Виділене моноклональне антитіло, яке зв’язується з erbb3, та його застосування
Номер патенту: 99276
Опубліковано: 10.08.2012
Автори: Фелдхаус Майкл, Арумугам Муруганандам, Девід Баклер, Шоеберл Біргіт, Нільсен Ульрік
Формула / Реферат
1. Виділене моноклональне антитіло, або його частина, яка зв'язує антиген, що зв'язується з ErbB3, яке включає:
a) варіабельну ділянку важкого ланцюга CDR1, що включає SEQ ID NO: 7;
b) варіабельну ділянку важкого ланцюга CDR2, що включає SEQ ID NO: 8;
c) варіабельну ділянку важкого ланцюга CDR3, що включає SEQ ID NO: 9;
d) варіабельну ділянку легкого ланцюга CDR1, що включає SEQ ID NO: 10;
e) варіабельну ділянку легкого ланцюга CDR2, що включає SEQ ID NO: 11; та
f) варіабельну ділянку легкого ланцюга CDR3, що включає SEQ ID NO: 12.
2. Виділене моноклональне антитіло, або його частина, що зв'язує антиген, що зв'язується з ErbB3, яке включає варіабельну ділянку важкого ланцюга, що включає SEQ ID NO: 1, та варіабельну ділянку легкого ланцюга, що включає SEQ ID NO: 2.
3. Антитіло, або його частина, що зв’язує антиген, за будь-яким з пп. 1, 2, де антитіло, вибране з групи, що включає людське антитіло, гуманізоване антитіло, біспецифічне антитіло та химерне антитіло.
4. Антитіло, або його частина, що зв'язує антиген, за будь-яким з пп. 1-3, де антитіло або його частина, що зв'язує антиген, вибране з групи, що включає: Fab, Fab'2, ScFv, SMIP, афітіло, авімер, нанотіло та домен-специфічне антитіло.
5. Антитіло, або його частина, що зв'язує антиген, за будь-яким з пп. 1-4, де ізотип антитіла, вибраний з групи, що включає: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD та IgE антитіло.
6. Антитіло за п. 5, де антитіло є являє собою антитіло ізотипу IgG2.
7. Композиція, що включає антитіло, або його частину, що зв'язує антиген, за будь-яким з попередніх пунктів, у фармацевтично-прийнятному носії.
8. Композиція за п. 7, яка представлена у формі стерильного водного розчину чи дисперсії, придатної для ін'єкції або інфузії, або представлена у формі стерильного порошку для екстемпорального приготування стерильного ін'єкційного розчину чи дисперсії, придатних для ін'єкції або інфузії.
9. Спосіб одержання стерильного водного розчину за п. 8, у якому виконують мікрофільтрацію зі стерилізацією водного розчину, що містить антитіло, або його частину, що зв’язує антиген, у фармацевтично-прийнятному носії.
10. Виділене моноклональне антитіло, яке зв'язується з ErbB, що містить варіабельні ділянки важкого та легкого ланцюгів, де варіабельна ділянка важкого ланцюга кодована нуклеїновою кислотою, що включає SEQ ID NO: 25, та варіабельна ділянка легкого ланцюга кодована нуклеїновою кислотою, що включає SEQ ID NO: 26.
11. Трансгенний ссавець, що не є людиною, який експресує моноклональне антитіло чи його частину, що зв'язує антиген, за п. 1 або за п. 2.
12. Трансгенна рослина, що експресує моноклональне антитіло чи його частину, що зв'язує антиген, за п. 1 або за п. 2.
13. Гібридома, яка продукує антитіло чи його частину, що зв'язує антиген, за будь-яким з пп. 1-6.
14. Гібридома, яка продукує антитіло людини чи його частину, що зв'язує антиген, за п. 1 або 2, де це антитіло кодується: нуклеотидною послідовністю варіабельної ділянки важкого ланцюга, наведеною в SEQ ID NO: 25 та нуклеотидною послідовністю варіабельної ділянки легкого ланцюга, наведеною в SEQ ID NO: 26.
15. Набір, який містить одне чи більше виділених моноклональних антитіл чи їх частин, що зв'язують антиген, за будь-яким з пп. 1-6, і включає інструкції щодо їх використання в лікуванні хвороби, яка асоціюється із залежним від ErbB3 проведенням сигналів.
16. Набір, який містить одне чи більше виділених моноклональних антитіл чи їх частин, що зв'язують антиген, за будь-яким з пп. 1-6, і включає інструкції щодо їх використання в діагностиці хвороби, яка асоціюється із залежним від ErbB3 проведенням сигналів.
17. Набір за п. 15 або п. 16, де хворобою є рак.
18. Спосіб пригнічення проведення сигналів ErbB3 у суб'єкта, який включає введення цьому суб'єкту виділеного моноклонального антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, за будь-яким з пп. 1-6, у кількості, достатній для пригнічення проведення сигналів ErbB3.
19. Спосіб лікування раку у суб'єкта, який включає введення цьому суб'єкту терапевтично ефективної кількості виділеного моноклонального антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, за будь-яким з пп. 1-6, у кількості, достатній для лікування раку.
20. Спосіб за п. 18 або п. 19, де антитіло, або його частина, яка зв’язує антиген, включає: варіабельну ділянку важкого ланцюга CDR1, що включає SEQ ID NO: 7; варіабельну ділянку важкого ланцюга CDR2, що включає SEQ ID NO: 8; варіабельну ділянку важкого ланцюга CDR3, що включає SEQ ID NO: 9; варіабельну ділянку легкого ланцюга CDR1, що включає SEQ ID NO: 10; варіабельну ділянку легкого ланцюга CDR2, що включає SEQ ID NO: 11; та варіабельну ділянку легкого ланцюга CDR3, що включає SEQ ID NO: 12.
21. Спосіб за п. 18 або п.19, де антитіло, або його частина, яка зв'язує антиген включає: варіабельну ділянку важкого ланцюга, що включає SEQ ID NO: 1 та варіабельну ділянку легкого ланцюга, що включає SEQ ID NO: 2.
22. Спосіб за будь-яким з пп. 19-21, де рак вибирається з групи, що містить меланому, рак молочної залози, рак яєчника, світлоклітинну карциному, рак шлунково-кишкового тракту/ободової кишки, рак легень, світлоклітинну саркому і рак передміхурової залози.
23. Спосіб за будь-яким з пп. 18-22, де суб'єктом є людина.
24. Спосіб за будь-яким з пп. 18-23, де антитіло чи його частина, що зв'язує антиген, вводяться суб'єкту внутрішньовенно, внутрішньом'язово чи підшкірно.
25. Спосіб за будь-яким з пп. 19-24, де антитіло чи його частина, що зв'язує антиген, вводяться в комбінації з другим терапевтичним препаратом.
26. Спосіб за п. 25, де другим препаратом є друге антитіло чи його частина, що зв'язує антиген.
27. Спосіб за п. 25, де другим препаратом є протираковий препарат.
28. Спосіб за п. 27, де протираковий препарат вибираютьз групи, що містить антитіло, невелику молекулу, антиметаболіт, алкілуючий агент, інгібітор топоізомерази, препарат, націлений на мікротрубки, інгібітор кінази, інгібітор синтезу білка, імунотерапевтичний препарат, гормон чи його аналог, аналог соматостатину, глюкокортикоїд, інгібітор ароматази, невелику молекулу, спрямовану на EGFR, і інгібітор mTOR.
29. Спосіб за п. 28, де антитіло є анти-IGF1R антитілом, анти-EGFR антитілом чи анти-cMET антитілом.
30. Спосіб за п. 28, де невелика молекула зв'язує IGF1R, EGFR або cMET.
31. Спосіб за п. 28, де невелика молекула, спрямована на EGFR, являє собою гефітиніб, лапатиніб або ерлотиніб.
32. Спосіб діагностики раку, асоційованого з ErbB3, у суб'єкта, який включає (a) контактування ex vivo клітин від цього суб'єкта з виділеним моноклональним антитілом чи його частиною, що зв'язує антиген, за будь-яким з пп. 1-6, та (b) визначення рівня зв'язування з ErbB3 на вказаних клітинах, де незвичайно великі рівні зв'язування з ErbB3 вказують на те, що суб'єкт має рак, пов'язаний з ErbB3.
33. Антитіло, яке є:
виділеним повнорозмірним моноклональним IgG антитілом,
зв'язується з ErbB3 з KD приблизно 4 нM, як визначено із застосуванням аналізу поверхневого плазмонного резонансу або аналізу зв'язування клітин, з використанням клітин MALME-3M, та
включає варіабельну ділянку важкого ланцюга CDR1, що включає SEQ ID NO: 7; варіабельну ділянку важкого ланцюга CDR2, що включає SEQ ID NO: 8; варіабельну ділянку важкого ланцюга CDR3, що включає SEQ ID NO: 9; варіабельну ділянку легкого ланцюга CDR1, що включає SEQ ID NO: 10; варіабельну ділянку легкого ланцюга CDR2, що включає SEQ ID NO: 11; та варіабельну ділянку легкого ланцюга CDR3, що включає SEQ ID NO: 12.
34. Антитіло, яке є:
виділеним повнорозмірним моноклональним IgG антитілом,
зв'язується з ErbB3,
знижує регуляцію ErbB3 рецептора в клітинах MALME-3M так, що при концентрації антитіла 100 нM, рівні ErbB3 на поверхні клітин знижуються принаймні на 50 %, і
включає варіабельну ділянку важкого ланцюга CDR1, що включає SEQ ID NO: 7; варіабельну ділянку важкого ланцюга CDR2, що включає SEQ ID NO: 8; варіабельну ділянку важкого ланцюга CDR3, що включає SEQ ID NO: 9; варіабельну ділянку легкого ланцюга CDR1, що включає SEQ ID NO: 10; варіабельну ділянку легкого ланцюга CDR2, що включає SEQ ID NO: 11; та варіабельну ділянку легкого ланцюга CDR3, що включає SEQ ID NO: 12.
35. Антитіло, яке є:
виділеним повнорозмірним моноклональним IgG антитілом,
зв’язується з ErbB3,
показує IC50 для бетацелюлін-опосередкованого фосфорилування ErbB3, що становить від 5,32-10 M до 1,32-9 M у клітинах ADRr, стимульованих за допомогою бетацелюліну, та
включає варіабельну ділянку важкого ланцюга CDR1, що включає SEQ ID NO: 7; варіабельну ділянку важкого ланцюга CDR2, що включає SEQ ID NO: 8; варіабельну ділянку важкого ланцюга CDR3, що включає SEQ ID NO: 9; варіабельну ділянку легкого ланцюга CDR1, що включає SEQ ID NO: 10; варіабельну ділянку легкого ланцюга CDR2, що включає SEQ ID NO: 11; та варіабельну ділянку легкого ланцюга CDR3, що включає SEQ ID NO: 12.
36. Антитіло, яке є:
виділеним повнорозмірним моноклональним IgG антитілом,
зв’язується з ErbB3,
при концентрації 63 нM, викликає зменшення у херегулін-опосередкованому фосфорилуванні AKT на приблизно 100 % в клітинах MALME-3M, та
включає варіабельну ділянку важкого ланцюга CDR1, що включає SEQ ID NO: 7; варіабельну ділянку важкого ланцюга CDR2, що включає SEQ ID NO: 8; варіабельну ділянку важкого ланцюга CDR3, що включає SEQ ID NO: 9; варіабельну ділянку легкого ланцюга CDR1, що включає SEQ ID NO: 10; варіабельну ділянку легкого ланцюга CDR2, що включає SEQ ID NO: 11; та варіабельну ділянку легкого ланцюга CDR3, що включає SEQ ID NO: 12.
Текст
Реферат: Винахід належить до виділеного моноклонального антитіла, яке зв'язує ЕrbВ3, гібридоми, що його продукує, композиції, набору, способу пригнічення проведення сигналів ЕrbВ3 у суб'єкта, способу лікування раку. UA 99276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Підродина ErbB/HER рецепторів поліпептидних факторів росту включає рецептор фактору епідермального росту (EGFR, ErbB1/HER1), новий продукт онкогену (ErbB2/HER2) та ідентифіковані пізніше рецепторні білки ErbB3/HER3 і ErbB4/HER4 (дивись, наприклад, Hynes et. al. (1994) Biochim. Biophys. Acta Rev. Cancer 1198, 165-184). Кожний з цих рецепторів прогнозовано складається з позаклітинного домену, який зв'язує ліганд, домену, який натягує мембрану, домену цитозольної протеїнтирозинкінази (РТК) і домену С-термінальної фосфориляції (дивись, наприклад, Kim et al., (1998) Biochem. J. 334, 189-195). Експериментами in vitro було встановлено, що активність протеїнтирозинкінази білку ErbB3 є суттєво зниженою по відношенню до активності інших представників родини ErbB/HER, і цю знижену активність було приписано, частково, наявності неконсервативних амінокислотних заміщень в прогнозованому каталітичному домені ErbB3 (дивись, наприклад, Guy et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 8132-8136; Sierke et al. (1997) Biochem. J. 322, 757-763). Однак було показано, що білок ErbB3 фосфорилюється в дуже різних клітинних контекстах. Наприклад, ErbB3 конститутивно фосфорилюється на тирозинових залишках в підгрупі клітинних ліній раку молочної залози людини, які з надлишком експресують цей білок (дивись, наприклад, Kraus et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90, 2900-2904; і Kim et al. Supra; дивись також Schaefer et al. (2006) Neoplasia 8(7):613-22 та Schaefer et al. Cancer Res (2004) 64(10):3395-405). Хоча роль ErbB3 у виникненні раку вже встановлено (дивись, наприклад, Horst et al. (2005) 115, 519-527; Xue et al. (2006) Cancer Res. 66, 1418-1426), ErbB3 залишається в основному неоціненим в якості мішені для клінічного втручання. Сучасні способи імунотерапії фокусуються головним чином на пригніченні дії ErbB2 і, зокрема, гетеродимеризації комплексів ErbB2/ErbB3 (дивись, наприклад, Sliwkowski et al. (1994) J. Biol. Chem. 269(20):14661-14665 (1994)). Відповідно, метою даного винаходу є вдосконалення імунотерапії в частині ефективного пригнічення сигнального шляху ErbB3, і він може бути використаний для лікування і діагностики різних видів раку. Даний винахід стосується нового класу моноклональних антитіл, які зв'язуються з рецептором ErbB3 і пригнічують різні функції ErbB3. Наприклад, описані тут антитіла здатні зв'язуватись з ErbB3 і пригнічувати фосфориляцію рецептору, опосередковану лігандом, подібним до епідермального фактору росту (EGF). Як тут описується, EGF-подібні ліганди включають EGF, TGF-α, бетацелулін, епідермальний фактор росту, що зв'язує гепарин, бірегулін і амфірегулін, які зв'язуються з EGFR і індукують димеризацію EGFR під дією ErbB3. Ця димеризація, в свою чергу, викликає фосфориляцію ErbB3 і активує проведення сигналів через цей рецептор. Отже, моноклональні антитіла за цим винаходом можуть бути використані для лікування і діагностики різних видів раку, що асоціюються з опосередкованим ErbB3 клітинним проведенням сигналів. Відповідно, в одному з варіантів здійснення, даний винахід стосується моноклональних антитіл (та їх частин, що зв'язують антиген), які зв'язуються з ErbB3 і пригнічують опосередковану EGF-подібним лігандом фосфориляцію ErbB3. В іншому варіанті здійснення ці антитіла додатково характеризуються однією чи більше з наступних властивостей: (i) здатністю пригнічувати опосередковане лігандом ErbB3 проведення сигналів, включаючи проведення сигналів, опосередковане зв'язуванням лігандів ErbB3, таких як херегулін, епірегулін, епігон і BIR, з ErbB3; (ii) здатністю пригнічувати проліферацію клітин, що експресують ErbB3; (iii) здатністю знижувати рівні ErbB3 на поверхнях клітин (наприклад, викликаючи інтерналізацію ErbB3); (iv) пригнічення секреції VEGF клітин, що експресують ErbB3; (v) здатністю пригнічувати міграцію клітин, що експресують ErbB3; (vi) здатністю пригнічувати сфероїдальний ріст клітин, що експресують ErbB3; та/або (vii) здатністю зв'язуватись з епітопом, що розміщується на домені І (залишки 20-209) ErbB3, наприклад епітопом, який включає чи перекриває залишки 20-202 амінокислотної послідовності ErbB3. Певні моноклональні антитіла і їх частини, що зв'язують антиген, за цим винаходом демонструють KD 50 нМ чи менше при визначенні за допомогою проби з використанням поверхневого плазмонного резонансу чи проби на зв'язування клітин. В інших варіантах здійснення конкретні моноклональні антитіла і їх частини, що зв'язують антиген, за цим винаходом включають варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 80 % (наприклад, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % чи 99 %) тотожна амінокислотній послідовності варіабельної ділянки важкого ланцюга, наведеній в SEQ ID №:1, SEQ ID №:3, SEQ ID №:5, SEQ ID №:35 чи SEQ ID №: 37. Інші конкретні моноклональні антитіла і їх частини, що зв'язують антиген, за цим винаходом включають варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 80 % (наприклад, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % чи 99 %) тотожна амінокислотній послідовності варіабельної ділянки легкого ланцюга, наведеній в SEQ ID №:2, 1 UA 99276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 SEQ ID №:4, SEQ ID №:6, SEQ ID №:36 чи SEQ ID №:38. Такі антитіла можуть включати також обидві вищезгадані варіабельні ділянки важкого ланцюга і легкого ланцюга. Варіабельні ділянки важкого і легкого ланцюгів таких антитіл чи їх частин, що зв'язують антиген, типово включають одну чи більше ділянку, що визначає комплементарність (CDR), яку ще називають гіперваріабельною ділянкою. Вони включають одну чи більше ділянку CDR1, CDR2 і CDR3. Відповідно, інші конкретні антитіла і їх частини, що зв'язують антиген, за цим винаходом включають одну чи більше послідовність CDR, вибрану з варіабельної ділянки CDR1 важкого ланцюга, що являє собою SEQ ID №:7; варіабельної ділянки CDR2 важкого ланцюга, що являє собою SEQ ID №:8; варіабельної ділянки CDR3 важкого ланцюга, що являє собою SEQ ID №:9; варіабельної ділянки CDR1 легкого ланцюга, що являє собою SEQ ID №:10; варіабельної ділянки CDR2 легкого ланцюга, що являє собою SEQ ID №:11; варіабельної ділянки CDR3 легкого ланцюга, що являє собою SEQ ID №:12; та їх комбінації. Ще інші конкретні антитіла і їх частини, що зв'язують антиген, за цим винаходом включають одну чи більше послідовність CDR, вибрану з варіабельної ділянки CDR1 важкого ланцюга, що являє собою SEQ ID №:13; варіабельної ділянки CDR2 важкого ланцюга, що являє собою SEQ ID №:14; варіабельної ділянки CDR3 важкого ланцюга, що являє собою SEQ ID №:15; варіабельної ділянки CDR1 легкого ланцюга, що являє собою SEQ ID №:16; варіабельної ділянки CDR2 легкого ланцюга, що являє собою SEQ ID №:17; варіабельної ділянки CDR3 легкого ланцюга, що являє собою SEQ ID №:18; та їх комбінації. Ще інші конкретні антитіла і їх частини, що зв'язують антиген, за цим винаходом включають одну чи більше послідовність CDR, вибрану з варіабельної ділянки CDR1 важкого ланцюга, що являє собою SEQ ID №:19; варіабельної ділянки CDR2 важкого ланцюга, що являє собою SEQ ID №:20; варіабельної ділянки CDR3 важкого ланцюга, що являє собою SEQ ID №:21; варіабельної ділянки CDR1 легкого ланцюга, що являє собою SEQ ID №:22; варіабельної ділянки CDR2 легкого ланцюга, що являє собою SEQ ID №:23; варіабельної ділянки CDR3 легкого ланцюга, що являє собою SEQ ID №:24; та їх комбінації. Ще інші конкретні антитіла і їх частини, що зв'язують антиген, за цим винаходом включають одну чи більше послідовність CDR, вибрану з варіабельної ділянки CDR1 важкого ланцюга, що являє собою SEQ ID №:39; варіабельної ділянки CDR2 важкого ланцюга, що являє собою SEQ ID №:40; варіабельної ділянки CDR3 важкого ланцюга, що являє собою SEQ ID №:41; варіабельної ділянки CDR1 легкого ланцюга, що являє собою SEQ ID №:42; варіабельної ділянки CDR2 легкого ланцюга, що являє собою SEQ ID №:43; варіабельної ділянки CDR3 легкого ланцюга, що являє собою SEQ ID №:44; та їх комбінації. Ще інші конкретні антитіла і їх частини, що зв'язують антиген, за цим винаходом включають одну чи більше послідовність CDR, вибрану з варіабельної ділянки CDR1 важкого ланцюга, що являє собою SEQ ID №:45; варіабельної ділянки CDR2 важкого ланцюга, що являє собою SEQ ID №:46; варіабельної ділянки CDR3 важкого ланцюга, що являє собою SEQ ID №:47; варіабельної ділянки CDR1 легкого ланцюга, що являє собою SEQ ID №:48; варіабельної ділянки CDR2 легкого ланцюга, що являє собою SEQ ID №:49; варіабельної ділянки CDR3 легкого ланцюга, що являє собою SEQ ID №:50; та їх комбінації. Антитіла і їх частини, що зв'язують антиген, можуть включати також одну чи більше ділянок CDR, які є щонайменше на 80 % (наприклад, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % чи 99 %) тотожними вищезгаданим CDR чи комбінаціям CDR. В одному варіанті здійснення даного винаходу антитіла і частини антитіл є повністю людськими (тобто, містять CDR і каркасні послідовності людини). Конкретні людські антитіла за цим винаходом включають ті, що мають варіабельну ділянку важкого ланцюга з гену зародкової лінії VH3 людини та/або варіабельну ділянку легкого ланцюга з гену зародкової лінії VH2 людини. Даний винахід охоплює також моноклональні антитіла і їх частини, що зв'язуються з тими самими чи епітопами чи епітопами, що перекриваються, зв'язаними будь-якими іншими антитілами чи їх частинами, описаними тут (наприклад, епітопом, розміщеним на домені І ErbB3, таким як епітоп, що включає чи перекриває залишки 20-202 амінокислотної послідовності ErbB3). Антитіла, які мають таку саму активність, що й антитіла, описані тут, наприклад антитіла з такою самою послідовністю, що й Ab №6, також охоплюються даним винаходом. Антитіла за даним винаходом включають всі відомі форми антитіл та інших білкових каркасів з властивостями, подібними до антитіл. Наприклад, таке антитіло може бути антитілом людини, гуманізованим антитілом, біспецифічним антитілом, химерним антитілом чи білковим каркасом з властивостями, подібними до антитіл, таким як фібронектин чи анкиринові повтори. Антитіло може бути також Fab, Fab’2, ScFv, SMIP, афітілом, нанотілом чи домен-специфічним 2 UA 99276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антитілом. Антитіло може мати також будь-який з наступних ізотопів: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD і IgE. В ще іншому варіанті здійснення даний винахід стосується також композицій, що містять комбінації антитіл чи їх частин, що зв'язують антиген, описаних тут, скомпоновані з прийнятним носієм та/або ад'ювантом. В одному конкретному варіанті здійснення така композиція містить два чи більше антитіла, які зв'язують різні епітопи на ErbB3, або антитіла, описані тут, комбінуються з протираковими антитілами, які не зв'язують ErbB3. В ще іншому варіанті здійснення даний винахід стосується виділених нуклеїнових кислот, які кодують описані тут антитіла і їх частини, що зв'язують антиген. В конкретних варіантах здійснення така нуклеїнова кислота кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга, що являє собою нуклеотидну послідовність, яка щонайменше на 80 % (наприклад, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % чи 99 %) є тотожною з SEQ ID №:25, SEQ ID №:27, SEQ ID №:29, SEQ ID №:35 чи SEQ ID №:37 або яка гібридизується з ними за дуже строгих умов; або варіабельну ділянку легкого ланцюга, що являє собою нуклеотидну послідовність, яка щонайменше на 80 % (наприклад, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % чи 99 %) є тотожною з SEQ ID №:26, SEQ ID №:28, SEQ ID №:30, SEQ ID №:36 чи SEQ ID №:38 або яка гібридизується з ними за дуже строгих умов; або комбінації таких варіабельних ділянок важкого і легкого ланцюгів. Даний винахід стосується також трансгенних ссавців, що не є людиною, гібридом і трансгенних рослин, які експресують та/або продукують описані тут антитіла і їх частини, що зв'язують антиген. Даний винахід стосується також набору, який включає одне чи більше виділене моноклональне антитіло чи його частини, що зв'язують антиген, описані тут, і, факультативно, інструкції щодо їх використання в лікуванні чи діагностуванні хвороби, пов'язаної із залежним від ErbB3 проведенням сигналів, такої як рак. Антитіла і їх частини, що зв'язують антиген, за цим винаходом можуть знайти використання для широкого кола терапевтичних і діагностичних застосувань, зокрема в онкології. Відповідно, в своєму іншому аспекті, даний винахід стосується способу пригнічення опосередкованої EGFподібним лігандом фосфориляції ErbB3 у суб'єкта шляхом введення йому одного чи більше антитіла чи його частин, що зв'язують антиген, описаних тут, у кількості, достатній для пригнічення опосередкованої EGF-подібним лігандом фосфориляції ErbB3. Даний винахід стосується також способів лікування різних видів раку у суб'єкта, включаючи, але не обмежуючись ними, меланому, рак молочної залози, рак яєчника, карциному нирок, рак шлунково-кишкового тракту чи ободової кишки, рак легень, світлоклітинну саркома і рак передміхурової залози, шляхом введення йому одного чи більше антитіла чи його частин, що зв'язують антиген, описаних тут, у кількості, достатній для лікування раку. Антитіла чи їх частини, що зв'язують антиген, можуть вводитись окремо або в комбінації з іншими терапевтичними препаратами, такими як протиракові препарати, наприклад з іншими антитілами, хіміотерапевтичними препаратами та/або опроміненням. В ще інших варіантах здійснення даний винахід стосується способів для діагностування і прогнозування виходу хвороб (наприклад, раку), пов'язаних з ErbB3. В одному варіанті це досягається шляхом контактування антитіл чи їх частин, що зв'язують антиген, за цим винаходом (наприклад, ex vivo чи in vivo) з клітинами від суб'єкта і визначення рівня їх зв'язування з ErbB3 на цих клітинах. Аномально високий рівень зв'язування з ErbB3 буде свідчити про те, що у даного суб'єкта є рак, асоційований з ErbB3. Інші характерні особливості і переваги даного винаходу стануть очевидними з наступного докладного опису, а також з формули винаходу. Короткий опис пояснювальних малюнків На Фіг. 1А і 1В представлені діаграми в вигляді стовпчиків, які показують зв'язування різних кандидатів на анти-ErbB3 антитіло (Fabs, які тут позначені як Ab) з ErbB3, експресованим на клітинах меланоми MALME-3M, з використанням вторинного антитіла козла проти людини Alexa 647. На Фіг. 2А-2D представлені графіки, які показують величини KD різних кандидатів на антиErbB3 антитіло. На Фіг. 2А-2В представлені графіки, які показують величини KD антитіла №6 (тут позначається як Ab №6) і антитіла №3 (тут позначається як Ab №3), відповідно, визначені за допомогою методики поверхневого плазмонного резонансу. На Фіг. 2А-2D представлені графіки, які показують величини KD Ab №6 і Ab №3, відповідно, визначені за допомогою проби на зв'язування з використанням клітин меланоми MALME-3M. На Фіг. 3 представлено графік специфічності зв'язування анти-ErbB3 антитіла (Ab №6), яка оцінювалась за допомогою ELISA (імуноферментного твердофазного аналізу). EGFR, BSA і TGF-α слугували у якості контролю. 3 UA 99276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 На Фіг. 4 графічно представлено здатність анти-ErbB3 антитіла (Ab №6) знижувати загальний рівень ErbB3 в клітинах меланоми MALME-3M in vitro, яка оцінювалась за допомогою ELISA (імуноферментного твердофазного аналізу). На Фіг. 5А і 5В графічно представлено здатність анти-ErbB3 антитіла (Ab №6) регулювати на пониження рецептори ErbB3 на клітинах MALME-3M, яка оцінювалась за допомогою FACSаналізу (аналізу збудженої флуоресценції сортованих клітин). Фіг. 5А показує результати, отримані при використанні IgG1 ізотипу цього антитіла. Фіг. 5В показує результати, отримані при використанні IgG2 ізотипу цього антитіла. На Фіг. 6А-6D представлені графіки, які показують залежність від часу опосередкованої антитілом регуляції ErbB3 на пониження (Ab №6), яка оцінювалась за допомогою FACS-аналізу (аналізу збудженої флуоресценції сортованих клітин). На Фіг. 7 представлена діаграма у вигляді стовпчиків, яка показує здатність різних антиErbB3 антитіл регулювати ErbB3 на пониження в клітинах меланоми in vivo. На Фіг. 8 представлена діаграма у вигляді стовпчиків, яка показує здатність анти-ErbB3 антитіла (Ab №6) регулювати ErbB3 на пониження в ксенотрансплантатах ADRr in vivo. На Фіг. 9 графічно представлена здатність анти-ErbB3 антитіла (Ab №6) пригнічувати проліферацію клітин MALME-3M в пробі на титроване світіння клітин. На Фіг. 10 графічно представлена здатність анти-ErbB3 антитіла (Ab №6) пригнічувати проліферацію клітин в клітинній лінії яєчника, ADRr. На Фіг. 11 графічно представлена здатність анти-ErbB3 антитіла (Ab №6) пригнічувати проліферацію клітин ACHN. На Фіг. 12 представлена діаграма у вигляді стовпчиків, яка показує здатність анти-ErbB3 антитіла (Ab №6) пригнічувати фосфориляцію ErbB3 в ксенотрансплантатах ADRr in vivo. На Фіг 13А-13С графічно представлена здатність анти-ErbB3 антитіла (Ab №6) пригнічувати опосередковану бетацелуліном і херегуліном фосфориляцію ErbB3 в клітинах ADRr. На Фіг 14А-14В графічно представлена здатність анти-ErbB3 антитіла (IgG2 ізотип Ab №6) пригнічувати фосфориляцію ErbB3 в клітинних лініях пухлини яєчнику OVCAR 5 і OVCAR 8. На Фіг 15А-15С графічно представлена здатність бетацелуліну (ВТС) зв'язувати ErbB1, продемонстровану відсутністю зв'язування з негативними щодо ErbB1 клітинами MALME-3M (Фіг. 17А); зв'язуванням з позитивними щодо ErbB1 клітинами ADRr при концентраціях 10 нМ (Фіг. 17В) і 200 нМ (Фіг. 17В), відповідно, і пригніченням такого зв'язування препаратом Erbitux. На Фіг 16А-16В графічно представлена здатність анти-ErbB3 антитіла (IgG2 ізотип Ab №6) пригнічувати опосередковане херегуліном проведення сигналів у клітинах MALME-3M. Фіг 16А показує здатність Ab №6 пригнічувати опосередковану херегуліном фосфориляцію ErbB3 в клітинах MALME-3M, а Фіг. 16В – здатність Ab №6 пригнічувати фосфориляцію АКТ в клітинах MALME-3M. На Фіг. 17А-17D графічно представлена здатність анти-ErbB3 антитіла (Ab №6) пригнічувати ріст пухлин (А) яєчнику (клітини ADRr), (В) передміхурової залози (клітини Du145), (С) яєчнику (клітини OvCAR8) і (D) підшлункової залози (клітини Colo357), яка оцінювалась за допомогою дослідження ксенотрансплантатів. На Фіг. 18А і 18В графічно представлена здатність анти-ErbB3 антитіла (Ab №6) (Фіг. 18А) і Fab як Ab №3 (Фіг. 18B) пригнічувати зв'язування херегуліну з ErbB3 на клітинах MALME-3M, яка оцінювалась за допомогою FACS-аналізу (аналізу збудженої флуоресценції сортованих клітин). На Фіг. 19А і 19В графічно представлена здатність Ab №6 пригнічувати зв'язування епірегуліну з ErbB3 на клітинах ADRr. Фіг. 19А показує зв'язування епірегуліну з клітинами ADRr, а Фіг. 19В – здатність Erbitux і Ab №6 пригнічувати зв'язування епірегуліну з клітинами ADRr. На Фіг. 20А і 20В графічно представлена здатність епідермального фактору росту, що зв'язує гепарин (HB-EGF), зв'язувати ErbB на клітинах ADRr (Фіг. 20А) і нездатність анти-ErbB3 антитіла (Ab №6) пригнічувати таке зв'язування (Фіг. 20В). Фіг. 21А-21С показують амінокислотні послідовності варіабельних ділянок важкого і легкого ланцюгів антитіл: Ab №6, Ab №3, Ab №14, Ab №17 і Ab №19. Фіг. 22А-22В показують нуклеотидні послідовності варіабельних ділянок важкого і легкого ланцюгів антитіл: Ab №6, Ab №3 і Ab №14. Фіг. 23 показує амінокислотні послідовності варіабельних ділянок важкого і легкого ланцюгів антитіл: Ab №6, Ab №17 і Ab №19, які було повернуто до відповідної зародкової амінокислотної послідовності. Зміни амінокислотних залишків підкреслені. На Фіг. 24А і 24С графічно представлена здатність Ab №6 пригнічувати секрецію VEGF клітин пухлини. На Фіг. 25 графічно показано вплив Ab №6 на міграцію клітин. 4 UA 99276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 На Фіг. 26А-26С графічно показано (А) пригнічення сфероїдального росту в клітинах AdrR, (В) пригнічення індукованого HRG сфероїдального росту в клітинах AdrR і (С) пригнічення індукованого HRG сфероїдального росту в клітинах Du145. На Фіг. 27А і 27В графічно показано вплив Ab №6 на зв'язування (А) HRG і (В) BTC з клітинами AdrR. На Фіг. 28 графічно показано вплив Ab №6 на індуковану HGF фосфориляцію ErbB3. На Фіг. 29А і 29В показано вплив Ab №6 на фосфориляцію (А) pErbB1 і pErbB3 і (В) індуковане HRG утворення комплексу ErbB2/3. На Фіг. 30 графічно показано, що Ab №6 зв'язує амінокислотні залишки 20-202 ErbB3. Докладний опис винаходу Для того, щоб полегшити сприйняття даного винаходу, спочатку будуть визначені основні терміни. І. Дефініції Терміни "ErbB3", "HER3", "рецептор ErbB3" і "рецептор HER3", які використовуються тут взаємозамінно, стосуються білку ErbB3 людини, як його описано в патенті США №5,480,968 і в статті Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:4905-4909 (1990); дивись також Kani et al., Biochemistry 44:15842-857 (2005), Cho & Leahy, Science 297:1330-1333 (2002)). Термін "EGF-подібний ліганд", як він тут використовується, стосується лігандів рецептору епідермального фактору росту (EGFR), включаючи епідермальний фактор росту (EGF) і близько споріднені з ним білки, такі як трансформуючий фактор росту-α (TGF-α), бетацелулін (ВТС), епідермальний фактор росту, що зв'язує гепарин (HB-EGF), бірегулін (BIR) і амфірегулін (AR), які зв'язуються з EGFR на поверхні клітин і стимулюють активність власної протеїнтирозинкінази цього рецептору. Більш конкретно, EGF-подібні ліганди індукують утворення EGFR (який позначають також як ErbB1) і комплексу білків ErbB3 (дивись також Kim et al., (1998) Biochem J., 334:189-195), що має своїм результатом фосфориляцію тирозинових залишків в цьому комплексі. Антитіла і їх частини, що зв'язують антиген, за цим винаходом пригнічують опосередковану EGF-подібним лігандом фосфориляцію ErbB3 і, в певних варіантах здійснення, демонструють одну чи більше з наступних додаткових властивостей: (i) здатність пригнічувати опосередковане одним чи більше з херегуліну, епірегуліну, епігену і бірегуліну (BIR) проведення сигналів через ErbB3; (ii) здатність пригнічувати проліферацію клітин, що експресують ErbB3; (iii) здатність знижувати рівень ErbB3 на поверхні клітин; (iv) здатність пригнічувати секрецію VEGF клітин, що експресують ErbB3; (v) здатність пригнічувати міграцію клітин, що експресують ErbB3; (vi) здатність пригнічувати сфероїдальний ріст клітин, що експресують ErbB3; та/або (vii) здатність зв'язуватись з епітопом, який міститься на домені І ErbB3, наприклад з епітопом, що включає чи перекриває залишки 20-202 амінокислотної послідовності ErbB3. Термін "пригнічення", як він тут використовується, стосується будь-якого статистично достовірного зниження біологічної активності, включаючи повне блокування такої активності. Наприклад, "пригнічення" може стосуватись зниження біологічної активності приблизно на 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % чи 100 %. Відповідно, фраза "пригнічення опосередкованої EGF-подібним лігандом фосфориляції ErbB3", як вона тут використовується, стосується здатності антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, статистично достовірно зменшувати фосфориляцію ErbB3, індуковану EGF-подібним лігандом, по відношенню до фосфориляції в необробленій (контрольній) клітині. Клітиною, яка експресує ErbB3, може бути клітина чи клітинна лінія, що зустрічається природно, або вона може бути рекомбінантно створеною шляхом введення нуклеїнової кислоти, кодуючої ErbB3, в клітину-хазяїна. В одному варіанті здійснення даного винаходу антитіло чи його частини, що зв'язує антиген, пригнічує опосередковану EGF-подібним лігандом фосфориляцію ErbB3 щонайменше на 10 %, або щонайменше на 20 %, або щонайменше на 30 %, або щонайменше на 40 %, або щонайменше на 50 %, або щонайменше на 60 %, або щонайменше на 70 %, або щонайменше на 80 %, або щонайменше на 90 %, або 100 %, що визначається, наприклад, за допомогою вестерн блотингу з наступним використанням антифосфотирозинового антитіла, як описано в публікації Kim et al., (1998) Biochem J., 334:189-195 і в подальших Прикладах. Фраза "пригнічення опосередкованого херегуліном, епірегуліном, епігеном чи бірегуліном проведення сигналів через ErbB3", як вона тут використовується, стосується здатності антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, статистично достовірно зменшувати проведення сигналів, опосередковане лігандом ErbB3 (наприклад, херегуліном, епірегуліном, епігеном і бірегуліном), через ErbB3 по відношенню до проведення сигналів за відсутності такого антитіла (контроль). ErbB3-ліганди тут також позначаються як "херегулін-подібні ліганди". Це означає, що в присутності антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, за цим винаходом сигнал, 5 UA 99276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 опосередкований в клітині, що експресує ErbB3, одним чи більше з херегуліну, епірегуліну, епігену і бірегуліну, є статистично достовірно зниженим по відношенню до контролю (за відсутності антитіла). Опосередкований ErbB3-лігандом сигнал може бути оцінений шляхом визначення рівня активності субстрату ErbB3 та/або білку, який присутній в клітинному каскаді за участі ErbB3. В одному варіанті здійснення антитіло чи його частина, що зв'язує антиген, знижує рівень активності субстрату ErbB3 та/або активність білку, який присутній в клітинному каскаді за участі ErbB3, щонайменше на 10 %, або щонайменше на 20 %, або щонайменше на 30 %, або щонайменше на 40 %, або щонайменше на 50 %, або щонайменше на 60 %, або щонайменше на 70 %, або щонайменше на 80 %, або щонайменше на 90 %, або 100 % по відношенню до рівня активності за відсутності такого антитіла чи його частини, що зв'язує антиген (контроль). Таке опосередковане ErbB3-лігандом проведення сигналів може оцінюватись за допомогою методів, відомих в цій галузі, які визначають рівень активності субстрату ErbB3 (наприклад, SHC чи PI3K) або білку, який присутній в клітинному каскаді за участі ErbB3 (наприклад, АКТ), використовуючи аналіз кіназної активності щодо таких білків (дивись, наприклад, Horst et al. supra, Sudo et al. (2000) Methods Enzymol, 322:388-92; а також Morgan et al. (1990) Eur. J. Biochem., 191:761-767). В одному конкретному варіанті здійснення антитіло чи його частина, що зв'язує антиген, пригнічує опосередковане ErbB3-лігандом (наприклад, херегуліном, епірегуліном, епігеном чи бірегуліном) проведення сигналів через ErbB3 шляхом пригнічення зв'язування ErbB3-ліганду (наприклад, одного чи більше з херегуліну, епірегуліну, епігену чи бірегуліну) з ErbB3. Деякі ліганди (наприклад, бірегулін чи BIR) функціонують і як EGF-подібні ліганди (тобто зв'язуються з EGFR/ErbB1), і як ErbB3-подібні ліганди (тобто зв'язуються з ErbB3). Фраза "пригнічення зв'язування херегуліну, епірегуліну, епігену чи бірегуліну з ErbB3", як вона тут використовується, стосується здатності антитіла чи його частини, що зв'язують антиген, статистично достовірно зменшувати зв'язування ліганду ErbB3 (наприклад, одного чи більше з херегуліну, епірегуліну, епігену чи бірегуліну) з ErbB3 по відношенню до зв'язування за відсутності такого антитіла (контроль). Це означає, що в присутності антитіла чи його частини, що зв'язують антиген, кількість ErbB3-ліганду (наприклад, херегуліну, епірегуліну, епігену чи бірегуліну), яка зв'язується з ErbB3, є статистично достовірно зменшеною по відношенню до контролю (за відсутності антитіла). Кількість ліганду ErbB3, яка зв'язує ErbB3, може бути зменшеною в присутності антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, за цим винаходом щонайменше на 10 %, або щонайменше на 20 %, або щонайменше на 30 %, або щонайменше на 40 %, або щонайменше на 50 %, або щонайменше на 60 %, або щонайменше на 70 %, або щонайменше на 80 %, або щонайменше на 90 %, або 100 % по відношенню до такої кількості за відсутності антитіла чи його частини, що зв'язує антиген (контроль). Зменшення зв'язування ErbB3-ліганду може оцінюватись за допомогою відомих в цій галузі методів, які визначають рівень зв'язування міченого ErbB3-ліганду (наприклад, радіоактивно міченого херегуліну, епірегуліну, епігену чи бірегуліну) до клітин, що експресують ErbB3, в присутності чи за відсутності (контроль) антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, за цим винаходом. Фраза "пригнічення проліферації клітин, що експресують ErbB3", як вона тут використовується, стосується здатності антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, статистично достовірно зменшувати проліферацію клітини, що експресує ErbB3, по відношенню до проліферації за відсутності такого антитіла. В одному варіанті здійснення проліферація клітини, що експресує ErbB3 (наприклад, ракової клітини), може бути зменшеною щонайменше на 10 %, або щонайменше на 20 %, або щонайменше на 30 %, або щонайменше на 40 %, або щонайменше на 50 %, або щонайменше на 60 %, або щонайменше на 70 %, або щонайменше на 80 %, або щонайменше на 90 %, або 100 %, коли клітини контактують з антитілом чи його частиною, що зв'язує антиген, за цим винаходом по відношенню до проліферації за відсутності такого антитіла чи його частини, що зв'язує антиген (контроль). Проліферація клітин може оцінюватись методами, відомими в цій галузі, які визначають швидкість поділу клітин, фракцію клітин в даній популяції, яка піддається поділу, та/або швидкість втрати клітин з даної їх популяції через термінальну диференціацію чи загибель клітин (наприклад, за допомогою аналізу титрованого світіння сортованих клітин чи включення тимидину). Фраза "здатність знижувати рівень ErbB3 на поверхні клітин", як вона тут використовується, стосується здатності антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, статистично достовірно зменшувати кількість ErbB3 на поверхні клітини, яку було піддано дії антитіла, по відношенню до необробленої (контрольної) клітини. Наприклад, зниження рівня ErbB3 на поверхні клітин може бути наслідком збільшеної інтерналізації ErbB3 (чи збільшеного ендоцитозу ErbB3). В одному варіанті здійснення даного винаходу антитіло чи його частина, що зв'язує антиген, зменшує експресію ErbB3 на поверхні клітин щонайменше на 10 %, або щонайменше на 20 %, 6 UA 99276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 або щонайменше на 30 %, або щонайменше на 40 %, або щонайменше на 50 %, або щонайменше на 60 %, або щонайменше на 70 %, або щонайменше на 80 %, або щонайменше на 90 %, або 100 % та/або збільшує інтерналізацію рецептору ErbB3 щонайменше на 10 %, або щонайменше на 20 %, або щонайменше на 30 %, або щонайменше на 40 %, або щонайменше на 50 %, або щонайменше на 60 %, або щонайменше на 70 %, або щонайменше на 80 %, або щонайменше на 90 %, або 100 % по відношенню до експресії на поверхні клітин чи інтерналізації за відсутності такого антитіла чи його частини, що зв'язує антиген (контроль). Рівні ErbB3 на поверхнях клітин та/або інтерналізація рецептору ErbB3 в присутності і за відсутності антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, можуть легко оцінюватись за допомогою методів, відомих в цій галузі, таких як описані в публікації Horst et al., supra та в подальших прикладах. Фраза "пригнічення секреції VEGF клітин, що експресують ErbB3", як вона тут використовується, стосується здатності антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, статистично достовірно зменшувати секрецію VEGF клітин, що експресують ErbB3, по відношенню до секреції VEGF за відсутності такого антитіла. В одному варіанті здійснення даного винаходу секреція VEGF клітини, що експресує ErbB3 (наприклад, ракової клітини), може бути зменшеною щонайменше на 10 %, або щонайменше на 20 %, або щонайменше на 30 %, або щонайменше на 40 %, або щонайменше на 50 %, або щонайменше на 60 %, або щонайменше на 70 %, або щонайменше на 80 %, або щонайменше на 90 %, або 100 %, коли клітини контактують з антитілом чи його частиною, що зв'язує антиген, за цим винаходом по відношенню до секреції VEGF за відсутності такого антитіла чи його частини, що зв'язує антиген (контроль). Секрецію VEGF можна оцінити методами, відомими в цій галузі, такими як описані тут. Фраза "пригнічення міграції клітин, що експресують ErbB3", як вона тут використовується, стосується здатності антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, статистично достовірно зменшувати міграцію клітин, що експресують ErbB3, по відношенню до міграції за відсутності такого антитіла. В одному варіанті здійснення даного винаходу міграція клітини, що експресує ErbB3 (наприклад, ракової клітини), може бути зменшеною щонайменше на 10 %, або щонайменше на 20 %, або щонайменше на 30 %, або щонайменше на 40 %, або щонайменше на 50 %, або щонайменше на 60 %, або щонайменше на 70 %, або щонайменше на 80 %, або щонайменше на 90 %, або 100 %, коли клітини контактують з антитілом чи його частиною, що зв'язує антиген, за цим винаходом по відношенню до міграції за відсутності такого антитіла чи його частини, що зв'язує антиген (контроль). Секрецію VEGF можна оцінити методами, відомими в цій галузі, такими як описані тут. Фраза "пригнічення сфероїдального росту клітин, що експресують ErbB3", як вона тут використовується, стосується здатності антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, статистично достовірно зменшувати міграцію клітини, що експресує ErbB3, по відношенню до міграції за відсутності такого антитіла. В одному варіанті здійснення даного винаходу міграція клітини, що експресує ErbB3 (наприклад, ракової клітини), може бути зменшеною щонайменше на 10 %, або щонайменше на 20 %, або щонайменше на 30 %, або щонайменше на 40 %, або щонайменше на 50 %, або щонайменше на 60 %, або щонайменше на 70 %, або щонайменше на 80 %, або щонайменше на 90 %, або 100 %, коли клітини контактують з антитілом чи його частиною, що зв'язує антиген, за цим винаходом по відношенню до міграції за відсутності такого антитіла чи його частини, що зв'язує антиген (контроль). Секрецію VEGF можна оцінити методами, відомими в цій галузі, такими як описані тут. Терміни "антитіло" чи "імуноглобулін", які тут використовуються взаємозамінно, включають цілі антитіла і будь-який їх фрагмент (тобто, "частину, що зв'язує антиген") чи одиночні ланцюги, що зв'язують антиген. "Антитіло" включає щонайменше два важких (Н) ланцюги і два легких (L) ланцюги, що з'єднані між собою дисульфід ними зв'язками. Кожний важкий ланцюг має варіабельну ділянку важкого ланцюга (яка тут скорочено позначається як VH) і постійну ділянку важкого ланцюга. Постійна ділянка важкого ланцюга складається з трьох доменів СН1, СН2 і СН3. Кожний легкий ланцюг має варіабельну ділянку легкого ланцюга (яка тут скорочено позначається як VL) і постійну ділянку легкого ланцюга. Постійна ділянка легкого ланцюга складається з одного домену, CL. На ділянках VH і VL можуть бути далі виділені ділянки гіперваріабельності, які називаються ділянками, що визначають комплементарність (CDR). Ділянки CDR вставлені в проміжки між ділянками, що є більш законсервованими, які називають каркасними ділянками (FR). Кожна ділянка VH і VL складається з трьох ділянок CDR і чотирьох ділянок FR, які розміщуються від Nкінця білкового ланцюга до його карбоксильного кінця в наступному порядку: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Варіабельні ділянки важкого і легкого ланцюгів містять зв'язувальний домен, який взаємодіє з антигеном. Постійні ділянки антитіл можуть опосередковувати 7 UA 99276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 зв'язування імуноглобуліну з тканинами чи факторами хазяїна, включаючи різні клітини імунної системи (наприклад, ефекторні клітини) і перший компонент (Clq) класичної системи комплементу. Показові антитіла за цим винаходом включають антитіла №1, №3 і №14 та їх частини, що зв'язують антиген. Термін "частина антитіла, що зв'язує антиген" або просто "частина антитіла", як він тут використовується, стосується одного чи більше фрагментів антитіла, які зберігають здатність специфічно зв'язуватись з антигеном (наприклад, ErbB3). Було показано, що функція зв'язування антигену може виконуватись фрагментами антитіла повної довжини. Приклади зв'язувальних фрагментів, які охоплюються терміном "частина антитіла, що зв'язує антиген", включають (i) фрагмент Fab, моновалентний фрагмент, що складається з доменів VL, VH, CL і CH1; (ii) фрагмент F(ab')2, двохвалентний фрагмент, що містить два фрагменти Fab, зв'язані дисульфідним містком на шарнірній ділянці; (iii) фрагмент Fd, що складається з доменів VH і CH1; (iv) фрагмент Fv, що складається з доменів VL і VH одного плеча антитіла; (v) dAb, що включає домени VH і VL; (vi) фрагмент dAb (Ward et al. (1989) Nature 341, 544-546), який містить домен VH; (vii) dAb, який містить домен VH чи VL; і (viii) виділену ділянку, що визначає комплементарність (CDR) чи (ix) комбінацію двох чи більше виділених CDR, які факультативно можуть бути з'єднаними синтетичним лінкером. Більш того, хоча два домени фрагменту Fv, VL і VH, кодуються окремими генами, їх можна об'єднати за допомогою рекомбінантних методів синтетичним лінкером з утворенням єдиного білкового ланцюга, в якому ділянки VL і VH паруються в моновалентні молекули, відомі як Fv з єдиним ланцюгом (scFv); дивись, наприклад, Bird et al. (1988) Science 242, 423-426; і Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 58795883). Мається на увазі, що такі антитіла з єдиним ланцюгом охоплюються терміном "частина антитіла, що зв'язує антиген". Ці фрагменти антитіл отримують за допомогою звичайних методів, відомих спеціалістам в цій галузі, і їх відбирають для використання так само, як інтактні антитіла. Частини антитіл, що зв'язують антиген, можуть бути отримані за методиками, які використовують рекомбінантну ДНК, або ферментативним чи хімічним розщепленням інтактних імуноглобулінів. Термін "моноклональне антитіло", як він тут використовується, стосується антитіла, отриманого з популяції суттєво гомогенних антитіл, тобто окремі антитіла, що складають цю популяцію, є ідентичними, за виключенням можливих мутацій, які трапляються природно і які можуть бути присутніми в незначній кількості. Моноклональні антитіла є високо специфічними, будучи спрямованими проти єдиної ділянки детермінанти. Більш того, на відміну від препаратів, що містять звичайні (поліклональні) антитіла і типово включають різні антитіла, спрямовані проти різних детермінант (епітопів), кожне моноклональне антитіло є спрямованим проти єдиної детермінанти на антигені. Моноклональні антитіла можуть бути отримані за допомогою методів, відомих в цій галузі і описаних тут, таких як, наприклад, метод гібридоми, як описано Kohler et al. (1975) Nature, 256:495, метод використання трансгенної тварини, як описано, наприклад в публікації Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859), методів рекомбінантної ДНК (дивись, наприклад, патент США № 4,816,567), або за допомогою бібліотек фагових антитіл з використанням методик, описаних, наприклад, в публікаціях Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) та Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991). Моноклональні антитіла включають химерні антитіла, антитіла людини і гуманізовані антитіла і можуть зустрічатись природно або бути отриманими рекомбінантно. Термін "рекомбінантне антитіло" стосується антитіл, які отримуються, експресуються, створюються чи виділяються рекомбінантними засобами, таких як (а) антитіла, виділені з тварини (наприклад, миші), що є трансгенною чи трансхромосомною щодо імуноглобулінових генів (наприклад, імуноглобулінових генів людини), чи гібридоми, отриманої з них; (б) антитіла, виділені з клітини-хазяїна, трансформованої таким чином, щоб експресувати це антитіло, наприклад з трансфектоми; (в) антитіла, виділені з бібліотеки рекомбінантних комбінаторних антитіл (наприклад такої, що містить послідовності антитіл людини) за допомогою фагового дисплею; і (г) антитіла, які отримуються, експресуються, створюються чи виділяються будьякими іншими засобами, які включають сплайсинг послідовностей імуноглобулінових генів (наприклад, імуноглобулінових генів людини) до інших послідовностей ДНК. Такі рекомбінантні антитіла можуть мати варіабельні і постійні ділянки, що походять від зародкових імуноглобулінових послідовностей людини. Однак, в певних варіантах здійснення даного винаходу такі рекомбінантні антитіла людини можуть бути піддані мутагенезу in vitro і, відповідно, амінокислотні послідовності ділянок VH і VL таких рекомбінантних антитіл є послідовностями, які, хоча походять від зародкових послідовностей VH і VL людини і споріднені з ними, можуть не існувати природно в зародковому репертуарі антитіл людини in vivo. 8 UA 99276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Термін "химерний імуноглобулін" чи антитіло стосується імуноглобуліну чи антитіла, варіабельні ділянки яких походять від першого виду, а постійні ділянки – від другого виду. Химерні імуноглобуліни чи антитіла можуть бути створені, наприклад, методами генної інженерії з сегментів генів імуноглобуліну, що належать різним видам. Термін "антитіло людини", як він тут використовується, включає антитіла з варіабельними ділянками, в яких каркасні і CDR ділянки походять від зародкових імуноглобулінових послідовностей людини, як описали, наприклад, Kabat et al. (Дивись Kabat, et al. (1991) Sequences of proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Більш того, якщо таке антитіло містить постійну ділянку, ця постійна ділянка також походить від зародкових імуноглобулінових послідовностей людини. Антитіла людини можуть включати амінокислотні залишки, які не кодовані зародковими імуноглобуліновими послідовностями людини (наприклад, мутації, введені випадковим чи сайтспецифічним мутагенезом in vitro чи соматичною мутацією in vivo). Однак термін "антитіло людини", як він тут використовується, не включає антитіл, в яких послідовності CDR, що походять від ембріональної лінії інших видів ссавців, таких як миша, було трансплантовано на каркасні послідовності людини. Антитіло людини може мати щонайменше одну чи більше амінокислот, заміщених амінокислотним залишком, наприклад посилюючим активність амінокислотним залишком, що не є кодованим зародковою імуноглобуліновою послідовністю людини. Типово, антитіло людини може мати до двадцяти позицій, заміщених амінокислотними залишками, які не є частиною зародкової імуноглобулінової послідовності людини. В одному конкретному варіанті здійснення ці заміщення припадають на ділянки CDR, як докладно буде описано далі. Термін "гуманізований імуноглобулін" чи "гуманізоване антитіло" стосується імуноглобуліну чи антитіла, які включають щонайменше один ланцюг гуманізованого імуноглобуліну чи антитіла (тобто, щонайменше один гуманізований важкий чи легкий ланцюг). Термін "ланцюг гуманізованого імуноглобуліну" чи "ланцюг гуманізованого антитіла" (тобто, "легкий ланцюг гуманізованого імуноглобуліну" чи "важкий ланцюг гуманізованого імуноглобуліну") стосується ланцюга імуноглобуліну чи антитіла (тобто, легкого чи важкого ланцюга, відповідно), варіабельна ділянка якого включає варіабельну каркасну ділянку від імуноглобуліну чи антитілалюдини і ділянки, що визначають комплементарність (CDR), (наприклад, щонайменше CDR, краще два CDR, а ще краще три CDR) суттєво від імуноглобуліну чи антитіла не людини, і додатково включає постійні ділянки (наприклад, щонайменше одну постійну ділянку чи її частину у випадку легкого ланцюга і переважно три постійні ділянки у випадку важкого ланцюга). Термін "гуманізована варіабельна ділянка" (наприклад, "гуманізована варіабельна ділянка легкого ланцюга" чи "гуманізована варіабельна ділянка важкого ланцюга") стосується варіабельної ділянки, яка включає варіабельну каркасну ділянку суттєво від імуноглобуліну чи антитіла людини і ділянки, що визначають комплементарність (CDR) суттєво від імуноглобуліну чи антитіла не людини. "Біспецифічне" чи "біфункціональне антитіло" – це штучне гібридне антитіло, що має дві різні пари важкого/легкого ланцюгів і два різних сайти зв'язування. Біспецифічні антитіла можуть бути отримані різними методами, включаючи зрощування гібридом чи зв'язування фрагментів Fab'. Дивись, наприклад, Songsivilai & Lachmann, (1990) Clin. Exp. Immunol. 79, 315-321; Kostelny et al. (1992) J. Immunol. 148, 1547-1553. В одному конкретному варіанті здійснення біспецифічне антитіло за даним винаходом включає сайти зв'язування і для ErbB3, і для IGF1-R (тобто, для рецептору інсулін-подібного фактору росту 1). В іншому варіанті здійснення біспецифічне антитіло за цим винаходом включає сайти зв'язування для ErbB3 і C-MET. В інших варіантах здійснення біспецифічне антитіло включає сайт зв'язування для ErbB3 і сайт зв'язування для ErbB2, ERbB3, ErbB4, EGFR, Lewis Y, MUC-1, EpCAM, CA125, специфічного до передміхурової залози мембранного антигену, PDGFR-α, PDGFR-β, C-KIT чи будь-якого з рецепторів FGF. Термін "гетерологічне антитіло", як він тут використовується, визначається по відношенню до трансгенного організму, що не є людиною, чи рослини, які продукують таке антитіло. Термін "виділене антитіло", як він тут використовується, стосується антитіла, що є суттєво вільним від інших антитіл, які мають різні антигенні специфічності (наприклад, виділене антитіло, яке специфічно зв'язується з ErbB3, є суттєво вільним від антитіл, що специфічно зв'язують інші ніж ErbB3 антигени). До того ж, виділене антитіло типово є суттєво вільним від іншого клітинного матеріалу та/або хімічних сполук. В одному варіанті здійснення даного винаходу комбінація "виділених" моноклональних антитіл з різною специфічністю щодо зв'язування ErbB3 утворює добре визначену композицію. Термін "ізотип", як він тут використовується, стосується класу антитіла (наприклад, IgM чи IgGl), який кодується генами постійної ділянки важкого ланцюга. В одному варіанті здійснення 9 UA 99276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антитіло чи його частина, що зв'язує антиген, є ізотипом, вибраним з наступних ізотипів антитіла: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD чи IgE. В певних варіантах здійснення моноклональне антитіло за цим винаходом належить до ізотипу IgG2. Термін "переключення ізотипу", як він тут використовується, стосується того явища, коли клас чи ізотип антитіла змінюється з Ig одного класу на Ig інших класів. Термін "не переключений ізотип", як він тут використовується, стосується ізотипного класу важкого ланцюга, який отримується тоді, коли ніякого переключення ізотипу не відбувається; ген СН, який кодує такий не переключений ізотип, типово є першим геном СН, що розміщується безпосередньо перед функціонально реаранжованим геном VDJ. Переключення ізотипу було класифіковано як класичне чи некласичне переключення ізотипу. Класичне переключення ізотипу відбувається при явищах рекомбінації, які передбачають щонайменше одну ділянку з послідовністю переключення в гені, що кодує антитіло. Некласичне переключення ізотипу може відбуватись, наприклад, при гомологічній рекомбінації між μ людини і μ людини (δасоційована делеція). Альтернативні механізми некласичного переключення, такі як інтертрансген та/або міжхромосомна рекомбінація, серед інших, можуть траплятись і здійснювати переключення ізотипу. Термін "послідовність переключення", як він тут використовується, стосується тих послідовностей ДНК, які відповідають за рекомбінацію на етапі переключення. Послідовність "донора переключення", типово ділянка μ переключення, буде 5' (тобто, вище) конструктивної ділянки і буде стерта під час рекомбінації на етапі переключення. Ділянка "акцептора переключення" буде знаходитись між конструктивною ділянкою, яку буде стерто, і постійною ділянкою заміщення (наприклад, γ, ε і т.д.). Оскільки не існує якогось специфічного місця, де завжди відбувається рекомбінація, кінцеву послідовність гену типово не можна передбачити за конструктивною ділянкою. "Антиген" є сутністю (наприклад, білковоподібною сутністю чи пептидом), з якою зв'язується антитіло чи його частина, що зв'язує антиген. В різних варіантах здійснення даного винаходу антигеном є ErbB3 чи ErbB3-подібна молекула. В одному конкретному варіанті здійснення даного винаходу антигеном є ErbB3 людини. Термін "епітоп" чи "антигенна детермінанта" стосується місця (сайту) на антигені, з яким специфічно зв'язується імуноглобулін чи антитіло. Епітопи можуть бути утвореними із замінних амінокислот чи незамінних амінокислот, які суміщуються з третинним фолдингом (укладкою, білку. Епітопи, утворені із замінних амінокислот, типово витримують дію денатуруючих розчинників, тоді як епітопи, утворені третинною укладкою, типово втрачаються після обробки денатуруючими розчинниками. Епітоп типово включає щонайменше 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 чи 15 амінокислот в унікальній просторовій конформації. Методи визначення просторової конформації епітопів включають методи, відомі в цій галузі, і ті, що описані тут, наприклад рентгенівська кристалографія і двомірний ядерний магнітний резонанс. Дивись, наприклад, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996). Даний винахід охоплює також антитіла, які зв'язують той самий чи частково покриваючий епітоп, що й антитіла за цим винаходом, тобто антитіла, які конкурують за зв'язування з ErbB3, або зв'язують епітопи, які перекриваються з епітопами, зв'язаними описаними тут антитілами, тобто епітоп, розміщений на домені І ErbB3. Антитіла, які впізнають той самий епітоп, можуть бути ідентифіковані за допомогою рутинних методів, таких як імунологічний аналіз, наприклад з визначенням здатності одного антитіла блокувати зв'язування іншого антитіла з антигеноммішенню, тобто методом конкурентного зв'язування. Конкурентне зв'язування оцінюється за методикою, в якій імуноглобулін, що тестується, пригнічує специфічне зв'язування контрольного антитіла з поширеним антигеном, таким як ErbB3. Відомі численні різновиди методу конкурентного зв'язування, наприклад: твердофазний прямий чи непрямий радіоімунний аналіз (RIA), твердофазний прямий чи непрямий ферментативний імунологічний аналіз (EIA), метод сандвіч-конкуренції (дивись Stahli et al., (1983) Methods in Enzymology 9:242); твердофазний прямий біотин-авідиновий ферментативний імунологічний аналіз (EIA) (дивись Kirkland et al., (1986) J. Immunol. 137:3614); твердофазний прямий радіоізотопний аналіз, твердофазний прямий радіоізотопний сандвіч-аналіз (дивись Harlow & Lane, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); твердофазний прямий радіоізотопний RIA з використанням 125 мітки І (дивись Morel et al., (1988) Mol. Immunol. 25(1):7); твердофазний прямий біотинавідиновий ЕІА (Cheung et al., (1990) Virology 176:546); і прямий радіоізотопний RIA (Moldenhauer et al., (1990) Scand. J. Immunol. 32:77). Типово, такий аналіз передбачає використання очищеного антигену (наприклад, ErbB3), зв'язаного з твердою поверхнею, чи клітин, що несуть те і інше, неміченого імуноглобуліну, що тестується, і міченого контрольного імуноглобуліну. Конкурентне пригнічення оцінюється шляхом визначення кількості мітки, 10 UA 99276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зв'язаної з твердою поверхнею чи клітинами в присутності імуноглобуліну, що тестується. Звичайно, імуноглобулін, що тестується, має бути присутнім в надлишку. Звичайно, коли конкуруюче антитіло присутнє в надлишку, воно буде пригнічувати специфічне зв'язування контрольного антитіла з загальним антигеном щонайменше на 50-55 %, 55-60 %, 60-65 %, 6570 %, 70-75 % чи більше. Терміни "специфічне зв'язування", "специфічно зв'язує", "селективне зв'язування" і "селективно зв'язує", як вони тут використовуються, означають, що антитіло чи його частина, що зв'язує антиген, демонструє помітну афінність до якогось конкретного антигену чи епітопу і, загалом, не демонструє суттєвої перехресної реактивності з іншими антигенами чи епітопами. 6 7 8 "Помітне" чи переважне зв'язування включає зв'язування з афінністю щонайменше 10 , 10 , 10 , 9 -1 10 -1 7 -1 10 M чи 10 M . Краще, щоб афінність перевищувала 10 M , а ще краще, щоб вона 8 -1 перевищувала 10 M . Величини, проміжні до тих, що наведені тут, також входять в об'єм даного винаходу, і краща афінність до зв'язування може вказуватись як діапазон значень, 6 10 -1 7 10 -1 8 10 -1 наприклад від 10 до 10 M , краще від 10 до 10 M , ще краще від 10 до 10 M . Антитіло, "яке не демонструє суттєвої перехресної реактивності", це таке антитіло, яке не буде помітно зв'язуватись з небажаною сутністю (наприклад, небажаною білковоподібною сутністю). Наприклад, в одному варіанті здійснення антитіло чи його частина, що зв'язує антиген, які специфічно зв'язуються з ErbB3, будуть помітно зв'язувати цю молекулу ErbB3, але не будуть суттєво реагувати з іншими молекулами ErbB і не-ErbB білками чи пептидами. Специфічне чи селективне зв'язування може оцінюватись відомими в цій галузі засобами для визначення такого зв'язування, включаючи, наприклад, аналіз за Scatchard та/або аналізи на конкурентне зв'язування. Термін "KD", як він тут використовується, стосується константи рівноваги дисоціації конкретної взаємодії антитіло-антиген чи афінності антитіла до антигену. В одному варіанті здійснення антитіло чи його частина, що зв'язує антиген, за цим винаходом зв'язують антиген (наприклад, ErbB3) з афінністю (KD) 50 нМ чи більше (або менше) (наприклад, 40 нМ, чи 30 нМ, чи 20 нМ, чи 10 нМ, чи менше), що оцінюється за допомогою поверхневого плазмонного резонансного аналізу чи методом зв'язування клітин. В одному конкретному варіанті здійснення антитіло чи його частина, що зв'язує антиген, за цим винаходом зв'язують ErbB3 з афінністю (KD) 8 нМ чи більше (наприклад, 7 нМ, 6 нМ, 5 нМ, 4 нМ, 2 нМ, 1,5 нМ, 1,4 нМ, 1,3 нМ, 1 нМ чи менше) при визначенні за допомогою поверхневого плазмонного резонансного аналізу чи методом зв'язування клітин. В інших варіантах здійснення антитіло чи його частина, що зв'язує 7 антиген, зв'язують антиген (наприклад, ErbB3) з афінністю (KD), меншою ніж приблизно 10- M, 8 9 10 такою як 10- M, 10- M чи 10- M або навіть меншою при визначенні за методикою поверхневого плазмонного резонансу (SPR) на приладі BIACORE 3000 з використанням рекомбінантного ErbB3 в якості того, що визначається при аналізі, і антитіла в якості ліганду. Зв'язування з цим попередньо визначеним антигеном відбувається з афінністю, яка щонайменше вдвічі перевищує афінність до зв'язування з неспецифічним антигеном (наприклад, BSA, казеїном), іншим ніж цей попередньо визначений антиген чи якийсь близько споріднений антиген. Термін "Koff", як він тут використовується, стосується константи швидкості дисоціації для дисоціації антитіла з комплексу антитіло/антиген. Термін "ЕС50", як він тут використовується, стосується концентрації антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, яка викликає реакцію при аналізі in vitro чи in vivo, що становить 50 % від максимальної реакції, тобто знаходиться посередині між максимальною реакцією і вихідним рівнем. Термін "характер глікозилювання", як він тут використовується, визначається як структура вуглеводневих одиниць, ковалентно приєднаних до білку, а конкретніше до імуноглобулінового білку. Термін "такий, що трапляється природно", як він тут використовується, у застосуванні до об'єкту стосується тієї обставини, що цей об'єкт може бути знайдений у природі. Наприклад, поліпептидна чи полінуклеотидна послідовність, що присутня в організмі (у вірусах включно), яку можна виділити з якогось джерела у природі і яку не було умисно модифіковано людиною в лабораторії, є такою, що трапляється природно. Термін "реаранжована", як він тут використовується, стосується конфігурації локусу імуноглобуліну важкого ланцюга чи легкого ланцюга, в якому V сегмент розміщується безпосередньо суміжно з D-J чи J сегментом в конформації, що кодує суттєво весь домен VH чи VL, відповідно. Реаранжований локус гену імуноглобуліну може бути ідентифікований шляхом порівняння із зародковою ДНК; реаранжований локус буде мати щонайменше один рекомбінований гептамер/нонамерний гомологічний елемент. 11 UA 99276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Термін "нереаранжована" або "зародкова конфігурація", як він тут використовується по відношенню до V сегменту, стосується такої конфігурації, в якій V сегмент не є рекомбінованим таким чином, щоб бути безпосередньо суміжним з D чи J сегментом. Термін "молекула нуклеїнової кислоти", як він тут використовується, включає молекули ДНК і молекули РНК. Молекула нуклеїнової кислоти може бути одноланцюговою чи дволанцюговою, але переважно є дволанцюговою ДНК. Термін "виділена молекула нуклеїнової кислоти", як він тут використовується по відношенню до нуклеїнових кислот, що кодують антитіла чи частини антитіл (наприклад, VH, VL, CDR3), які зв'язуються з ErbB3, стосується молекули нуклеїнової кислоти, в якій нуклеотидні послідовності, що кодують антитіло чи частину антитіла, є вільними від інших нуклеотидних послідовностей, що кодують антитіла, які зв'язують антигени, інші ніж ErbB3, причому ці інші послідовності можуть природно бути розташованими з боків нуклеїнової кислоти в геномній ДНК людини. Термін "модифікація", як він тут використовується, стосується зміни однієї чи більше амінокислот в антитілах чи їх частинах, що зв'язують антиген. Така зміна може здійснюватись шляхом додавання, заміщення чи видалення якоїсь амінокислоти в одній чи більше позицій. Для цього використовуються відомі в цій галузі методи, такі як ПЛР мутагенез. Наприклад, в певних варіантах здійснення даного винаходу антитіло чи його частина, що зв'язує антиген, ідентифіковані за допомогою способів за цим винаходом, можуть бути модифіковані, щоб тим самим модифікувати афінність до зв'язування цього антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, з ErbB3. Даний винахід охоплює також "консервативні амінокислотні заміщення" в послідовностях антитіл за цим винаходом, тобто такі модифікації нуклеотидних і амінокислотних послідовностей, які не скасовують зв'язування антитіла, кодованого цією нуклеотидною послідовністю, чи такого, що містить цю амінокислотну послідовність, з антигеном, тобто з ErbB3. Консервативні амінокислотні заміщення включають заміщення амінокислоти одного класу амінокислотою того самого класу, де клас визначається загальними фізико-хімічними властивостями бокового ланцюга амінокислоти. У природі з високою частотою зустрічаються заміщення в гомологічних білках, що визначається за допомогою, наприклад, стандартної матриці частоти обміну Дайхофа чи матриці BLOSUM. Виділяють шість загальних класів бокових ланцюгів амінокислот: Клас I (Cys); Клас II (Ser, Thr, Pro, Ala, Gly); Клас III (Asn, Asp, Gln, Glu); Клас IV (His, Arg, Lys); Клас V (Ile, Leu, Val, Met); та Клас VI (Phe, Tyr, Trp). Наприклад, заміщення Asp на інший залишок класу ІІІ, такий як Asn, Gln чи Glu, є консервативним заміщенням. Отже, прогнозований залишок замінної амінокислоти в анти-ErbB3 антитілі краще заміщувати залишком іншої амінокислоти з того самого класу. Методи ідентифікації нуклеотидних і амінокислотних консервативних заміщень, які не усувають зв'язування антигену, є добре відомими спеціалістам в цій галузі (дивись, наприклад, Brummell et al., Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); а також Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:.412-417 (1997)). Термін "неконсервативне амінокислотне заміщення" стосується заміщення амінокислоти одного класу амінокислотою з іншого класу; наприклад, заміщення Ala, залишку класу ІІ, залишком з класу ІІІ, таким як Asp, Asn, Glu чи Gln. Альтернативно, в іншому варіанті здійснення, мутації (консервативні чи неконсервативні) можуть вводитись по всій кодуючій послідовності чи по частині кодуючої послідовності антиErbB3 антитіла, як при мутагенезі з насиченням, і отримані модифіковані анти-ErbB3 антитіла можуть бути відібрані за активністю зв'язування. "Консенсусна послідовність" – це послідовність, утворена з найпоширеніших амінокислот (чи нуклеотидів) в родині споріднених послідовностей (дивись, наприклад, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987). В родині білків кожну позицію в консенсусній послідовності займає амінокислота, яка найчастіше зустрічається в цій позиції в цій родині. Якщо дві амінокислоти зустрічаються з однаковою частотою, кожна з них може включатись в консенсусну послідовність. "Консенсусній каркас" імуноглобуліну стосується каркасної ділянки в консенсусній імуноглобуліновій послідовності. Так само, консенсусна послідовність для ділянок CDR може бути отримана шляхом оптимального суміщення амінокислотних послідовностей CDR антитіл ErbB3 за цим винаходом. Для нуклеїнових кислот термін "суттєва гомологія" вказує на те, що дві нуклеїнові кислоти чи їх визначені послідовності при оптимальному суміщенні і порівнянні є ідентичними, з відповідними вставками чи делеціями, по щонайменше 80 % нуклеотидів, звичайно по щонайменше 90-95 %, а краще по щонайменше 98-99,5 % нуклеотидів. Альтернативно, суттєва гомологія існує тоді, коли сегменти будуть гібридизуватись за селективних умов гібридизації до комплементу ланцюга. 12 UA 99276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Відсоток ідентичності між двома послідовностями є функцією кількості ідентичних позицій, спільних для обох послідовностей (тобто, % гомології = кількість ідентичних позицій / загальна кількість позицій х 100), з урахуванням кількості пропусків (і довжини кожного пропуску), які необхідно було ввести для оптимального суміщення двох послідовностей. Порівняння послідовностей і визначення відсотку тотожності між двома послідовностями можуть здійснюватись за допомогою математичного алгоритму, як буде описано далі в Прикладах, що не є обмежуючими. Відсоток ідентичності між двома нуклеотидними послідовностями можна визначити за допомогою програми GAP в програмному забезпеченні GCG з використанням матриці NWSgapdna CMP, вагового коефіцієнту пропуску 40, 50, 60, 70 чи 80 і вагового коефіцієнту довжини пропуску 1, 2, 3, 4, 5 чи 6. Відсоток ідентичності між двома нуклеотидними чи амінокислотними послідовностями можна визначити також за допомогою алгоритму E. Meyers та W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)), який було включено до програми ALIGN (версія 2.0), з використанням таблиці ваги залишків РАМ120, штрафу за довжину пропуску 12 і штрафу за пропуск 4. До того ж, Відсоток ідентичності між двома амінокислотними послідовностями можна визначити також за допомогою алгоритму Needleman і Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)), який було включено до програми GAP в пакеті програмного забезпечення GCG, з використанням матриці Blossum 62 чи матриці PAM250, вагового коефіцієнту пропуску 16, 14, 12, 10, 8, 6 чи 4 і вагового коефіцієнту довжини пропуску 1, 2, 3, 4, 5 чи 6. Послідовності нуклеїнових кислот і білків за цим винаходом можуть бути використані також в якості "пошукової послідовності" для здійснення пошуку в загальних базах даних з метою, наприклад, ідентифікації споріднених послідовностей. Такі пошуки можуть здійснюватись за допомогою програм NBLAST і XBLAST (версія 2.0), описаних Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Нуклеотидні пошуки BLAST можуть здійснюватись за допомогою програми NBLAST, сума балів = 100, розрядність слова = 12, щоб отримати нуклеотидні послідовності, гомологічні молекулам нуклеїнових кислот за цим винаходом. Пошуки білків BLAST можуть здійснюватись за допомогою програми ХBLAST, сума балів = 50, розрядність слова = 3, щоб отримати амінокислотні послідовності, гомологічні білковим молекулам за цим винаходом. Щоб досягти суміщень з пропусками для цілей порівняння, можна скористатись програмою Gapped BLAST, описаною Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. При використанні програм BLAST і Gapped BLAST можна застосувати стандартні значення параметрів (значення за умовчанням) для відповідних програм (наприклад, XBLAST і NBLAST). Нуклеїнові кислоти можуть бути присутніми в цілих клітинах, клітинному лізаті чи в частково очищеному або суттєво чистому вигляді. Нуклеїнова кислота є "виділеною" чи "доведеною до суттєвої чистоти", коли її очищено від інших клітинних компонентів чи інших контамінантів, наприклад інших клітинних нуклеїнових кислот чи білків, стандартними методами, включаючи обробку лугом/SDS (SDS = додецилсульфат натрію), CsCl бендинг, колонкову хроматографію, електрофорез в агарозному гелі та інші методи, добре відомі спеціалістам в цій галузі (дивись F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987). Композиції нуклеїнових кислот за цим винаходом, хоча й часто в нативній послідовності (крім модифікованих сайтів рестрикції і т.п.), з кДНК, геномної ДНК чи їх сумішей можуть бути піддані мутації за стандартними методиками для отримання генних послідовностей. В разі кодуючих послідовностей такі мутації можуть впливати на амінокислотну послідовність, як це є бажаним. Зокрема, розглядаються послідовності ДНК, суттєво гомологічні нативним постійним ділянкам V, D, J чи похідні від них, переключення та інші такі послідовності, описані тут (термін "похідна" означає, що дана послідовність є ідентичною чи модифікованою з іншої послідовності). Термін "функціонально пов'язана" стосується послідовності нуклеїнових кислот, що знаходиться у функціональному взаємозв'язку з іншою послідовністю нуклеїнових кислот. Наприклад, ДНК для передпослідовності чи секреторної лідерної послідовності є функціонально пов'язаною з ДНК для поліпептиду, якщо вона експресується як білок-попередник, який приймає участь в секреції даного поліпептиду. Промотор чи енхансер є функціонально пов'язаними з кодуючою послідовністю, якщо він має вплив на транскрипцію цієї послідовності. Сайт зв'язування рибосоми є функціонально пов'язаним з кодуючою послідовністю, якщо він позиціонований таким чином, щоб забезпечувати трансляцію. Загалом, "функціональний зв'язок" означає, що послідовності ДНК, будучи зшитими, є суміжними і, у випадку секреторної лідерної послідовності, суміжними також у фазі зчитування. Однак енхансери не мають бути суміжними. Зшивка здійснюється шляхом лігірування на звичайних сайтах рестрикції. Якщо такі 13 UA 99276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 сайти не існують, то у відповідності до звичної практики використовуються синтетичні олігонуклеотидні адаптери чи лінкери. Нуклеїнова кислота є "функціонально зв'язаною", коли її поставлено у функціональну взаємозалежність з іншою послідовністю нуклеїнових кислот. Наприклад, промотор чи енхансер є функціонально зв'язаним з кодуючою послідовністю, якщо він впливає на транскрипцію цієї послідовності. По відношенню до регуляторних послідовностей транскрипції функціональний зв'язок означає, що послідовності ДНК, будучи зшитими, є суміжними і, коли необхідно приєднати дві білкові кодуючі ділянки, суміжними також в рамці зчитування. Для послідовностей переключення функціональний зв'язок означає, що ці послідовності здатні впливати на рекомбінацію на етапі переключення. Термін "вектор", як він тут використовується, стосується молекули нуклеїнової кислоти, здатної транспортувати іншу нуклеїнову кислоту, з якою її було зшито. Одним з видів вектору є "плазміда" – кругова двонитчаста петля ДНК, в якій можуть бути зшитими додаткові сегменти ДНК. Іншим типом вектору є вірусний вектор, в якому додаткові сегменти ДНК можуть бути вшиті у вірусний геном. Певні вектори є здатними до автономної реплікації в клітині-хазяїні, в яку вони вводяться (наприклад, бактеріальні вектори, що мають бактеріальне походження реплікації, і епісомні вектори ссавців). Інші вектори (наприклад, неепісомні вектори ссавців) можуть бути інтегрованими в геном клітини-хазяїна після інтродукції в клітину-хазяїна і, тим самим, бути включеними в реплікацію разом з геномом хазяїна. Більш того, певні вектори є здатними спрямовувати експресію генів, з якими вони функціонально поєднані. Такі вектори називаються тут "рекомбінантними векторами експресії" (або просто "векторами експресії"). Загалом, вектори експресії, які знаходять застосування в технології рекомбінантних ДНК, часто мають вигляд плазмід. Терміни "плазміда" і "вектор" можуть використовуватись взаємозамінно. Однак даний винахід включає інші види векторів експресії, такі як вірусні вектори (наприклад, дефективні щодо реплікації ретровіруси, аденовіруси і адено-асоційовані віруси), які виконують еквівалентні функції. Термін "рекомбінантна клітина-хазяїн" (або просто "клітина-хазяїн"), як він тут використовується, стосується клітини, в яку було введено рекомбінантний вектор експресії. Слід розуміти, що ці терміни стосуються не тільки конкретної клітини суб'єкту, а й також потомства такої клітини. Оскільки в наступних генераціях можуть трапитись певні модифікації через мутацію чи вплив оточуючого середовища, таке потомство може, в дійсності, не бути ідентичним материнській клітині, але воно все ще включається в об'єм терміну "клітина-хазяїн", як він тут використовується. Терміни "лікувати" і "лікування", як вони тут використовуються, стосуються терапевтичних чи профілактичних заходів, описаних тут. Способи "лікування" застосовують введення суб'єкту антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, за цим винаходом, наприклад суб'єкту з хворобою чи розладом, асоційованими із залежним від ErbB3 проведенням сигналів, чи схильному до розвитку такої хвороби чи розладу, для того щоб попередити, вилікувати, відстрочити, зменшити тяжкість, пом'якшити один чи більше симптомів такої хвороби чи розладу, або зменшити частоту рецидивування хвороби чи розладу, або подовжити виживання суб'єкта зверх очікуваного за відсутності такого лікування. Термін "хвороба, що асоціюється із залежним від ErbB3 проведенням сигналів" чи "розлад, що асоціюється із залежним від ErbB3 проведенням сигналів", як він тут використовується, включає патологічні стани та/або симптоми, пов'язані з патологічним станом, коли виявляються підвищені рівні ErbB3 та/або активація клітинних каскадів з участю ErbB3. Має бути зрозумілим, що ErbB3 гетеродимеризується з іншими ErbB білками, такими як EGFR і ErbB2, коли виявляються підвищені рівні ErbB3. Відповідно, термін "хвороба, що асоціюється із залежним від ErbB3 проведенням сигналів" включає також патологічні стани та/або симптоми, пов'язані з патологічним станом, коли виявляються підвищені рівні гетеродимерів EGFR/ErbB3 та/або ErbB2/ErbB3. Загалом, термін "хвороба, що асоціюється із залежним від ErbB3 проведенням сигналів" стосується будь-якого розладу, початок, прогресування чи персистенція симптомів якого вимагає участі ErbB3. Показові опосередковані ErbB3 розлади включають, але не обмежуються ним, наприклад рак. Терміни "рак" чи "канцерозний" стосуються або описують фізіологічний стан у ссавців, який типово характеризується неконтрольованим ростом клітин. Приклади раку включають, не обмежуючись ними, карциному, лімфому, бластому, саркому і лейкемію. Більш конкретні приклади раку включають плоскоклітинний рак, дрібноклітинну карциному легень, недрібноклітинну карциному легень, рак шлунку, рак підшлункової залози, гліальноклітинні пухлини, такі як гліобластома і нейрофіброматоз, рак шийки матки, рак яєчнику, рак печінки, рак сечового міхура, гепатому, рак молочної залози, рак ободової кишки, меланому, колоректальний рак, карциному ендометрію, карциному слинних залоз, рак нирок, рак 14 UA 99276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 передміхурової залози, рак піхви, рак щитовидної залози, карциному печінки і різні види раку голови і шиї. В одному конкретному варіанті здійснення даного винаходу рак, що лікується чи діагностується з використанням способів за цим винаходом, вибирається з меланоми, раку молочної залози, раку яєчнику, світлоклітинного раку, раку шлунково-кишкового тракту/товстої кишки, раку легень і раку передміхурової залози. Термін "ефективна кількість", як він тут використовується, стосується такої кількості антитіла чи його частини, що зв'язує ErbB3, якої достатньо для здійснення лікування, прогнозування чи діагностування хвороби, що асоціюється із залежним від ErbB3 проведенням сигналів, як тут описано, коли вона вводиться суб'єкту. Терапевтично ефективна кількість буде варіювати в залежності від суб'єкту і патологічного стану, який лікується, маси тіла і віку суб'єкту, тяжкості патологічного стану, способу введення і т.п. і легко визначається спеціалістами в цій галузі. Дози для введення можуть коливатись, наприклад, від приблизно 1 нг до приблизно 10000 мг, від приблизно 5 нг до приблизно 9500 мг, від приблизно 10 нг до приблизно 9000 мг, від приблизно 20 нг до приблизно 8500 мг, від приблизно 30 нг до приблизно 7500 мг, від приблизно 40 нг до приблизно 7000 мг, від приблизно 50 нг до приблизно 6500 мг, від приблизно 100 нг до приблизно 6000 мг, від приблизно 200 нг до приблизно 5500 мг, від приблизно 300 нг до приблизно 5000 мг, від приблизно 400 нг до приблизно 4500 мг, від приблизно 500 нг до приблизно 4000 мг, від приблизно 1 мкг до приблизно 3500 мг, від приблизно 5 мкг до приблизно 3000 мг, від приблизно 10 мкг до приблизно 2600 мг, від приблизно 20 мкг до приблизно 2575 мг, від приблизно 30 мкг до приблизно 2550 мг, від приблизно 40 мкг до приблизно 2500 мг, від приблизно 50 мкг до приблизно 2475 мг, від приблизно 100 мкг до приблизно 2450 мг, від приблизно 200 мкг до приблизно 2425 мг, від приблизно 300 мкг до приблизно 2000 мг, від приблизно 400 мкг до приблизно 1175 мг, від приблизно 500 мкг до приблизно 1150 мг, від приблизно 0,5 мг до приблизно 1125 мг, від приблизно 1 мг до приблизно 1100 мг, від приблизно 1,25 мг до приблизно 1075 мг, від приблизно 1,5 мг до приблизно 1050 мг, від приблизно 2,0 мг до приблизно 1025 мг, від приблизно 2,5 мг до приблизно 1000 мг, від приблизно 3,0 мг до приблизно 975 мг, від приблизно 4,0 мг до приблизно 925 мг, від приблизно 4,5 мг до приблизно 900 мг, від приблизно 5 мг до приблизно 875 мг, від приблизно 10 мг до приблизно 850 мг, від приблизно 20 мг до приблизно 825 мг, від приблизно 30 мг до приблизно 800 мг, від приблизно 40 мг до приблизно 775 мг, від приблизно 50 мг до приблизно 750 мг, від приблизно 100 мг до приблизно 725 мг, від приблизно 200 мг до приблизно 700 мг, від приблизно 300 мг до приблизно 675 мг, від приблизно 400 мг до приблизно 650 мг, приблизно 500 мг чи від приблизно 525 мг до приблизно 625 мг антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, за цим винаходом. Схеми прийому лікарського засобу можуть регулюватись таким чином, щоб забезпечувати оптимальну терапевтичну реакцію. Ефективна кількість є також такою, при якій будь-які токсичні чи ушкоджуючі ефекти (тобто, побічні ефекти) антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, мінімізуються та/або переважуються корисними ефектами. Термін "пацієнт" включає людину та інших суб'єктів-ссавців, які приймають профілактичне чи терапевтичне лікування. Термін "суб'єкт", як він тут використовується, включає людину чи будь-яку тварину. Наприклад, способи і композиції за цим винаходом можуть бути використані для лікування суб'єкта, що має рак. В конкретному варіанті здійснення суб'єктом є людина. Тварини, що не відносяться до людини, включають всіх хребетних, наприклад ссавців і не ссавців, таких як примати, вівці, собаки, корови, кури, амфібії, рептилії і т.д. Термін "зразок" стосується тканини, рідини організму чи клітини від пацієнта чи суб'єкта. Звичайно, тканину чи клітину можна взяти у пацієнта, але діагностика in vivo також мається на увазі. У випадку солідної пухлини зразок тканини може бути взятий з хірургічно видаленої пухлини і підготовлений до дослідження звичайними методами. У випадку лімфом і лейкемій можуть бути отримані і відповідно підготовлені для дослідження лімфоцити, лейкозні клітини чи лімфатичні тканини. Інші зразки від пацієнта, включаючи сечу, слізну рідину, сироватку, цереброспінальну рідину, фекалії, мокротиння, екстракти клітин і т.п., також можуть бути корисними у випадку певних пухлин. Терміни "протираковий препарат" і "антинеопластичний препарат" стосуються лікарських препаратів, які використовуються для лікування неоплазій, таких як ракові пухлини. Медикаментозна терапія може використовуватись самостійно або в комбінації з іншими видами лікування, такими як хірургія чи променева терапія. Кілька класів лікарських препаратів можуть знайти використання в лікуванні раку в залежності від природи ураженого органу. Наприклад, рак молочної залози звичайно викликається естрогенами і може лікуватись препаратами, які інактивують ці статеві гормони. Подібно до цього, рак передміхурової залози може лікуватись 15 UA 99276 C2 препаратами, які інактивують андрогени, чоловічий статевий гормон. Протиракові препарати за цим винаходом включають, серед інших, наступні препарати: Протираковий препарат Коментарі Приклади Антитіла (а) антитіла інші ніж анти-ErbB3 антитіла; і (б) анти-ErbB3 антитіла, які зв'язують різні епітопи Антитіла, які зв'язують IGF-1R (рецептор інсулін подібного фактору росту типу 1), який експресується на поверхні клітини більшості раків людини. A12 (повністю гуманізоване mAb) 19D12 (повністю гуманізоване mAb) CP751-871 (повністю гуманізоване mAb) H7C10 (гуманізоване mAb) alphaIR3 (миша) scFV/FC (миша/людина химера) EM/164 (миша) Антитіла, які зв'язують EGFR (рецептор епідермального фактору росту); Мутації, які впливають на експресію чи активність EGFR, можуть призводити до раку. Matuzumab (EMD72000) Erbitux® / Cetuximab (Imclone) Vectibix® / Panitumumab (Amgen) mAb 806 Nimotuzumab (TheraCIM) Антитіла, які зв'язують сМЕТ (мезенхімальний фактор епітеліального переходу); представник родини МЕТ рецепторних тірозинкіназ. AVEO (AV299) (AVEO) AMG102 (Amgen) 5D5 (OA-5D5) (Genentech) Анти-ErbB3 антитіла, які зв'язують різні епітопи. Ab #14 (MM 121-14) описаний тут, Herceptin® (Trastuzumab; Genentech) 1B4C3; 2D1D12 (U3 Pharma AG) Малі молекули, націлені на IGF1R IGF-1R (рецептор інсулін подібного фактору росту типу 1), який експресується на поверхні клітини більшості раків людини. NVP-AEW541-A BMS-536,924 (1H-бензоімідазол-2-іл)-1Hпирідин-2-он) BMS-554,417 Cycloligan TAE226 PQ401 Малі молекули, націлені на EGFR EGFR (рецептор епідермального фактору росту); Мутації, які впливають на експресію чи активність EGFR, можуть призводити до раку. Iressa® / Gefitinib (AstraZeneca) CI-1033 (PD 183805) (Pfizer) Lapatinib (GW-572016) (GlaxoSmithKline) Tykerb® / Lapatinib Ditosylate (SmithKline Beecham) Tarceva®/ Erlotinib HCL (OSI-774) (OSI Pharma) PKI-166 (Novartis) PD-158780 EKB-569 Tyrphostin AG 1478(4-(3-хлораніліно)-6,7диметоксихіназолін) Малі молекули, сМЕТ (мезенхімальний фактор PHA665752 націлені на сМЕТ епітеліального переходу); ARQ 197 представник родини МЕТ рецепторних тірозинкіназ. 5 16 UA 99276 C2 Антиметаболіти Антиметаболіт – це хімічна сполука зі структурою, подібною до субстанції (метаболіта), необхідної для нормальних біохімічних реакцій, і все-таки достатньо відмінною, щоб впливати на нормальні функції клітин, включаючи поділ клітин. Фторурацил (5-FU) Capecitabine / XELODA® (HLR Roche) 5-Трифторметил-2'-деоксиуридин Натрієва сіль метотрексату (Trexall) (Barr) Raltitrexed / Tomudex® (AstraZaneca) Pemetrexed / Alimta® (Lilly) Tegafur Цитозин арабінозид (Cytarabine, Ara-C) / Thioguanine® (GlaxoSmithKline) 5-азацитидин 6-меркаптопурин (Mercaptopurine, 6-MP) Азатіоприн / Azasan® (AAIPHARMA LLC) 6-тіогуанін (6-TG) / Purinethol® (TEVA) Пентостатин / Nipent® (Hospira Inc.) Флударабіну фосфат / Fludara® (Bayer Health Care) Cladribine (2-CdA, 2-хлордеоксиаденозин) / Leustatin® (Ortho Biotech) Алкилюючі препарати Алкилюючий антинеопластичний препарат – це алкилюючий агент, який приєднує алкильну групу до ДНК. Оскільки ракові клітини загалом проліферують необмежено більше, ніж здорові клітини, вони є більш чутливими до ушкодження ДНК, і алкилюючі препарати використовуються в клініці для лікування широкого кола пухлин. Інгібітор рибонуклеотидредуктази (RNR) Циклофосфамід / Cytoxan (BMS) Neosar (TEVA) Іфосфамід /Mitoxana® (ASTA Medica) Тіотепа (Bedford, Abraxis, Teva) BCNU→ 1,3-bis(2-хлоретил)-1нітрозосечовина CCNU→ 1,-(2-хлоретил)-3-циклогексил-1нітрозосечовина (метил CCNU) Гексаметилмеламін (Altretamine, HMM) / Hexalen® (MGI Pharma Inc.) Бусульфан / Myleran (GlaxoSmithKline) Прокарбазин HCL / Matulane (Sigma Tau Pharmaceuticals, Inc.) Дакарбазин (DTIC) Хлорамбуцил / Leukaran® (SmithKline Beecham) Мелфалан / Alkeran® (GlaxoSmithKline) Цисплатин (Cisplatinum, CDDP) / Platinol (Bristol Myers) Карбоплатин / Paraplatin (BMS) Оксаліплатин / Eloxitan® (Sanofi-Aventis US) Інгібітори топоізомерази Doxorubicin HCL / Doxil® (Alza) Daunorubicin citrate / Daunoxome® (Gilead) Mitoxantrone HCL/Novantrone (EMD Serono) Actinomycin D Etoposide / Vepesid® (BMS)/ Etopophos® (Hospira, Bedford, Teva Parenteral, Etc.) Topotecan HCL / Hycamtin® (GlaxoSmithKline) Teniposide (VM-26) / Vumon® (BMS) Irinotecan HCL(CPT-11) / Camptosar® (Pharmacia & Upjohn) Інгібітори топоізомерази – це хіміотерапевтичні препарати, призначені для порушення дії топоізомеразних ферментів (топоізомерази І і ІІ), що є ферментами, які контролюють зміни в структурі ДНК, каталізуючи розрив і возз'єднання фосфодиефірного каркасу ниток ДНК під час нормального клітинного циклу. 17 UA 99276 C2 Препарати, націлені на мікротрубки Мікротрубки є одним з компонентів цитоскелету. Вони мають діаметр біля 24 нм і довжину від кількох мікрометрів до, можливо, міліметрів в аксонах нервових клітин. Мікротрубки слугують структурними компонентами в клітинах і задіяні в багатьох клітинних процесах, включаючи мітоз, цитокінез і везикулярний транспорт. Вінкристин / Oncovin® (Lilly) Вінбластин сульфат / Velban® (вже не випускається) (Lilly) Вінорелбін тартрат / Navelbine® (PierreFabre) Віндезин сульфат / Eldisine® (Lilly) Паклітаксель / Taxol® (BMS) Доцетаксель / Taxotere® (Sanofi Aventis США) Паклітаксель в наночастках (ABI-007) / Abraxane® (Abraxis BioScience, Inc.) Ixabepilone / IXEMPRA™ (BMS) Інгібітори кіназ Тирозинкінази є ферментами всередині клітини, функція яких полягає в приєднанні фосфатних груп до амінокислоти тирозин. Блокуючи здатність протеїнтирозинкіназ функціонувати, ці сполуки є інструментом для контролю канцерозного росту клітин. Imatinib mesylate / Gleevec (Novartis) Sunitinib malate / Sutent® (Pfizer) Sorafenib tosylate / Nexavar® (Bayer) Nilotinib hydrochloride monohydrate / Tasigna® (Novartis) Інгібітори синтезу білку Викликають апоптоз клітин L-аспарагіназа / Elspar® (Merck & Co.) Імунотерапевтичні препарати Індукують у онкологічних пацієнтів імунну реактивність Альфа інтерферон Інгібітор ангіогенезу / Avastin® (Genentech) IL-2→ Інтерлейкін 2 (Aldesleukin) / Proleukin ® (Chiron) IL-12→ Інтерлейкін 12 Гормони Гормональна терапія, асоційована з менопаузою і старінням, намагається збільшити кількість певних гормонів в організмі, щоб компенсувати вікове чи пов'язане з хворобою зниження їх рівнів. Гормональна терапія як лікування раку знижує рівень певних гормонів чи змінює здатність раку використовувати ці гормони для росту і поширення. Тореміфен цитрат / Fareston® (GTX, Inc.) Fulvestrant / Faslodex® (AstraZeneca) Raloxifene HCL / Evista® (Lilly) Anastrazole / Arimidex® (AstraZeneca) Letrozole / Femara® (Novartis) Fadrozole (CGS 16949A) Exemestane / Aromasin® (Pharmacia & Upjohn) Лейпролід ацетат / Eligard® (QTL США) Lupron® (TAP Pharm.) Госерелін ацетат / Zoladex® (AstraZeneca) Triptorelin pamoate / Trelstar® (Watson Labs) Buserelin / Suprefact® (Sanofi Aventis) Nafarelin Cetrorelix / Cetrotide® (EMD Serono) Bicalutamide / Casodex® (AstraZeneca) Nilutamide / Nilandron® (Aventis Pharm.) Мегестрол ацетат / Megace® (BMS) Аналоги соматостатину (Октреотид ацетат / Sandostatin® (Novartis)) 18 UA 99276 C2 Глюкокортикоїди Протизапальні препарати, які використовуються для зменшення набряку, що спричинює раковий біль. Преднізолон Дексаметазон / Decadron® (Wyeth) Інгібітори ароматози Включають імідазоли Кетоконазол Інгібітори mTOR Сигнальний шлях mTOR було спершу відкрито під час досліджень імуносупресивного препарату рапаміцин. Цей дуже консервативний сигнальний шлях регулює проліферацію і метаболізм клітин у відповідь на дію чинників оточуючого середовища, проводячи сигнали рецептору фактору росту клітини через фосфоінозитид-3-кіназу (РІ3К) для клітинного росту, проліферації і ангіогенезу. Sirolimus (Rapamycin) / Rapamune® (Wyeth) Temsirolimus (CCI-779) / Torisel® (Wyeth) Deforolimus (AP23573) (Ariad Pharm.) Everolimus (RAD001) /Certican® (Novartis) Хіміотерапевтичні препарати 5 10 15 20 25 30 35 Адріаміцин, 5-Фторурацил, Цитоксин, Блеоміцин, Мітоміцин C, Дауноміцин, Карміноміцин, Аміноптерин, Дактиноміцин, Мітоміцини, Еспераміцини Один чи більше протиракових препаратів можуть вводитись одночасно з введенням антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, за цим винаходом, до такого введення чи після нього. Різні аспекти даного винаходу описуються більш докладно в наступних підрозділах. ІІ. Способи отримання антитіл за цим винаходом (i) Моноклональні антитіла Моноклональні антитіла за цим винаходом можуть бути отримані за допомогою різних відомих методів, таких як стандартний метод гібридизації соматичних клітин, описаний Kohler і Milstein (1975) Nature 256: 495, вірусна чи онкогенна трансформація В лімфоцитів чи метод фагового дисплею з використанням бібліотек генів антитіл людини. В певних варіантах здійснення даного винаходу такі антитіла є повністю моноклональними антитілами людини. Відповідно, в одному варіанті здійснення, для отримання антитіла, яке зв'язує ErbB3, використовується гібридомний метод. За цим методом мишу чи іншу відповідну тварину-хазяїна імунізують відповідним антигеном, щоб отримати лімфоцити, які продукують чи здатні продукувати антитіла, що специфічно зв'язуються з тим антигеном, який було використано для імунізації. Як варіант, лімфоцити можуть бути імунізовані in vitro. Потім лімфоцити можуть бути злиті з мієломними клітинами, для чого використовується відповідний фактор, що викликає злиття клітин, такий як поліетилен гліколь, з утворенням клітини гібридоми (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Культуральне середовище, в якому вирощуються клітини гібридоми, досліджують на продукцію моноклональних антитіл, спрямованих проти даного антигену. Після ідентифікації клітин гібридоми, що продукують антитіла бажаної специфічності, афінності та/або активності, відповідні клони можуть бути субклоновані методами серійного розведення і можуть вирощуватись стандартними методами (Goding, Monoclonal Antibodies:Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). Придатні для цієї мети культуральні середовища включають, наприклад, D-MEM чи середовище RPMI-1640. Крім того, клітини гібридоми можуть вирощуватись in vivo як асцитні пухлини у тварини. Моноклональні антитіла, секретовані такими субклонами, можуть біти відділені від культурального середовища, асцитної рідини чи сироватки звичайними методами очистки імуноглобуліну, такими як, наприклад, протеїн А-Сефарозна, гідроксилапатитна хроматографія, гель-електрофорез, діаліз чи афінна хроматографія. В іншому варіанті здійснення антитіла і частини антитіл, що зв'язують ErbB3, можуть бути виділені з фагових бібліотек антитіл, створених з використанням методів, описаних, наприклад, McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991), Marks et 19 UA 99276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) та Hoet et al (2005) Nature Biotechnology 23, 344-348; патенти США №№ 5,223,409; 5,403,484; і 5,571,698, видані Ladner et al.; патенти США №№ 5,427,908 і 5,580,717, видані Dower et al.; патенти США №№ 5,969,108 і 6,172,197, видані McCafferty et al.; і патенти США №№ 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 і 6,593,081, видані Griffiths et al… Додатково, може бути використана також продукція антитіл людини з високою афінністю (нМ діапазон) за допомогою перестановки ланцюгів (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), а також комбінаторної інфекції і рекомбінації in vivo як стратегії для створення дуже великих фагових бібліотек (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). В одному конкретному варіанті здійснення моноклональне антитіло чи його частина, що зв'язує ErbB3, отримується за допомогою методу фагового дисплею, описаного Hoet et al., supra. Цей метод передбачає генерацію бібліотеки Fab людини, що містить унікальну комбінацію імуноглобулінових послідовностей, виділених від донорів-людей, із забезпеченою синтезом різноманітністю ділянок CDR важкого ланцюга. З цієї бібліотеки потім вибирають Fabs, які зв'язуються з ErbB3. В ще іншому варіанті здійснення моноклональні антитіла людини, спрямовані проти ErbB3, можуть бути отримані з використанням трансгенних чи трансхромосомних мишей, які несуть швидше частини імунної системи людини, ніж систему миші (дивись, наприклад, Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Lonberg, N. et al. (1994), supra; рецензовану в книзі Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, а також Harding, F. і Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546. Дивись також патенти США №№ 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; і 5,770,429; всі видані Lonberg і Kay; патент США № 5,545,807, виданий Surani et al.; публікації PCT №№ WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 і WO 99/45962, всі від Lonberg і Kay; і публікацію PCT № WO 01/14424 від Korman et al.). В іншому варіанті здійснення антитіла людини за цим винаходом можуть бути отримані з використанням миші, яка несе імуноглобулінові послідовності людини на трансгенах і трансхромосомах, такої як миша, яка несе трансген важкого ланцюга людини і трансхромосому легкого ланцюга людини (дивись, наприклад, публікацію РСТ WO 02/43478 від Ishida et al.). Відомі в цій галузі альтернативні системи на трансгенних тваринах, що експресують імуноглобулінові гени людини, також можуть бути використані для отримання анти-ErbB3 антитіл за цим винаходом. Наприклад, можна скористатись альтернативною трансгенною системою під назвою Xenomouse (Abgenix, Inc.); такі миші описані, наприклад, в патентах США №№ 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6,150,584 і 6,162,963, виданих Kucherlapati et al. Більш того, відомі в цій галузі альтернативні трансхромосомні системи у тварин, що експресують імуноглобулінові гени людини, також можуть бути використані для отримання антиErbB3 антитіл за цим винаходом. Наприклад, можуть бути використані миші, що несуть і трансхромосому важкого ланцюга людини, і трансхромосому легкого ланцюга людини, як описано Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727. Крім того, описані корови, що несуть трансхромосоми важкого і легкого ланцюга людини (Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894), які теж можуть бути використані для отримання анти-ErbB3 антитіл за цим винаходом. В ще іншому варіанті здійснення антитіла за цим винаходом можуть бути отримані за допомогою трансгенної рослини та/або культивованих клітин рослини (такої як, наприклад, тютюн, кукурудза і ряска), які продукують такі антитіла. Наприклад, листя трансгенного тютюну, що експресує антитіла чи його частини, що зв'язують антиген, може бути використане для отримання таких антитіл за допомогою, наприклад, індукованого промотору (дивись, наприклад, Cramer et al., Curr. Top. Microbol. Immunol. 240:95 118 (1999)). Трансгенна кукурудза також може бути використана для експресії таких антитіл і їх частин, що зв'язують антиген (дивись, наприклад, Hood et al., Adv. Exp. Med. Biol. 464:127 147 (1999)). Антитіла можуть отримуватись у великих кількостях також з насіння трансгенних рослин, включаючи частини антитіл, такі як одноланцюгові антитіла (scFv's), наприклад, при використанні насіння тютюну і бульб картоплі (дивись, наприклад, Conrad et al., Plant Mol. Biol. 38:101 109 (1998)). Методи отримання антитіл чи їх частин, що зв'язують антиген, з рослин описані також в інших джерелах, наприклад Fischer et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 30:99 108 (1999), Ma et al., Trends Biotechnol. 13:522 7 (1995); Ma et al., Plant Physiol. 109:341 6 (1995); Whitelam et al., Biochem. Soc. Trans. 22:940 944 (1994) та патенти США №№ 6,040,498 і 6,815,184. Специфічність зв'язування моноклональних антитіл чи їх частин, що зв'язують ErbB3, отриманих будь-яким способом, включаючи способи, описані тут, може бути визначена за 20 UA 99276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 допомогою методу імунної преципітації або аналізу зв'язування in vitro, такого як радіоімунологічне дослідження (RIA) чи твердофазний імуноферментний аналіз (ELISA). Афінність моноклонального антитіла чи його частини до зв'язування можна оцінити за допомогою аналізу Scatchard (Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)). В певних варіантах здійснення даного винаходу антитіло ErbB3 чи його частина, отримані будь-яким з описаних вище методів, можуть бути піддані подальшим змінам чи оптимізації для досягнення бажаної специфічності зв'язування та/або афінності, для чого можуть бути використані методи, відомі в цій галузі, такі як описані тут. В одному варіанті здійснення для отримання структурно і функціонально споріднених антитіл можуть бути використані часткові послідовності антитіла, похідні від антитіла ErbB3. Наприклад, антитіла взаємодіють з цільовими антигенами головним чином через амінокислотні залишки, які знаходяться на шести ділянках, що визначають комплементарність (CDR), важкого і легкого ланцюгів. З цієї причини амінокислотні послідовності в межах CDR більше відрізняються між окремими антитілами, ніж послідовності поза CDR. Оскільки послідовності CDR є відповідальними за більшість взаємодій антитіло-антиген, то існує можливість експресії рекомбінантних антитіл, які імітують властивості специфічних антитіл природного походження, якщо створити вектори експресії, які включають послідовності CDR від специфічного антитіла природного походження, перенесені на каркасні послідовності від іншого антитіла з іншими властивостями (дивись, наприклад, Riechmann, L. et al., 1998, Nature 332:323-327; Jones, P. et al., 1986, Nature 321:522-525; та Queen, C. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:1002910033). Такі каркасні послідовності можна отримати із загальних баз даних щодо ДНК, які включають зародкові послідовності гену антитіла. Отже, одна чи більше структурні особливості анти-ErbB3 антитіла за цим винаходом, такі як CDR, можуть бути використані для створення структурно споріднених анти-ErbB3 антитіл, які зберігають щонайменше одну функціональну властивість антитіл за цим винаходом, наприклад властивість пригнічувати опосередковану EGF-подібним лігандом фосфориляцію ErbB3; властивість пригнічувати опосередковане одним чи більше з херегуліну, епірегуліну, епігену чи бірегуліну проведення сигналів через ErbB3; властивість пригнічувати проліферацію клітин, що експресують ErbB3; та/або властивість знижувати рівні ErbB3 на поверхні клітин. В одному конкретному варіанті здійснення одна чи більше ділянок CDR, вибраних з SEQ ID №:7-12, SEQ ID №:13-18, SEQ ID №:19-24, SEQ ID №:39-44, and SEQ ID №:45-50, рекомбінантно комбінуються з відомими каркасними ділянками і ділянками CDR людини для створення додаткових, рекомбінантно сконструйованих анти-ErbB3 антитіл за цим винаходом. Варіабельні каркасні ділянки важкого і легкого ланцюгів можуть отримуватись з тієї самої або з різних послідовностей антитіла. Спеціалістам в цій галузі добре відомо, що домени CDR3 важкого і легкого ланцюгів антитіла відіграють особливо важливу роль в специфічності зв'язування/афінності антитіла щодо антигену (дивись Hall et al., J. Imunol., 149:1605-1612 (1992); Polymenis et al., J. Immunol., 152:5318-5329 (1994); Jahn et al., Immunobiol., 193:400-419 (1995); Klimka et al., Brit. J. Cancer, 83:252-260 (2000); Beiboer et al., J. Mol. Biol, 296:833-849 (2000); Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:8910-8915 (1998); Barbas et al., J. Am. Chem. Soc., 116:2161-2162 (1994); Ditzel et al., J. Immunol., 157:739-749 (1996)). Відповідно, в певних варіантах здійснення генеруються антитіла, які включають CDR3 важкого та/або легкого ланцюга конкретних антитіл, описаних тут (наприклад, SEQ ID №:9, 15, 21, 41, 47 та/або SEQ ID №:12, 18, 24, 44, 50). Такі антитіла можуть додатково включати CDR1 та/або CDR2 важкого та/або легкого ланцюга антитіл за цим винаходом (наприклад, SEQ ID №:7-8 та/або SEQ ID №:10-11; SEQ ID №:13-14 та/або SEQ ID №:16-17; SEQ ID №:20-21 та/або SEQ ID №:22-23; SEQ ID №:39-40 та/або SEQ ID №:42-43; or SEQ ID №:45-46 та/або SEQ ID №:48-49). Ділянки CDR1, 2, та/або 3 описаних вище сконструйованих антитіл можуть включати точну амінокислотну послідовність (послідовності), як та, що описана тут (наприклад, ділянки CDR Ab №6, Ab №3, Ab №14, Ab №17 чи Ab №19, показані в SEQ ID №:7-12, 13-18, 19-24, 39-44 і 45-50, відповідно). Однак спеціалістам в цій галузі має бути очевидно, що можливі певні відхилення від точних послідовностей CDR при збереженні здатності такого антитіла ефективно зв'язувати ErbB3 (наприклад, консервативні амінокислотні заміщення). Відповідно, в іншому варіанті здійснення, сконструйоване антитіло може включати одну чи більше ділянок CDR, які є, наприклад, на 90 %, 95 %, 98 %, 99 % чи 99,5 % ідентичними одній чи більше ділянок CDR Ab №6, Ab №3 чи Ab №14. В іншому варіанті здійснення один чи більше залишків CDR можуть бути змінені з метою модифікувати зв'язування для досягнення більш сприятливої швидкості зв'язування. У такий 10 -1 спосіб можна створити антитіло, що має надвисоку афінність до зв'язування, наприклад 10 M 21 UA 99276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 чи більше. Методи дозрівання афінності, добре відомі в цій галузі і ті, що описані тут, можуть бути використані для того, щоб змінити ділянку (ділянки) CDR і відібрати серед отриманих молекул ті, які демонструють бажану зміну щодо зв'язування. Відповідно, коли ділянки CDR змінюються, зміни в афінності зв'язування, а також в імуногенності можуть контролюватись і оцінюватись таким чином, щоб отримане антитіло було оптимізованим щодо найкращої комбінації зв'язування і низької імуногенності. На додачу до модифікацій в ділянках CDR, чи замість них, модифікації можуть вноситись також в одну чи більше каркасних ділянок FR1, FR2, FR3 і FR4 варіабельних ділянок важкого і легкого ланцюга антитіла, якщо ці модифікації не знищують афінність цього антитіла до зв'язування. В іншому варіанті здійснення антитіло модифікується далі у відношенні ефекторної функції з тим, щоб посилити ефективність цього антитіла, наприклад в лікуванні раку. Так, в ділянку Fc може бути введений цистеїнів залишок (залишки), що забезпечує утворення на цій ділянці дисульфідного зв'язку між ланцюгами. Гомодимерне антитіло, яке створюється при цьому, може мати поліпшену здатність до інтерналізації та/або посилені опосередкований комплементом лізис клітин і залежну від антитіла клітинну цитотоксичність (ADCC). Дивись Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) and Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Гомодимерні антитіла з посиленою протипухлинною активністю можуть бути отримані також з використанням гетеробіфункціональних крослінкерів, як описано в статті Wolff et al. Cancer Research 53:25602565 (1993). Як варіант, можна сконструювати антитіло, що має подвійні ділянки Fc і, відповідно, посилену здатність щодо опосередкованого комплементом лізису клітин і залежної від антитіла клітинної цитотоксичності (ADCC). Дивись Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989). Даний винахід охоплює також біспецифічні антитіла та імунокон'югати, як докладніше буде описано далі. (ii) Біспецифічні антитіла Біспецифічні антитіла за цим винаходом включають щонайменше одну специфічність зв'язування для ErbB3 і щонайменше одну специфічність зв'язування для іншого антигену, такого як продукт онкогену. Біспецифічні антитіла можуть бути отримані як антитіла повної довжини або як фрагменти антитіла (наприклад, біспецифічні антитіла F(ab')2). Методи отримання біспецифічних антитіл є добре відомими в цій галузі (дивись, наприклад, публікації WO 05117973 і WO 06091209). Наприклад, отримання біспецифічних антитіл повної довжини може базуватись на коекспресії двох пар важкий ланцюг-легкий ланцюг імуноглобуліну, причому ці два ланцюги мають різні специфічності (дивись, наприклад, Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). Більш докладний опис отримання біспецифічних антитіл можна знайти, наприклад, в таких джерелах, як Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986) та Brennan et al., Science, 229: 81 (1985), в яких описано процес хімічного зв'язку для отримання біспецифічних антитіл. Описані також різні методи для отримання і виділення фрагментів біспецифічних антитіл безпосередньо з культури рекомбінантних клітин. Наприклад, біспецифічні антитіла отримувались з використанням лейцинових "блискавок" (дивись, наприклад, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)). Повідомлялось також про іншу стратегію отримання фрагментів біспецифічних антитіл з використанням одноланцюгових димерів Fv (sFv) (дивись, наприклад, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)). В одному конкретному варіанті здійснення даного винаходу біспецифічне антитіло включає перше антитіло або його зв'язувальну частину, яка зв'язує ErbB3, і друге антитіло або його зв'язувальну частину, яка зв'язується з ErbB2, ERbB3, ErbB4, EGFR, IGF1-R, C-MET, Lewis Y, MUC-1, EpCAM, CA125, специфічним мембранним антигеном передміхурової залози, PDGFR-α, PDGFR-β, C-KIT або будь-яким з FGF рецепторів. (iii) Імунокон'югати Імунокон'югати за цим винаходом можуть бути отримані шляхом кон'югації описаних тут антитіл чи їх частин, що зв'язують антиген, з іншим терапевтичним препаратом. Відповідні препарати включають, наприклад, цитотоксичний препарат (наприклад, хіміотерапевтичний препарат), токсин (наприклад, ферментативно активний токсин бактеріального, грибкового, рослинного чи тваринного походження або його фрагменти) та/або радіоактивний ізотоп (тобто, радіокон'югат). Хіміотерапевтичні препарати, придатні для використання в отриманні таких імунокон'югатів, були описані раніше. Придатні для використання ферментативно активні токсини і їх фрагменти включають А ланцюг дифтерії, незв'язувальні активні фрагменти дифтерійного токсину, А ланцюг екзотоксину (від Pseudomonas aeruginosa), А ланцюг рицину, А ланцюг абрину, А ланцюг модецину, альфа-сарцин, білки Aleurites fordii, білки діантину, білки Phytolaca Americana (PAPI, PAPII і PAP-S), інгібітор momordica charantia, курцин, кротин, інгібітор 22 UA 99276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 sapaonaria officinalis, гелонін, мітогелін, рестриктоцин, феноміцин, еноміцин і трикотецени. Для отримання радіокон'югованих анти-ErbB3 антитіл підходить широке коло радіонуклідів. 212 131 131 90 186 Приклади включають Bi, I, In, Y і Re. Імунокон'югати за цим винаходом можуть бути отримані з використанням широкого кола біфункціональних білкових зв'язувальних агентів, таких як N-сукцинімідил-3-(2-пирідилдитіол) пропіонат (SPDP), імінотіолан (ІТ), біфункціональних похідних імідоефірів (таких як диметиладипімідат HCl), активних ефірів (таких як дисукцинімідил суберат, альдегідів (таких як глютаральдегід), сполук bis-азидо (таких як bis(р-азидобензоїл) гександиамін), похідних bisдиазонію (таких як bis-(p-диазонійбензоїл)-етилендиамін), похідних диазонію (таких як диазонійбензоїл)-етилендиамін), диізоціанатів (таких як толуол 2,6-диізоціанат). Наприклад, рициновий імунотоксин можна отримати, як описано в Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987). Мічена вуглецем-14 1-ізотіоціанатобензил-3-метилдиетилен триамінпентаоцтова кислота (MXDTPA) є показовим хелатоутворюючим агентом для кон'югації радіонуклеотиду до антитіла (дивись, наприклад, WO94/11026). III. Методи відбору антитіл за цим винаходом Після отримання антитіл чи їх частин, що зв'язують ErbB3, такі антитіла чи їх частини мають пройти відбір за різними властивостями, такими як описані тут, з використанням численних аналізів, які є добре відомими в цій галузі. В одному варіанті здійснення даного винаходу антитіла чи їх частини, що зв'язують антиген, проходять відбір на здатність пригнічувати опосередковану EGF-подібним лігандом фосфориляцію ErbB3. Це можна здійснити, обробивши клітини, що експресують ErbB3, EGFподібним лігандом в присутності і за відсутності даного антитіла чи його частин, що зв'язують антиген. Потім ці клітини піддають лізису, і неочищені лізати центрифугують, щоб видалити нерозчинний матеріал. Фосфориляцію ErbB3 можна оцінити за допомогою, наприклад, вестерн блотингу з наступним дослідженням анти-фосфотирозиновим антитілом, як описано в Kim et al., supra і в подальших Прикладах. В інших варіантах здійснення антитіла чи їх частини, що зв'язують антиген, піддаються подальшому відбору за однією чи більше з наступних властивостей: (1) здатність пригнічувати опосередковане ErbB3-лігандом (наприклад, херегуліном, епірегуліном, епігеном чи бірегуліном) проведення сигналів через ErbB3; (2) здатність пригнічувати проліферацію клітин, що експресують ErbB3; (3) здатність знижувати рівні ErbB3 на поверхнях клітин (наприклад, викликаючи інтерналізацію ErbB3); (4) здатність пригнічувати секрецію VEGF клітинами, що експресують ErbB3; (5) здатність пригнічувати міграцію клітин, що експресують ErbB3; (6) здатність пригнічувати сфероїдальний ріст клітин, що експресують ErbB3; та/або (7) здатність зв'язуватись з епітопом, що розміщується на домені І ErbB3. Кожну з цих властивостей можна легко оцінити за допомогою методів, відомих в цій галузі, і тих, що описані тут. Пригнічення опосередкованого одним чи більше з херегуліну, епірегуліну, епігену чи бірегуліну проведення сигналів через ErbB3 можна легко оцінити за допомогою рутинних аналізів, таких як описані в Horst et al. supra. Наприклад, здатність антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, пригнічувати опосередковане херегуліном, епірегуліном, епігеном чи бірегуліном проведення сигналів через ErbB3 можна оцінити за допомогою аналізів активності кінази щодо відомих субстратів ErbB3, таких як, наприклад, SHC і PI3K, як описано, наприклад, в Horst et al. supra, Sudo et al., (2000) Methods Enzymol, 322:388-92; and Morgan et al. (1990) Eur. J. Biochem., 191:761-767, після стимуляції одним чи більше з херегуліну, епірегуліну, епігену чи бірегуліну. Відповідно, клітини, що експресують ErbB3, можуть стимулюватись одним чи більше з херегуліну, епірегуліну, епігену чи бірегуліну та інкубуватись з антитілом-кандидатом чи його частиною, що зв'язує антиген. Отримані з таких клітин лізати можуть бути піддані імунопреципітації антитілом до субстрату ErbB3 (або білку на шляху клітинного метаболізму за участі ErbB3), такого як, наприклад, антиJNK-1 антитіло, і досліджені на активність кінази (наприклад, активність JNK кінази чи активність PI3-кінази) за допомогою методів, відомих в цій галузі. Зниження рівня чи повне зникнення активності (наприклад, активності кінази) субстрату ErbB3 чи білку на шляху клітинного метаболізму за участі ErbB3 в присутності антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, по відношенню до рівня активності за відсутності антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, є свідченням того, що це антитіло чи його частина, що зв'язує антиген, пригнічує опосередковане одним чи більше з херегуліну, епірегуліну, епігену чи бірегуліну проведення сигналів. В певних варіантах здійснення даного винаходу антитіло чи його частина, що зв'язує антиген, пригнічує опосередковане ErbB3-лігандом (наприклад, херегуліном, епірегуліном, епігеном чи бірегуліном) проведення сигналів, зменшуючи зв'язування одного чи більше з херегуліну, епірегуліну, епігену чи бірегуліну з ERbB3. 23 UA 99276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Для того, щоб відібрати ті антитіла чи їх частини, що зв'язують антиген, які пригнічують зв'язування одного чи більше з херегуліну, епірегуліну, епігену чи бірегуліну з ERbB3, клітини, що експресують ErbB3 (наприклад, клітини MALME-3M, як описано в Прикладах далі), можуть бути приведені в контакт з міченим ErbB3-лігандом (наприклад, радіоактивно міченим херегуліном, епірегуліном, епігеном чи бірегуліном) за відсутності (контроль) чи в присутності анти-ErbB3 антитіла чи його частини, що зв'язує антиген. Якщо антитіло чи його частина, що зв'язує антиген, пригнічує зв'язування херегуліну, епірегуліну, епігену чи бірегуліну з ErbB3, то буде спостерігатись статистично достовірне зменшення кількості відновленої мітки (наприклад, радіоактивно міченого херегуліну, епірегуліну, епігену чи бірегуліну) по відношенню до кількості за відсутності антитіла чи його частини, що зв'язує антиген. Антитіло чи його частина, що зв'язує антиген, можуть пригнічувати зв'язування ErbB3ліганду (наприклад, херегуліну, епірегуліну, епігену чи бірегуліну) будь-яким механізмом. Наприклад, антитіло чи його частина, що зв'язує антиген, можуть пригнічувати зв'язування ErbB3-ліганду (наприклад, одного чи більше з херегуліну, епірегуліну, епігену чи бірегуліну) до ErbB3 за рахунок зв'язування до того самого сайту чи сайту, що накладається, на ErbB3, що й ErbB3 ліганд. Як варіант, антитіло чи його частина, що зв'язує антиген, можуть пригнічувати зв'язування ErbB3-ліганду, змінюючи чи спотворюючи конформацію ErbB3, що робить його нездатним зв'язуватись з ErbB3 лігандом. Антитіла чи їх частини, що зв'язують антиген, які знижують рівні ErbB3 на поверхні клітин, можуть бути ідентифіковані за їх здатністю регулювати на пониження ErbB3 на пухлинних клітинах. В певних варіантах здійснення антитіла чи їх частини, що зв'язують антиген, зменшують поверхневу експресію клітинами ErbB3 за рахунок індукції інтерналізації (чи збільшення ендоцитозу) ErbB3. Щоб довести це, ErbB3 може бути біотинильованим, і кількість молекул ErbB3 на поверхні клітин може бути легко визначена, наприклад шляхом визначення кількості біотину на моношарі клітин в культурі в присутності чи за відсутності антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, наприклад як описано у Waterman et al., J. Biol. Chem. (1998), 273:13819-27, наступної імунопреципітації ErbB3 і дослідження стрептавідином. Зниження виявлення біотинильованого ErbB3 з часом в присутності антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, є свідченням того, що дане антитіло знижує рівні ErbB3 на поверхні клітин. Антитіла чи їх частини, що зв'язують антиген, за цим винаходом можуть бути досліджені на здатність пригнічувати проліферацію клітин, що експресують ErbB3, наприклад пухлинних клітин, за допомогою відомих в цій галузі методів, таких як аналіз збудженої флуоресценції сортованих клітин, описаний в Прикладах далі (дивись також, наприклад, Macallan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1998) 20;95(2):708-13; Perez et al. (1995) Cancer Research 55, 392-398). В іншому варіанті здійснення антитіла чи їх частини, що зв'язують антиген, відбираються за здатністю пригнічувати секрецію VEGF клітинами, що експресують ErbB3. Це можна здійснити за допомогою добре відомих аналізів, таких як аналіз з використанням набору VEGF ELISA від фірми R&D Systems (США, кат. №DY293B). Подібно до цього, антитіла чи їх частини можуть відбиратись за здатністю пригнічувати міграцію клітин, що експресують ErbB3 (наприклад, клітин MCF-7) з використанням транс-лункового аналізу (Millipore Corp., США, кат. № ECM552), як його тут описано. В іншому варіанті здійснення даного винаходу антитіла чи їх частини, що зв'язують антиген, відбираються за здатністю пригнічувати сфероїдальний ріст клітин, що експресують ErbB3. Це можна здійснити за допомогою аналізу, який апроксимує умови розвитку пухлинного росту (дивись, наприклад, Herman et al. (2007) Journal of Biomolecular Screening Electronic publication), як тут описано. Антитіла чи їх частини, що зв'язують антиген, можуть зв'язуватись з тим самим епітопом чи з епітопами, що накладаються, оскільки одне чи більше антитіл за цим винаходом можуть бути ідентифіковані також за допомогою стандартних методів, відомих в цій галузі і описаних тут. Наприклад, для того, щоб відібрати антитіла, які зв'язуються з тим самим епітопом чи з епітопом, що накладається, на ErbB3, зв'язаному досліджуваним антитілом, може бути використаний епітоп-перехресний конкурентний аналіз, такий як описаний в книзі Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow & David Lane (1988). IV. Фармацевтичні композиції В іншому аспекті даний винахід стосується композиції, наприклад фармацевтичної композиції, яка містить одне моноклональне антитіло чи комбінацію моноклональних антитіл або їх частини, що зв'язують антиген, за цим винаходом, разом з фармацевтично прийнятним носієм. В одному варіанті здійснення такі композиції включають комбінацію з кількох (наприклад, двох чи більше) окремих антитіл за цим винаходом, які зв'язують різні епітопи на ErbB3. 24 UA 99276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Термін "фармацевтично прийнятний носій", як він тут використовується, включає будь-який і всі розчинники, середовища для диспергування, покриття, антибактеріальні і антифунгальні препарати, ізотонічні агенти, агенти, що уповільнюють всмоктування, і т.п., що є фізіологічно сумісними. Переважно, такий носій є придатним для внутрішньовенного, внутрішньом'язового, підшкірного, парентерального, спинального чи епідермального введення (наприклад, у вигляді ін'єкції чи інфузії). В залежності від шляху введення, активна сполука, тобто антитіло, біспецифічна чи мультиспецифічна молекула, може бути покрита матеріалом, який захищає її від дії кислот та інших природних умов, здатних інактивувати цю сполуку. "Фармацевтично прийнятна сіль" стосується солі, яка зберігає бажану біологічну активність материнської сполуки і не чинить будь-яких небажаних токсикологічних ефектів (дивись, наприклад, Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19). Приклади таких солей включають солі, отримані шляхом додавання кислоти, і солі, отримані шляхом додавання основи. Солі приєднання кислоти включають ті, що походять від нетоксичних неорганічних кислот, таких як соляна, азотна, фосфорна, сірчана, бромисто-воднева, йодисто-воднева, фосфориста і т.п., а також від нетоксичних органічних кислот, таких як аліфатичні моно- і дикарбонові кислоти, феніл-заміщені алканові кислоти, гідроксиалканові кислоти, ароматичні кислоти, аліфатичні і ароматичні сильфонові кислоти і т.п. Солі приєднання основи включають ті, що походять від лужноземельних металів, таких як натрій, калій, магній, кальцій і т.п., а також від нетоксичних органічних амінів, таких як N, N'-дибензилетилендиамін, N-метилглюкамін, хлорпрокаїн, холін, диетаноламін, етилендіамін, прокаїн і т.п. Фармацевтичні композиції за цим винаходом можуть вводитись окремо чи в складі комплексної терапії, тобто в комбінації з іншими препаратами. Наприклад, така комплексна терапія може включати композицію за цим винаходом і щонайменше один чи більше додатковий терапевтичний препарат, такий як протиракові препарати, які будуть описані далі. Фармацевтичні композиції за цим винаходом можуть також вводитись у поєднанні з променевою терапією та/або хірургією. Композиція за цим винаходом може вводитись різними способами, відомими в цій галузі. Як має бути зрозуміло спеціалістам, шлях та/або спосіб введення будуть залежати від бажаних результатів. Активні сполуки можуть бути доповнені носіями, які захищають їх від швидкого вивільнення, як це має місце в препаратах з контрольованим вивільненням, включаючи імплантати, трансдермальні накладки і мікроінкапсульовані системи доставки. Для цього можуть використовуватись біосумісні полімери, що біологічно розкладаються, такі як етилен вінілацетат, поліангідриди, полігліколева кислота, колаген, поліортоефіри і полімолочна кислота (полімер молочної кислоти). Спеціалістам в цій галузі відомо багато методів приготування таких препаратів, в тому числі і запатентованих. Дивись, наприклад, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. Щоб ввести сполуку за цим винаходом певними шляхами введення може знадобитись покрити цю сполуку матеріалом, що запобігає її інактивації, або вводити її одночасно з таким матеріалом. Наприклад, сполука може вводитись суб'єкту у відповідному носії, наприклад в ліпосомах чи в розріджувачі. Фармацевтично прийнятні розріджувачі включають сольові і водні буферні розчини. Ліпосоми включають емульсії вода-в-маслі-в-воді фірми CGF і звичайні ліпосоми (Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7:27). Фармацевтично прийнятні носії включають стерильні водні розчини чи дисперсії і стерильні порошки для приготування для негайного прийому стерильних ін'єкційних розчинів чи дисперсій. Використання таких середовищ і агентів для фармацевтично активних субстанцій є добре відомим спеціалістам в цій галузі. Крім випадків, коли будь-яке звичайне середовище чи агент є несумісними з активною сполукою, використання їх в фармацевтичних композиціях за цим винаходом є можливим. В такі композиції можуть включатись також допоміжні активні сполуки. Терапевтичні композиції типово мають бути стерильними і стабільними в умовах виготовлення і зберігання. Така композиція може мати вигляд розчину, мікроемульсії, ліпосоми чи іншої упорядкованої структури, придатної для того, щоб містити високу концентрацію препарату. Носій може бути розчинником чи середовищем для диспергування, яке містить, наприклад, воду, етиловий спирт, поліол (наприклад, гліцерин, пропилен гліколь і рідкий поліетилен гліколь і т.п.), а також їх придатні суміші. Необхідна текучість може підтримуватись, наприклад, за рахунок використання покриття, такого як лецитин, забезпечення необхідного розміру часток у випадку дисперсії і застосування сурфактантів. В багатьох випадках буває доцільно включати в композицію ізотонічні агенти, наприклад цукри, поліспирти, такі як манітол, сорбіт, чи натрію хлорид. Пролонговане всмоктування ін'єкційних композицій може забезпечуватись включенням до їх складу агента, який уповільнює всмоктування, наприклад моностеаратних солей чи желатину. 25 UA 99276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Стерильні ін'єкційні розчини можуть готуватись включенням активної сполуки в необхідній кількості у відповідний розчинник з одним інгредієнтом чи з комбінацією інгредієнтів, перелічених вище, як необхідно, з наступною стерилізацією мікрофільтрацією. Загалом, дисперсії готують включенням активної сполуки в стерильний носій, який містить основне середовище для диспергування і інші необхідні інгредієнти з тих, що перелічені вище. У випадку стерильних порошків для приготування стерильних ін'єкційних розчинів кращими методами приготування є вакуумна сушка і сушка заморожуванням (ліофілізація), які дають порошок активної сполуки плюс будь-який додатковий бажаний інгредієнт з його попередньо стерилізованого фільтруваннням розчину. Схеми введення регулюються таким чином, щоб забезпечити оптимальну бажану реакцію (наприклад, терапевтичну реакцію). Наприклад, може вводитись єдиний болюс, можуть вводитись кілька розділених доз за певний час чи доза може пропорційно зменшуватись або збільшуватись, що визначається потребами конкретної терапевтичної ситуації. Наприклад, людські антитіла за цим винаходом можуть вводитись один раз чи двічі на тиждень шляхом підшкірної ін'єкції або раз чи два на місяць шляхом підшкірної ін'єкції. Особливо доцільно мати парентеральні композиції у вигляді дозованої лікарської форми, що забезпечує легкість введення і однорідність дози. Дозована лікарська форма, як цей термін тут використовується, стосується фізично дискретних одиниць, призначених для введення за один раз суб'єктам, які лікуються; при цьому кожна одиниця містить наперед визначену кількість активної сполуки, розраховану так, щоб викликати бажаний терапевтичний ефект, у сполученні з необхідним фармацевтичним носієм. Технічні вимоги до дозованих лікарських форм за цим винаходом диктуються і безпосередньо залежать від (а) унікальних характеристик активної сполуки і того конкретного терапевтичного ефекту, який необхідно досягти, і (б) обмежень, які накладаються способом приготування такої активної сполуки з урахуванням чутливості індивідуумів. Приклади фармацевтично прийнятних антиоксидантів включають: (1) водорозчинні антиоксиданти, такі як аскорбінова кислота, цистеїну гідрохлорид, натрію бісульфат, натрію метабісульфіт, натрію сульфіт і т.п.; (2) антиоксиданти, розчинні в олії, такі як аскорбілпальмітат, бутильований оксианізол (ВНА), бутильований окситолуол (ВНТ), лецитин, пропилгалат, альфа-токоферол і т.п.; і (3) металохелатні агенти, такі як лимонна кислота, етилендіамін тетраоцтова кислота (EDTA), сорбіт, винна кислота, фосфорна кислота і т.п. Препарати, що містять терапевтичні композиції за цим винаходом, можуть бути призначеними для орального, назального, місцевого (включаючи трансбукальне і сублінгвальне), ректального, вагінального та/або парентерального введення. Для зручності ці препарати можуть бути у вигляді дозованої лікарської форми, і їх можна приготувати будьякими методами, відомими в галузі фармації. Кількість активного інгредієнту, яка може комбінуватись з матеріалом-носієм для отримання дозованої лікарської форми, буде коливатись в залежності від суб'єкта, якого лікують, і конкретного способу введення. Кількість активного інгредієнту, яка може комбінуватись з матеріалом-носієм для отримання дозованої лікарської форми, загалом буде відповідати кількості композиції, яка викликає терапевтичний ефект. Загалом, від ста відсотків ця кількість буде в межах від приблизно 0,001 відсотка до приблизно 90 відсотків активного інгредієнта, краще від приблизно 0,005 відсотка до приблизно 70 відсотків, а найкраще від приблизно 0,01 відсотка до приблизно 30 відсотків. Препарати за цим винаходом, призначені для вагінального введення, включають також песарії, тампони, креми, гелі, пасти, пінки чи аерозолі, які містять носії, визнані придатними для цієї галузі. Лікарські форми для місцевого чи трансдермального введення композицій за цим винаходом включають порошки, аерозолі, мазі, пасти, креми, лосьйони, гелі, розчини, накладки і лікарську форму для інгаляції. Активна сполука може змішуватись в стерильних умовах з фармацевтично прийнятним носієм, а також з будь-яким консервантом, буфером чи пропелентом, як може знадобитись. Вирази "парентеральне введення" чи "введений парентерально", як вони тут використовуються, означають спосіб введення, інший ніж ентеральне і місцеве введення, звичайно у вигляді ін'єкції чи інфузії, і включає, без обмеження, внутрішньовенне, внутрішньом'язове, інтраартеріальне, інтратекальне, інтракапсулярне, інтраорбітальне, інтракардіальне, інтрадермальне, інтраперитонеальне, транстрахеальне, підшкірне, субкутикулярне, інтраартикулярне, субкапсулярне, субарахноїдальне, інтраспинальне, епідуральне і інтрастернальне введення. Приклади придатних водних і неводних носіїв, які можуть бути використані в фармацевтичних композиціях за цим винаходом, включають воду, етиловий спирт, поліоли (такі як гліцерин, пропилен гліколь, поліетилен гліколь і т.п.) і їх суміші, рослинні олії, такі як оливкова 26 UA 99276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 олія, і придатні для ін'єкції органічні складні ефіри, такі як етил олеат. Необхідна текучість може досягатись, наприклад, шляхом використання покриття, такого як лецитин, забезпеченням необхідного розміру часток у випадку дисперсій і застосуванням сурфактантів. Такі композиції можуть містити також ад'юванти, такі як консерванти, зволожувачі, емульгатори і диспергатори. Конкретні приклади ад'ювантів, які є добре відомими спеціалістам в цій галузі, включають, наприклад, неорганічні ад'юванти (такі як солі алюмінію, наприклад фосфат алюмінію і гідроокис алюмінію), органічні ад'юванти (наприклад, сквален), ад'юванти на олійній основі, віросоми (наприклад, віросоми, які містять зв'язаний з мембраною гемаглютинін і нейрамінідазу, похідну від вірусу грипу). Відсутність мікроорганізмів може забезпечуватись як описаними вище методами стерилізації, так і включенням різних антибактеріальних і антифунгальних препаратів, наприклад парабену, хлорбутанолу, фенолсорбінової кислоти і т.п. Може бути бажаним включення в такі композиції також ізотонічних агентів, таких як цукри, натрію хлорид і т.п. Крім того, пролонговане всмоктування ін'єкційної фармацевтичної форми може досягатись включенням агентів, які уповільнюють всмоктування, таких як моностеарат алюмінію і желатин. Коли сполуки за цим винаходом вводяться як фармацевтичні препарати людям чи тваринам, вони можуть даватись окремо або як фармацевтична композиція, що містить, наприклад, від 0,001 до 90 % (краще від 0,05 до 70 %, так як від 0,01 до 30 %) активного інгредієнта в комбінації з фармацевтично прийнятним носієм. Незалежно від обраного шляху введення, сполукам за цим винаходом, які можуть використовуватись і відповідній гідратованій формі, та/або фармацевтичним композиціям за цим винаходом фармацевтично прийнятні лікарські форми можуть надаватись звичайними методами, відомими спеціалістам в цій галузі. Дійсний рівень дози активного інгредієнту в фармацевтичній композиції може змінюватись з метою досягнення такої кількості активного інгредієнту, яка є ефективною для забезпечення бажаної терапевтичної реакції для даного пацієнта, складу препарату і способу введення і не буде токсичною для цього пацієнта. Обраний рівень дози буде залежати від широкого кола фармакокінетичних чинників, включаючи активність тих конкретних композицій за цим винаходом, які використовуються, форми активного інгредієнту (складний ефір, сіль чи амід), шляху введення, тривалості введення, швидкості екскреції даної сполуки, тривалості лікування, інших препаратів, сполук та/або матеріалів, які використовуються одночасно, віку, статі, маси тіла, хвороби, загального стану здоров'я, анамнезу пацієнта і подібних чинників добре відомих медикам. Лікар чи ветеринар, які мають звичайну підготовку, можуть легко визначити і призначити ефективну кількість необхідної фармацевтичної композиції. Наприклад, лікар чи ветеринар можуть почати вводити сполуки за цим винаходом у фармацевтичній композиції з рівня, нижчого ніж той, який необхідний для досягнення бажаного терапевтичного ефекту, і поступово підвищувати дозу доки не буде досягнутий бажаний ефект. Загалом, доцільною добовою дозою композиції за цим винаходом буде така кількість сполуки, яка є найнижчою ефективною дозою, здатною забезпечити терапевтичний ефект. Така ефективна доза буде загалом залежати від описаних вище чинників. Краще, щоб введення було внутрішньовенним, внутрішньом'язовим, інтраперитонеальним чи підшкірним, причому краще вводити близько до місця-мішені. Якщо це бажано, ефективна добова доза терапевтичної композиції може вводитись за два, три, чотири, п'ять, шість чи більше прийомів через відповідні інтервали впродовж одного дня, факультативно у вигляді дозованих лікарських форм. Хоча можливо, щоб сполука за цим винаходом вводилась окремо, доцільно вводити цю сполуку у вигляді фармацевтичного препарату (композиції). Терапевтичні композиції можуть вводитись зо допомогою медичних пристроїв, відомих в цій галузі. Наприклад, в кращому варіанті здійснення терапевтична композиція за цим винаходом може вводитись за допомогою безголкового підшкірного ін'єкційного пристрою, описаного в патентах США №№ 5,399,163, 5,383,851, 5,312,335, 5,064,413, 4,941,880, 4,790,824 чи 4,596,556. Приклади добре відомих імплантатів і модулів, які можуть бути використані за цим винаходом, включають ті, що описані в патенті США № 4,487,603 (мікро-інфузійний насос, що імплантується, для видачі медикаменту з контрольованою швидкістю), в патенті США № 4.,486,194 (терапевтичний пристрій для введення медикаментів через шкіру), в патенті США № 4,447,233 (інфузійний насос для видачі медикаменту, який забезпечує точну швидкість вливання), в патенті США № 4,447,224 (інфузійний апарат, що імплантується, для постійної доставки препарату з регульованою швидкістю), в патенті США № 4,439,196 (багатокамерна осмотична система доставки препарату) і в патенті США № 4,475,196 (осмотична система доставки препарату). Спеціалістам в цій галузі відомо багато інших імплантатів, систем доставки і модулів. 27 UA 99276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В певних варіантах здійснення моноклональні антитіла за цим винаходом можуть входити в рецептуру, яка забезпечує належний їх розподіл in vivo. Наприклад, бар'єр кров-головний мозок виключає застосування багатьох сполук з сильною гідрофільністю. Щоб сполуки за цим винаходом могли перетинати цей бар'єр (якщо це бажано), вони можуть вводитись у вигляді, наприклад, ліпосом. Способи виготовлення ліпосом описані, наприклад, в патентах США №№ 4,522,811; 5,374,548; і 5,399,331. Ліпосоми можуть включати одну чи більше складових, які вибірково транспортуються до специфічних клітин чи органів, тим самим посилюючи цільову доставку препаратів (дивись, наприклад, V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Показові спрямовуючі складові ліпосом включають фолат чи біотин (дивись, наприклад, патент США № 5,416,016, виданий Low et al.); манозиди (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); антитіла (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); рецептор протеїну А сурфактанту (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134). Вони можуть включати препарати за цим винаходом, а також компоненти винайдених молекул (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); дивись також K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273. V. Методи використання антитіл за даним винаходом Даний винахід стосується також методів використання антитіл і їх частин, що зв'язують ErbB3, в різноманітних діагностичних і терапевтичних застосуваннях ex vivo і in vivo. Наприклад, антитіла за цим винаходом можуть бути використані для лікування хвороби, що асоціюється із залежним від ErbB3 проведенням сигналів, включаючи різновиди раку. В одному варіанті здійснення даний винахід стосується способу лікування хвороби, що асоціюється із залежним від ErbB3 проведенням сигналів, шляхом введення суб'єкту антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, за цим винаходом в кількості, яка є ефективною в лікуванні цієї хвороби. Відповідні хвороби включають, наприклад, різновиди раку, включаючи, але не обмежуючись ними, меланому, рак молочної залози, рак яєчнику, світлоклітинну карциному, рак шлунково-кишкового тракту, рак ободової кишки, рак легень і рак передміхурової залози. Таке антитіло може вводитись окремо чи разом з іншим терапевтичним препаратом, який діє спільно чи в синергізмі з цим антитілом в лікуванні хвороби, що асоціюється з опосередкованим ErbB3 проведенням сигналів. Такі терапевтичні препарати включають, наприклад, протиракові препарати, описані далі (наприклад, цитотоксини, хіміотерапевтичні препарати, низькомолекулярні препарати і опромінення). В іншому варіанті здійснення даний винахід стосується способу діагностики хвороби (наприклад, раку), що асоціюється з підвищеною регуляцією ErbB3 у суб'єкта, шляхом контактування антитіл чи їх частин, що зв'язують антиген, за цим винаходом (наприклад, ex vivo чи in vivo) з клітинами від цього суб'єкта і визначення рівня зв'язування з ErbB3 на цих клітинах. Аномально високі рівні зв'язування з ErbB3 засвідчують, що даний суб'єкт має хворобу, що асоціюється з підвищеною регуляцією ErbB3. В об'єм даного винаходу входять також набори, які містять антитіла і їх частини, що зв'язують антиген, за цим винаходом і, факультативно, інструкцію щодо їх використання в лікуванні хвороби, що асоціюється з підвищеною регуляцією ErbB3 та/або залежного від ErbB3 проведення сигналів. Такі набори можуть включати етикетку, інформація на якій стосується призначення вмісту набору. Термін "етикетка" включає будь-який напис, маркетингові матеріали чи матеріал, записаний на плівку, який розміщується зверху чи всередині набору або супроводжує набір якимось іншим способом. Інші варіанти здійснення даного винаходу описані в наступних Прикладах. Даний винахід ілюструється також наступними Прикладами, які не мають вважатись такими, що обмежують його об'єм. Зміст Переліку послідовностей, малюнків і всіх посилань, патентів і опублікованих патентних заявок вважаються включеними в цей опис в повному об'ємі за посиланням. Приклади Матеріали і методі В цих прикладах були використані наступні матеріали і методи, якщо не вказувалось на інше. Загалом, практика здійснення даного винаходу передбачає використання, якщо не вказується на інше, звичайних методів хімії, молекулярної біології, біотехнології на основі рекомбінантної ДНК, імунології (зокрема, наприклад, технології отримання антитіл) і стандартних методик приготування поліпептидів. Дивись, наприклад, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A 28
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюIsolated monoclonal antibody which binds to erbb3 and uses thereof
Автори англійськоюSchoeberl, Birgit, Nielsen, Ulrik, Feldhaus, Michael, Arumugam Muruganandam, David Buckler
Назва патенту російськоюВыделенное моноклональное антитело, которое связывается с erbb3, и его применение
Автори російськоюШоэберл Биргит, Нильсен Ульрик, Фелдхаус Майкл, Арумугам Муруганандам, Девид Баклер
МПК / Мітки
МПК: C12N 15/13, G01N 33/577, C07K 16/28, A61P 35/00, A61K 39/395, C12N 5/20
Мітки: антитіло, яке, моноклональне, erbb3, зв'язується, виділене, застосування
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/95-99276-vidilene-monoklonalne-antitilo-yake-zvyazuehtsya-z-erbb3-ta-jjogo-zastosuvannya.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Виділене моноклональне антитіло, яке зв’язується з erbb3, та його застосування</a>
Виділене моноклональне антитіло людини, яке зв’язується з сd20, та його застосування
Номер патенту: 93478
Опубліковано: 25.02.2011
Автори: Петерсен Йорген, Ван де Вінкель Ян Г. Й., Хуанг Хайчун, Руулс Зігрід, Баадсгаард Оле Д. М. С., Гленні Мартін, Паррен Пауль, Тілінг Джесіка
МПК: A61P 35/00, C07K 16/28, C07K 16/42, A61K 39/395
Мітки: виділене, моноклональне, яке, антитіло, зв'язується, застосування, людини, сd20
Формула / Реферат:
1. Виділене моноклональне антитіло людини, яке зв’язується з CD20 людини і з епітопом на CD20, що не включає або не потребує амінокислотного залишка проліну у положенні 172, але що включає або потребує амінокислотні залишки аспарагіну у положенні 163 та у положенні 166 і яке включає:(і) CDR1-ділянку важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, зазначену в SEQ ID NO:13, CDR2-ділянку важкого ланцюга, що має амінокислотну...
Моноклональне антитіло, яке спричиняє апоптоз кров’яних клітин, що містять ядро та інтегрин-пов’язаний протеїн людини (іпп), фрагмент моноклонального антитіла, гібридома, яка продукує моноклональне антитіло (ва
Номер патенту: 72192
Опубліковано: 15.02.2005
Автори: Фукушіма Наоші, Уно Шінсуке
МПК: C12P 21/08, C07K 16/28, C12N 5/20
Мітки: антитіла, спричиняє, апоптоз, продукує, гібридома, яка, протеїн, кров'яних, людини, яке, інтегрин-пов'язаний, ва, фрагмент, містять, моноклонального, клітин, моноклональне, ядро, іпп, антитіло
Формула / Реферат:
1. Моноклональне антитіло, яке зв’язується із інтегрин-пов’язаним протеїном людини (ІПП) і спричиняє апоптоз кров'яних клітин, що містять ядро та ІПП.2. Моноклональне антитіло за п.1, яке відрізняється тим, що антитіло отримують способом, що включає:а) імунізацію тварин з використанням ІПП людини як сенсибілізуючого антигена,б) одержання гібридом;в) відбір антитіл, що розпізнають ІПП людини та спричиняють апоптоз...
Виділене антитіло, яке зв’язується з her-3, та його застосування
Номер патенту: 97473
Опубліковано: 27.02.2012
Автори: Хартманн Сузанн, Радінскій Боб, Боргез Ерік, Фріман Дан, Роте Майк, Тредер Мартін
МПК: G01N 33/577, C07K 16/28, C12N 15/63, A61K 39/395, C12N 15/13, A61P 35/00, C12N 5/10, C12P 21/08
Мітки: her-3, застосування, виділене, антитіло, яке, зв'язується
Формула / Реферат:
1. Виділений зв'язувальний білок, який зв'язується з HER-3, який містить:амінокислотну послідовність важкого ланцюга, яка містить щонайменше одну з гіперваріабельних ділянок (CDR), вибрану з групи, до складу якої входять: (a) CDRH1, представлені ПОСЛІДОВНОСТЯМИ: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 46, 50, 60, 62, 66, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162,...
Виділене антитіло, яке специфічно зв’язує gdf-8, та його застосування
Номер патенту: 91815
Опубліковано: 10.09.2010
Автори: Вальге-Архер Фія, Расселл Керолайн, Філд Енн, Гроув-Бріджес Крісті, Вольфман Нейл М., Девіс Монік В., Сонг Кенінг, Фельдман Гейтруіда М.
МПК: A61K 39/395, A61P 3/00, A61P 21/00, C07K 16/22
Мітки: антитіло, виділене, застосування, зв'язує, яке, специфічно, gdf-8
Формула / Реферат:
1. Виділене антитіло, яке специфічно зв'язує GDF-8, що містить щонайменше одну амінокислотну послідовність, вибрану із групи, що складається з:a) SEQ ID NO:14;b) SEQ ID NO:26;c) амінокислотної послідовності, що містить SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35 і SEQ ID NO:36, де одна або декілька амінокислот у SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35 або SEQ ID NO:36...
Виділене повністю людське моноклональне cd3 антитіло
Номер патенту: 94211
Опубліковано: 26.04.2011
Автори: Елсон Грег Крістофер Ендрю, Леже Олів'є, Дін Ян, Коско-Вільбуа Марі, Мах Бернар, Фішер Ніколас
МПК: A61K 39/395, A61P 37/00, C07K 16/28
Мітки: виділене, людське, повністю, антитіло, моноклональне
Формула / Реферат:
1. Виділене повністю людське моноклональне CD3 антитіло або його імунологічно активний фрагмент, яке включає комбінацію важкого і легкого ланцюгів, вибрану із групи, яку складають:(i) важкий ланцюг, який включає гіперваріабельну ділянку 1 важкого ланцюга (VH CDR1), яка має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 27, гіперваріабельну ділянку 2 важкого ланцюга (VH CDR2), яка має амінокислотну послідовність...
Попередній патент: Композиція для очищення води, спосіб її використання та застосування вказаної композиції
Наступний патент: Підшипник для вала конусної дробарки і спосіб регулювання ширини розмельної щілини в дробарці
Випадковий патент: Спосіб видобутку вуглеводневої сировини