, або (Pro Leu Gly Leu Ala Gly GluPro /PLGLAGEP), позначену як SEQ ID NO: 56; - послідовність, розпізнану урокіназою uPA, зокрема, послідовність ArgValValArg (RVVR - у однобуквеному вираженні) позначену як SEQ ID NO: 25, або її фрагмент, що з останньою амінокислотою послідовності, до якої він приєднаний, формує послідовність SEQ ID NO: 25, та їх комбінації. В одному з прикладів здійснення винаходу сайт розщеплення протеазою являє собою комбінацію послідовності, розпізнаної металопротеазою MMP, і послідовності, розпізнаної урокіназою uPA, розташованих поруч одна з одною у будь-якому порядку. В одному з прикладів здійснення домен (с) являє собою комбінацію MMP/uPA SEQ ID NO:24/SEQ.No.25, або комбінацію uPA/MMP SEQ ID NO: 25/SEQ ID NO: 24. В іншому прикладі здійснення домен (с) являє собою комбінацію MMP/uPA SEQ ID NO:55/SEQ.No.25, або комбінацію uPA/MMP SEQ ID NO: 25/SEQ ID NO: 55. Ще в одному прикладі здійснення домен (с) являє собою комбінацію MMP/uPA SEQ ID NO:56/SEQ.No.25, або комбінацію uPA/MMP SEQ ID NO: 25/SEQ ID NO: 56. Такі протеази, як металопротеаза MMP і урокіназа uPA піддаються гіперекспресіі в пухлинному середовищі. Наявність послідовності, розпізнаної протеазою, забезпечує відщеплення домену (а) від домену (b), тобто секретування функціонального домену (b) і, отже, його активацію. Наявність сайту розщеплення протеазою, завдяки забезпеченню швидкого спливу ефекторного пептиду, підвищує можливості перенесення пептиду до місця його дії ще до того моменту, коли може відбутися випадкова деградація злитого протеїну через протеази, присутні в клітині. Крім основних функціональних елементів злитого протеїну, домену (доменів) сайту розщеплення, злиті протеїни, згідно винаходу, можуть включати нейтральну послідовність / послідовності гнучкого стеричного гліцин-серин-аланінового лінкера (спейсера). Такі лінкери / спейсери, добре відомі і описані в літературі. Їх включення в послідовність злитого протеїну призначено для забезпечення правильного укладання протеїнів, що продукуються в процесі його гіперекспресії в клітинах-хазяїнах. Зокрема, гнучкий стеричний лінкер може бути обраний з групи, що складається з SEQ ID NO: 26 і SEQ ID NO: 27, які є комбінаціями залишків гліцину, цистеїну і аланіну. В іншому прикладі здійснення гнучкий стеричний лінкер може бути обраний з групи, що складається з 9 UA 108778 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 і SEQ ID NO: 54, які містять залишки гліцину і серину. Крім того, гнучким стеричним лінкером може бути будь-який фрагмент з послідовностей SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 і SEQ ID NO: 54, що функціонує як гнучкий стеричний лінкер, наприклад, фрагмент Gly Gly Gly /GGG або фрагмент Gly Gly/GG. В одному з прикладів здійснення гнучкий стеричний лінкер може бути також вибраний з одного амінокислотного залишку, наприклад, одного залишку глютамінової кислоти, цистеїну, серину, проліну або залишку гліцину. В іншому прикладі здійснення гнучкий стеричний лінкер може бути будь-якою комбінацією лінкерів, що складається з SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 54 і одних амінокислотних залишків залишку глютамінової кислоти, цистеїну, серину, проліну або гліцину. Конкретними прикладами здійснення злитого протеїну за даним винаходом є злиті протеїни, що містять антиангіогенний пептид, вибраний з групи, що складається з протеїнів, представлених SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 і SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 і SEQ ID NO: 48, що в якості ефекторного пептиду включають в себе гептапептид, отриманий з VEGF. Іншим конкретним прикладом здійснення злитого протеїну за даним винаходом є злитий протеїн, що містить антиангіогенний пептид, вибраний з групи, що складається з протеїнів, представлених SEQ ID NO: 7 і SEQ ID NO: 8, що в якості ефекторного пептиду включають в себе послідовності зв'язування з CD13. Іншим конкретним прикладом здійснення злитого протеїну за даним винаходом є злитий протеїн, що містить антиангіогенний пептид, вибраний з групи, що складається з протеїнів, представлених SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 і SEQ ID NO: 49, що в якості ефекторного пептиду включають в себе фрагмент PDGF. Ще одним конкретним прикладом здійснення злитого протеїну за даним винаходом є злитий протеїн, що містить антиангіогенний пептид, вибраний з групи, що складається з протеїнів, представлених SEQ ID NO: 12 і SEQ ID NO: 13, що в якості ефекторного пептиду включають в себе фрагменти I і II тумстатину. Іншим конкретним прикладом здійснення злитого протеїну за даним винаходом є злитий протеїн, що містить антиангіогенний пептид, вибраний з групи, що складається з протеїнів, представлених SEQ ID NO: 14 і SEQ ID NO: 15, що в якості ефекторного пептиду включають в себе фрагмент EGF. Ще одними конкретними прикладами здійснення злитого протеїну за даним винаходом є злиті протеїни, що містять антиангіогенний пептид, вибраний з групи, яка складається з протеїнів, представлених SEQ ID NO: 3, що в якості ефекторного пептиду включають в себе гептапептид, похідний від VEGF, фрагмент I пептиду тумстатину і фрагмент II пептиду тумстатину. Детальний опис структури прикладів злитих протеїнів, що були згадані вище, показані на фіг.1-3 і на фіг. 9 і в прикладах, представлених далі по тексту. Відповідно до даного винаходу, термін "злитий протеїн" означає одиночну молекулу протеїну, що містить два або більше протеїнів чи їх фрагментів, ковалентно зв'язаних за допомогою пептидного зв'язку в межах їх відповідних пептидних ланцюгів без додаткових хімічних лінкерів. В якості альтернативи, злитий протеїн може бути описаний як узагальнений образ структури протеїну або химерний протеїн. Відповідно до даного винаходу, терміни "узагальнений образ структури" або "химерний протеїн", якщо вони використовується, слід розуміти як такий, що відноситься до злитого протеїну, як визначено вище. Для кваліфікованого фахівця в даній галузі техніки, є очевидним, що злитий протеїн, визначений таким чином, може бути синтезований відомими методами хімічного синтезу пептидів і протеїнів. Злитий протеїн може бути синтезований з використанням методів хімічного синтезу пептидів, зокрема, із застосуванням способів синтезу пептидів у твердій фазі, використовуючи відповідні смоли в якості носіїв. Такі методи є традиційними і відомі з рівня техніки, зокрема, вони описані в таких монографіях як, наприклад, Bodanszky and Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis (Застосування пептидного синтезу на практиці), 1984, Springer-Verlag, New York, Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis (Твердофазний пептидний синтез), 2nd Edition, 1984, Pierce Chemical Company Злитий протеїн може бути синтезований із застосуванням методів хімічного синтезу пептидів як безперервний протеїн. Крім того, окремі фрагменти (домени) протеїну можуть бути синтезовані індивідуально, а потім об'єднані разом в один безперервний пептид за допомогою 10 UA 108778 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 пептидного зв'язку шляхом конденсації аміно - кінця одного пептидного фрагмента із карбоксильного кінця другого пептиду. Такі методи є традиційними і добре відомі з рівня техніки. Для перевірки структури отриманого пептиду можуть бути використані відомі методи аналізу амінокислотного складу пептидів, наприклад, метод мас-спектрометрії високої роздільної здатності для визначення молекулярної ваги пептидів. Для підтвердження пептидної послідовності можуть бути також використані секвенсори протеїну, які послідовно руйнують пептид і ідентифікують послідовність амінокислот. Однак, переважно, злитий протеїн за винаходом є рекомбінантним протеїном, генерованим методами генної експресії полінуклеотидної послідовності, що кодує злитий протеїн в клітинаххазяїнах. Ще одним аспектом винаходу є полінуклеотидна послідовність, зокрема, послідовності ДНК, що кодує злитий протеїн, як зазначено вище Переважно, полінуклеотидною послідовністю, зокрема ДНК, відповідно до винаходу, що кодує злитий протеїн, як зазначено вище, є послідовність, яка оптимізована для експресії в E. coli. Іншим аспектом винаходу є також вектор експресії, що містить полінуклеотидну послідовність, зокрема, послідовність ДНК за винаходом, як визначено вище. Ще одним аспектом винаходу є також клітина - господар, що містить вектор експресії, як описано вище. Переважною клітиною-господарем для експресії злитих протеїнів за винаходом є клітина E. coli (клітина кишкової палички). Способи генерування рекомбінантних протеїнів, у тому числі злитих протеїнів, добре відомі. Якщо говорити коротко, даний спосіб полягає в генеруванні полінуклеотидної молекули, наприклад молекули ДНК, що кодує амінокислотну послідовність цільового протеїну і спрямовує експресію цільового протеїну в клітині – хазяїні. Далі цільовий протеїн, що кодує полінуклеотидну молекулу, інкорпорують у відповідний вектор експресії, який забезпечує ефективну експресію поліпептиду. Далі рекомбінантний вектор експресії вводять в клітинихазяїни для трансфекції / трансформації, і, як наслідок, виробляють трансформовану клітинухазяїна. Після цього цільовий протеїн піддають гіперекспресії, застосовуючи культуру трансформованих клітин, забезпечують очищення отриманих протеїнів, і, за вибором, відділяють шляхом відщеплення марковані послідовності, застосовані для експресії або очищення протеїну. Придатні для застосування способи експресії і очищення описані, наприклад, в монографії Goeddel, Gene Expression Technology, Methods in Enzymology (Технологія генної експресії, методи ензимології) 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), and A. Staron et al., Advances Mikrobiol., 2008, 47, 2, 1983-1995. В якості векторів експресії для впровадження і тиражування послідовностей ДНК в клітинаххазяїнах можуть бути використані косміди, плазміди або модифіковані віруси. Зазвичай, в якості векторів експресії використовують плазміди. Відповідні для цієї мети плазміди добре відомі і комерційно доступні. Вектор експресії за винаходом включає полінуклеотидну молекулу, що кодує злитий протеїн за винаходом і необхідні регуляторні послідовності для транскрипції і трансляції кодуючої послідовності, інкорпорованої в підходящу клітину-хазяїна. Вибір регуляторних послідовностей залежить від типу клітин-хазяїнів і може бути легко здійснений кваліфікованим фахівцем в даній області. Прикладами таких регуляторних послідовностей є транскрипційний промотор і енхансер (підсилювач) або РНК - полімераза - зв’язувальна послідовність, рибосома зв’язувальна послідовність, що містить сигнал ініціації транскрипції, вбудований перед кодуючою послідовністю, і послідовність закінчення транскрипції, вбудовану після кодуючої послідовності. Крім того, в залежності від клітини-хазяїна і застосованого вектора, в вектор експресії можуть бути введені інші послідовності, такі як джерело реплікації, додаткові ділянки рестрикції ДНК, підсилювачі (енхансери) і послідовності, що забезпечують індукування транскрипції. Вектор експресії також буде включати послідовність маркерного гена, який надає визначеного фенотипу трансформованій клітині і створює можливість для специфічної селекції трансформованих клітин. Крім того, вектор може також містити другу маркерну послідовність, яка дозволяє відрізняти клітини, трансформовані рекомбінантною плазмідою, що містить вбудовану кодуючу послідовність цільового протеїну, від тих, які прийняли плазміду без інсерту (вставки). Найчастіше використовуються типові маркери стійкі до антибіотиків, однак, можуть бути використані будь-які інші репортерні гени, відомі з рівня техніки, чия присутність в клітині (in vivo) може бути легко визначена з використанням методів авторадіографіі, 11 UA 108778 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 спектрофотометрії або біо-та хемілюмінесценції. Наприклад, в залежності від клітини-хазяїна, можуть бути використані такі репортерні гени, як β-галактозидаза, β-глюкуронідаза, люціфераза, хлорамфенікол ацетилтрансфераза або зелений флуоресцентний протеїн. Крім того, вектор експресії може містити сигнальну послідовність, транспортуючу протеїни у відповідний клітинний компартмент, наприклад, періплазму, де полегшується утворення складчастості. При цьому, може бути присутньою послідовність, яка кодує мітку / тег, така як HisTag, прикріплена до точки N закінчення, або GST, прикріплена до точки C закінчення, що полегшує подальше очищення протеїну, яке відбувається з використанням принципу афінності, за допомогою афінної хроматографії на нікелевій колонці Також можуть бути присутніми додаткові послідовності, які захищають протеїни від протеолітичної деградації в клітинаххазяїнах, а також послідовності, які підвищують його розчинність. Допоміжний елемент, приєднаний до послідовності цільового протеїну, може блокувати її діяльність, або чинити несприятливий вплив з іншої причини, наприклад, через токсичність. Такий елемент повинен вилучатися, що може бути досягнуто шляхом ферментативного або хімічного розщеплення. Зокрема, шестигістидиновий маркер (тег) HisTag або інші маркери зазначеного типу, приєднані для забезпечення очищення протеїну за допомогою афінної хроматографії, повинні бути видалені, через уже описаний вплив на печінкову токсичність розчинного протеїну TRAIL. Можуть бути використані гетерологічні системи експресії на основі різних відомих клітинхазяїнів, в тому числі прокаріотичних клітин: бактеріальних клітин, таких як кишкова паличка (Escherichia coli) або сінна паличка (Bacillus subtilis), дріжджі, такі як Saccharomyces cervisiae або Pichia pastoris (пекарські дріжджі), і еукаріотичні клітинні лінії (комах, ссавців, рослин). Переважно, завдяки простоті культивування та генетичних маніпуляцій, а також великій кількості отриманого продукту, використовується система експресії E. coli (кишкової палички). Відповідно, полінуклеотидна послідовність, що містить цільову послідовність, яка кодує злитий протеїн за винаходом, буде оптимізована для експресії в E. coli , тобто в кодуючій послідовності вона буде містити кодони, оптимальні для експресії в E. coli , вибрані з можливих варіантів послідовностей, відомих з рівня техніки. Крім того, вектор експресії буде містити описані вище елементи, що підходять для E. coli , приєднані до кодуючої послідовності. Таким чином, у переважному прикладі здійснення винаходу полінуклеотидна послідовність, що містить послідовність, яка кодує злитий протеїн за винаходом, оптимізований для експресії в E. coli , вибрана з групи полінуклеотидних послідовностей, що складається з: SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 які кодують злитий протеїн, що має амінокислотну послідовність, відповідну до амінокислотної послідовності, вибраної з групи, яка складається з наступних амінокислотних послідовностей, відповідно: SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 47; SEQ ID NO: 48 і SEQ ID NO: 49. У переважному прикладі здійснення винахід також забезпечує вектор експресії, придатний для трансформації E. coli , що містить полінуклеотидну послідовність, вибрану з групи полінуклеотидних послідовностей від SEQ ID NO: 31 до SEQ ID NO: 45 і від SEQ ID NO: 50 до SEQ ID NO: 53, зазначених вище, а також клітину E. coli , трансформовану таким вектором експресії. Трансформація, тобто введення послідовності ДНК в бактеріальні клітини-хазяїни, зокрема, E. coli (кишкову паличку), як правило, здійснюється на компетентних клітинах, приготованих для сприйняття ДНК, наприклад, шляхом обробки іонами кальцію при низькій температурі (4° С), з подальшим впливом із застосуванням теплового шоку (при 37-42° С), або методом електропорації. Такі способи добре відомі і, як правило, визначаються виробником системи експресії або описані в літературі та в навчальних посібниках для проведення лабораторних робіт, наприклад, Maniatis et al., Molecular Cloning (Молекулярне клонування). Cold Spring Harbor, N.Y., 1982. Процедура гіперекспресії злитих протеїнів за даним винаходом у системі експресії E. coli , буде описана нижче. Винахід також відноситься до фармацевтичної композиції, що містить злитий протеїн за винаходом, як визначено вище, в якості активного інгредієнта, а також відповідний фармацевтично прийнятний носій, розріджувач та звичайні допоміжні компоненти. 12 UA 108778 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Фармацевтична композиція має містити ефективну кількість злитого протеїну за винаходом і фармацевтично прийнятні допоміжні компоненти, розчинені або дисперговані у носії або розріджувачі, і бажано, фармацевтична композиція має бути представлена виконаною в стандартній лікарській формі у вигляді дозувальної одиниці або у вигляді препарату, що містить безліч доз. Фармацевтичні форми і методи їх приготування, а також інші компоненти, носії та розріджувачі відомі кваліфікованим фахівцям і описані в літературі. Наприклад, вони описані в монографії Remington's Pharmaceutical Sciences, ed. 20, 2000, Mack Publishing Company, Easton, USA. Термін "фармацевтично прийнятний носій, розріджувач та допоміжний інгредієнт" включає будь-які розчинники, дисперсійні середовища, поверхнево-активні речовини, антиоксиданти, стабілізатори, консерванти (наприклад, антибактеріальні засоби, протигрибкові препарати), ізотонічні агенти, відомі з рівня техніки. Фармацевтична композиція за винаходом може містити різні типи носіїв, розріджувачів та наповнювачів, в залежності від обраного способу введення і бажаних лікарських форм, таких як рідкі, тверді і аерозольні форми для орального, парентерального, інгаляційного, місцевого (зовнішнього) застосування, при цьому, обрана форма повинна бути стерильною при її введенні методом ін'єкції. Кращим шляхом введення фармацевтичної композиції за винаходом є парентеральний шлях, в тому числі із застосуванням маршрутів ін'єкції, таких як внутрішньовенний, внутрішньом'язовий, підшкірний, внутрішньочеревний, внутрішньопухлинний, також шлях або одноразового, або безперервного внутрішньовенного вливання. В одному з прикладів здійснення фармацевтична композиція за винаходом може бути введена шляхом ін'єкції безпосередньо в пухлину. В іншому прикладі здійснення фармацевтична композиція за винаходом може бути введена внутрішньовенно. Ще в одному прикладі здійснення фармацевтична композиція за винаходом може бути введена підшкірно або інтраперитонеально (внутрішньочеревно). Фармацевтичною композицією для парентерального введення може бути розчин або дисперсія в фармацевтично прийнятному водному або неводному середовищі, що містить буферний розчин для забезпечення відповідного показника рН та є ізоосмотичним щодо рідин організму, в разі необхідності, а також може містити антиоксиданти, буфери, бактеріостатичні агенти і розчинні речовини, які роблять композицію сумісною з тканинами чи кров'ю реципієнта. Іншими компонентами, які можуть бути включені в композицію, є, наприклад, вода, спирти, такі як етанол, поліоли, такі як гліцерин, пропіленгліколь, рідкий поліетиленгліколь, ліпіди, такі як тригліцериди, рослинні олії, ліпосоми. Відповідна плинність і розмір часток вказаної речовини може бути забезпечена за рахунок покривних речовини, таких як лецитин і поверхнево-активні речовини, наприклад, гідроксипропілцелюлози полісорбати, і інших подібних речовин. Підходящими ізотонічними (isotoning) засобами для парентеральних рідких композицій, являються, наприклад, цукри, такі як глюкоза, і хлорид натрію, а також їх комбінації. Крім того, фармацевтична композиція для введення шляхом ін'єкції або інфузії, може бути приготована у вигляді порошку, наприклад, у вигляді ліофілізованого порошку, що розводиться безпосередньо перед використанням у відповідному носії, такому як, наприклад, стерильна апірогенна вода. Фармацевтична композиція за винаходом для парентерального введення в організм може також мати форму, придатну для інтраназального введення, в тому числі, вона може бути приготована у вигляді розчинів, спреїв або аерозолів. Переважно, форма для інтраназального введення представлена у вигляді водного розчину і є ізотонічною або містить буферний розчин для підтримання показника рН від приблизно 5,5 до приблизно 6,5, щоб забезпечувати характеристики композиції аналогічними за своїми ознаками виділенням з носа. Крім того, композиція містить консерванти або стабілізатори, наприклад, такі як у відомих інтраназальних препаратах. Композиція може містити різні антиоксиданти, які уповільнюють окислення одного або декількох компонентів. Крім того, з метою запобігання дії мікроорганізмів, композиція може містити різні антибактеріальні і протигрибкові засоби, в тому числі, наприклад, і не обмежуючись названим, парабени, хлорбутанол, тімеросал, сорбінова кислота, і подібні відомі речовини зазначеного типу. Загалом, фармацевтична композиція за винаходом може включати, наприклад, щонайменше, близько 0,01% за вагою активного інгредієнта. Зокрема, композиція може містити активний інгредієнт у кількості від 1% до 75% за вагою одиниці композиції або, наприклад, від 25% до 60% за вагою, але не обмежуючись зазначеними значеннями. 13 UA 108778 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фактична кількість дози композиції за даним винаходом, введена пацієнтам, включаючи людину, має визначатися фізичними і фізіологічними факторами, наприклад, такими як вага тіла, тяжкість стану хворого, вид захворювання, яке лікують, попередні або супутні терапевтичні втручання і спосіб введення композиції. Підходяща одинична доза, загальна доза та концентрація активного інгредієнта в композиції повинна визначатися лікарем. Композиція може, наприклад, вводитися при дозуванні від близько 1 мкг / кг маси тіла до, приблизно, 1000 мг / кг маси тіла пацієнта, наприклад, в діапазоні від 5 мг / кг маси тіла до 100 мг / кг маси тіла або в діапазоні від 5 мг / кг маси тіла до 500 мг / кг маси тіла. Злитий протеїн і композиції, що його включають, проявляють протиракову або протипухлинну активність і можуть бути використані для лікування ракових захворювань. Винахід також відноситься до застосування злитого протеїну за винаходом, як визначено вище, для лікування онкологічних захворювань у ссавців, включаючи людину. Винахід також відноситься до способу лікування онкологічних захворювань у ссавців, у тому числі людини, що включає введення пацієнту, потребуючому такого лікування, протиракової ефективної кількості злитого протеїну за винаходом, як визначено вище, опційно, у вигляді відповідної фармацевтичної композиції. Злитий протеїн за винаходом може бути використаний для лікування гематологічних злоякісних новоутворень, таких як лейкемія, гранулематоз, мієлома та інших гематологічних злоякісних новоутворень. Злитий протеїн також може бути використаний для лікування щільних пухлин, таких як рак молочної залози, рак легені, в тому числі недрібноклітинний рак легені, рак товстої кишки, рак підшлункової залози, рак яєчників, рак сечового міхура, рак простати, рак нирки, рак мозку тощо. Відповідним шляхом введення злитого протеїну при лікуванні раку, зокрема, являється парентеральний шлях, який полягає у введенні злитого протеїну за винаходом у вигляді ін'єкцій або інфузій (вливань), застосовуючи композицію і форму, прийнятну для такого шляху введення. Винахід більш детально розкрито в описі наступних загальних процедур і прикладів специфічних злитих протеїнів. Загальна процедура гіперекспресії злитого протеїну Приготування плазміди Амінокислотна послідовність цільового злитого протеїну була використана в якості шаблону для генерування кодуючої його послідовності ДНК, що містить кодони, оптимізовані для експресії в Escherichia coli (кишковій паличці). Така процедура дозволяє збільшити ефективність наступної операції синтезу цільового протеїну в Escherichia coli (кишковій паличці). Далі була автоматично синтезована результуюча нуклеотидна послідовність. Крім того, сайти розщеплення ферментів рестрикції NdeI (на 5'-кінці ведучої нитки) і XhoI (на 3'-кінці ведучої нитки) були додані до результуючого гену, що кодує цільовий протеїн. Вони були використані для клонування гену у векторі pET28a (Novagen). Вони також можуть бути використані для клонування гену, що кодує протеїн для інших векторів. Цільовий протеїн, експресований з даної структури, може бути забезпечений за вибором на N-кінці полігістидиновим тегом (шість гістидинів), якому передує ділянка, розпізнана (активізована) тромбіном, що згодом застосовується для його очищення за допомогою афінної хроматографії. Деякі цілі були експресовані без будь-яких тегів, зокрема без гістидину (histidine tah), і вони були очищені на SP Sepharose. Коректність отриманої структури була підтверджена, по-перше, дослідженням рестрикції виділених плазмід із застосуванням ферментів NdeI і XhoI, а потім автоматичним секвенуванням усієї рамки зчитування цільового протеїну. Праймери, використані для секвенування, стали доповненням до послідовностей промотора T7 (5'TAATACGACTCACTATAGG-3') і термінатора T7 (5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'), присутніх у векторі. Результуюча плазміда була використана для гіперекспресії цільового злитого протеїну в комерційному штамі E. coli , який був трансформований у відповідності до рекомендацій виробника. Колонії, отримані на селективному середовищі (LB агар, канаміцин (50 мкг / мл), 1% розчин глюкози), були використані для приготування нічної культури в рідкому середовищі LB, доповнені канаміцином (50 мкг / мл) і 1% глюкозою. Через 15 годин росту, культури, отримані в перемішувальному інкубаторі, були застосовані для інокуляції відповідної культури. Гіперекспресія і очищення злитих протеїнів – загальна процедура А LB середовище з канаміцином (30 мкг / мл) і 100 мкМ (UM) сульфату цинку інокулювали нічною культурою. Культуру інкубували при 37° С до тих пір, поки оптична щільність (OD) при 600 нм не досягала 0,60-0,80. Потім додавали IPTG до отримання кінцевої концентрації в діапазоні 0,25-1мМ. Після перемішувальної інкубації (3,5 – 20год.) при 25° C культуру 14 UA 108778 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 центрифугували протягом 25 хв. при 6000g). Бактеріальні гранули повторно суспендували в буфері, що містить 50 мМ KH 2PO4, 0,5 М NaCl, 10 мМ імідазолу, рН 7,4. Суспензію обробляли ультразвуком на льоду протягом 8 хвилин (40% - амплітуда, 15-секундний імпульс, інтервал 10с) Отриманий екстракт освітлювали центрифугуванням протягом 40 хвилин при 20000 g, 4° С. Смолу Ni-Sepharose (Ni-Сефарози) (GE Healthcare) попередньо обробляли методом урівноваження буфером, який використовували для приготування екстракту бактеріальних клітин. Далі смолу інкубували протягом ночі при 4° С з супернатантом, отриманим після центрифугування екстракту. Далі її завантажували в хроматографічну колонку і промивали від 15 до 50 об'ємами буфера 50 мМ KH2PO4, 0,5 М NaCl, 20 мМ імідазолу, рН 7,4. Отриманий протеїн елюїрували з колонки з використанням градієнту імідазолу в буфері 50 мМ KH2PO4 з 0,5 М NaCl, рН 7,4. Одержані фракції досліджували (аналізували) за допомогою SDS-PAGE. Відповідні фракції об'єднували і діалізували протягом ночі при 4° С проти 50 мМ Тріс-буфера, рН 7,2, 150 мМ NaCl, 500 мМ L-аргініну, 0,1 мМ ZnSO4, 0,01% Твін (Твін) 20, і в той же час HisТag (при наявності) розщеплювали тромбіном (1:50). Після розщеплення тромбін був відділений від цільового злитого протеїну, завдяки використанню смоли Benzamidine TM Sepharose . Чистоту продукту досліджували із застосуванням SDS-PAGE - електрофорезу [Maniatis et al, Molecular Cloning. (Молекулярне клонування) Cold Spring Harbor, NY, 1982]. Гіперекспресія і очищення злитих протеїнів – загальна процедура В LB середовище з канаміцином (30 мкг / мл) і 100 мкМ сульфату цинку було інокульоване нічною культурою. Культуру інкубували при 37° С до тих пір, поки оптична щільність (OD) при 600 нм не досягала 0,60-0,80. Далі додавали IPTG до отримання кінцевої концентрації в діапазоні 0,5-1мМ. Після 20 - годинної перемішувальної інкубації при 25° C культуру центрифугували протягом 25 хв. при 6000 g. Після гіперекспресії бактеріальні клітини були зруйновані у френч-пресі у буфері, що містив 50 мМ KH2PO4, 0,5 M NaCl, 10 мM імідазолу, 5мM бета-меркаптоетанолу, 0,5 мМ PMSF (фенілметілсульфоніл флуориду (фториду), рН 7,8. Отриманий екстракт освітлювали центрифугуванням протягом 50 хвилин при 80000 g. Смолу Ni-Sepharose (Ni-сефарозу) інкубували протягом ночі з отриманим супернатантом. Після цього смолу зі зв'язаним протеїном упаковували в хроматографічну колонку. Для вимивання фракцій, що містять незв'язувальні протеїни, колонку промивали від 15 до 50 об'ємами буферу 50 мМ KH2PO4, 0,5 М NaCl, 10 мМ імідазолу, 5 мМ бета-меркаптоетанолу, 0,5 мМ PMSF (фенілметілсульфоніл флуориду (фториду), рН 7,8. Далі, щоб вимити більшість протеїнів, специфічно зв'язуючих із шаром (постіллю), колонку промивали буфером, що містить 50 мМ KH2PO4, 0,5 М NaCl, 500 мМ імідазолу, 10% гліцерину, 0,5 мм PMSF, рН 7, 5. Отримані фракції були проаналізовані, застосовуючи SDS-PAGE (Maniatis et al, Molecular Cloning (Молекулярне клонування) Cold Spring Harbor, NY, 1982). Фракції, що містять цільової протеїн, об'єднували і, якщо протеїн був експресований із застосуванням гістидинової мітки, розщеплювали тромбіном (1U на 4 мг протеїну, 8 годин при 16 °C), щоб видалити полігістидинові мітки. Потім фракції піддавали діалізу проти буфера (500 мМ L-аргініну, 50 мМ Тріс, 2,5 мМ ZnSO4, рН 7,4). Приклад 1. Злитий протеїн SEQ ID NO: 1 Протеїн послідовності SEQ ID NO: 1 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 173 амінокислот, і масу 19,8 кДа, в якому на N-кінці послідовності TRAIL121-281 гептапептид, похідний від VEGF (SEQ ID NO: 17) приєднано в якості ефекторного пептиду. Між ефекторним пептидом і послідовністю TRAIL інкорпорований гнучкий гліциновий стеричний лінкер SEQ ID NO: 28. Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 1, а його амінокислотна послідовність і ДНК кодуюча послідовність, що містить кодони, оптимізовані для експресії в E. coli , є, відповідно, SEQ ID NO: 1 і SEQ ID NO: 31, як показано в доданому переліку послідовностей. Амінокислотна послідовність SEQ ID NO: 1 структури, описаної вище, була використана в якості шаблону для генерування його кодуючої ДНК послідовності SEQ ID NO: 31. Була генерована плазміда, яка містить кодуючу послідовність ДНК у двох варіантах, один з яких забезпечує експресію мітки HisТag і сайту, розпізнаного тромбіном, а другий – без жодної мітки, при цьому гіперекспресію злитого протеїну здійснювали відповідно до описаних вище загальних методик. Гіперекспресію проводили відповідно до загальної методики А з використанням штамів E. coli , BL21 (DE3) і Tuner (DE3) pLysS , обидва від Novagen. Протеїни розділяли із застосуванням електрофорезу відповідно до загальної методики, описаної вище. Приклад 2. Злитий протеїн SEQ ID NO: 2 Злитий протеїн послідовності SEQ ID NO: 2 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 199 амінокислот, і масу 22,8 кДа, в якому на N-кінці послідовності TRAIL95-281 гептапептид, похідний від VEGF (SEQ ID NO: 17) приєднано в якості ефекторного пептиду. Між 15 UA 108778 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ефекторним пептидом і послідовністю TRAIL інкорпорований гнучкий гліциновий стеричний лінкер SEQ ID NO: 28. Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 1, а його амінокислотна послідовність і ДНК кодуюча послідовність, що містить кодони, оптимізовані для експресії в E. coli , є, відповідно, SEQ ID NO: 2 і SEQ ID NO: 32, як показано в доданому переліку послідовностей. Амінокислотна послідовність SEQ ID NO: 2 була використана в якості шаблону для генерування його кодуючої ДНК послідовності SEQ ID NO: 32. Була генерована плазміда, яка містить кодуючу послідовність ДНК з послідовністю, що забезпечує експресію мітки HisТag і сайту, розпізнаного тромбіном, при цьому гіперекспресію злитого протеїну здійснювали відповідно до описаних вище загальних методик. Гіперекспресію проводили відповідно до загальної методики А з використанням штаму E. coli , BL21 (DE3) від Novagen. Протеїн розділяли із застосуванням електрофорезу відповідно до загальної методики, описаної вище. Приклад 3. Злитий протеїн SEQ ID NO: 3 Злитий протеїн послідовності SEQ ID NO: 3 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 230 амінокислот, і масу 26,3 кДа, в якому на N-кінці послідовності TRAIL121-281 гептапептид, похідний від VEGF (SEQ ID NO: 17), а на С-кінці послідовності TRAIL121-281 фрагменти I і II тумстатину (SEQ ID NO: 18 і SEQ ID NO: 19, відповідно), приєднано в якості ефекторного пептиду. Між ефекторним пептидом на N-кінці послідовності TRAIL і послідовністю TRAIL інкорпорований гнучкий гліциновий стеричний лінкер SEQ ID NO: 28. Між ефекторним пептидом, приєднаним на С-кінці послідовності TRAIL і послідовністю TRAIL інкорпорований стеричний лінкер, що складається з 3 гліцинових залишків Gly Gly Gly, і послідовності сайтів розщеплення, розпізнаних металопротеазою MMP (SEQ. No. 24) і урокіназою uPA (SEQ. No. 25), завдяки чому ефекторний пептид має бути розщепленим у середовищі пухлини. Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 1, а його амінокислотна послідовність і ДНК кодуюча послідовність, що містить кодони, оптимізовані для експресії в E. coli , є, відповідно, SEQ ID NO: 3 і SEQ ID NO: 33, як показано в доданому переліку послідовностей. Амінокислотна послідовність SEQ ID NO: 3 була використана в якості шаблону для генерування його кодуючої ДНК послідовності SEQ ID NO: 33. Була генерована плазміда, яка містить кодуючу послідовність ДНК з послідовністю, яка дає можливість забезпечити експресію мітки Histag і сайту, розпізнаного тромбіном, при цьому гіперекспресію злитого протеїну здійснювали відповідно до описаних вище загальних методик. Гіперекспресію проводили відповідно до загальної методики В з використанням штаму E. coli , BL21 (DE3) від Novagen. Протеїн розділяли із застосуванням електрофорезу відповідно до загальної методики, описаної вище. Приклад 4. Злитий протеїн SEQ ID NO: 4 Протеїн послідовності SEQ ID NO: 4 представляє собою злитий протеїн, що має довжину 187 амінокислот і масу 21,4 кДа, в якому на N-кінці послідовності TRAIL 121-281 приєднано дві послідовності гептапептиду, отриманих з VEGF (SEQ No.17 ), в якості ефекторного пептиду. Між двома послідовностями ефекторного пептиду включена послідовність сайту розщеплення, розпізнаного металопротеазою MMP (SEQ ID NO: 24), за рахунок чого ефекторний пептид піддається розщепленню в пухлинному середовищі. Між послідовність сайту розщеплення ММР і послідовністю ефекторного пептиду включений один залишок глютамінової кислоти Е. Між ефекторним пептидом (SEQ 17) і послідовністю TRAIL інкорпорований гнучкий стеричний гліциновий лінкер (SEQ No.28 ). Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 1, а його амінокислотна послідовність і ДНК кодуюча послідовність, що містить кодони, оптимізовані для експресії в E. coli , є, відповідно, SEQ ID NO: 4 і SEQ ID NO: 34, як показано в доданому переліку послідовностей. Амінокислотна послідовність SEQ ID NO: 4 була використана в якості шаблону для генерування його кодуючої ДНК послідовності SEQ ID NO: 34. Була генерована плазміда, яка містить кодуючу послідовність ДНК у двох варіантах, один з яких забезпечує експресію мітки HisТag і сайту, розпізнаного тромбіном, а другий – без жодної мітки, при цьому гіперекспресію злитого протеїну здійснювали відповідно до описаних вище загальних методик. Гіперекспресію проводили відповідно до загальної методики В з використанням штаму E. coli BL21DE3pLysSRIL від Stratagene і штаму Tuner (DE3) від Novagen. Протеїни розділяли із застосуванням електрофорезу відповідно до загальної методики, описаної вище. Приклад 5. Злитий протеїн SEQ ID NO: 5 16 UA 108778 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Протеїн послідовності SEQ ID NO: 5 являє собою злитий протеїн, що має довжину 187 амінокислот і масу 21,8 кДа, в якому на N-кінці послідовності TRAIL 121-281 приєднано дві послідовності гептапептиду, отриманих з VEGF (SEQ No.17 ), в якості ефекторного пептиду. Між двома послідовностями ефекторного пептиду протеїн містить послідовності сайтів розщеплення, розпізнаних урокіназою uPA (SEQ ID NO: 25) і металопротеазою ММР (SEQ ID NO: 24), за рахунок чого ефекторний пептид піддається розщепленню в пухлинному середовищі. Між послідовність сайту розщеплення ММР і послідовністю ефекторного протеїну включений один залишок глютамінової кислоти Е. Крім того, на N-кінці TRAIL приєднані два гліцинові залишки. Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 1, а його амінокислотна послідовність і ДНК кодуюча послідовність, що містить кодони, оптимізовані для експресії в E. coli , є, відповідно, SEQ ID NO: 5 і SEQ ID NO: 35, як показано в доданому переліку послідовностей. Амінокислотна послідовність SEQ ID NO: 5 була використана в якості шаблону для генерування його кодуючої ДНК послідовності SEQ ID NO: 35. Була генерована плазміда, яка містить кодуючу послідовність ДНК у двох варіантах, один з яких забезпечує експресію мітки HisТag і сайту, розпізнаного тромбіном, а другий – без жодної мітки, при цьому гіперекспресію злитого протеїну здійснювали відповідно до описаних вище загальних методик. Гіперекспресію проводили відповідно до загальної методики А з використанням штаму E. coli Tuner (DE3) від Novagen. Протеїни розділяли із застосуванням електрофорезу відповідно до загальної методики, описаної вище. Приклад 6. Злитий протеїн SEQ ID NO: 6 Протеїн послідовності SEQ ID NO: 6 являє собою злитий протеїн, що має довжину 222 амінокислот і масу 25,3 кДа, в якому на N-кінці послідовності TRAIL95-281 приєднано дві послідовності гептапептиду, отриманих з VEGF (SEQ No.17 ), в якості ефекторного пептиду. Між двома послідовностями ефекторного пептиду протеїн містить послідовності сайтів розщеплення, розпізнаних урокіназою uPA (SEQ ID NO: 25) і металопротеазою ММР (SEQ ID NO: 55), за рахунок чого ефекторний пептид піддається розщепленню в пухлинному середовищі. Між ефекторним пептидом (SEQ ID NO: 17) і послідовністю TRAIL інкорпоровано цистеїнів гнучкий стеричний лінкер (SEQ ID NO: 26). Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 1, а його амінокислотна послідовність і ДНК кодуюча послідовність, що містить кодони, оптимізовані для експресії в E. coli , є, відповідно, SEQ ID NO: 6 і SEQ ID NO: 36, як показано в доданому переліку послідовностей. Амінокислотна послідовність SEQ ID NO: 6 була використана в якості шаблону для генерування його кодуючої ДНК послідовності SEQ ID NO: 36. Була генерована плазміда, яка містить кодуючу послідовність ДНК без послідовності, що забезпечує експресію мітки HisТag і сайту, розпізнаного тромбіном, при цьому гіперекспресію злитого протеїну здійснювали відповідно до описаних вище загальних методик. Гіперекспресію проводили відповідно до загальної методики А з використанням штаму E. coli Tuner (DE3) від Novagen. Протеїни розділяли із застосуванням електрофорезу відповідно до загальної методики, описаної вище. Приклад 7. Злитий протеїн SEQ ID NO: 7 Протеїн послідовності SEQ ID NO: 7 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 168 амінокислот, і масу 19,4 кДа, в якому на N-кінці послідовності TRAIL119-281 приєднано в якості ефекторного пептиду послідовність, якою є ліганд CD13 (SEQ ID NO: 20). Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 2, а його амінокислотна послідовність і ДНК кодуюча послідовність, що містить кодони, оптимізовані для експресії в E. coli , є, відповідно, SEQ ID NO: 7 і SEQ ID NO: 37, як показано в доданому переліку послідовностей. Амінокислотна послідовність SEQ ID NO: 7 була використана в якості шаблону для генерування його кодуючої ДНК послідовності SEQ ID NO: 37. Була генерована плазміда, яка містить кодуючу послідовність ДНК у двох варіантах, один з яких забезпечує експресію мітки HisТag і сайту, розпізнаного тромбіном, а другий – без жодної мітки, при цьому гіперекспресію злитого протеїну здійснювали відповідно до описаних вище загальних методик. Гіперекспресію проводили відповідно до загальної методики А з використанням штаму E. coli Tuner (DE3) від Novagen. Протеїни розділяли із застосуванням електрофорезу відповідно до загальної методики, описаної вище. Приклад 8. Злитий протеїн SEQ ID NO: 8 Протеїн послідовності SEQ ID NO: 8 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 201 амінокислот, і масу 23,2 кДа, в якому на N-кінці послідовності TRAIL95 приєднано в якості 17 UA 108778 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ефекторного пептиду послідовність, якою є ліганд CD13 (SEQ ID NO: 21). Між послідовністю TRAIL і послідовністю ефекторного пептиду протеїн містить послідовність гнучкого гліцинсеринового лінкера (SEQ ID NO: 30). Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 2, а його амінокислотна послідовність і ДНК кодуюча послідовність, що містить кодони, оптимізовані для експресії в E. coli , є, відповідно, SEQ ID NO: 8 і SEQ ID NO: 38, як показано в доданому переліку послідовностей. Амінокислотна послідовність SEQ ID NO: 8 була використана в якості шаблону для генерування його кодуючої ДНК послідовності SEQ ID NO: 38. Була генерована плазміда, яка містить кодуючу послідовність ДНК з послідовністю, що забезпечує експресію мітки HisТag і сайту, розпізнаного тромбіном, при цьому гіперекспресію злитого протеїну здійснювали відповідно до описаних вище загальних методик. Гіперекспресію проводили відповідно до загальної методики А з використанням штаму E. coli Tuner (DE3) від Novagen. Протеїн розділяли із застосуванням електрофорезу відповідно до загальної методики, описаної вище. Приклад 9. Злитий протеїн SEQ ID NO: 9 Протеїн послідовності SEQ ID NO: 9 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 192 амінокислот, і масу 22,1 кДа, в якому на N-кінці послідовності TRAIL119-281 приєднано в якості ефекторного пептиду послідовність фрагменту PDGF (SEQ ID NO: 22). Між ефекторним пептидом і послідовністю TRAIL протеїн містить послідовності сайтів розщеплення, розпізнані урокіназою uPA (SEQ ID NO: 25) і металопротеазою MMP (SEQ ID NO: 24), завдяки чому ефекторний пептид має піддаватися розщепленню у пухлинному середовищі. Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 2, а його амінокислотна послідовність і ДНК кодуюча послідовність, що містить кодони, оптимізовані для експресії в E. coli , є, відповідно, SEQ ID NO: 9 і SEQ ID NO: 39, як показано в доданому переліку послідовностей. Амінокислотна послідовність SEQ ID NO: 9 була використана в якості шаблону для генерування його кодуючої ДНК послідовності ДНК SEQ ID NO: 39. Була генерована плазміда, яка містить кодуючу послідовність ДНК у двох варіантах, один з яких забезпечує експресію мітки HisТag і сайту, розпізнаного тромбіном, а другий – без жодної мітки, при цьому гіперекспресію злитого протеїну здійснювали відповідно до описаних вище загальних методик. Гіперекспресію проводили відповідно до загальної методики А з використанням штаму E. coli Rosetta (DE3) від Novagen. Протеїни розділяли із застосуванням електрофорезу відповідно до загальної методики, описаної вище. Приклад 10. Злитий протеїн SEQ ID NO: 10 Протеїн послідовності SEQ ID NO: 10 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 216 амінокислот, і масу 24,9 кДа, в якому на N-кінці послідовності TRAIL95-281 приєднано в якості ефекторного пептиду послідовність фрагменту PDGF (SEQ ID NO: 22). Між ефекторним пептидом і доменом TRAIL протеїн містить послідовності сайтів розщеплення, розпізнані урокіназою uPA (SEQ ID NO: 25) і металопротеазою MMP (SEQ ID NO: 24), завдяки чому ефекторний пептид має піддаватися розщепленню у пухлинному середовищі. Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 2, а його амінокислотна послідовність і ДНК кодуюча послідовність, що містить кодони, оптимізовані для експресії в E. coli , є, відповідно, SEQ ID NO: 10 і SEQ ID NO: 40, як показано в доданому переліку послідовностей. Амінокислотна послідовність SEQ ID NO: 10 була використана в якості шаблону для генерування його кодуючої ДНК послідовності ДНК SEQ ID NO: 40. Була генерована плазміда, яка містить кодуючу послідовність ДНК з послідовністю, що забезпечує експресію мітки HisТag і сайту, розпізнаного тромбіном, при цьому гіперекспресію злитого протеїну здійснювали відповідно до описаних вище загальних методик. Гіперекспресію проводили відповідно до загальної методики А з використанням штамів E. coli BL21 (DE3) і Tuner(DE3)pLysS обидва - від Novagen. Протеїн розділяли із застосуванням електрофорезу відповідно до загальної методики, описаної вище. Приклад 11. Злитий протеїн SEQ ID NO: 11 Протеїн послідовності SEQ ID NO: 11 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 226 амінокислот, і масу 25,7 кДа, в якому на N-кінці послідовності TRAIL95-281 приєднано в якості ефекторного пептиду послідовність фрагменту PDGF (SEQ ID NO: 22). Між ефекторним пептидом і послідовністю TRAIL протеїн містить послідовності сайтів розщеплення, розпізнані урокіназою uPA (SEQ ID NO: 25) і металопротеазою MMP (SEQ ID NO: 24), завдяки чому ефекторний пептид має піддаватися розщепленню у пухлинному середовищі. Між 18 UA 108778 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовністю TRAIL і послідовністю сайту розщеплення, розпізнаного металопротеазою MMP протеїн також містить гнучкий гліцин-цистеїн-аланіновий лінкер (SEQ ID NO: 27). Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 2, а його амінокислотна послідовність і ДНК кодуюча послідовність, що містить кодони, оптимізовані для експресії в E. coli , є, відповідно, SEQ ID NO: 11 і SEQ ID NO: 41, як показано в доданому переліку послідовностей. Амінокислотна послідовність SEQ ID NO: 11 була використана в якості шаблону для генерування його кодуючої ДНК послідовності ДНК SEQ ID NO: 41. Була генерована плазміда, яка містить кодуючу послідовність ДНК без послідовності, що забезпечує експресію мітки HisТag і сайту, розпізнаного тромбіном, при цьому гіперекспресію злитого протеїну здійснювали відповідно до описаних вище загальних методик. Гіперекспресію проводили відповідно до загальної методики А з використанням штамів E. coli BL21 (DE3) і Tuner(DE3)pLysS обидва - від Novagen. Протеїн розділяли із застосуванням електрофорезу відповідно до загальної методики, описаної вище. Приклад 12. Злитий протеїн SEQ ID NO: 12 Протеїн послідовності SEQ ID NO: 12 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 217 амінокислот, і масу 25 кДа, в якому на N-кінці послідовності TRAIL121-281 приєднано в якості ефекторного пептиду фрагменти I і II тумстатину (SEQ ID NO: 18 і SEQ ID NO: 19). Між ефекторним пептидом і послідовністю TRAIL протеїн містить послідовності сайтів розщеплення, розпізнані урокіназою uPA (SEQ ID NO: 25) і металопротеазою MMP (SEQ ID NO: 24), завдяки чому ефекторний пептид має піддаватися розщепленню у пухлинному середовищі. Між послідовністю TRAIL і послідовністю сайту розщеплення, розпізнаного металопротеазою MMP протеїн також містить гнучкий лінкер, що складається з 3 гліцинових залишків Gly Gly Gly. Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 3, а його амінокислотна послідовність і ДНК кодуюча послідовність, що містить кодони, оптимізовані для експресії в E. coli , є, відповідно, SEQ ID NO: 12 і SEQ ID NO: 41, як показано в доданому переліку послідовностей. Амінокислотна послідовність SEQ ID NO: 12 була використана в якості шаблону для генерування його кодуючої ДНК послідовності ДНК SEQ ID NO: 42. Була генерована плазміда, яка містить кодуючу послідовність ДНК з послідовністю, що забезпечує експресію мітки HisТag і сайту, розпізнаного тромбіном, при цьому гіперекспресію злитого протеїну здійснювали відповідно до описаних вище загальних методик. Гіперекспресію проводили відповідно до загальної методики А з використанням штамів E. coli BL21 (DE3) і Tuner(DE3)pLysS обидва - від Novagen. Протеїн розділяли із застосуванням електрофорезу відповідно до загальної методики, описаної вище. Приклад 13. Злитий протеїн SEQ ID NO: 13 Злитий протеїн послідовності SEQ ID NO: 13 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 220 амінокислот, і масу 25,1 кДа, в якому на N-кінці послідовності TRAIL121-281 приєднано в якості ефекторного пептиду фрагмент II тумстатину (SEQ ID NO: 19), а на С-кінці послідовності TRAIL121-281 фрагмент I тумстатину (SEQ ID NO: 18), приєднано в якості ефекторного пептиду. Між ефекторним пептидом послідовністю TRAIL протеїн містить послідовності сайтів розщеплення, розпізнаних урокіназою uPA (SEQ ID NO: 25) і металопротеазою MMP (SEQ. No. 24), завдяки чому ефекторний пептид має бути розщепленим у середовищі пухлини. Між послідовністю сайту розщеплення, розпізнаного металопротеазою MMP, і послідовністю TRAIL протеїн містить три гліцинові залишки Gly Gly Gly, а між С-кінцем послідовності TRAIL і фрагментом II тумстатину – гнучкий лінкер, який складається з трьох гліцинових залишків Gly Gly Gly Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 3, а його амінокислотна послідовність і ДНК кодуюча послідовність, що містить кодони, оптимізовані для експресії в E. coli , є, відповідно, SEQ ID NO: 13 і SEQ ID NO: 43, як показано в доданому переліку послідовностей. Амінокислотна послідовність SEQ ID NO: 13 була використана в якості шаблону для генерування його кодуючої ДНК послідовності ДНК SEQ ID NO: 42. Була генерована плазміда, яка містить кодуючу послідовність ДНК з послідовністю, що забезпечує експресію мітки HisТag і сайту, розпізнаного тромбіном, при цьому гіперекспресію злитого протеїну здійснювали відповідно до описаних вище загальних методик. Гіперекспресію проводили відповідно до загальної методики В з використанням штаму E. coli BL21 (DE3) від Novagen і штаму BL21DE3pLysSRIL від Stratagene. Протеїн розділяли із застосуванням електрофорезу відповідно до загальної методики, описаної вище. Приклад 14. Злитий протеїн SEQ ID NO: 14 19 UA 108778 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Протеїн послідовності SEQ ID NO: 14 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 181 амінокислоти, і масу 21 кДа, в якому на N-кінці послідовності TRAIL120-281 приєднано в якості ефекторного пептиду фрагмент EGF (SEQ ID NO: 23). Між ефекторним пептидом і N-кінцем домену TRAIL протеїн містить послідовності сайтів розщеплення, розпізнаних урокіназою uPA (SEQ ID NO: 25) і металопротеазою MMP (SEQ ID NO: 56), завдяки чому ефекторний пептид має піддаватися розщепленню у пухлинному середовищі. Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 3, а його амінокислотна послідовність і ДНК кодуюча послідовність, що містить кодони, оптимізовані для експресії в E. coli , є, відповідно, SEQ ID NO: 14 і SEQ ID NO: 44, як показано в доданому переліку послідовностей. Амінокислотна послідовність SEQ ID NO: 14 була використана в якості шаблону для генерування його кодуючої ДНК послідовності ДНК SEQ ID NO: 44. Була генерована плазміда, яка містить кодуючу послідовність ДНК з послідовністю, що забезпечує експресію мітки HisТag і сайту, розпізнаного тромбіном, при цьому гіперекспресію злитого протеїну здійснювали відповідно до описаних вище загальних методик. Гіперекспресію проводили відповідно до загальної методики В з використанням штаму E. coli BL21 (DE3) від Novagen і штаму BL21DE3pLysSRIL від Stratagene. Протеїн розділяли із застосуванням електрофорезу відповідно до загальної методики, описаної вище. Приклад 15. Злитий протеїн SEQ ID NO: 15 Протеїн послідовності SEQ ID NO: 15 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 217 амінокислот, і масу 24,4 кДа, в якому на N-кінці послідовності hTRAIL 95-281 приєднано в якості ефекторного пептиду фрагмент EGF (SEQ ID NO: 23). Між ефекторним пептидом і N-кінцем домену TRAIL протеїн містить послідовності сайтів розщеплення, розпізнаних урокіназою uPA (SEQ ID NO: 25) і металопротеазою MMP (SEQ ID NO: 56), завдяки чому ефекторний пептид має піддаватися розщепленню у пухлинному середовищі. Між послідовністю сайту розщеплення, розпізнаного металопротеазою MMP, і послідовністю TRAIL протеїн містить одиночний залишок проліну, за яким слідує гнучкий гліцин-цистеїн-аланіновий лінкер (SEQ ID NO: 26). Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 3, а його амінокислотна послідовність і ДНК кодуюча послідовність, що містить кодони, оптимізовані для експресії в E. coli , є, відповідно, SEQ ID NO: 15 і SEQ ID NO: 44, як показано в доданому переліку послідовностей. Амінокислотна послідовність SEQ ID NO: 15 була використана в якості шаблону для генерування його кодуючої ДНК послідовності ДНК SEQ ID NO: 45. Була генерована плазміда, яка містить кодуючу послідовність ДНК з послідовністю, що забезпечує експресію мітки HisТag і сайту, розпізнаного тромбіном, при цьому гіперекспресію злитого протеїну здійснювали відповідно до описаних вище загальних методик. Гіперекспресію проводили відповідно до загальної методики В з використанням штаму E. coli BL21 (DE3) від Novagen. Протеїн розділяли із застосуванням електрофорезу відповідно до загальної методики, описаної вище. Приклад 16. Злитий протеїн SEQ ID NO: 46 Злитий протеїн послідовності SEQ ID NO: 46 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 211 амінокислот, і масу 24,4 кДа, в якому на N-кінці послідовності TRAIL95-281 два зв’язані один з одним гептапептиди, похідні від VEGF (SEQ ID NO: 17), приєднані в якості ефекторних пептидів. Між ефекторними пептидами протеїн містить послідовності сайтів розщеплення, розпізнаних урокіназою uPA (SEQ ID NO: 25) і металопротеазою MMP (SEQ ID NO: 55), завдяки чому ефекторний пептид має піддаватися розщепленню у пухлинному середовищі. Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 9, а його амінокислотна послідовність і ДНК кодуюча послідовність, що містить кодони, оптимізовані для експресії в E. coli , є, відповідно, SEQ ID NO: 46 і SEQ ID NO: 50, як показано в доданому переліку послідовностей. Амінокислотна послідовність SEQ ID NO: 46 була використана в якості шаблону для генерування його кодуючої ДНК послідовності ДНК SEQ ID NO: 50. Була генерована плазміда, яка містить кодуючу послідовність ДНК з послідовністю, що забезпечує експресію мітки HisТag і сайту, розпізнаного тромбіном, при цьому гіперекспресію злитого протеїну здійснювали відповідно до описаних вище загальних методик. Гіперекспресію проводили відповідно до загальної методики В з використанням штаму E. coli BL21 (DE3) від Novagen. Протеїн розділяли із застосуванням електрофорезу відповідно до загальної методики, описаної вище. Приклад 17. Злитий протеїн SEQ ID NO: 47 20 UA 108778 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Злитий протеїн послідовності SEQ ID NO: 46 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 200 амінокислот, і масу 22,7 кДа, в якому на N-кінці послідовності TRAIL120-281 два зв’язані один з одним гептапептиди, похідні від VEGF (SEQ ID NO: 17), приєднані в якості ефекторних пептидів. Між ефекторними пептидами протеїн містить послідовності сайтів розщеплення, розпізнаних урокіназою uPA (SEQ ID NO: 25) і металопротеазою MMP (SEQ ID NO: 55), завдяки чому ефекторний пептид має піддаватися розщепленню у пухлинному середовищі. Між ефекторним протеїном і доменом TRAIL протеїн містить згодом гнучкий лінкер (SEQ ID NO: 26), який сприяє формуванню триланцюгового полімеру, і гнучкий гліцин-сериновий лінкер (SEQ ID NO: 54). Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 9, а його амінокислотна послідовність і ДНК кодуюча послідовність, що містить кодони, оптимізовані для експресії в E. coli , є, відповідно, SEQ ID NO: 47 і SEQ ID NO: 51, як показано в доданому переліку послідовностей. Амінокислотна послідовність SEQ ID NO: 47 була використана в якості шаблону для генерування його кодуючої ДНК послідовності ДНК SEQ ID NO: 51. Була генерована плазміда, яка містить кодуючу послідовність ДНК з послідовністю, що забезпечує експресію мітки HisТag і сайту, розпізнаного тромбіном, при цьому гіперекспресію злитого протеїну здійснювали відповідно до описаних вище загальних методик. Гіперекспресію проводили відповідно до загальної методики В з використанням штаму E. coli BL21 (DE3) від Novagen. Протеїн розділяли із застосуванням електрофорезу відповідно до загальної методики, описаної вище. Приклад 18. Злитий протеїн SEQ ID NO: 48 Злитий протеїн послідовності SEQ ID NO: 48 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 192 амінокислот, і масу 21,9 кДа, в якому на N-кінці послідовності TRAIL120-281 два зв’язані один з одним гептапептиди, похідні від VEGF (SEQ ID NO: 17), приєднані в якості ефекторних пептидів. Між ефекторними пептидами протеїн містить послідовність сайту розщеплення, розпізнаного урокіназою uPA (SEQ ID NO: 25), завдяки чому ефекторний пептид має піддаватися розщепленню у пухлинному середовищі. Між ефекторним протеїном і доменом TRAIL протеїн містить згодом гнучкий лінкер (SEQ ID NO: 26), який сприяє формуванню триланцюгового полімеру, і гнучкий гліцин-сериновий лінкер (SEQ ID NO: 54). Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 9, а його амінокислотна послідовність і ДНК кодуюча послідовність, що містить кодони, оптимізовані для експресії в E. coli , є, відповідно, SEQ ID NO: 48 і SEQ ID NO: 52, як показано в доданому переліку послідовностей. Амінокислотна послідовність SEQ ID NO: 48 була використана в якості шаблону для генерування його кодуючої ДНК послідовності ДНК SEQ ID NO: 52. Була генерована плазміда, яка містить кодуючу послідовність ДНК з послідовністю, що забезпечує експресію мітки HisТag і сайту, розпізнаного тромбіном, при цьому гіперекспресію злитого протеїну здійснювали відповідно до описаних вище загальних методик. Гіперекспресію проводили відповідно до загальної методики В з використанням штаму E. coli BL21 (DE3) від Novagen. Протеїн розділяли із застосуванням електрофорезу відповідно до загальної методики, описаної вище. Приклад 19. Злитий протеїн SEQ ID NO: 49 Протеїн послідовності SEQ ID NO: 49 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 206 амінокислот, і масу 23,3 кДа, в якому на N-кінці послідовності TRAIL120-281 фрагмент PDGF (SEQ ID NO: 22), приєднано в якості ефекторного пептиду. Між ефекторним пептидом і послідовністю TRAIL протеїн містить послідовності сайтів розщеплення, розпізнаних урокіназою uPA (SEQ ID NO: 25) і металопротеазою MMP (SEQ ID NO: 55), завдяки чому ефекторний пептид має піддаватися розщепленню у пухлинному середовищі. Між послідовністю TRAIL і послідовністю сайту розщеплення, розпізнаного металопротеазою ММР, протеїн містить також розташований згодом гнучкий гліцин-цистеїн-аланіновий лінкер (SEQ ID NO: 26), який сприяє формуванню триланцюгового полімеру, і гнучкий гліцин-сериновий лінкер (SEQ ID NO: 54). Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 9, а його амінокислотна послідовність і ДНК кодуюча послідовність, що містить кодони, оптимізовані для експресії в E. coli , є, відповідно, SEQ ID NO: 49 і SEQ ID NO: 53, як показано в доданому переліку послідовностей. Амінокислотна послідовність SEQ ID NO: 49 була використана в якості шаблону для генерування його кодуючої ДНК послідовності ДНК SEQ ID NO: 53. Була генерована плазміда, яка містить кодуючу послідовність ДНК без послідовності, що забезпечує експресію мітки HisТag і сайту, розпізнаного тромбіном, при цьому гіперекспресію злитого протеїну здійснювали відповідно до описаних вище загальних методик. Гіперекспресію проводили відповідно до 21 UA 108778 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 загальної методики А з використанням штамів E. coli BL21 (DE3) і Tuner(DE3)pLysS обидва від Novagen. Протеїн розділяли із застосуванням електрофорезу відповідно до загальної методики, описаної вище. Приклад 20. Дослідження протипухлинної активності злитих протеїнів Дослідження протипухлинної активності злитих протеїнів було проведено in vitro при випробуваннях на цитотоксичність на клітинних лініях пухлини та in vivo на мишах. Для порівняння були використані протеїн rhTRAIL 114-281 і плацебо. 1. Вимірювання циркулярного дихроїзму – визначення вмісту вторинних структур отриманих протеїнів Якість препаратів злитих протеїнів з точки зору їх структури було визначено методом циркулярного дихроїзму (CD) у прикладах 1, 4, 5, 9 і 14. Циркулярний дихроїзм застосовують для визначення вторинних структур і конформації протеїну. У методі CD використовують оптичну активність протеїнових структур, що проявляється через поворот площини поляризації світла і через виникнення еліптичної поляризації. Спектр CD протеїнів в області дальнього ультрафіолету (UV) надає точні дані про конформацію основного поліпептидного ланцюга. Діаліз Призначені для досліджень зразки протеїну, після приготування в буферному розчині, що складається з 50 мМ Тris-HCl, рН 8,0, 100 мМ NaCl, 10% гліцерину, 0,1 мМ ZnCl2, 80 мМ сахарози, 5 мМ DTT, pH 7,4 (або як альтернатива, 5 мМ NaH2PO4, 95 мМ Na2HPO4, 200 мМ NaCl, 5 мМ глютаміну, 0,1 мМ ZnCl2, 10% гліцерину, 80 мМ сахарози, pH 8,0 для протеїнів, підданих гіперекспресії у відповідності з методикою, описаною вище, але без мітки HisТag і очищених на SP Sepharose – з міткою * на результатах, зведених у Таблицю 5) були піддані обробці методом діалізу в пакетах для діалізу (Sigma-Aldrich) з відділенням (відрізанням) 12 кДа. Діаліз проводили з перемішуванням проти 100-кратного надлишку (V/V) буфера, в порівнянні з протеїновими препаратами, протягом декількох годин при температурі 4° C. Після завершення діалізу кожен препарат центрифугували (при 25 000 оборотів за хвилину, протягом 10 хв., при 4° C) і збирали відповідні супернатанти. Концентрацію протеїну в зразках, отриманих таким чином, визначали за методом Бредфорда. Визначення концентрації протеїну із застосуванням методу Бредфорда В дослідженнях протеїну концентрацію реагенту отримували шляхом розчинення 17,5 мг Coomassie G-250 в суміші етанолу (4,8% об’єм/об’єм), фосфорної кислоти (V) (5,95% об’єм/об’єм) і води. Для визначення концентрації протеїну 1-10 мл зразка додавали до 800 мл реагенту Бредфорда. Еталонний зразок містив реагент Бредфорда і відповідний об’єм буфера, в якому визначали розчинений протеїн. Спектральну поглинальну спроможність зчитували на спектрофотометрі Cary 300 при довжині хвилі 595 нм після принаймні 5 хвилин інкубації зразків при кімнатній температурі. Концентрацію протеїну розраховували за стандартною кривою, одержаною для BSA (бичачого сироваткового альбуміну) в діапазоні 10 концентрації 1-10 мкг / мл. Вихідні концентрації протеїну оцінювали після урахуванням розбавлення в процесі підготовки зразка для вимірювання. Вимірювання циркулярного дихроїзму Вимірювання циркулярного дихроїзму для протеїнів в діапазоні концентрацій 0,1-2,7 мг / мл було виконано на Jasco J-710 спектрополяриметрі в кварцовій кюветі з оптичним шляхом 0,2 мм або 1 мм. Вимірювання проводили в потоку азоту при 7 л / хв., що дозволило виконувати вимірювання в діапазоні довжини хвилі від 195 до 250 нм. Параметри вимірювання: спектральний дозвіл - 1 нм, половина ширини світлового пучка 1 нм, чутливість 20 мdeg (міліградусів повороту), час усереднення для однієї довжини хвилі - 8 с, швидкість сканування - 10нм/хв., усереднення 3 вимірювань. Результати були представлені як середнє значення трьох вимірювань. Спектри циркулярного дихроїзму для rhTRAIL 114-281, rhTRAIL 95-281 і протеїнів, відповідно до Прикладів 1, 4, 5, 9 і 14 представлені на фіг. 4. Визначення вмісту вторинних структур Отримані спектри були проаналізовані числовими методами в діапазоні 193-250 нм з використанням CDPro пакета програмного забезпечення. Точки, для яких напруга на фотоумножувачі перевищувала 700 V, були опущені через занадто низьке співвідношення "сигнал – шум" в даному діапазоні довжини хвилі. Отримані дані були використані для розрахунку вмісту окремих вторинних структур в досліджуваних протеїнах з використанням пакету програмного забезпечення CDPro (Таблиця 1) 22 UA 108778 C2 Таблиця 1 Вміст вторинних структур у досліджуваних протеїнах Протеїн Приклад 4 Приклад 1 Приклад 5 Приклад 9 Приклад 14 rhTRAIL* rhTRAIL 114-281 NRMSD (Exp-Cal) 0.319 0.093 0.04 0.112 0.244 0.389 α-спіраль β- лист Зміщення Розлад 3.7% 7.8% 41.3% 2.9% 0.2% 1.94% 4.9% 39.4% 8.6% 15.0% 41.0% 55.3% 50.97% 33.7% 20.7% 63.1% 2.5% 20.7% 17.1% 7.74% 23.1% 36.2% 20.5% 41.2% 35.4% 27.4% 39.35% 38.3% * Значення, отримане на базі кристалічної структури 1D4V 5 10 15 Контрольні зразки (rhTRAIL 114-281) виявляють спектр CD, характерний для протеїнів з переважним типом структур β-лист (різко окреслена еліптичність, мінімум, на довжині хвилі 220 нм). Це підтверджує розрахунок вторинних компонентів структури, який передбачає наявність незначної кількості α-спіраль елементів. Отриманий результат також узгоджується з даними про кристалічну структуру протеїну hTRAIL і є характеристичним для протеїнів, що розкриті у прикладах 4, 9 і 14, відповідно до яких бета-елементи становлять більше 40% їх складу. Що стосується всіх злитих протеїнів, спектри дихроїзму характеризуються одним мінімумом на довжині хвилі 220 нм. Невеликі молекули ефекторних пептидів прикріплені до TRAIL в злитих протеїнах, становлять незначну частину протеїну і не обов'язково створюють певну вторинну структуру; проаналізовані протеїни не повинні суттєво відрізнятися від первинного протеїну. Значні відмінності, наприклад, високий вміст альфа-структур у разі протеїну згідно з прикладом. 5, або листи (sheets), такі як ті, що спостерігалися для білків з прикладу 1 dVCTR, сталися, можливо, через обмежений діапазон спектра CD, що було піддано аналізу, особливо в області 180 - 200 нм. 2. Випробовування на клітинних лініях in vitro. Клітинні лінії 20 Таблиця 2 Адгезивні клітинні лінії Клітинна лінія Вид раку Середовище RPMI (середовище для культур Людський клітин і тканин) + 10% FBS колоректальний рак (рак (фетальна бичача сироватка) + прямої кишки) пеніцилін + стрептоміцин Людський McCoy’s (клітинна культура) + 10% HT-29 колоректальний рак (рак FBS (фетальна бичача сироватка) ATCC # CCL-2 прямої кишки) + пеніцилін + стрептоміцин RPMI (середовище для культур DU-145 клітин і тканин) + 10% FBS Людський рак простати ATCC # HTB-81 (фетальна бичача сироватка) + пеніцилін + стрептоміцин RPMI (середовище для культур PC-3 клітин і тканин) + 10% FBS Людський рак простати ATCC # CRL-1435 (фетальна бичача сироватка) + пеніцилін + стрептоміцин MEM (клітинна культура)+ 10% FBS MCF-7 Людський рак молочної (фетальна бичача сироватка) + ATCC #HTB-22 залози пеніцилін + стрептоміцин Colo 205 ATCC #CCL-222 23 Число клітин на лунку (тисячі) 5 5 3 4 4.5 UA 108778 C2 Таблиця 2 Адгезивні клітинні лінії Клітинна лінія MDA-MB-231 ATCC # HTB-26 UM-UC-3 ATCC # CLR-1749 SW780 ATCC #CRL-2169 SW620 ATCC #CCL-227 BxPC-3 ATCC #CRL-1687 NIH: OVCAR-3 ATCC #HTB-161 HepG2 ATCC # HB-8065 293 ATCC # CLR-1573 ACHN ATCC #CCL-222 CAKI 2 ATCC # HTB-47 HT144 ATCC # HTB-63 LNCaP ATCC # CRL-1740 NCI-H69 ATCC# HTB-119 Jurkat A3 ATCC#CRL-2570 MES-SA/Dx5 ATCC# CRL-1977 SK-MES-1 ATCC# HTB-58 Вид раку Середовище DMEM (клітинна культура)+ 10% Людський рак молочної FBS (фетальна бичача сироватка) залози + пеніцилін + стрептоміцин MEM (клітинна культура)+ 10% FBS Людський рак сечового (фетальна бичача сироватка) + міхура пеніцилін + стрептоміцин DMEM (клітинна культура)+ 10% Людський рак сечового FBS (фетальна бичача сироватка) міхура + пеніцилін + стрептоміцин Людський DMEM (клітинна культура)+ 10% колоректальний рак (рак FBS (фетальна бичача сироватка) прямої кишки) + пеніцилін + стрептоміцин RPMI (середовище для культур Людський клітин і тканин) + 10% FBS панкреатичний рак (рак (фетальна бичача сироватка) + підшлункової залози) пеніцилін + стрептоміцин RPMI (середовище для культур клітин і тканин) + 20% FBS Людський оваріальний (фетальна бичача сироватка) + рак (рак яєчників) 0,01мг/мл інсуліну + пеніцилін + стрептоміцин MEM (клітинна культура)+ 10% FBS Людська гепатома (фетальна бичача сироватка) + печінки пеніцилін + стрептоміцин MEM (клітинна культура)+ 10% FBS Людські ембріональні (фетальна бичача сироватка) + ниркові клітини (рак) пеніцилін + стрептоміцин MEM (клітинна культура)+ 10% FBS Людський нирковий рак (фетальна бичача сироватка) + пеніцилін + стрептоміцин McCoy’s (клітинна культура) + 10% Людський нирковий рак FBS (фетальна бичача сироватка) + пеніцилін + стрептоміцин McCoy’s (клітинна культура) + 10% Клітини меланоми FBS (фетальна бичача сироватка) людини + пеніцилін + стрептоміцин RPMI (середовище для культур клітин і тканин) + 10% FBS Людський рак простати (фетальна бичача сироватка) + пеніцилін + стрептоміцин RPMI (середовище для культур Людський клітин і тканин) + 10% FBS дрібноклітинний рак (фетальна бичача сироватка) + легені пеніцилін + стрептоміцин RPMI (середовище для культур клітин і тканин) + 10% FBS Людська лейкемія (фетальна бичача сироватка) + пеніцилін + стрептоміцин McCoy’s (клітинна культура) + 10% Рак матки FBS (фетальна бичача сироватка) + пеніцилін + стрептоміцин MEM (клітинна культура)+ 10% FBS Людський рак легені (фетальна бичача сироватка) + пеніцилін + стрептоміцин 24 Число клітин на лунку (тисячі) 4.5 3.5 3 5 4.5 7 7 4 4 3.5 7 4.5 22 10 4 4 UA 108778 C2 Таблиця 2 Адгезивні клітинні лінії Клітинна лінія Вид раку Середовище RPMI (середовище для культур клітин і тканин) + 20% FBS Людський рак легені (фетальна бичача сироватка) + пеніцилін + стрептоміцин Людський McCoy’s (клітинна культура) + 10% HCT116 колоректальний рак (рак FBS (фетальна бичача сироватка) ATCC# CCL-247 прямої кишки) + пеніцилін + стрептоміцин DMEM-F12 (1:1) + 5% кінської сироватки + 0,5мкг/мл MCF10A Епітеліальні клітини гідрокортизону + 10мкг/мл інсуліну ATCC# CRL-10317 молочної залози + 20нг/мл EGF (епідермального фактора росту) McCoy’s (клітинна культура) + 10% MES-SA Рак матки FBS (фетальна бичача сироватка) ATCC# CRL-1976 + пеніцилін + стрептоміцин Людський DMEM (клітинна культура)+ 10% PANC-1 панкреатичний рак (рак FBS (фетальна бичача сироватка) CLS# 300228 підшлункової залози) + пеніцилін + стрептоміцин A549 ATCC# CCL-185 Число клітин на лунку (тисячі) 2.5 3 4.5 3.5 5 Таблиця 3 Неадгезивні клітини: Клітинна лінія NCI-H69 ATCC# HTB-119 Людська лейкемія HL60 ATCC# CCL-240 Людська лейкемія CCRF-CEM ATCC# CCL-119 10 Людський дрібноклітинний рак легені Jurkat A3 ATCC#CRL-2570 5 Вид раку Людська лейкемія Середовище RPMI (середовище для культур клітин і тканин) + 10% FBS (фетальна бичача сироватка) + пеніцилін + стрептоміцин RPMI (середовище для культур клітин і тканин) + 10% FBS (фетальна бичача сироватка) + пеніцилін + стрептоміцин RPMI (середовище для культур клітин і тканин) + 20% FBS (фетальна бичача сироватка) + пеніцилін + стрептоміцин RPMI (середовище для культур клітин і тканин) + 10% FBS (фетальна бичача сироватка) + пеніцилін + стрептоміцин Число клітин на лунку (тисячі) 22 10 10 10 Тест на цитотоксичність МТТ МТТ є колориметричним аналізом, застосовуваним для вимірювання клітинної проліферації, життєздатності і цитотоксичності. Він полягає в розкладанні жовтої солі тетразолію МТТ (4,5диметил-2-тіазоліл) -2,5-дифенілтетразолію броміду) до нерозчинного у воді фіолетового барвника формазану за допомогою мітохондріального ферменту сукцинат-тетразолію редуктази 1. Скорочення МТТ відбувається тільки в живих клітинах. Аналіз даних полягає у визначенні IC50 концентрації протеїну (в нг / мл), при якому 50% скорочення числа клітин відбувається в обробленій популяції, у порівнянні з контрольними клітинами. Результати були досліджені з використанням програмного забезпечення GraphPad Prism 5.0. Випробування проводилися відповідно до описів з літератури (Celis, JE, (1998). Cell Biology, a Laboratory Handbook (Клітинна біологія, лабораторний довідник), second edition, Academic Press, San Diego; Yang, Y., Koh, LW, Tsai, JH., (2004); Involvеment of viral and chemical factors with oral 25 UA 108778 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 cancer in Taiwan (Дослідження впливу вірусних і хімічних факторів на злоякісні новоутворення порожнини рота в Тайвані), Jpn J Clin Oncol, 34 (4), 176-183). Середовище клітинної культури 4 5 розбавляли до певної щільності (10 - 10 клітин на 100 мкл). Потім 100 мкл належним чином розведеної клітинної суспензії поміщали в 96-лунковий планшет у трьох повторах. Підготовлені таким чином клітини інкубували протягом 24 год. при 37 °C у 5% або 10% СО2, залежно від використовуваного середовища, а далі до клітин (в 100 мкл середовища) було додано ще 100 мкл середовища, що мало різні концентрації досліджуваних протеїнів. Після інкубації клітин з досліджуваними протеїнами протягом найближчих 72 годин, що еквівалентно 3-4 разовому поділу клітин, до середовища з досліджуваним протеїном додавали 20 мл робочого розчину МТТ [5 мг / мл] і інкубували протягом 3 г од при температурі 37° С в 5% СО2. Після цього середовище з розчином МТТ видаляли, і кристали формазану розчиняли шляхом додавання 100 мкл ДМСО (DMSO). Після перемішування вимірювали спектральну поглинальну спроможність при 570 нм (референс - фільтр 690 нм). Тест на цитотоксичність EZ4U Тест EZ4U (Біомедіка) був застосований для тестування цитотоксичної активності протеїнів у неадгезивних клітинних лініях. Зазначений тест є модифікацією МТТ, в якому формазан, сформований при відновленні солі тетразолію, є водорозчинним. Дослідження життєздатності клітин проводили після безперервної 72-годинної інкубації клітин з протеїном (сім концентрацій протеїну, кожен у трьох повторах). На цій основі були визначені значення IC50 (як середня величина, виведена з показників результатів двох незалежних експериментів), застосовуючи програмне забезпечення GraphPad Prism 5. Результати досліджень цитотоксичності in vitro наведені в таблиці 4 і Таблиці 5 як значення IC50 (нг / мл), що є відповідними концентрації протеїну, при якій цитотоксичний ефект злитих протеїнів спостерігається на рівні 50% по відношенню до контрольних клітин, оброблених тільки розчинником. В Таблиці 4 показано, що протеїни, які були спочатку експресовані з міткою гістидину, який згодом був видалений, позначалися як а) у прикладі №… Протеїни, які були спочатку експресовані без мітки гістидину, позначалися як b) у прикладі №… Кожен експеримент демонструє середнє значення показників результатів, щонайменше, двох незалежних експериментів, проведених у трьох повторах. Як критерій відсутності активності протеїнових препаратів була прийнята межа IC50, відповідна 2000 нг / мл. Злиті протеїни зі значенням IC50 вище 2000 вважаються неактивними. Клітини для даного дослідження були обрані таким чином, щоб включити пухлинні клітинні лінії з природного резистентністю до протеїну TRAIL (критерій природної резистентності до TRAIL: IC50 для протеїну TRAIL> 2000), пухлинні клітинні лінії, чутливі до протеїну TRAIL і резистентні до доксорубіцинової лінії MES- SA/DX5 як ракової лінії, резистентної до звичайних протиракових лікарських засобів. Недиференційована клітинна лінія HUVEC була використана в якості здорової контрольної клітинної лінії для оцінки впливу / токсичності злитих протеїнів у середовищі неракових клітин. Отримані результати підтверджують можливість подолання резистентності клітинних ліній щодо TRAIL шляхом введення певних злитих протеїнів за винаходом в клітини з природною стійкістю до TRAIL. При введенні злитих протеїнів за винаходом в клітини, чутливі до TRAIL, в деяких випадках дійсно спостерігалося чітке і сильне потенціювання дієвості, проявляючись в зниженні значень IC50 для злитого протеїну, порівняно з IC50 тільки для TRAI. Крім того, була отримана цитотоксична активність злитого протеїну за винаходом в клітинах, резистентних до класичного протиракового лікарського засобу доксорубіцину, і в деяких випадках вона виявилася сильнішою, ніж активність тільки TRAIL. Значення IC50 вище 2000, отримані для неракових клітинних ліній, показують відсутність токсичних ефектів, пов'язаних з використанням протеїнів за даним винаходом, відносно здорових клітин, що вказує на потенціал низької системної токсичності протеїну. Визначення цитотоксичної активності вибраних протеїнових препаратів проти розширеної панелі пухлинних клітинних ліній. У таблиці 5 представлені результати цитотоксичної активності in vitro для вибраних злитих протеїнів за даним винаходом проти широкої панелі пухлинних клітин різних органів, відповідних широкому спектру найпоширеніших видів раку. В Таблиці 4 протеїни, які були спочатку експресовані з міткою гістидину, який згодом був видалений, позначалися як а) у прикладі №… Протеїни, які були спочатку експресовані без мітки гістидину, позначалися як b) у прикладі №… Отримані значення IC50 підтверджують високу цитотоксичну активність злитих протеїнів, а отже, їх потенційну корисність в лікуванні раку. 26 UA 108778 C2 Таблиця 4 Цитотоксична активність злитих протеїнів за винаходом Непереривна інкубація препаратів з клітинами протягом 72годин (тест MTT, нг/мл) MES-SA MES-SA/Dx5 HCT116 SK-MES-1 A549 MCF10A IC50 ±SD IC50 ±SD IC50 ±SD IC50 ±SD IC50 ±SD IC50 ±SD Протеїн rhTRAIL 114-281 Прикл. 9 a) Прикл. 14 a) Прикл.7 a) Прикл.1 a) Прикл. 4 a) Прикл. 5 a) Прикл. 13 a) >2000 3.96 32.2 1.44 2.40 173 31.3 12.2 2.33 >2000 3.250 0.95 3.95 9.95 3.00 2.34 131.10 1738.1 2000 1.47 632.05 26.94 81.27 13.41 >2000 2000 43.98 1420.5 451.22 2000 2000 7.96 4.79 1.03 0.72 0.78 0.08 6.822 0.743 3.69 0.699 2.83 0.15 1.05 0.06 38.66 25.23 14.27 2.48 11.34 21.98 2.48 2.03 5.80 0.64 0.43 0.54 1.93 0.12 0.15 0.34 2000 513.10 705.15 9.95 38.33 40.38 0.88 2000 131.90 >2000 13.01 83.03 21,.74 34.000 3.54 162.00 95.88 22.08 1.43 979.75 1.91 834.05 77.92 2.17 38.11 SD – стандартна погрішність Таблиця 5 Аналіз цитотоксичної активності окремих вибраних протеїнових препаратів проти розширеної панелі пухлинних клітинних ліній Клітинна лінія rhTRAIL 95-281 COLO 205 mean SD Пр. 14 a) HT 29 mean SD SW 620 mean SD MCF 7 mean SD MDA-MB-231 DU 145 mean SD mean SD 24.90 17,68 10000 10000 10000 10000 3.19 10000 1,68 10000 Пр. 14 a) Клітинна лінія rhTRAIL 95-281 93.13 33.76 30.37 3.10 8538 NCI-H460 mean SD BxPC3 mean SD 8928.0 543.0 792.70 96.66 10000 0 6 OV-CAR-3 H69AR NCI-H69 mean SD mean SD mean SD 10000 93.10 10000 2068 10000 HepG2 mean SD 5889 111.0 64.71 31.81 10000 1642.6 10000 0 CAKI 2 SK-OV-3 mean SD mean SD 8839 SW 780 UM-UC-3 293 Клітинна лінія mean SD mean SD mean SD rhTRAIL 120.00 42.43 2242 1367 10000 95-281 10000 LNCaP PC 3 mean SD mean SD 2052.0 466.0 10000 0 10000 HT 144 mean SD 1734 ACHN mean SD 218.5 10000 8.34 10000 808.2 Пр. 14 a) 186.80 76.72 79.60 18.81 6153 1130 26.16 10000 10000 2 HT 29 SW 620 MCF 7 MDA-MB-231 DU 145 Клітинна COLO 205 лінія mean SD mean SD mean SD mean SD mean SD mean SD rhTRAIL 24.90 17.68 10000 10000 10000 10000 10000 95-281 128.7 Пр. 1 a) 0.87 0.19 852.60 1.06 3650 832 329.20 23.83 0.54 64.33 22.31 0 SW 780 UM-UC-3 293 CAKI 2 SK-OV-3 OV-CAR-3 Клітинна лінія mean SD mean SD mean SD mean SD mean SD mean SD rhTRAIL 120.00 42.43 2242 1367 10000 10000 10000 93.10 8,34 95-281 a) Пр. 1 3.78 0.22 7.03 0.13 84350 3.80 230.50 61.50 2116 379 5.58 2.94 NCI-H460 BxPC3 HepG2 HT 144 ACHN JURKAT A3 Клітинна лінія mean SD mean SD mean SD mean SD mean SD mean SD rhTRAIL 5889 111.0 64.71 31.81 10000 1734 218.5 10000 10000 95-281 a) Пр. 1 7.71 0.09 2.57 0.43 633 89.73 4.47 1.11 71.19 8.92 5.09 2.40 HT 29 SW 620 MCF 7 MDA-MB-231 DU 145 Клітинна COLO 205 лінія mean SD mean SD mean SD mean SD mean SD mean SD rhTRAIL 24.90 17.68 10000 10000 10000 10000 10000 95-281 a) Пр. 5 12.24 3.65 1600 1600 684.50 17.00 345 11,17 473 63.64 SW 780 UM-UC-3 293 CAKI 2 SK-OV-3 OV-CAR-3 Клітинна лінія mean SD mean SD mean SD mean SD mean SD mean SD 27 10000 10000 143.1 190.80 10000 10000 7 JURKAT A3 HL60 CCRF-CEM mean SD mean SD mean SD 10000 10000 10000 10000 LNCaP PC 3 mean SD mean SD 2052,0 466,0 10000 0 254.00 4.24 980.60 H69AR mean SD NCI-H69 mean SD 10000 10000 1530 137 1436 HL60 CCRF-CEM mean SD mean SD 10000 10000 1339 LNCaP mean SD 1357 PC 3 mean SD 2052 466.0 10000 1600 H69AR mean SD 1056 NCI-H69 mean SD UA 108778 C2 Продовження таблиці 5 Аналіз цитотоксичної активності окремих вибраних протеїнових препаратів проти розширеної панелі пухлинних клітинних ліній rhTRAIL 120.00 42.43 95-281 a) Пр. 5 38.46 1.03 Клітинна NCI-H460 лінія mean SD rhTRAIL 5889 111.0 95-281 Пр. 5 a) Клітинна лінія rhTRAIL 95-281 Пр. 9 a) Клітинна лінія rhTRAIL 95-281 Пр. 9 a) Клітинна лінія rhTRAIL 95-281 Пр. 9 a) Клітинна лінія rhTRAIL 95-281 Пр. 7 a) Клітинна лінія rhTRAIL 95-281 Пр. 7 a) Клітинна лінія rhTRAIL 95-281 Пр. 7 a) Клітинна лінія rhTRAIL 95-281 Пр. 9 b) Клітинна лінія rhTRAIL 95-281 Пр. 6 10000 10000 93.10 134.80 9.55 1600 BxPC3 HepG2 mean SD mean SD 1303 2.10 HT 144 mean SD 1600 ACHN mean SD 79.25 27.93 1600 1600 JURKAT A3 HL60 CCRF-CEM mean SD mean SD mean SD 64.71 31.81 10000 1734 218.5 10000 389.6 57.44 1.89 2 SW 620 MCF 7 mean SD mean SD 8.34 10000 510.00 76.37 30.15 COLO 205 mean SD MDA-MB-231 DU 145 mean SD mean SD HT 29 mean SD 24.90 17.68 10000 10000 10000 10000 4,00 10000 1600 1600 LNCaP mean SD PC 3 mean SD 10000 2052 0.013 0.01 264.20 46.95 47.86 12,50 1025 190.10 1.276 0.40 SW 780 UM-UC-3 293 CAKI 2 SK-OV-3 mean SD mean SD mean SD mean SD mean SD 15.77 9.81 OV-CAR-3 mean SD 32.90 27.01 463.90 H69AR NCI-H69 mean SD mean SD 120.00 42.43 2242 1367 10000 93.10 10000 10000 1.006 0.136 0.07 181.60 44.50 24.42 NCI-H460 mean SD BxPC3 mean SD HepG2 mean SD 10000 10000 10000 118.90 28.14 93.90 1.41 1315 10000 0.10 HT 144 mean SD 2500 ACHN mean SD 10000 130.6 0.456 0.64 818.60 2500 7 JURKAT A3 HL60 CCRF-CEM mean SD mean SD mean SD 5889 111.0 64.71 31.81 10000 1734 9.78 1.31 SW 620 mean SD 0.845 1.20 MCF 7 mean SD 4.46 1.98 0.615 1.00 MDA-MB-231 DU 145 mean SD mean SD 2500 PC 3 mean SD 24.90 17.68 10000 10000 10000 10000 10000 3.04 8500 8500 8500 58.00 UM-UC-3 mean SD 293 mean SD CAKI 2 mean SD SK-OV-3 mean SD 2500 LNCaP mean SD 2052.0 10000 466.0 0 766.5 4062 1109 3250 0 OV-CAR-3 H69AR mean SD mean SD 10000 10000 93.10 8500 ACHN mean SD 15.14 2.62 JURKAT A3 mean SD 8500 8500 HL60 CCRF-CEM mean SD mean SD 10000 10000 10000 8500 8500 8500 0.32 SW 780 mean SD 0.001 HT 29 mean SD 120.00 42.43 2242 1367 10000 7.01 2.58 NCI-H460 mean SD 7.63 0.51 6767 2188 8500 BxPC3 HepG2 HT 144 mean SD mean SD mean SD 5889 111.0 64.71 31.81 10000 422.70 218.5 10000 8.34 466.0 10000 0.004 0.01 COLO 205 mean SD 7.11 1.52 A549 mean SD >1000 0 391.00 52.33 A549 mean SD >1000 0 268.2 a) Пр. 16 224.84 6 A549 Клітинна лінія mean SD rhTRAIL >1000 95-281 0 a) 2242 1367 10000 1734 10000 2.12 218.5 10000 7.94 3.19 8500 HCT116 MCF10A mean SD mean SD 92.05 40.52 MES-SA/Dx5 mean SD 8500 SK-MES-1 mean SD 7557 3454 >10000 29.15 39.35 3.44 HCT116 mean SD 12.66 1169 1000 >9000 95-281 0 Пр. 6 a) 2.15 0.79 2.35 A549 MCF10A Клітинна лінія mean SD mean SD 129.90 0.00 8.13 5 MES-SA/Dx5 SK-MES-1 mean SD mean SD 29.15 29.15 12.66 39.35 0.01 Colo 205 mean SD HepG2 mean SD >1000 24.90 17.68 0 0.003 0.062 MES-SA/Dx5 SK-MES-1 mean SD mean SD 28 111 22.76 MES-SA mean SD 12.66 NCI-H69 mean SD 10000 5889 29.15 12.66 39.35 7557 3454 >10000 8500 NCI-H460 mean SD 12.66 MCF10A mean SD 10000 3.58 0.81 MES-SA/Dx5 SK-MES-1 mean SD mean SD 29.15 HCT116 mean SD 8.34 10000 8.13 7557 3454 >10000 500 99.27 51.24 10000 HT29 mean SD 8.13 >10000 0.004 0.0068 1.41 3 BxPc3 SW 620 mean SD mean SD 69.19 18.79 64.71 31.81 >10000 0.014 PANC1 mean SD 398.80 80.89 293 UM-UC-3 mean SD mean SD NCI-H460 mean SD 5889 111 0.02