Регуляторна молекула нуклеїнової кислоти для посилення насінно-специфічної та/або насінно-селективної експресії генів у рослинах

Реферат: Винахід належить до молекулярної біології рослин і забезпечує спосіб одержання високоекспресійного насінно-специфічного та/або насінно-селективного промотору та одержання рослини з посиленою насінно-специфічною та/або насінно-селективною експресією нуклеїнових кислот, причому нуклеїнові кислоти, які посилюють експресію нуклеїнових кислот (NEENA), є гетерологічними і функціонально зв'язаними з промоторами і/або включеними у рослини. UA 110018 C2 (12) UA 110018 C2 UA 110018 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Опис винаходу Даний винахід належить до галузі молекулярної біології рослин і забезпечує способи одержання високоекспресійних насінно-специфічних та/або насінно-селективних промоторів та одержання рослин з посиленою насінно-специфічною та/або насінно-селективною експресією нуклеїнових кислот, причому нуклеїнові кислоти, які посилюють експресію нуклеїнових кислот (NEENA), є функціонально зв’язаними з зазначеними промоторами та/або включеними у рослини. Експресія трансгенів у рослинах зазнає сильного впливу різних зовнішніх та внутрішніх чинників в результаті чого експресія трансгенів стає мінливою й непередбачуваною. Часто доводиться одержувати й аналізувати велику кількість трансформантів для розпізнавання ліній з потрібною силою експресії. Оскільки трансформація та відбір ліній з потрібною силою експресії є дорогою й трудомісткою операцією, існує потреба у високій експресії одного або кількох трансгенів у рослині. Ця проблема є особливо очевидною, коли кілька генів мають бути узгоджено експресовані у трансгенній рослині з метою досягнення специфічного ефекту, оскільки треба виявити рослину, в якій сильно експресується кожен з генів. Наприклад, експресія трансгена може виявляти значні коливання, залежно від конструкції послідовності та ефектів позиції генів місця інсерції T-ДНК в окремих випадках перетворення. Сильні промотори дозволяють частково долати ці проблеми. Однак наявність прийнятних промоторів, які виявляють сильну експресію з потрібною специфічністю, часто буває обмеженою. Для забезпечення наявності достатніх промоторів з потрібною специфічністю експресії, здійснюють ідентифікацію та характеризацію додаткових промоторів, що дозволяє заповнити цей пропуск. Однак природна наявність промоторів з відповідною специфічністю та силою і довготривала процедура характеризації можливих промоторів перешкоджає ідентифікації прийнятних нових промоторів. У пошуках шляхів подолання цих проблем було виявлено, що різні генетичні елементи та/або мотиви позитивно впливають на експресію генів. Серед них було розпізнано деякі інтрони як генетичні елементи з сильним потенціалом поліпшення експресії генів. Хоча механізм ще здебільшого є нез’ясованим, було продемонстровано, що деякі інтрони позитивно впливають на кількість зрілої мРНК у стійкому стані, можливо, через посилену транскрипційну активність, поліпшене визрівання мРНК, посилений ядерний експорт мРНК та/або поліпшену ініціацію трансляції (наприклад, Huang and Gorman, 1990; Le Hir et al., 2003; Nott et al., 2004). Оскільки було виявлено, що лише вибрані інтрони посилюють експресію, сплайсинг як такий навряд чи відповідає за ефект, що спостерігається. Посилення експресії генів, яке спостерігається після функціонального зв’язування інтронів з промоторами, називається опосередкованим інтроном посиленням (IME) експресії генів і виявляється у різних однодольних рослинах (наприклад, Callis et al., 1987; Vasil et al., 1989; Bruce et al., 1990; Lu et al., 2008) та дводольних рослинах (наприклад, Chung et al., 2006; Kim et al., 2006; Rose et al., 2008). У цьому відношенні було продемонстровано, що позиція інтрона відносно сайта початку трансляції (ATG) є ключовою для опосередкованого інтроном посилення експресії генів (Rose et al., 2004). Крім потенціалу посилення експресії генів, деякі інтрони також продемонстрували здатність впливати на тканинну специфічність у їх природному нуклеотидному середовищі у рослинах. Було виявлено, що експресія генів-репортерів залежить від присутності геномних ділянок, які містять до двох інтронів (Sieburth et al., 1997; Wang et al., 2004). Також повідомлялося, що 5’UTR інтрони мають значення для належної функціональності промоторних елементів, можливо, через тканинно-специфічні елементи генного контролю, які містяться в інтронах (Fu et al.,1995a; Fu et al., 1995b; Vitale et al., 2003; Kim et al., 2006). Однак ці дослідження також демонструють, що комбінація інтронів з гетерологічними промоторами може мати сильний негативний вплив на силу та/або специфічність експресії генів (Vitale et al., 2003; Kim et al., 2006, документи WO2006/003186, WO2007/098042). Наприклад, сильно конститутивний промотор вірусу мозаїки цвітної капусти CaMV35S зазнає негативного впливу через комбінацію з 5’UTR інтроном кунжуту SeFAD2 (Kim et al., 2006). На відміну від цих спостережень, у деяких документах демонструється посилення експресії нуклеїнової кислоти під дією IME без впливу на тканинну специфічність відповідного промотора (Schünmann et al., 2004). Інтрони або NEENA, які посилюють насінно-специфічну та/або насінно-селективну експресію, будучи функціонально зв’язаними з гетерологічним промотором, у джерелах існуючого рівня техніки не описувалися. У даній заявці описуються інші молекули нуклеїнових кислот, які посилюють експресію зазначених промоторів без зашкодження їх специфічності після функціонального зв’язування з насінно-специфічні та/або насінно-селективні промотори. Ці молекули нуклеїнових кислоти описуються у даній заявці як “нуклеїнові кислоти, які посилюють експресію нуклеїнових кислот” 1 UA 110018 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (NEENA). Інтрони мають характерну особливість, яка полягає у сплайсингу з відповідної премРНК. Натомість нуклеїнові кислоти, представлені у даній заявці, не обов’язково мають бути включені до мРНК або, у разі присутності в мРНК, не обов’язково мають бути сплайсовані з мРНК для посилення експресії, зумовленої промотором, з яким є функціонально зв’язаними NEENA. Детальний опис винаходу Перший варіант втілення винаходу включає спосіб одержання високоекспресійного насінноспецифічного та/або насінно-селективного промотора, причому спосіб включає функціональне зв’язування з промотором однієї або кількох молекул нуклеїнової кислоти, яка посилює експресію нуклеїнових кислот (NEENA), що включає i) молекулу нуклеїнової кислоти, яка має послідовність, визначену у будь-якій з послідовностей SEQ ID NO: з 1 по 15, або ii) молекулу нуклеїнової кислоти, яка має послідовність з ідентичністю 80% або більше будьякій з послідовностей, визначених у SEQ ID NO: з 1 по 15, в оптимальному варіанті ідентичність складає 85% або більше, у ще кращому варіанті ідентичність складає 90% або більше, у ще кращому варіанті ідентичність складає 95% або більше, 96% або більше, 97% або більше, 98% або більше або 99% або більше, у найкращому варіанті ідентичність складає 100% будь-якій з послідовностей, визначених у SEQ ID NO: з 1 по 15 або iii) фрагмент зі 100 або більшої кількості послідовних основ, в оптимальному варіанті – 150 або більшої кількості послідовних основ, у ще кращому варіанті – 200 послідовних основ або більше, у ще кращому варіанті – 250 або більшої кількості послідовних основ молекули нуклеїнової кислоти i) або ii), який має активність посилення експресії, наприклад, 65% або більше, в оптимальному варіанті – 70% або більше, у ще кращому варіанті – 75% або більше, у ще кращому варіанті – 80% або більше, 85% або більше або 90% або більше, у найкращому варіанті – має 95% або більше активності посилення експресії відносно показника відповідної молекули нуклеїнової кислоти, яка має послідовність згідно з будь-якою з послідовностей, визначених у SEQ ID NO: з 1 по 15, або iv) молекулу нуклеїнової кислоти, яка є комплементом або зворотним комплементом будьякої з вищезгаданих молекул нуклеїнової кислоти з i) по iii), або v) молекулу нуклеїнової кислоти, яку одержують шляхом ПЛР з застосуванням олігонуклеотидних праймерів, описаних у SEQ ID NO: з 20 по 29, з 34 по 41, з 44 по 51 і з 54 по 57, як показано у Таблиці 2, або vi) молекулу нуклеїнової кислоти з 100 нуклеотидів або більше, 150 нуклеотидів або більше, 200 нуклеотидів або більше або 250 нуклеотидів або більше, яка гібридизується в умовах, рівноцінних гібридизації у 7% додецилсульфату натрію (SDS), 0,5 M NaPO4, 1 мM EDTA при 50 °C з промиванням у 2 X SSC, 0,1% SDS при 50 °C або 65 °C, в оптимальному варіанті – 65 °C, з молекулою нуклеїнової кислоти, яка включає принаймні 50, в оптимальному варіанті – принаймні 100, у ще кращому варіанті – принаймні 150, у ще кращому варіанті – принаймні 200, у найкращому варіанті – принаймні 250 послідовних нуклеотидів нуклеотидної послідовності, що посилює транскрипцію, описаної у SEQ ID NO: з 1 по 15, або її комплемента. В оптимальному варіанті зазначена молекула нуклеїнової кислоти гібридизується в умовах, рівноцінних гібридизації у 7% додецилсульфату натрію (SDS), 0,5 M NaPO4, 1 мM EDTA при 50 °C з промиванням у 1 X SSC, 0,1% SDS при 50 °C або 65 °C, в оптимальному варіанті – 65 °C, з молекулою нуклеїнової кислоти, яка включає принаймні 50, в оптимальному варіанті – принаймні 100, у ще кращому варіанті – принаймні 150, у ще кращому варіанті – принаймні 200, у найкращому варіанті – принаймні 250 послідовних нуклеотидів нуклеотидної послідовності, що посилює транскрипцію, описаної у SEQ ID NO: з 1 по 15, або її комплементом, у ще кращому варіанті зазначена молекула нуклеїнової кислоти гібридизується в умовах, рівноцінних гібридизації у 7% додецилсульфату натрію (SDS), 0,5 M NaPO4, 1 мM EDTA при 50 °C з промиванням у 0,1 X SSC, 0,1% SDS при 50 °C або 65 °C, в оптимальному варіанті – 65 °C, з молекулою нуклеїнової кислоти, яка включає принаймні 50, в оптимальному варіанті – принаймні 100, у ще кращому варіанті – принаймні 150, у ще кращому варіанті – принаймні 200, у найкращому варіанті – принаймні 250 послідовних нуклеотидів нуклеотидної послідовності, що посилює транскрипцію, описаної у будь-якій з послідовностей, визначених у SEQ ID NO: з 1 по 15, або її комплементом. В одному варіанті втілення одна або кілька NEENA є гетерологічними промоторові, з яким вони є функціонально зв’язаними. Як описано вище під пунктом v), молекула нуклеїнової кислоти, яку одержують шляхом ПЛР з застосуванням олігонуклеотидів, визначених у SEQ ID з 20 по 29, з 34 по 41, з 44 по 51 і з 54 по 57, як показано у Таблиці 2 може бути одержана, наприклад, з геномної ДНК рослин 2 UA 110018 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Arabidopsis, таких, як A. thaliana, з застосуванням умов, описаних нижче у Прикладі 1. Спеціалістам у даній галузі відомо про можливість зміну у температурному профілі, кількості циклів та/або складу або концентрації буфера для одержання відповідної молекули NEENA. Конкретна комбінація олігонуклеотидів, яка має застосовуватись у відповідній ПЛР-реакції для одержання відповідної молекули NEENA, описується у Таблиці 2. Спеціалістам у даній галузі відомі способи перетворення односпрямованого промотора на двоспрямований та способи застосування комплемента або зворотного комплемента послідовності промотора для створення промотора, який має таку саму специфічність, що й у первісної послідовності. Такі способи описуються, наприклад, для конститутивних, а також індуцибельних промоторів у публікації Xie et al. (2001) “Bidirectionalization of polar promoters in plants”, Nature Biotechnology 19, стор. 677 – 679. Автори описують, що достатньо додати мінімальний промотор на 5´-кінці будь-якого промотора для одержання промотора, який контролює експресію в обох напрямках з однаковою специфічністю. Таким чином, високоекспресійний промотор, функціонально зв’язаний з NEENA, як описано вище, функціонує у комплементі або зворотному комплементі, а отже, NEENA також є функціональною у комплементі або зворотному комплементі. В принципі, NEENA може бути функціонально зв’язана з будь-яким промотором, таким як тканинно-специфічні, індуцибельні, специфічні для розвитку або конститутивні промотори. Відповідна NEENA веде до посиленої насінно-специфічної та/або насінно-селективної експресії гетерологічної нуклеїнової кислоти під контролем відповідного промотора, з яким одна або кілька NEENA є функціонально зв’язаними. Посилення експресії промоторів, відмінних від насінно-специфічних та/або насінно-селективних промоторів, наприклад, конститутивних промоторів або промоторів з відмінною тканинною специфічністю, надає цим промоторам специфічності. Експресія нуклеїнової кислоти під контролем відповідного промотора значною мірою підвищується у насінні, у якому транскрипт зазначеної нуклеїнової кислоти може не виявлятися або лише слабо виявлятися без NEENA, функціонально зв’язаної з її промотором. Отже, тканинно-специфічний або специфічний для розвитку або будь-який інший промотор може бути перетворений на насінно-специфічний та/або насінно-селективний промотор через функціональне зв’язування однієї або кількох молекул NEENA, як було описано вище, з зазначеним промотором. Таким чином, ще один варіант втілення винаходу полягає у забезпеченні способу надання специфічності будь-якого даного промотора, що функціонує у рослині, насінно-специфічному та/або насінно-селективному промоторові шляхом зв’язування відповідного промотора з молекулою NEENA, яка включає послідовність, описану вище під пунктами з i) по vi). В оптимальному варіанті одна або кілька NEENA є функціонально зв’язаними з будь-яким насінно-специфічним та/або насінно-селективним промотором і посилюють експресію молекули нуклеїнової кислоти, яка перебуває під контролем зазначеного промотора. Насінно-специфічні та/або насінно-селективні промотори, які мають застосовуватися за будь-яким способом згідно з винаходом, можуть походити з рослин, наприклад, однодольних або дводольних рослин, з бактерій та/або вірусів, або можуть бути синтетичними промоторами. Насінно-специфічними та/або насінно-селективними промоторами, які мають застосовуватися, є, наприклад, SBPпромотор з Vicia faba, промотор невідомого насінного білка (USP) з Vicia faba, промотор напіну з Brassica napus, conlinin-промотор з Linum usitatissmum, промотор з гена A. thaliana At5g01670, який кодує подібний до пероксиредоксину білок, промотор подібного до пероксиредоксину білка з Linum usitatissmum, промотор глобуліноподібного білка з Brassica napus, промотор arcelin5-1 з Phaseolus vulgaris, промотор зеїну з Zea maize, промотор глобуліну з Zea maize, промотор pKG86 з Zea maize, як описано нижче у Прикладі 6, і т. ін. Високоекспресійні насінно-специфічні та/або насінно-селективні промотори згідно з винаходом, функціонально зв’язані з NEENA, можуть застосовуватись у будь-якій рослині, включаючи, наприклад, мох, папороть, голонасінні або покритонасінні, наприклад, однодольні або дводольні рослини. В оптимальному варіанті втілення зазначений промотор згідно з винаходом, функціонально зв’язаний з NEENA, може застосовуватись в однодольних або дводольних рослинах, в оптимальному варіанті – у культурних рослинах, таких, як кукурудза, соя, канола, бавовна, картопля, цукровий буряк, рис, пшениця, сорго, ячмінь, бананові, цукрова тростина, міскантус і т. ін. В оптимальному варіанті втілення винаходу зазначений промотор, який є функціонально зв’язаним з NEENA, може застосовуватися в однодольних культурних рослинах, таких, як кукурудза, рис, пшениця, сорго, ячмінь, бананові, міскантус або цукрова тростина. У варіанті втілення, якому віддають особливу перевагу, промотор, функціонально зв’язаний з NEENA, може застосовуватись у дводольних культурних рослинах, таких, як соя, канола, бавовна або картопля. 3 UA 110018 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Високоекспресійний насінно-специфічний та/або насінно-селективний промотор, який застосовують згідно з цією заявкою, означає, наприклад, промотор, який є функціонально зв’язаним з NEENA, викликаючи посилену насінно-специфічну та/або насінно-селективну експресію промотора у насінні рослини або його частині, причому накопичення в насінні РНК або швидкість синтезу РНК, що походить з молекули нуклеїнової кислоти під контролем відповідного промотора, функціонально зв’язаного з NEENA, є вищими, в оптимальному варіанті – суттєво вищими за експресію у насінні, викликану таким самим промотором, у якому відсутня NEENA згідно з винаходом. В оптимальному варіанті кількість РНК відповідної нуклеїнової кислоти та/або швидкість синтезу РНК та/або стійкість РНК у рослині підвищується на 50% або більше, наприклад, 100% або більше, в оптимальному варіанті – 200% або більше, у ще кращому варіанті – у 5 разів або більше, у ще кращому варіанті – у 10 разів або більше, у найкращому варіанті – у 20 разів або більше, наприклад, у 50 разів, порівняно з контрольною рослиною такого самого віку, вирощуваною за таких самих умов, які включають такий самий насінно-специфічний та/або насінно-селективний промотор, коли останній не є функціонально зв’язаним з NEENA згідно з винаходом. У контексті даного опису значно вищий означає статистичну значущість, спосіб визначення якої є відомим спеціалістам у даній галузі, наприклад, з застосуванням статистичних критеріїв, таких, як критерій Ст’юдента, до відповідних наборів даних. Способи виявлення експресії, яка забезпечується промотором, є відомими спеціалістам у даній галузі. Наприклад, промотор може бути функціонально зв’язаним з маркерним геном, таким як GUS, GFP або люцифераза, і у рослині або її частині може визначатись активність відповідного білка, кодованого відповідним маркерним геном. Як типовий приклад нижче детально описується спосіб виявлення люциферази. Іншими способами є, наприклад, вимірювання рівня у стійкому стані або вимірювання швидкості синтезу РНК молекули нуклеїнової кислоти під контролем промотора з застосуванням способів, відомих спеціалістам у даній галузі, наприклад, нозерн-блоттингу, кількісної ПЛР, кінетичних аналізів або інших способів, описаних у джерелах, які належать до даної галузі. Спеціалістам у даній галузі відомі різні способи функціонального зв’язування двох або більшої кількості молекул нуклеїнових кислот. Такі способи можуть включати рестрикцію / лігування, лігазно-незалежне клонування, рекомбінування, рекомбінацію або синтез. Можуть застосовуватися й інші способи функціонального зв’язування двох або більшої кількості молекул нуклеїнових кислот. Іншим варіантом втілення даного винаходу є спосіб одержання рослини або її частини з посиленою, порівняно з відповідною контрольною рослиною або її частиною, насінноспецифічною та/або насінно-селективною експресією однієї або кількох молекул нуклеїнової кислоти, який включає етапи включення у рослину або її частину однієї або кількох NEENA, які включають молекулу нуклеїнової кислоти, як визначено вище під пунктами з i) по vi), та функціонального зв’язування зазначених однієї або кількох NEENA з промотором, в оптимальному варіанті – насінно-специфічним та/або насінно-селективним промотором, і з молекулою нуклеїнової кислоти, що перебуває під контролем зазначеного промотора, в оптимальному варіанті – насінно-специфічного та/або насінно-селективного промотора, причому NEENA є гетерологічною зазначеній молекулі нуклеїнової кислоти. NEENA може бути гетерологічною молекулою нуклеїнової кислоти, яка перебуває під контролем зазначеного промотора, з яким NEENA є функціонально зв’язаною, або вона може бути гетерологічною як промоторові, так і молекулі нуклеїнової кислоти під контролем зазначеного промотора. Термін "гетерологічна” стосовно молекули нуклеїнової кислоти або ДНК означає молекулу нуклеїнової кислоти, яка є функціонально зв’язаною, або підданою маніпуляції для функціонального зв’язування, з молекулою нуклеїнової кислоти, з якою вона є функціонально зв’язаною у природі, або з якою вона у природних умовах є функціонально зв’язаною в іншому місці. Наприклад, NEENA згідно з винаходом у природному середовищі є функціонально зв’язаною з її природним промотором, тоді як згідно з винаходом, вона є зв’язаною з іншим промотором, який може походити з того самого організму, з іншого організму, або може бути синтетичним промотором. Це також може означати, що NEENA згідно з даним винаходом зв’язується з її природним промотором, але молекула нуклеїнової кислоти під контролем зазначеного промотора є гетерологічною промоторові, який включає природну NEENA. Також слід розуміти, що промотор та/або молекула нуклеїнової кислоти під контролем зазначеного промотора, що функціонально зв’язується з NEENA згідно з винаходом, є гетерологічними зазначеній NEENA, оскільки їхня послідовність піддавалася маніпуляції, наприклад, мутації, такій, як інсерція, делеція і т. ін., таким чином, що природна послідовність промотора та/або 4 UA 110018 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 молекули нуклеїнової кислоти під контролем зазначеного промотора є модифікованою, а отже, стала гетерологічною NEENA згідно з винаходом. Також слід розуміти, що NEENA є гетерологічною нуклеїновій кислоті, з якою вона є функціонально зв’язаною, коли NEENA є функціонально зв’язаною з природним промотором, причому позиція NEENA відносно зазначеного промотора є зміненою таким чином, що промотор після такої маніпуляції демонструє вищу експресію. Рослина, яка демонструє посилену насінно-специфічну та/або насінно-селективну експресію молекули нуклеїнової кислоти, у контексті даного опису означає рослину, яка має вищу, в оптимальному варіанті – статистично значно вищу насінно-специфічну та/або насінноселективну експресію молекули нуклеїнової кислоти порівняно з контрольною рослиною, вирощуваною за таких самих умов без відповідної NEENA, функціонально зв’язаної з відповідною молекулою нуклеїнової кислоти. Такою контрольною рослиною може бути рослина дикого типу або трансгенна рослина, яка включає такий самий промотор, який контролює такий самий ген, що й у рослині згідно з винаходом, у якій промотор не є зв’язаним з NEENA згідно з винаходом. У контексті даного винаходу одержання рослини включає способи стійкої трансформації, такі як включення послідовності рекомбінантної ДНК у рослину або її частину за допомогою опосередкованої Agrobacterium трансформації, протопластної трансформації, бомбардування частинками або іншого подібного способу та, необов’язково, наступної регенерації трансгенної рослини. Воно також включає способи тимчасової трансформації рослини або її частини, наприклад, вірусну інфекцію або інфільтрацію Agrobacterium. Спеціалістам у даній галузі відомі інші способи стійкої та/або тимчасової трансформації рослини або її частини. Для одержання рослини згідно з винаходом також можуть застосовуватися такі підходи, як селекція або злиття протопластів, і охоплюються обсягом даного винаходу. Спосіб згідно з винаходом може застосовуватися до будь-якої рослини, наприклад, голонасінних або покритонасінних, в оптимальному варіанті – покритонасінних, наприклад, дводольних або однодольних рослин, в оптимальному варіанті – дводольних рослин. Оптимальними однодольними рослинами є, наприклад, кукурудза, пшениця, рис, ячмінь, сорго, бананові, цукрова тростина, міскантус та коротконіжка, причому особливу перевагу віддають таким однодольним рослинам, як кукурудза, пшениця та рис. Оптимальними дводольними рослинами є, наприклад, соя, рапс, канола, льон, бавовна, картопля, цукровий буряк, календула та Arabidopsis, причому особливу перевагу віддають таким дводольним рослинам, як соя, рапс, канола та картопля. В одному варіанті втілення винаходу визначені вище способи включають етапи a) включення однієї або кількох NEENA, які містять молекулу нуклеїнової кислоти, як визначено вище у пунктах з i) по vi), у рослину або її частину та b) об’єднання зазначених однієї або кількох NEENA у геном зазначеної рослини або її частини, таким чином, щоб зазначена одна або кілька NEENA були функціонально зв’язаними з ендогенною, в оптимальному варіанті – насінно-специфічною та/або насінно-селективною експресованою нуклеїновою кислотою, гетерологічною зазначеним одній або кільком NEENA, і, необов’язково, c) регенерації рослини або її частини, що включає зазначені одну або кілька NEENA з зазначеної трансформованої клітини. Одна або кілька молекул NEENA можуть бути включені у рослину або її частину за допомогою бомбардування частинками, електропорації протопластів, вірусної інфекції, опосередкованої Agrobacterium трансформації або будь-яким іншим способом, відомим спеціалістам у даній галузі. Молекула NEENA може бути включена, наприклад, у плазміду або вірусну ДНК або вірусну РНК. Молекула NEENA також може перебувати на BAC, YAC або штучній хромосомі перед включенням у рослину або частину рослини. Вона також може бути включена як лінійна молекула нуклеїнової кислоти, яка включає послідовність NEENA, причому додаткові послідовності можуть бути присутні суміжно з послідовністю NEENA на молекулі нуклеїнової кислоти. Ці послідовності, які межують з послідовністю NEENA, можуть включати від приблизно 20 п. о., наприклад, від 20 п. о. до кількох сотень пар основ, наприклад, 100 п. о. або більше, і можуть сприяти включенню у геном, наприклад, шляхом гомологічної рекомбінації. Може застосовуватися будь-який інший спосіб включення геному, чи то способи спрямованого включення, такі як гомологічна рекомбінація, чи способи випадкового включення, такі як незаконна рекомбінація. Ендогенна, в оптимальному варіанті – насінно-специфічна та/або насінно-селективна експресована нуклеїнова кислота, з якою може функціонально зв’язуватися молекула NEENA, може бути будь-якою нуклеїновою кислотою, в оптимальному варіанті – будь-якою насінно 5 UA 110018 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 специфічною та/або насінно-селективною експресованою молекулою нуклеїнової кислоти. Молекула нуклеїнової кислоти може бути кодуючою білок молекулою нуклеїнової кислоти або некодуючою молекулою, такою, як антисмислова РНК, рРНК, тРНК, мікроРНК, та-міРНК, міРНК, длРНК, мяРНК, мноРНК або будь-яка некодуюча РНК, відома спеціалістам у даній галузі. Спеціалістам у даній галузі відомі способи ідентифікації насінно-специфічних та/або насінноселективних експресованих молекул нуклеїнових кислот, яких в оптимальному варіанті може стосуватися спосіб згідно з винаходом, наприклад, шляхом гібридизації мікрочіпів, кількісної ПЛР, нозерн-блоттингу, секвенування наступного покоління і т. ін. Ще один шлях виконання способів згідно з винаходом може полягати у a) забезпеченні експресійної послідовності, яка включає одну або кілька NEENA, які включають молекулу нуклеїнової кислоти, як визначено вище у пунктах з i) по vi), функціонально зв’язану з промотором, в оптимальному варіанті – насінно-специфічним та/або насінноселективним промотором, як визначено вище, і з однією або кількома молекулами нуклеїнової кислоти, причому остання є гетерологічною зазначеним одній або кільком NEENA, перебуваючи під контролем зазначеного промотора, в оптимальному варіанті – насінно-специфічного та/або насінно-селективного промотора, та b) включенні зазначеної експресійної послідовності, яка включає зазначені одну або кілька NEENA, у геном зазначеної рослини або її частини та, необов’язково, c) регенерації рослини або її частини, яка включає зазначені одну або кілька експресійних послідовностей, з зазначеної трансформованої рослини або її частини. NEENA може бути гетерологічною молекулі нуклеїнової кислоти, яка перебуває під контролем зазначеного промотора, з яким NEENA є функціонально зв’язаною, або вона може бути гетерологічною як промоторові, так і молекулі нуклеїнової кислоти під контролем зазначеного промотора. Експресійна послідовність може бути включена у геном відповідної рослини будь-яким способом, відомим спеціалістам у даній галузі. Включення може бути випадковим, з застосуванням таких способів, як бомбардування частинками або опосередкована Agrobacterium трансформація. В оптимальному варіанті втілення включення здійснюють через спрямоване включення наприклад, шляхом гомологічної рекомбінації. Останній спосіб дозволяє включати експресійну послідовність, яка включає високоекспресійний промотор, функціонально зв’язаний з NEENA, у прийнятну геномну ділянку. Прийнятними геномними ділянками є, наприклад, геномні ділянки, які включають гени, які сильно експресуються, наприклад, у насінні, а отже, можуть посилювати експресію, зумовлену зазначеною експресійною послідовністю, порівняно з геномною ділянкою, яка не демонструє транскрипційної активності. В іншому оптимальному варіанті втілення зазначені одна або кілька NEENA є функціонально зв’язаними з промотором, в оптимальному варіанті – насінно-специфічним та/або насінно-селективним промотором, наближеним до сайта початку транскрипції зазначеної гетерологічної молекули нуклеїнової кислоти. Наближення до сайта початку транскрипції у контексті даного опису означає функціональне зв’язування однієї або кількох NEENA з промотором, в оптимальному варіанті – насінноспецифічним та/або насінно-селективним промотором, 2500 п. о. або менше, в оптимальному варіанті – 2000 п. о. або менше, ще краще – 1500 п. о. або менше, ще краще – 1000 п. о. або менше, найкраще – 500 п. о. або менше, від сайта початку транскрипції зазначеної гетерологічної молекули нуклеїнової кислоти. Слід розуміти, що NEENA може бути включена на відповідній відстані від початку транскрипції відповідного промотора перед ним або після нього. Таким чином, одна або кілька NEENA не обов’язково мають бути включеними у транскрипт відповідної гетерологічної нуклеїнової кислоти під контролем промотора, в оптимальному варіанті – насінно-специфічного та/або насінно-селективного промотора, з яким одна або кілька NEENA є функціонально зв’язаними. В оптимальному варіанті одна або кілька NEENA включаються після сайта початку транскрипції відповідного промотора, в оптимальному варіанті – насінно-специфічного та/або насінно-селективного промотора. Сайт включення після сайта початку транскрипції може бути в 5´ UTR, 3´ UTR, екзоні або інтроні, або може замінювати інтрон або, частково або повністю, 5´ UTR або 3´ UTR гетерологічної нуклеїнової кислоти під контролем промотора, в оптимальному варіанті – насінно-специфічного та/або насінноселективного промотора. В оптимальному варіанті одна або кілька NEENA включаються у 5´ UTR або інтрон, або NEENA замінює інтрон або, частково або повністю, 5´UTR, у найкращому варіанті – включається до 5´UTR відповідної гетерологічної нуклеїнової кислоти. Ще один варіант втілення винаходу стосується рекомбінантної експресійної послідовності, яка включає одну або кілька NEENA, які включають молекулу нуклеїнової кислоти, як визначено вище у пунктах з i) по vi). 6 UA 110018 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Рекомбінантна експресійна послідовність також може включати один або кілька промоторів, в оптимальному варіанті – насінно-специфічний та/або насінно-селективний промотор, з яким одна або кілька NEENA є функціонально зв’язаними, та, необов’язково, одну або кілька експресованих молекул нуклеїнової кислоти, причому остання є гетерологічною зазначеним одній або кільком NEENA. NEENA може бути гетерологічною молекулі нуклеїнової кислоти, яка перебуває під контролем зазначеного промотора, з яким NEENA є функціонально зв’язаною, або вона може бути гетерологічною як промоторові, так і молекулі нуклеїнової кислоти під контролем зазначеного промотора. Експресійна послідовність може включати одну або більше, наприклад, дві або більше, наприклад, 5 або більше, наприклад, 10 або більше комбінацій промоторів, в оптимальному варіанті – насінно-специфічних та/або насінно-селективних промоторів, функціонально зв’язаних з NEENA, та молекулу нуклеїнової кислоти, яка має бути експресована, яка є гетерологічною відповідній NEENA. Експресійна послідовність також може включати інші промотори, які не включають NEENA, функціонально зв’язані з молекулами нуклеїнових кислот, які мають бути експресовані, гомологічні або гетерологічні відповідному промоторові. Вектор рекомбінантної експресії, який включає одну або кілька рекомбінантних експресійних послідовностей, як визначено вище, є ще одним предметом втілення винаходу. Багато векторів експресії, які можуть застосовуватися згідно з даним винаходом, є відомими спеціалістам у даній галузі. Способи включення такого вектора, який включає таку експресійну послідовність, яка включає, наприклад, промотор, функціонально зв’язаний з NEENA, та, необов’язково, інші елементи, такі як термінатор, у геном рослини та відтворення трансгенних рослин з трансформованої клітини також є добре відомими спеціалістам у даній галузі. Залежно від способу, який застосовують для трансформації рослини або її частини, у геном зазначеної рослини або її частини може бути включений повний вектор, або ж у геном можуть бути включені певні компоненти вектора, такі, як, наприклад, T-ДНК. Трансгенна рослина або її частина, яка включає одну або кілька гетерологічних NEENA, як визначено вище у пунктах з i) по vi), також є предметом цього винаходу. NEENA вважається гетерологічною рослиною, якщо вона є синтетичною, походить з іншого організму або того ж самого організму, але відтворюється її природна геномна локалізація порівняно з контрольною рослиною, наприклад, рослиною дикого типу. Слід розуміти, що відтворена геномна локалізація означає, що NEENA розташовується на іншій хромосомі або на тій самій хромосомі, але є на 10 т. н. або більше, наприклад, 10 т. н., в оптимальному варіанті – 5 т. н. або більше, наприклад, 5 т. н., у ще кращому варіанті – 1000 п. о. або більше, наприклад, 1000 п. о., у ще кращому варіанті – 500 п. о. або більше, наприклад, 500 п. о., у найкращому варіанті – 100 п. о. або більше, наприклад, 100 п. о., у найкращому варіанті – 10 п. о. або більше, наприклад, 10 п. о. зсунутою відносно її природної геномної локалізації, наприклад, у рослині дикого типу. Трансгенна клітина або трансгенна рослина або її частина, яка включає вектор рекомбінантної експресії, як визначено вище, або рекомбінантну експресійну послідовність, як визначено вище, є ще одним предметом втілення винаходу. Трансгенна клітина, трансгенна рослина або її частина може бути вибрана з групи, до якої належать бактерії, грибки, дріжджі, або клітини рослин, комах або ссавців або рослини. Оптимальними трансгенними клітинами є бактерії, грибки, дріжджі, рослинні клітини. Серед бактерій перевагу віддають кишковим бактеріям, таким як E. coli, та бактеріям роду Agrobacteria, наприклад, Agrobacterium tumefaciens та Agrobacterium rhizogenes. Серед рослин перевагу віддають однодольним або дводольним рослинам, наприклад, однодольним або дводольним культурним рослинам, таким як кукурудза, соя, канола, бавовна, картопля, цукровий буряк, рис, пшениця, сорго, ячмінь, бананові, цукрова тростина, міскантус і т. ін. Серед культурних рослин перевагу віддають таким, як кукурудза, рис, пшениця, соя, канола, бавовна або картопля. Серед дводольних культурних рослин особливу перевагу віддають таким, як соя, канола, бавовна або картопля. Серед однодольних культурних рослин особливу перевагу віддають таким, як кукурудза, пшениця та рис. Трансгенна клітинна культура, трансгенне насіння, частини або матеріал для розмноження, які походять з трансгенної клітини або рослини або її частини, як визначено вище, які включають зазначену гетерологічну NEENA, як визначено вище у пунктах з i) по vi), або зазначену рекомбінантну експресійну послідовність або зазначений рекомбінантний вектор, як визначено вище, є іншими предметами втілення винаходу. Трансгенні частини або матеріал для розмноження у контексті даного опису означають усі тканини та органи, наприклад, листя, стебла та плоди, а також матеріал, який застосовують для розмноження та/або регенерації рослин, такий як живці, пагони, відгілки, гілки або паростки, які 7 UA 110018 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 включають відповідну NEENA, рекомбінантну експресійну послідовність або рекомбінантний вектор. Інший варіант втілення винаходу стосується застосування NEENA, як визначено вище у пунктах з i) по vi), або рекомбінантної послідовності або рекомбінантного вектора, як визначено вище, для посилення експресії у рослинах або їх частинах. Таким чином, дана заявка забезпечує молекули нуклеїнових кислот, які посилюють насінноспецифічну та/або насінно-селективну експресію генів, які включають один або кілька промоторів, в оптимальному варіанті – насінно-специфічний та/або насінно-селективний промотор, функціонально зв’язаний з однією або кількома NEENA. Крім того, пропонується застосування таких молекул нуклеїнових кислот, які посилюють експресію генів, та експресійних послідовностей, векторів експресії, трансгенних рослин або їх частин та трансгенних клітин, які включають такі молекули нуклеїнових кислот, які посилюють експресію генів. Застосування трансгенної клітинної культури, трансгенного насіння, частин або матеріалу для розмноження, які походять з трансгенної клітини або рослини або її частини, як визначено вище, для виробництва продуктів харчування, кормів для тварин, насіння, фармацевтичних продуктів або чистих хімікатів також охоплюється обсягом цього винаходу. ВИЗНАЧЕННЯ Абревіатури: NEENA – нуклеїнова кислота, яка посилює експресію нуклеїнових кислот, GFP – білок зеленої флуоресценції, GUS – бета-глюкуронідаза, BAP – 6-бензиламінопурин; 2,4-D 2,4-дихлорофеноксіоцтової кислоти; MS - середовище Мурасіге-Скуга; NAA - 1-нафталіноцтова кислота; MES, 2-(N-морфоліно-етансульфонова кислота, IAA - індолоцтова кислота; Kan TM сульфат канаміцину; GA3 - гіберелова кислота; Timentin : тикарцилін динатрію / клавуланат калію, мкл - мікролітр. Слід розуміти, що цей винахід не обмежується конкретною методологією або протоколами. Також слід розуміти, що вжита авторами термінологія має на меті лише опис конкретних варіантів втілення і не обмежує обсяг даного винаходу, який обмежується лише супровідною формулою винаходу. Слід зазначити, що вжиті в описі та супровідній формулі винаходу форми однини передбачають також форми множини, якщо контекстом не передбачається іншого. Таким чином, наприклад, посилання на "вектор" є посиланням на один або кілька векторів і включає еквіваленти, відомі спеціалістам у даній галузі, і т. д. Вжитий авторами термін "приблизно" означає "приблизно", "неточно", "близько" або "у межах". Якщо термін "приблизно" вживається у зв’язку з діапазоном числових значень, він змінює цей діапазон, розширюючи його у бік зменшення та збільшення за межі вказаних значень. Як правило, термін "приблизно" вживається авторами для зміни вказаних числових значень у бік зменшення та збільшення з 20відсотковим коливанням, в оптимальному варіанті – з 10-відсотковим у бік зменшення або збільшення. Вжите авторами слово "або" означає будь-який предмет з певного переліку і також включає будь-яку комбінацію предметів з цього переліку. Слова "включати" "включаючи" та "включає", вжиті в цьому описі та супровідній формулі винаходу, вказують на наявність однієї або кількох зазначених особливостей, цілих чисел, компонентів або етапів, але вони не виключають наявності або додавання однієї або кількох інших особливостей, цілих чисел, компонентів, етапів, або їх груп. Для кращого розуміння деякі терміни, вжиті в описі, визначаються й вживаються таким чином: Антипаралельний: "антипаралельні" у контексті даного опису означають дві нуклеотидні послідовності, з’єднані водневими зв’язками між комплементарними залишками основ з фосфодіестерними зв’язками, які проходять у 5’-3’-напрямку в одній нуклеотидній послідовності і у 3’-5’-напрямку в іншій нуклеотидній послідовності. Антисмисловий: термін "антисмислова" стосується нуклеотидної послідовності, яка є інвертованою відносно її нормальної орієнтації для транскрипції або функції і, таким чином, експресує транскрипт РНК, який є комплементарним молекулі мРНК гена-мішені, що експресується у клітині-хазяїні (наприклад, може гібридизуватися з молекулою мРНК генамішені або одноланцюговою геномною ДНК через створення пар основ Вотсона-Крика), або яка є комплементарною молекулі ДНК-мішені, такій, як, наприклад, геномна ДНК, присутня у клітиніхазяїні. Кодуюча ділянка: термін "кодуюча ділянка", вжитий авторами стосовно структурного гена, означає нуклеотидні послідовності, які кодують амінокислоти, які містяться у виникаючому поліпептиді в результаті трансляції молекули мРНК. В еукаріотах кодуюча ділянка зв’язується на 5’-стороні нуклеотидним триплетом "ATG", який кодує ініціатор метіонін, а на 3’-стороні одним з трьох триплетів, які визначають стоп-кодони (тобто, TAA, TAG, TGA). Крім того, що вони містять інтрони, геномні форми гена також можуть включати послідовності, розташовані як на 5’-, так і на 3’-кінці послідовностей, які є присутніми на транскрипті РНК. Ці послідовності 8 UA 110018 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 називаються "фланкуючими" послідовностями або ділянками (ці фланкуючі послідовності розташовуються у 5’ або 3’ напрямках відносно нетрансльованих послідовностей, присутніх на транскрипті мРНК). 5’-фланкуюча ділянка може містити регуляторні послідовності, такі як промотори та енхансери, які контролюють транскрипцію гена або впливають на неї. 3’фланкуюча ділянка може містити послідовності, які спрямовують термінацію транскрипції, посттранскрипційне розщеплення та поліаденілування. Комплементарний: "комплементарна" або "комплементарність" означає дві нуклеотидні послідовності, які включають антипаралельні нуклеотидні послідовності, здатні утворювати пари одна з одною (за правилами спарювання основ) після утворення водневих зв’язків між комплементарними залишками основ в антипаралельних нуклеотидних послідовностях. Наприклад, послідовність 5’-AGT-3’ є комплементарною послідовності 5’-ACT-3’. Комплементарність може бути "частковою" або "повною". "Частковою" комплементарністю є та, в якій одна або кілька основ нуклеїнових кислот не є відповідними за правилами спарювання основ. "Повна" або "цілковита" комплементарність між молекулами нуклеїнових кислот є такою, в якій кожна основа нуклеїнової кислоти відповідає іншій основі за правилами спарювання основ. Ступінь комплементарності між ланцюгами молекул нуклеїнових кислот має суттєвий вплив на ефективність та силу гібридизації між ланцюгами молекул нуклеїнових кислот. "Комплемент" нуклеїновокислотної послідовності у контексті даного опису означає нуклеотидну послідовність, у якій молекули нуклеїнових кислот демонструють повну комплементарність молекулам нуклеїнових кислот нуклеїновокислотної послідовності. Дволанцюгова РНК: молекула "дволанцюгової РНК" або молекула "длРНК" включає смисловий фрагмент РНК нуклеотидної послідовності та антисмисловий фрагмент РНК нуклеотидної послідовності, обидва з яких включають нуклеотидні послідовності, комплементарні одна одній, що дозволяє смисловим та антисмисловим фрагментам РНК з’єднуватись у пари й утворювати дволанцюгову молекулу РНК. Ендогенний: "ендогенна" нуклеотидна послідовність означає нуклеотидну послідовність, яка є присутньою у геномі нетрансформованої рослинної клітини. Посилена експресія: визначення “посилювати” або “підвищувати” стосовно експресії молекули нуклеїнової кислоти у рослинній клітині вживаються у рівноцінному сенсі й означають, що рівень експресії молекули нуклеїнової кислоти у рослині, частині рослини або рослинній клітині після застосування способу згідно з даним винаходом є вищим за її експресію у рослині, частині рослини або рослинній клітині до застосування способу або порівняно з контрольною рослиною, в якій відсутня рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти згідно з винаходом. Наприклад, контрольна рослина включає таку саму послідовність, але без відповідної NEENA. Терміни "посилена" або "підвищена" у контексті цього опису є синонімічними і означають вищу, в оптимальному варіанті – значно вищу експресію молекули нуклеїнової кислоти, яка має бути експресована. У контексті даного опису "посилення" або "підвищення" рівня агента, такого, як білок, мРНК або РНК, означає, що рівень підвищується відносно показника по суті ідентичної рослини, частини рослини або рослинної клітини, яку вирощували у по суті ідентичних умовах, але без рекомбінантної молекули нуклеїнової кислоти згідно з винаходом, наприклад, без молекули NEENA, рекомбінантної послідовності або рекомбінантного вектора згідно з винаходом. У контексті даного опису "посилення" або "підвищення" рівня агента, такого, як, наприклад, преРНК, мРНК, рРНК, тРНК, мноРНК, мяРНК, що експресується геном-мішенню, та/або білкового продукту, який ним кодується, означає, що рівень підвищується на 50% або більше, наприклад, на 100% або більше, в оптимальному варіанті – на 200% або більше, у ще кращому варіанті – у 5 разів або більше, у ще кращому варіанті – у 10 разів або більше, у найкращому варіанті – у 20 разів або більше, наприклад, у 50 разів порівняно з клітиною або організмом без рекомбінантної молекули нуклеїнової кислоти згідно з винаходом. Посилення або підвищення може визначатися способами, відомими спеціалістам у даній галузі. Таким чином, посилення або підвищення кількості нуклеїнової кислоти або білка може визначатися, наприклад, шляхом імунологічного виявлення білка. Крім того, можуть застосовуватися такі способи, як білковий спектр, флуоресценція, нозерн-гібридизація, захист від нуклеази, зворотна транскрипція (кількісна ЗТ-ПЛР), ELISA (ферментний імуносорбентний аналіз), вестерн-блотинг, радіоімунний аналіз (RIA) або інші імунологічні аналізи та сортування флуоресцентноактивованих клітин (FACS), для вимірювання конкретного білка або РНК у рослині або рослинній клітині. Залежно від типу індукованого білкового продукту, також може визначатись його активність або вплив на фенотип організму. Способи визначення кількості білка є відомими спеціалістам у даній галузі. Прикладами, які можуть бути наведені, є такі: мікробіуретовий спосіб (Goa J (1953) Scand J Clin Lab Invest 5:218-222), спосіб Фоліна-Чокальтеу (Lowry OH et al. (1951) J Biol Chem 193:265-275) або вимірювання поглинання CBB G-250 (Bradford мM (1976) 9 UA 110018 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Analyt Biochem 72:248-254). Як один приклад кількісного визначення активності білка, нижче у Прикладах описується виявлення активності люциферази. Експресія: "експресія" означає біосинтез генного продукту, в оптимальному варіанті – транскрипцію та/або трансляцію нуклеотидної послідовності, наприклад, ендогенного гена або гетерологічного гена, у клітині. Наприклад, у разі структурного гена, експресія включає транскрипцію структурного гена на мРНК та, необов’язково, наступну трансляцію мРНК на один або кілька поліпептидів. В інших випадках експресія може стосуватися лише транскрипції ДНК, яка включає молекулу РНК. Експресійна послідовність: "експресійна послідовність" у контексті даного опису означає послідовність ДНК, здатну спрямовувати експресію конкретної нуклеотидної послідовності у відповідних частинах рослини або рослинної клітини, яка включає промотор, який функціонує у зазначених частинах рослини або рослинної клітини, у яку її вводять, що функціонально зв’язується з потрібною нуклеотидною послідовністю, яка необов’язково функціонально зв’язується з сигналами термінації. Якщо вимагається трансляція, вона також зазвичай включає послідовності, необхідні для належної трансляції нуклеотидної послідовності. Кодуюча ділянка може кодувати потрібний білок, але також може кодувати потрібну функціональну РНК, наприклад, РНКa, міРНК, мноРНК, мяРНК, мікроРНК, та-міРНК або будь-яку іншу некодуючу регуляторну РНК, у смисловому або антисмисловому напрямку. Експресійна послідовність, яка включає потрібну нуклеотидну послідовність, може бути химерною, тобто, один або кілька її компонентів є гетерологічними одному або кільком іншим її компонентам. Експресійна послідовність також може бути такою, що трапляється у природі, але була одержана у рекомбінантній формі, яку застосовують для гетерологічної експресії. Однак зазвичай експресійна послідовність є гетерологічною хазяїнові, тобто, конкретна послідовність ДНК експресійної послідовності не трапляється у природі у клітині-хазяїні і мала бути включена у клітину-хазяїн або попередник клітини-хазяїна шляхом трансформації. Експресія нуклеотидної послідовності в експресійній послідовності може перебувати під контролем насінноспецифічного та/або насінно-селективного промотора або індукованого промотора, що започатковує транскрипцію лише тоді, коли клітина-хазяїн піддається дії певного зовнішнього подразника. У разі рослини промотор також може бути специфічним до конкретної тканини або органа або стадії розвитку. Чужорідний: термін "чужорідний" стосується будь-якої молекули нуклеїнової кислоти (наприклад, послідовності гена), яку включають у геном клітини шляхом експериментальних маніпуляцій, і яка може включати послідовності, які містяться в цій клітині доти, доки включена послідовність містить певні модифікації (наприклад, точкову мутацію, наявність селектованого маркерного гена і т. ін.), і, таким чином, відрізняється від природної послідовності. Функціональне зв’язування: термін "функціональне зв’язування" або "функціонально зв’язаний" слід розуміти, наприклад, як послідовне розташування регуляторного елемента (наприклад, промотора) з послідовністю нуклеїнової кислоти, яка має бути експресована, і, у відповідних випадках, іншими регуляторними елементами (такими, як, наприклад, термінатор або NEENA) таким чином, щоб кожен з регуляторних елементів міг виконувати свою призначену функцію для забезпечення можливості, модифікації, сприяння або іншого впливу на експресію зазначеної нуклеїновокислотної послідовності. Результат експресії може залежати від розташування нуклеїновокислотних послідовностей відносно смислових або антисмислових РНК. Для цього не обов’язково вимагається пряме зв’язування у хімічному сенсі. Послідовності генетичного контролю, такі як енхансерні послідовності, також можуть виконувати свою функцію стосовно послідовності-мішені з більш віддалених позицій, або й з інших молекул ДНК. Оптимальними варіантами розташування є ті, в яких нуклеїновокислотна послідовність, яка підлягає рекомбінантній експресії, розташовується за послідовністю, що діє як промотор, таким чином, щоб дві послідовності ковалентно зв’язувалися одна з одною. Відстань між промоторною послідовністю та нуклеїновокислотною послідовністю, яка підлягає рекомбінантній експресії, в оптимальному варіанті складає менше, ніж 200 пар основ, у ще кращому варіанті – менше, ніж 100 пар основ, у найкращому варіанті – менше, ніж 50 пар основ. В оптимальному варіанті втілення нуклеїновокислотна послідовність, яка підлягає транскрипції, розташовується за промотором таким чином, щоб початок транскрипції був ідентичним потрібному початкові химерної РНК згідно з винаходом. Функціональне зв’язування та експресійна послідовність можуть забезпечуватися за допомогою традиційних технологій рекомбінації та клонування, як описано (див., наприклад, Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY); Silhavy et al. (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY); Ausubel et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley 10 UA 110018 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Interscience; Gelvin et al. (Eds) (1990) Plant Molecular Biology Manual; Kluwer Academic Publisher, Dordrecht, Нідерланди). Однак інші послідовності, які діють, наприклад, як лінкери з сайтами специфічного розщеплення для рестрикційних ферментів або як сигнальні пептиди, також можуть розташовуватися між двома послідовностями. Інсерція послідовностей також може забезпечувати експресію злитих білків. В оптимальному варіанті експресійна послідовність, яка складається зі зв’язку регуляторної ділянки, наприклад, промотора, та нуклеїновокислотної послідовності, яка підлягає експресії, може існувати в інтегрованій у вектор формі і може бути вставлена у геном рослини, наприклад, шляхом трансформації. Ген: термін "ген" стосується ділянки, функціонально з’єднаної з відповідними регуляторними послідовностями, здатними регулювати експресію генного продукту (наприклад, поліпептидом або функціональною РНК) у певний спосіб. Ген включає нетрансльовані регуляторні ділянки ДНК (наприклад, промотори, енхансери, репресори і т. ін.), розташовані до або після кодуючої ділянки (відкрита рамка зчитування, ORF), а також, у відповідних випадках, вставні послідовності (тобто, інтрони) між окремими кодуючими ділянками (тобто, екзонами). Термін "структурний ген" у контексті даного опису означає послідовність ДНК, яка транскрибується на мРНК, яка потім транслюється на послідовність амінокислот, характерну для певного поліпептиду. Геном та геномна ДНК: терміни "геном" або "геномна ДНК" стосуються спадкової генетичної інформації організму-хазяїна. Зазначена геномна ДНК включає ДНК ядра (також відому як хромосомна ДНК), а також ДНК пластид (наприклад, хлоропластів) та інших клітинних органел (наприклад, мітохондрій). В оптимальному варіанті терміни "геном" або "геномна ДНК" стосуються хромосомної ДНК ядра. Гетерологічний: термін "гетерологічна" стосовно молекули нуклеїнової кислоти або ДНК означає молекулу нуклеїнової кислоти, яка є функціонально зв’язаною, або підданою маніпуляції для функціонального зв’язування, з молекулою нуклеїнової кислоти, з якою вона є функціонально зв’язаною у природі, або з якою вона у природних умовах є функціонально зв’язаною в іншому місці. Гетерологічна експресійна послідовність, яка включає молекулу нуклеїнової кислоти та одну або кілька регуляторних молекул нуклеїнової кислоти (такі, як промотор або сигнал термінації транскрипції), які, наприклад, зв’язуються з нею, є послідовністю, одержаною через експериментальні маніпуляції, у яких a) зазначена молекула нуклеїнової кислоти або b) зазначена регуляторна молекула нуклеїнової кислоти, або c) обидві (тобто, (a) та (b)), знаходяться не у природному генетичному середовищі або були модифіковані через експериментальні маніпуляції, причому прикладом такої модифікації є заміщення, додавання, делеція, інверсія інсерція одного або кількох нуклеотидних залишків. Природне генетичне середовище означає природний хромосомний локус в організмі походження або присутність у геномній бібліотеці. У разі геномної бібліотеки природне генетичне середовище послідовності молекули нуклеїнової кислоти в оптимальному варіанті зберігається, принаймні частково. Середовище прилягає до нуклеїновокислотної послідовності принаймні з одного боку і має послідовність з принаймні 50 п. о., в оптимальному варіанті – принаймні 500 п. о., у ще кращому варіанті – принаймні 1000 п. о., у найкращому варіанті – принаймні 5000 п. о. Природна експресійна послідовність, наприклад, природна комбінація промотора з відповідним геном, стає трансгенною експресійною послідовністю, коли модифікується неприродними, синтетичними "штучними" способами, такими, як, наприклад, мутагенізація. Такі способи було описано (документи US 5,565,350; WO 00/15815). Наприклад, кодуюча білок молекула нуклеїнової кислоти, функціонально зв’язана з промотором, який не є природним промотором цієї молекули, вважається гетерологічною стосовно промотора. В оптимальному варіанті гетерологічна ДНК не є ендогенною або природно пов’язаною з клітиною, до якої вона включена, а була одержана з іншої клітини або синтезована. Гетерологічна ДНК також включає ендогенну послідовність ДНК, яка містить певну модифікацію, неприродні, повторювані копії ендогенної послідовності ДНК, або послідовність ДНК, яка не є природно пов’язаною з іншою послідовністю ДНК, яка з нею фізично з’єднується. Зазвичай, хоча й не обов’язково, гетерологічна ДНК кодує РНК або білки, які зазвичай не продукуються клітиною, в яку вона експресується. Високоекспресійний насінно-специфічний та/або насінно-селективний промотор: "високоекспресійний насінно-специфічний та/або насінно-селективний промотор" у контексті даного опису означає промотор, який викликає насінно-специфічну та/або насінно-селективну експресію у рослині або її частині, причому накопичення або швидкість синтезу РНК або стійкість РНК, що походить з молекули нуклеїнової кислоти, під контролем відповідного промотора є вищими, в оптимальному варіанті – суттєво вищими за експресію, викликану промотором без NEENA згідно з винаходом. В оптимальному варіанті кількість РНК та/або 11 UA 110018 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 швидкість синтезу РНК та/або стійкість РНК підвищується на 50% або більше, наприклад, 100% або більше, в оптимальному варіанті – 200% або більше, у ще кращому варіанті – у 5 разів або більше, у ще кращому варіанті – у 10 разів або більше, у найкращому варіанті – у 20 разів або більше, наприклад, у 50 разів, порівняно з насінно-специфічним та/або насінно-селективним промотором без NEENA згідно з винаходом. Гібридизація: термін "гібридизація" у контексті даного опису включає "будь-який процес, за допомогою якого ланцюг молекули нуклеїнової кислоти з’єднується з комплементарним ланцюгом через створення пар основ" (J. Coombs (1994) Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York). На гібридизацію та силу гібридизації (тобто, силу асоціації між молекулами нуклеїнових кислот) впливають такі чинники, як ступінь комплементарності між молекулами нуклеїнових кислот, жорсткість застосовуваних умов, т. п. утвореного гібриду та співвідношення G:C у молекулах нуклеїнових кислот. У контексті даного опису термін "т. п." означає "температуру плавлення". Температура плавлення є температурою, при якій популяція дволанцюгових молекул нуклеїнових кислот стає наполовину дисоційованою на окремі ланцюги. Рівняння для розрахунку т. п. молекул нуклеїнових кислот є добре відомим спеціалістам у даній галузі. Як вказується у стандартних джерелах, просте приблизне значення т. п. може бути розраховано за рівнянням: Т. п. = 81,5+0,41(% G+C), коли молекула нуклеїнової кислоти перебуває у водному розчині при 1 M NaCl [див., наприклад, Anderson and Young, Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization (1985)]. В інших джерелах представлено більш складні розрахунки, у яких для визначення т. пл. враховуються структурні характеристики, а також характеристики послідовності. Жорсткі умови є відомими спеціалістам у даній галузі і описуються у публікації Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. “Ідентичність”: термін “ідентичність”, вжитий стосовно порівняння двох або більшої кількості молекул нуклеїнових кислот або амінокислот, означає, що послідовності зазначених молекул мають певний ступінь подібності послідовностей, і послідовності є частково ідентичними. Для визначення відсотка ідентичності (у контексті даного опису взаємозамінно вживається термін “гомологія”) двох амінокислотних послідовностей або двох молекул нуклеїнових кислот послідовності записують одну під одною для оптимального порівняння (наприклад, можуть бути вставлені пробіли у послідовність білка або нуклеїнової кислоти для забезпечення оптимального співставлення з іншим білком або іншою нуклеїновою кислотою). Потім порівнюють амінокислотні залишки або молекули нуклеїнових кислот у відповідних амінокислотних позиціях або нуклеотидних позиціях. Якщо позиція в одній послідовності займається тим самим амінокислотним залишком або тією самою молекулою нуклеїнової кислоти, що й відповідна позиція в іншій послідовності, молекули у цій позиції є гомологічними (тобто, "гомологія" амінокислоти або нуклеїнової кислоти у контексті цього опису відповідає "ідентичності" амінокислоти або нуклеїнової кислоти. Відсоток гомології між двома послідовностями залежить від кількості ідентичних позицій, які є спільними для послідовностей (тобто, % гомології = кількість ідентичних позицій/загальна кількість позицій x 100). Таким чином, терміни "гомологія" та "ідентичність" слід розглядати яксинонімічні. Для визначення відсотка ідентичності двох або більшої кількості амінокислот або двох або більшої кількості нуклеотидних послідовностей було розроблено кілька комп’ютерних програм. Ідентичність двох або більшої кількості послідовностей розраховують, наприклад, за допомогою програми Fasta, яка у даний час застосовується у версії Fasta 3 (W. R. Pearson and D. J. Lipman, PNAS 85, 2444(1988); W. R. Pearson, Methods in Enzymology 183, 63 (1990); W. R. Pearson and D. J. Lipman, PNAS 85, 2444 (1988); W. R. Pearson, Enzymology 183, 63 (1990)). Іншою програмою, яка може застосовуватися для розрахунку ідентичності різних послідовностей, є стандартна програма Blast, яка є включеною до програми Pedant від Biomax (Biomax, Мюнхен, Федеративна Республіка Німеччина). На жаль, це іноді призводить до субоптимальних результатів, оскільки Blast не завжди включає повні послідовності наявних у базі даних та досліджуваних зразків. Незважаючи на це, завдяки високій ефективності цієї програми, вона може застосовуватися для порівняння великої кількості послідовностей. Для порівняння послідовностей зазвичай застосовують такі настройки: -p Назва програми [рядок]; -d База даних [рядок]; за замовчуванням = nr; -i Query File [File In]; за замовчуванням = stdin; -e очікуване значення (E) [Real]; за замовчуванням = 10.0; -m опції перегляду вирівнювання: 0 = попарно; 1 = query-anchored з ідентичністю; 2 = query-anchored без ідентичності; 3 = flat query-anchored, показ ідентичності; 4 = flat query-anchored, без ідентичності; 5 = query-anchored без ідентичності та тупих кінців; 6 = flat query-anchored, без ідентичності та тупих кінців; 7 = вивід XML Blast; 8 = таблиця; 9 таблиця з рядками коментарів [ціле число]; за замовчуванням = 0; -o файл виводу звіту BLAST [File Out] необов’язково; за замовчуванням = 12 UA 110018 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 stdout; -F Filter query послідовність (DUST з blastn, SEG з іншими) [рядок]; за замовчуванням = T; -G плата за відкриття пробілу (нуль запускає поведінку за замовчуванням) [ціле число]; за замовчуванням = 0; -E плата за продовження пробілу (нуль запускає поведінку за замовчуванням) [ціле число]; за замовчуванням = 0; -X X зменшене значення за вирівнювання з пробілами (у бітах) (нуль запускає поведінку за замовчуванням); blastn 30, megablast 20, tblastx 0, усі інші 15 [ціле число]; за замовчуванням = 0; -I показ GI у deflines [T/F]; за замовчуванням = F; -q штраф за невідповідність нуклеотидів (лише blastn) [ціле число]; за замовчуванням = -3; -r винагорода за відповідність нуклеотидів (лише blastn) [ціле число]; за замовчуванням = 1; -v кількість послідовностей з бази даних для показу онлайн-описів для (V) [ціле число]; за замовчуванням = 500; -b номер послідовності з бази даних для показу вирівнювання для (B) [ціле число]; за замовчуванням = 250; -f поріг для продовження збігів, за замовчуванням, якщо нуль; blastp 11, blastn 0, blastx 12, tblastn 13; tblastx 13, megablast 0 [ціле число]; за замовчуванням = 0; -g виконання вирівнювання з пробілами (не передбачено з tblastx) [T/F]; за замовчуванням = T; -Q генетичний код досліджуваного зразка [ціле число]; за замовчуванням = 1; -D DB генетичний код (лише для tblast[nx]) [ціле число]; за замовчуванням = 1; -a кількість застосовуваних процесорів [ціле число]; за замовчуванням = 1; -O файл SeqAlign [File Out] необов’язково; -J гадане значення query defline [T/F]; за замовчуванням = F; -M Matrix [рядок]; за замовчуванням = BLOSUM62; -W розмір слова, за замовчуванням, якщо нуль (blastn 11, megablast 28, усі інші 3) [ціле число]; за замовчуванням = 0; -z ефективна довжина бази даних (використовуйте нуль для реального розміру) [Real]; за замовчуванням = 0; -K кількість найкращих збігів у ділянці для дотримання (off за замовчуванням, у разі використання рекомендується значення 100) [ціле число]; за замовчуванням = 0; -P 0 для багатьох збігів, 1 для єдиного збігу [ціле число]; за замовчуванням = 0; -Y ефективна довжина області пошуку (використовуйте нуль для реального розміру) [Real]; за замовчуванням = 0; -S досліджувані ланцюги для пошуку у базі даних (для blast[nx] та tblastx); 3 - обидва, 1 - верхній, 2 - нижній [ціле число]; за замовчуванням = 3; - вивід T Produce HTML [T/F]; за замовчуванням = F; -l обмеження пошуку у базі даних для списку GI [рядок] необов’язково; -U застосування фільтра нижнього реєстру послідовності FASTA [T/F] необов’язково; за замовчуванням = F; -y X значення dropoff для продовжень без пробілів у бітах (0.0 запускає поведінку за замовчуванням); blastn 20, megablast 10, усі інші 7 [Real]; за замовчуванням = 0.0; -Z X значення dropoff для остаточного вирівнювання з пробілами у бітах (0.0 запускає поведінку за замовчуванням); blastn/megablast 50, tblastx 0, усі інші 25 [ціле число]; за замовчуванням = 0; -R PSI-TBLASTN checkpoint file [File In] необов’язково; -n пошук MegaBlast [T/F]; за замовчуванням = F; -L розташування на досліджуваній послідовності [рядок] необов’язково; -A розмір вікна множинних збігів, за замовчуванням, якщо нуль (blastn/megablast 0, усі інші 40 [ціле число]; за замовчуванням = 0; -w штраф за зсув рамки (алгоритм OOF для blastx) [ціле число]; за замовчуванням = 0; -t довжина найбільшого інтрона, який допускається у tblastn для з’єднання HSP (0 унеможливлює з’єднання) [ціле число]; за замовчуванням = 0. Результатів високої якості досягають при застосуванні алгоритму Нідлмана – Вунша або Сміта – Вотермана. Таким чином, перевагу віддають програмам на основі зазначених алгоритмів. Зручне порівняння послідовностей може бути здійснене за допомогою програми PileUp (J. Mol. Evolution., 25, 351 (1987), Higgins et al., CABIOS 5, 151 (1989)) або, в оптимальному варіанті, – за допомогою програм "Gap" та "Needle", обидві на основі алгоритмів Нідлмана – Вунша (J. Mol. Biol. 48; 443 (1970)), та "BestFit", на основі алгоритму Сміта – Вотермана (Adv. Appl. Math. 2; 482 (1981)). "Gap" та "BestFit" є частиною пакета програм GCG (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, США 53711 (1991); Altschul et al., (Nucleic Acids Res. 25, 3389 (1997)), "Needle" є частиною Європейського комплекту відкритих програм з молекулярної біології (EMBOSS) (Trends in Genetics 16 (6), 276 (2000)). Таким чином, в оптимальному варіанті розрахунки для визначення відсотка гомології послідовностей здійснюють за допомогою програм "Gap" або "Needle" по всіх послідовностях. Для "Needle" застосовували : матриця: EDNAFULL, штраф за пробіл: 10,0, штраф за продовження: 0,5. Для "Gap" застосовували такі стандартні установки для порівняння нуклеїновокислотних послідовностей: значущість пробілу: 50, значущість довжини: 3, середня відповідність: 10,000, середня невідповідність: 0,000. Наприклад, послідовність, яка має 80% ідентичності з послідовністю SEQ ID NO: 1 на рівні нуклеїнової кислоти, розглядається як послідовність, яка, після порівняння з послідовністю, представленою у SEQ ID NO: 1, за допомогою зазначеної програми "Needle" з зазначеним набором параметрів, має 80% ідентичності. В оптимальному варіанті гомологію розраховують по всій довжині досліджуваної послідовності, наприклад, SEQ ID NO:1. Інтрон: означає відрізки ДНК (вставні послідовності) з геном, які не кодують частину білка, 13 UA 110018 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 яку виробляє ген, і яка сплайсується з мРНК, що транскрибується з гена до перенесення з ядра клітини. Послідовність інтрона означає нуклеїновокислотну послідовність інтрона. Таким чином, інтрони є ділянками послідовностей ДНК, які транскрибуються разом з кодуючою ділянкою (екзонами), але видаляються під час утворення зрілої мРНК. Інтрони можуть розташовуватись у межах існуючої кодуючої ділянки або у 5’ або 3’ нетрансльованих лідерних послідовностях премРНК (несплайсованої мРНК). Інтрони у первинному транскрипті вирізаються, і кодуючі послідовності одночасно і точно лігуються для утворення зрілої мРНК. Місця з’єднання інтронів та екзонів утворюють сайт сплайсингу. Послідовність інтрона починається з GU і закінчується AG. Крім того, у рослинах було описано два приклади AU-AC інтронів: чотирнадцятий інтрон RecA-подібного білкового гена та сьомий інтрон G5 гена з Arabidopsis thaliana є AT-AC інтронами. Пре-мРНК, які містять інтрони, мають три короткі послідовності, які є – крім інших послідовностей – суттєвими для інтрона, який має бути точно сплайсований. Ці послідовності є 5’-сайтом сплайсингу, 3’-сайтом сплайсингу та точкою галуження. Сплайсинг мРНК є видаленням вставних послідовностей (інтронів), присутніх у первинних транскриптах мРНК, та з’єднання або лігування екзонних послідовностей. Це також називається цис-сплайсингом, який з’єднує два екзони на одній РНК з видаленням вставної послідовності (інтрона). Функціональні елементи інтрона включають послідовності, які розпізнаються й зв’язуються специфічними білковими компонентами сплайсингосоми (наприклад, сплайсинговими консенсусними послідовностями на кінцях інтронів). Взаємодія функціональних елементів зі сплайсингосомою в результаті веде до видалення послідовності інтрона з незрілої мРНК та повторного з’єднання послідовностей екзонів. Інтрони мають три короткі послідовності, які є суттєвими, хоча й недостатніми, для інтрона, який має бути точно сплайсований. Цими послідовностями є 5’-сайт сплайсингу, 3’-сайт сплайсингу та точка галуження. Послідовність точки галуження є важливою для сплайсингу та вибору сайтів сплайсингу у рослинах. Послідовність точки галуження зазвичай розташовується за 10-60 нуклеотидів перед 3’-сайтом сплайсингу. Ізогенний: організми (наприклад, рослини), які є генетично ідентичними, за винятком відмінностей, які полягають у присутності або відсутності гетерологічної послідовності ДНК. Виділений: термін "виділений" у контексті даного опису означає, що матеріал було видалено людиною, і він існує окремо від його первісного, природного середовища і, таким чином, не є природним продуктом. Виділений матеріал або молекула (наприклад, молекула ДНК або фермент) може існувати в очищеній формі або може існувати у неприродному середовищі, наприклад, у трансгенній клітині-хазяїні. Наприклад, природний полінуклеотид або поліпептид, присутній у живій рослині, не є виділеним, але той самий полінуклеотид або поліпептид, відокремлений від деяких або всіх співіснуючих матеріалів у природній системі, є виділеним. Такі полінуклеотиди можуть бути частиною вектора, та/або такі полінуклеотиди або поліпептиди можуть бути частиною композиції і вважатимуться виділеними у тому сенсі, що такі вектор або композиція не є частиною первісного середовища. В оптимальному варіанті термін "виділений", вжитий стосовно молекули нуклеїнової кислоти, як у "виділеній нуклеїновокислотній послідовності", означає нуклеїновокислотну послідовність, яка є ідентифікованою й відокремленою від принаймні однієї сторонньої молекули нуклеїнової кислоти, з якою вона є первісно зв’язаною у природному джерелі. Виділеною молекулою нуклеїнової кислоти є молекула нуклеїнової кислоти, присутня у формі або в оточенні, які відрізняються від тих, у яких вона існує у природі. Натомість невиділеними молекулами нуклеїнових кислот є молекули нуклеїнових кислот, такі як ДНК та РНК, які перебувають у стані, в якому вони існують у природі. Наприклад, дана послідовність ДНК (наприклад, ген) міститься на хромосомі клітини-хазяїна поблизу від сусідніх генів; послідовності РНК, такі як специфічна послідовність мРНК, яка кодує певний білок, існують у клітині як суміш з багатьма іншими мРНК, які кодують велику кількість білків. Однак виділена нуклеїновокислотна послідовність, яка включає, наприклад, SEQ ID NO: 1, включає, скажімо, такі нуклеїновокислотні послідовності у клітинах, які первісно містять SEQ ID NO:1, де нуклеїновокислотна послідовність перебуває у хромосомній або позахромосомній позиції, відмінній від позиції природних клітин, або іншим чином межує з нуклеїновокислотною послідовністю, відмінною від тієї, що існує у природі. Виділена нуклеїновокислотна послідовність може бути присутньою в одноланцюговій або дволанцюговій формі. Якщо виділена нуклеїновокислотна послідовність має бути застосована для експресії білка, нуклеїновокислотна послідовність міститиме принаймні частину смислового або кодуючого ланцюга (тобто, нуклеїновокислотна послідовність може бути одноланцюговою). В альтернативному варіанті вона може містити як смислові, так і антисмислові ланцюги (тобто, нуклеїновокислотна послідовність може бути дволанцюговою). Мінімальний промотор: промоторні елементи, зокрема, TATA-елемент, які є неактивними або які мають сильно знижену промоторну активність за відсутності активації у 3’-5’-напрямку. У 14 UA 110018 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 присутності відповідного фактора транскрипції мінімальний промотор функціонує, забезпечуючи можливість транскрипції. NEENA: див. "Нуклеїнова кислота, яка посилює експресію нуклеїнових кислот". Некодуючий: термін "некодуючий" стосується послідовностей молекул нуклеїнових кислот, які не кодують частину експресованого білка або весь експресований білок. До некодуючих послідовностей, крім інших, належать інтрони, енхансери, промоторні ділянки, 3’нетрансльовані ділянки та 5’-нетрансльовані ділянки. Нуклеїнова кислота, яка посилює експресію нуклеїнових кислот (NEENA): термін "нуклеїнова кислота, яка посилює експресію нуклеїнових кислот" стосується послідовності та/або молекули нуклеїнової кислоти з певною послідовністю, яка має природну властивість посилення експресії нуклеїнової кислоти під контролем промотора, з яким NEENA є функціонально зв’язаною. На відміну від промоторних послідовностей, NEENA як така, не здатна запускати експресію. Для виконання функції посилення експресії молекули нуклеїнової кислоти, функціонально зв’язаної з NEENA, NEENA сама має бути функціонально зв’язана з промотором. На відміну від енхансерних послідовностей, відомих спеціалістам у даній галузі, NEENA діє у цис-, а не транспозиції, і має розташовуватись поблизу від сайта початку транскрипції нуклеїнової кислоти, яка підлягає експресії. Нуклеїнові кислоти та нуклеотиди: терміни "нуклеїнові кислоти" та "нуклеотиди" стосуються природних або синтетичних або штучних нуклеїнових кислот або нуклеотидів. Терміни “нуклеїнові кислоти” та "нуклеотиди” охоплюють дезоксирибонуклеотиди або рибонуклеотиди або будь-які нуклеотидні аналоги та полімери або їх гібриди в одно-або дволанцюговій, смисловій або антисмисловій формі. Якщо не зазначено іншого, передбачається, що конкретна нуклеїновокислотна послідовність також охоплює її консервативно модифіковані варіанти (наприклад, заміщення вироджених кодонів) та комплементарні послідовності, а також прямо вказану послідовність. Термін "нуклеїнова кислота" вжито взаємозамінно з термінами "ген", "кДНК", "мРНК", "олігонуклеотид" та "полінуклеотид". До нуклеотидних аналогів належать нуклеотиди, які мають модифікації у хімічній структурі основи, цукру та/або фосфату, включаючи, крім інших, піримідинові модифікації у 5-позиції, пуринові модифікації у 8-позиції, модифікації в екзоциклічних амінах цитозину, заміщення 5-бромоурацилу і т. ін.; та модифікації цукрів у 2’-позиції, включаючи, крім інших, модифіковані цукрами рибонуклеотиди, у яких 2'-OH є заміненим на групу, вибрану з H, OR, R, гало, SH, SR, NH2, NHR, NR2 або CN. Короткі шпилькові РНК (шРНК) також можуть включати неприродні елементи, такі як неприродні основи, наприклад, іонозин та ксантин, неприродні цукри, наприклад, 2’-метоксирибозу, або неприродні фосфодіестерні зв’язки, наприклад, метилфосфонати, фосфоротіоати та пептиди. Нуклеїновокислотна послідовність: фраза "нуклеїновокислотна послідовність" стосується одно- або дволанцюгового полімеру дезоксирибонуклеотидних або рибонуклеотидних основ, які читаються з 5’- до 3’-кінця. Вона включає хромосомну ДНК, саморепліковані плазміди, інфекційні полімери ДНК або РНК та ДНК або РНК, які виконують здебільшого структурну роль. "Нуклеїновокислотна послідовність" також стосується впорядкованого списку скорочень, літер, знаків або слів, які представляють нуклеотиди. В одному варіанті втілення нуклеїнова кислота може бути "зондом", який є відносно короткою нуклеїновою кислотою, зазвичай меншою за 100 нуклеотидів завдовжки. Часто нуклеїновокислотний зонд має довжину від приблизно 50 нуклеотидів до приблизно 10 нуклеотидів. "Ділянка-мішень" нуклеїнової кислоти є частиною нуклеїнової кислоти, ідентифікованою як така, що являє інтерес. "Кодуюча ділянка" нуклеїнової кислоти є частиною нуклеїнової кислоти, яка транскрибується й транслюється у специфічний до послідовності спосіб для утворення конкретного поліпептиду або білка при поміщенні під контроль відповідних регуляторних послідовностей. Кодуюча ділянка кодує такий поліпептид або білок. Олігонуклеотид: термін "олігонуклеотид" стосується олігомеру або полімеру рибонуклеїнової кислоти (РНК) або дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК) або їх міметиків, а також олігонуклеотидів, які мають неприродні частини, які функціонують подібним чином. Таким модифікованим або заміщеним олігонуклеотидам часто віддають перевагу перед природними формами завдяки потрібним властивостям, таким, як, наприклад, підвищене клітинне захоплення, підвищена афінність до нуклеїнової кислоти-мішені та підвищена стійкість у присутності нуклеаз. Олігонуклеотид в оптимальному варіанті включає два або більше нуклеомономерів, ковалентно зв’язаних один з одним зв’язками (наприклад, фосфодіестерами) або замісними зв’язками. Нависання: "нависання" є відносно короткою одноланцюговою нуклеотидною послідовністю на 5’- або 3’-гідроксильному кінці дволанцюгової олігонуклеотидної молекули (також називається "подовженням", "виступаючим кінцем" або "липким кінцем"). 15 UA 110018 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Рослина: під рослиною зазвичай розуміють будь-який еукаріотний одно- або багатоклітинний організм або його клітину, тканину, орган, частину або матеріал для розмноження (такий, як насіння або плоди), здатні до фотосинтезу. З точку зору даного винаходу, до них належать усі роди та види вищих та нижчих рослин з царства рослин. Перевагу віддають однорічним, багаторічним, однодольним та дводольним рослинам. Термін охоплює зрілі рослини, насіння, паростки та сіянці та одержані з них частини, матеріал для розмноження (такий, як насіння або мікроспори), органи рослин, тканини, протопласти, калюс та інші культури, наприклад, культури клітин та будь-який інший тип групи рослинних клітин для одержання функціональних або структурних одиниць. Зрілі рослини означають рослини на будь-якій потрібній стадії розвитку після стадії сіянців. Сіянець означає молоду незрілу рослину на ранній стадії розвитку. Однорічні, дворічні, однодольні та дводольні рослини є оптимальними організмами-хазяями для створення трансгенних рослин. Крім того, експресія генів забезпечує переваги в усіх декоративних рослинах, корисних або декоративних деревах, квітах, квітах на зрізання, чагарниках або газонних травах. До рослин, які можна згадати для прикладу, але не для обмеження обсягу винаходу, належать покритонасінні, мохи, такі, як, наприклад, Hepaticae (печінкові мохи) та Musci; птеридофіти, такі як папороть, хвощі та плауни; голонасінні, такі як хвойні, цикадові, гінкго та Gnetatae; водорості, такі як Chlorophyceae, Phaeophpyceae, Rhodophyceae, Myxophyceae, Xanthophyceae, Bacillariophyceae (діатомові) та Euglenophyceae. Перевагу віддають рослинам, які застосовують для виробництва продовольства та кормів, наприклад, з родин Leguminosae, таким як горох, люцерна та соя; Gramineae, таким як рис, кукурудза, пшениця, ячмінь, сорго, просо, жито, тритикале або овес; родині Umbelliferae, зокрема, роду Daucus, особливо, таким видам, як carota (морква) та Apium, зокрема, таким видам, як Graveolens dulce (селера) та багато інших; родині Solanaceae, зокрема, роду Lycopersicon, зокрема, видові esculentum (томати) та роду Solanum, зокрема, видам tuberosum (картопля) та melongena (баклажан), а також багатьом іншим (таким, як тютюн); та роду Capsicum, зокрема, видові annuum (перець) та багатьом іншим; родині Leguminosae, особливо, роду Glycine, зокрема, видові max (соя), таким рослинам, як горох, люцерна, квасоля або арахіс та багато інших; та родині Cruciferae (Brassicacae), особливо, роду Brassica, зокрема, видам napus (олійний рапс), campestris (буряк), oleracea cv Tastie (капуста), oleracea cv Snowball Y (цвітна капуста) та oleracea cv Emperor (броколі); та роду Arabidopsis, зокрема, видові thaliana, та багатьом іншим; родині Compositae, особливо, роду Lactuca, зокрема, видові sativa (lettuce) та багатьом іншим; родині Asteraceae, зокрема, таким рослинам, як соняшник, календула, латук, та багатьом іншим; родині Cucurbitaceae, зокрема, таким рослинам, як диня, гарбуз або цукіні, та льняному насінню. Також перевагу віддають таким рослинам, як бавовна, цукрова тростина, конопля, льон, чилі, а також різні види деревних рослин, горіхів та винограду. Поліпептид: терміни "поліпептид", "пептид", "олігопептид", "поліпептид", "генний продукт", "продукт експресії" та "білок" у контексті даного опису вживаються взаємозамінно і стосуються полімеру або олігомеру з послідовних амінокислотних залишків. Білок-попередник: білок, який зазвичай є спрямованим на клітинну органелу, наприклад, хлоропласт, і зберігає свій перехідний пептид. Первинний транскрипт: термін "первинний транскрипт" у контексті даного опису означає незрілий РНК-транскрипт гена. "Первинний транскрипт", наприклад, зберігає інтрони та/або ще не містить поліA-хвоста або кеп-структури та/або не містить інших модифікацій, необхідних для його належної функції як транскрипта, наприклад, зачищення або коректування. Промотор: терміни "промотор" або "промоторна послідовність" є рівноцінними і у контексті даного опису означають послідовність ДНК, яка, будучи лігованою з потрібною нуклеотидною послідовністю, здатна контролювати транскрипцію потрібної нуклеотидної послідовності в РНК. Такі промотори можна знайти, наприклад, у таких загальнодоступних базах даних: http://www.grassius.org/grasspromdb.html, http://mendel.cs.rhul.ac.uk/mendel.php?topic=plantprom, http://ppdb.gene.nagoya-u.ac.jp/cgi-bin/index.cgi. Перелічені у них промотори можуть застосовуватися згідно зі способами винаходу і, таким чином, є включеними шляхом посилання. Промотор розташовується на 5’-кінці (тобто, у зворотному напрямку), поблизу від сайта початку транскрипції потрібної нуклеотидної послідовності, транскрипцію якої в мРНК він контролює, і забезпечує сайт специфічного зв’язування РНК-полімеразою та інші та інші фактори транскрипції для започаткування транскрипції. Зазначений промотор включає, наприклад, принаймні 10 т. н., наприклад, 5 т. н. або 2 т. н. поблизу від сайта початку транскрипції. Він також може включати принаймні 1500 п. о. поблизу від сайта початку транскрипції, в оптимальному варіанті – принаймні 1000 п. о., у ще кращому варіанті – принаймні 500 п. о., у ще кращому варіанті – принаймні 400 п. о., принаймні 300 п. о., принаймні 200 п. о. або принаймні 100 п. о. У ще одному оптимальному варіанті втілення промотор включає принаймні 50 п. о. 16 UA 110018 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 поблизу від сайта початку транскрипції, наприклад, принаймні 25 п. о. Промотор не включає екзонних та/або інтронних ділянок або 5´ нетрансльованих ділянок. Промотор може бути, наприклад, гетерологічним або гомологічним відповідній рослині. Полінуклеотидна послідовність є "гетерологічною" організмові або другій полінуклеотидній послідовності, якщо вона походить з іншого виду, або, якщо походить з того самого виду, є модифікованою з первісної форми. Наприклад, промотор, функціонально зв’язаний з гетерологічною кодуючою послідовністю, означає кодуючу послідовність з виду, відмінного від того, з якого походить промотор, або, якщо походить з того самого виду, кодуючу послідовність, яка у природі не є зв’язаною з промотором (наприклад, піддану генній інженерії кодуючу послідовність або алель з іншого екотипу або сорту). Прийнятні промотори можуть походити з генів клітин-хазяїв, у яких має відбуватися експресія, або з патогенів для цих клітин-хазяїв (наприклад, рослин або рослинних патогенів, таких, як рослинні віруси). Рослинно-специфічний промотор є промотором, придатним для регулювання експресії у рослині. Він може походити з рослини, але також і з рослинних патогенів, або ж може бути синтетичним промотором, побудованим людиною. Якщо промотор є індукованим промотором, швидкість транскрипції збільшується у відповідь на дію індукуючого агента. Крім того, промотор може регулюватись у тканинно-специфічний спосіб, таким чином, що він є виключно або переважно активним у транскрипції асоційованої кодуючої ділянки у конкретному(их) типі(ах) тканин, таких, як листя, коріння або меристема. Термін "тканинно-специфічний", якщо стосується промотора, означає промотор, здатний спрямовувати вибіркову експресію потрібної нуклеотидної послідовності на певний тип тканини (наприклад, пелюстки) за відносної відсутності експресії тієї ж самої потрібної нуклеотидної послідовності в іншому типі тканини (наприклад, корінні). Тканинна специфічність промотора може визначатися, наприклад, шляхом функціонального зв’язування гена-репортера з промоторною послідовністю для утворення репортерної послідовності, включення репортерної послідовності у геном рослини, таким чином, щоб репортерної послідовності були включені у кожну тканину одержаної в результаті трансгенної рослини, та виявлення експресії гена-репортера (наприклад, виявлення мРНК, білка або активності білка, який кодується геном-репортером) в інших тканинах трансгенної рослини. Виявлення вищого рівня експресії гена-репортера в одній або кількох тканинах відносно рівня експресії гена-репортера в інших тканинах свідчить, що промотор є специфічним для тканин, у яких виявляється вищий рівень експресії. Термін "специфічний для типу клітин" стосовно промотора означає промотор, здатний спрямовувати вибіркову експресію потрібної нуклеотидної послідовності у певний тип клітини за відносної відсутності експресії тієї ж самої потрібної нуклеотидної послідовності в іншому типі клітин у межах однієї тканини. Термін "специфічний для типу клітин" стосовно промотора також означає промотор, здатний сприяти вибірковій експресії потрібної нуклеотидної послідовності у ділянці у межах однієї тканини. Специфічність промотора для типу клітин визначають способами, добре відомими спеціалістам у даній галузі, наприклад, за допомогою забарвлення GUS на виявлення активності, зеленого флуоресцентного білка або імуногістохімічного забарвлення. Термін "конститутивний" стосовно промотора або експресії, зумовленої промотором, означає, що промотор здатен спрямовувати транскрипцію функціонально зв’язаної молекули нуклеїнової кислоти за відсутності подразника (наприклад, термічного шоку, хімікатів, світла і т. ін.) у більшості рослинних тканин та клітин протягом практично всієї тривалості життя рослини або частини рослини. Як правило, конститутивні промотори здатні спрямовувати експресію трансгена практично у будь-якій клітині та будь-якій тканині. Промотор специфічність: Термін “специфічність” стосовно промотора означає характер експресії, зумовлений відповідним промотором. Специфічність характеризує тканини та/або стан розвитку рослини або її частини, у якій промотор забезпечує експресію молекули нуклеїнової кислоти під контролем відповідного промотора. Специфічність промотора також може включати умови середовища, за яких промотор може активуватися або пригнічуватися, наприклад, викликання або пригнічення через біологічні стреси або вплив навколишнього середовища, такі як холод, посуха, пошкодження або інфікування. Очищений: у контексті даного опису термін "очищена" стосується молекул, нуклеїновокислотних або амінокислотних послідовностей, видалених з їх природного середовища, виділених або відокремлених. "Суттєво очищені" молекули є принаймні на 60% вільними, в оптимальному варіанті – принаймні на 75% вільними, у ще кращому варіанті – принаймні на 90% вільними від інших компонентів, з якими вони є зв’язаними у природі. Очищена нуклеїновокислотна послідовність може бути виділеною нуклеїновокислотною послідовністю. Рекомбінантний: термін "рекомбінантна" стосовно молекул нуклеїнових кислот означає молекули нуклеїнових кислот, одержані за допомогою технологій рекомбінантних ДНК. 17 UA 110018 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Рекомбінантні молекули нуклеїнових кислот також можуть включати молекули, що як такі не існують у природі, але є модифікованими, зміненими, мутованими або іншим чином підданими маніпуляціям з боку людини. В оптимальному варіанті "рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти" є неприродною молекулою нуклеїнової кислоти, яка відрізняється за послідовністю від природної молекули нуклеїнової кислоти принаймні на одну нуклеїнову кислоту. "Рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти" також може включати "рекомбінантну послідовність", яка включає, в оптимальному варіанті – є функціонально зв’язаною, з послідовностями молекул нуклеїнових кислот, які не є природними у цьому порядку. Оптимальні способи одержання зазначеної рекомбінантної молекули нуклеїнової кислоти можуть включати клонування, спрямований або неспрямований мутагенез, синтез або способи рекомбінації. "Насінно-специфічний промотор" у контексті цього винаходу означає промотор, який регулює транскрипцію молекули нуклеїнової кислоти під контролем відповідного промотора у насінні, причому транскрипція у будь-якій тканині або клітині насіння складає більш, ніж 90%, в оптимальному варіанті – більш, ніж 95%, у ще кращому варіанті – більш, ніж 99% загальної кількості РНК, транскрибованої з зазначеної нуклеїновокислотної послідовності в усій рослині протягом будь-якої стадії її розвитку. Терміни "насінно-специфічна експресія" та "насінноспецифічна NEENA" слід розуміти відповідним чином. Отже, "насінно-специфічна NEENA" посилює транскрипцію насінно-специфічного або насінно-селективного промотора таким чином, що транскрипція у насінні, зумовлена зазначеним промотором, функціонально зв’язаним з відповідною NEENA, складає більш, ніж 90%, в оптимальному варіанті – більш, ніж 95%, у ще кращому варіанті – більш, ніж 99% загальної кількості РНК, транскрибованої з відповідного промотора, функціонально зв’язаного з NEENA, в усій рослині протягом будь-якої стадії її розвитку. "Насінно-селективний промотор" у контексті цього винаходу означає промотор, який регулює транскрипцію молекули нуклеїнової кислоти під контролем відповідного промотора у насінні, причому транскрипція у будь-якій тканині або клітині насіння складає більш, ніж 50%, в оптимальному варіанті – більш, ніж 70%, у ще кращому варіанті – більш, ніж 80% загальної кількості РНК, транскрибованої з зазначеної нуклеїновокислотної послідовності в усій рослині протягом будь-якої стадії її розвитку. Терміни "насінно-селективна експресія" та "насінноселективна NEENA" слід розуміти відповідним чином. Отже, "насінно-селективна NEENA" посилює транскрипцію насінно-специфічного або насінно-селективного промотора таким чином, що транскрипція у насінні, зумовлена зазначеним промотором, функціонально зв’язаним з відповідною NEENA, складає більш, ніж 50%, в оптимальному варіанті – більш, ніж 70%, у ще кращому варіанті – більш, ніж 80% загальної кількості РНК, транскрибованої з відповідного промотора, функціонально зв’язаного з NEENA, в усій рослині протягом будь-якої стадії її розвитку. Смислова: термін "смислова" означає молекулу нуклеїнової кислоти, яка має послідовність, комплементарну або ідентичну послідовності-мішені, наприклад, послідовність, яка зв’язується з фактором транскрипції білка і бере участь в експресії даного гена. Згідно з оптимальним варіантом втілення, молекула нуклеїнової кислоти включає потрібний ген та елементи, які забезпечують можливість експресії зазначеного потрібного гена. Значне підвищення або зниження: підвищення або зниження, наприклад, ферментної активності або експресії генів, яке перевищує межу похибки, характерну для даного способу вимірювання, в оптимальному варіанті – приблизно дворазове або більше підвищення або зниження активності контрольного ферменту або експресії у контрольній клітині, у ще кращому варіанті – підвищення або зниження приблизно у 5 разів або більше, у найкращому варіанті – підвищення або зниження приблизно у 10 разів або більше. Малі молекули нуклеїнових кислот: "малі молекули нуклеїнових кислот" слід розуміти як молекули, які складаються з нуклеїнових кислот або їх похідних, таких, як РНК або ДНК. Вони можуть бути дволанцюговими або одноланцюговими і включають від приблизно 15 до приблизно 30 п. о., наприклад, від 15 до 30 п. о., у ще кращому варіанті – від приблизно 19 до приблизно 26 п. о., наприклад, від 19 до 26 п. о., у ще кращому варіанті – від приблизно 20 до приблизно 25 п. о., наприклад, від 20 до 25 п. о. У варіанті втілення, якому віддають найбільшу перевагу, олігонуклеотиди складають від приблизно 21 до приблизно 24 п. о., наприклад, від 21 до 24 п. о. У найкращому варіанті малі молекули нуклеїнових кислот складають приблизно 21 п. о. та приблизно 24 п. о., наприклад, 21 п. о. та 24 п. о. Суттєво комплементарна: у найширшому сенсі термін "суттєво комплементарна", вжитий у контексті даного опису стосовно нуклеотидної послідовності для контрольної або заданої нуклеотидної послідовності, означає нуклеотидну послідовність, яка має відсоток ідентичності між суттєво комплементарною нуклеотидною послідовністю та точно комплементарною 18 UA 110018 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовністю зазначеної контрольної або заданої нуклеотидної послідовності принаймні 60%, більш бажано – принаймні 70%, більш бажано – принаймні 80% або 85%, в оптимальному варіанті – принаймні 90%, у ще кращому варіанті – принаймні 93%, у ще кращому варіанті – принаймні 95% або 96%, у ще кращому варіанті – принаймні 97% або 98%, у ще кращому варіанті – принаймні 99%, або у найкращому варіанті – 100% (остання є рівноцінною термінові "ідентична" у цьому контексті). В оптимальному варіанті ідентичність визначають на відрізку принаймні 19 нуклеотидів завдовжки, в оптимальному варіанті – принаймні 50 нуклеотидів, у ще кращому варіанті – по всій довжині нуклеїновокислотної послідовності, з зазначеною контрольною послідовністю (якщо нижче не зазначено іншого). Порівняння послідовностей здійснюють, застосовуючи стандартний GAP-аналіз з GCG Університету шт. Вісконсін, платформа SEQWEB для GAP, на основі алгоритму Нідлмана – Вунша (Needleman and Wunsch (1970) J Mol. Biol. 48: 443-453; як визначено вище). Нуклеотидна послідовність, "суттєво комплементарна " контрольній нуклеотидній послідовності, гібридизується з контрольною нуклеотидною послідовністю в умовах низької жорсткості, в оптимальному варіанті – і в умовах середньої жорсткості, у найкращому варіанті – в умовах високої жорсткості (як визначено вище). Трансген: термін "трансген" у контексті даного опису стосується будь-якої нуклеїновокислотної послідовності, яку вводять у геном клітини шляхом експериментальних маніпуляцій. Трансген може бути "ендогенною послідовністю ДНК" або "гетерологічною послідовністю ДНК" (тобто, "чужорідною ДНК"). Термін "ендогенна послідовність ДНК" стосується нуклеотидної послідовності, яка у природі міститься у клітині, до якої вона включена, якщо вона не містить певних модифікацій (наприклад, точкової мутації, наявності селектованого маркерного гена і т. ін.) відносно природної послідовності. Трансгенний: термін "трансгенний" стосовно організму означає трансформований, в оптимальному варіанті – стійко трансформований, молекулою рекомбінантної ДНК, яка в оптимальному варіанті включає відповідний промотор, функціонально з’єднаний з потрібною послідовністю ДНК. Вектор: у контексті даного опису термін "вектор" стосується молекули нуклеїнової кислоти, здатної переносити іншу молекулу нуклеїнової кислоти, з якою він зв’язується. Один тип вектора являє собою геномний інтегрований вектор або "інтегрований вектор", який може бути інтегрований у хромосомну ДНК клітини-хазяїна. Іншим типом вектора є епісомний вектор, тобто, молекула нуклеїнової кислоти, здатна до позахромосомної реплікації. Вектори, здатні спрямовувати експресію генів, з якими вони є функціонально зв’язаними, у даному описі називаються "векторами експресії". У даному описі терміни "плазміда" та "вектор" вживаються взаємозамінно, якщо контекст прямо не передбачає іншого. Вектори експресії, побудовані для утворення описаних авторами РНК in vitro або in vivo, можуть містити послідовності, які розпізнаються будь-якою РНК-полімеразою, включаючи мітохондріальну РНК-полімеразу, РНК pol I, РНК pol II та РНК pol III. Ці вектори можуть застосовуватися для транскрипції потрібної молекули РНК у клітині згідно з винаходом. Вектор трансформації рослин слід розуміти як вектор, прийнятний для процесу трансформації рослин. Дикий тип: терміни "дикий тип", "природний" або "природне походження" стосовно організму, поліпептиду або нуклеїновокислотної послідовності означає, що зазначений організм є природним або наявним у принаймні одному природному організмі, який не був змінений, мутований або підданий іншим маніпуляціям з боку людини. ПРИКЛАДИ Хімічні речовини та загальні способи Якщо не зазначено іншого, процедури клонування, які здійснюють згідно з даним винаходом, включаючи рестрикційне картування, електрофорез в агарозному гелі, очищення нуклеїнових кислот, лігування нуклеїнових кислот, трансформація, відбір та культивування бактеріальних клітин, здійснювали, як описано (Sambrook et al., 1989). Аналізи послідовностей рекомбінантних ДНК здійснювали за допомогою пристрою для лазерного флуоресцентного секвенування ДНК (Applied Biosystems, Foster City, CA, США) з застосуванням технології Сенджера (Sanger et al., 1977). Якщо не описується іншого, хімічні речовини та реагенти одержували від Sigma Aldrich (Sigma Aldrich, St. Louis, США), від Promega (Madison, WI, США), Duchefa (Haarlem, Нідерланди) або Invitrogen (Carlsbad, CA, США). Рестрикційні ендонуклеази одержували від New England Biolabs (Ipswich, MA, США) або Roche Diagnostics GmbH (Penzberg, Німеччина). Олігонуклеотиди були синтезовані компанією Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Німеччина). Приклад 1: Ідентифікація нуклеїнових кислот-кандидатів, які посилюють експресію нуклеїнових кислот (NEENA), з генів з насінно-специфічною або насінно-селективною експресією 1.1 Ідентифікація молекул NEENA з генів A. thaliana 19 UA 110018 C2 5 Застосовуючи загально доступні геномні послідовності ДНК (наприклад, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/PLANTS/PlantList.html) та дані експресії транскриптів (наприклад, http://www.weigelworld.org/resources/microarray/AtGenExpress/), набір з 19 NEENAкандидатів, що походять з транскриптів Arabidopsis thaliana з насінно-специфічною або насінноселективною експресією було відібрано для детального аналізу. Кандидати зазначені нижче: Таблиця 1 Насінно-специфічні NEENA-кандидати (NEENAss). Назва NEENA NEENAss1 NEENAss2 NEENAss15 NEENAss18 NEENAss14 NEENAss4 At2g04520 At5g60760 At1g11170 At4g37050 At1g56170 At1g54100 At3g12670 At4g04460 NEENAss10 At1g04120 NEENAss6 At2g41070 NEENAss12 At1g05450 NEENAss7 NEENAss17 15 At5g07830 NEENAss13 NEENAss3 NEENAss5 NEENAss11 NEENAss8 NEENAss16 NEENAss9 NEENAss20 10 Локус At1g62290 At1g65090 At2g27040 At1g01170 At5g63190 At4g03050 At3g12490 Анотація SEQ ID NO білок групи аспартил-протеаз 1 експресований білок 2 білок, який містить PAZ-домен 3 реагуючий на озон стрес-білок, гаданий 4 білок, який містить MA3-домен 5 білок, який містить N-кінцевий домен, подібний до бета6 глюкуронідази AtGUS2, з родини 79 глікозил-гідролаз фактор ініціації еукаріотної трансляції 1A, гаданий / eIF-1A 7 пов’язаний з 2-фосфогліцераткіназою 8 експресований білок містить Pfam-профіль PF05212 9 PLA V/PLP4 (пататиноподібний білок 4) 10 HAP5B (гем-активуючий білок (дріжджі) гомолог 5B) 11 альдегіддегідрогеназа, гаданий / антиквітин 12 CTP-синтаза, гаданий / UTP-аміак-лігаза, гаданий 13 білок групи аспартил-протеаз 14 ATMRP5 (білок множинної лікарської резистентності 5 15 Arabidopsis thaliana) основний фактор транскрипції лейцинової застібки 16 (BZIP12) пов’язаний з інгібітором протеази / запасанням у 17 насінні/білком перенесення ліпідів (LTP) 2-оксоглутарат-залежна діоксигеназа, гаданий (AOP3) 18 інгібітор цистеїнпротеази, гаданий / цистатин 19 1.2 Виділення NEENA-кандидатів Геномну ДНК видобували з зеленої тканини A. thaliana, застосовуючи комплект Qiagen DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Німеччина). Фрагменти геномної ДНК, які містять гадані молекули NEENA виділяли за допомогою традиційної полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Праймери будували на основі геномної послідовності A. thaliana з багатьма NEENAкандидатами. Реакція включала 19 наборів праймерів (Таблиця 2), і її здійснювали за протоколом Phusion High Fidelity DNA Polymerase (Cat No F-540L, New England Biolabs, Ipswich, MA, США). Виділену ДНК використовували як матричну ДНК у ПЛР-ампліфікації з застосуванням таких праймерів: Таблиця 2 Праймерні послідовності Назва праймера NEENAss1_for NEENAss1_rev NEENAss2_for NEENAss2_rev NEENAss3_for NEENAss3_rev NEENAss4_for Послідовність aataatggtacctggtgcttaaacactctggtgagt aataatccatggtttgacctacaaaatcaaagcagtca ttttttggtaccagttctttgctttcgaagttgc ttttttccatggtactacgtactgttttcaattct aaaaaaggtaccatttccacacgctttctatcatttc aaaaaaccatggttatctctctctaaaaaataaaaacgaatc aataaaggtaccgtccagaattttctccattga 20 SEQ ID NO 20 21 22 23 24 25 26 ПЛР, що забезпечує SEQ ID NO 1 2 8 6 UA 110018 C2 Таблиця 2 Праймерні послідовності Назва праймера NEENAss4_rev NEENAss5_for NEENAss5_rev NEENAss6_for NEENAss6_rev NEENAss7_for NEENAss7_rev NEENAss8_for NEENAss8_rev NEENAss9_for NEENAss9_rev NEENAss10_for NEENAss10_rev NEENAss11_for NEENAss11_rev NEENAss12_for NEENAsskor-rev NEENAss13_for NEENAss13_rev NEENAss14_for NEENAss14_rev NEENAss15_for NEENAss15_rev NEENAss16_for NEENAss16_rev NEENAss17_for NEENAss17_rev NEENAss18_for NEENAss18_rev NEENAss20_for NEENAss20(2)_rev 5 10 15 20 Послідовність aataaaccatggtcttcactatccaaagctctca ttttttggtaccgtctactttcattacagtgactctg ttttttccatggttatattttacctgcaacacaattcaa ttttatggtacccactcgaatactgcatgcaa ttttatccatggttatgtagcctttacacagaaaacaa tatataggtaccaacaactatggcctgagggt tatataccatggttatcttactgtttttaaccaaaaaataaaat tttttaggtaccatcttagggtttcgcgagatctca ttttttccatggtgctaagctatctctgttaatataaaattg ttttttggtaccatttttgttggtgaaaggtaga tttttaccatggttacgtttttgtctctgcttcttct tatattggtacctctgggaaatatcgattttgatct tatataccatggtctcaccacatcccaaagctc ttttatggtaccgcacaatcttagcttaccttgaa ttttatccatggttatttaatccacaagccttgcctc tttttaggtacctgtcggagaagtgggcg tttttaccatggagaagtgggcggacg ttttatggtacctagcttaatctcagattcgaatcgt ttttatccatggtagtatctacataccaatcatacaaatg ttttttggtacctttcacgatttggaatttga ttttttccatggtctacaacattaaaacgaccatta tatataggtaccagggtttcgtttttgtttca tatataccatggttatctcctgctcaaagaaacca tttataggtaccagaagctcatttcttcgatac tttataccatggtctctgcgcaaaaattcacc tatattggtacctctaaaaatacagggcacc tatattccatggttactcttcgttgcagaagccta tatataggtaccactgtttaagcttcactgtct tatataccatggtttcttctaaagctgaaagt tatataggtaccttaagcttttaagaatctctactcaca atatatccatggttaaattttacctgtcatcaaaaacaaca SEQ ID NO 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 ПЛР, що забезпечує SEQ ID NO 9 16 18 11 13 15 10 17 7 5 3 12 19 4 14 Ампліфікацію під час ПЛР здійснювали з такою композицією (50 мкл): 3,00 мкл геномної ДНК A. thaliana (50 нг/мкл) 10,00 мкл 5x Phusion HF буфера 4,00 мкл дНТФ (2,5 мM) 2,50 мкл прямого праймера (10 мкM) 2,50 мкл зворотного праймера (10 мкM) 0,50 мкл ДНК-полімерази Phusion HF (2U/мкл) Для ПЛР застосовували метод touch-down з такими параметрами: 98,0 °C протягом 30 сек (1 цикл), 98,0 °C протягом 30 сек, 56,0 °C протягом 30 сек та 72,0 °C протягом 60 сек (4 цикли), 4 додаткові цикли кожен для температури випалу 54,0 °C, 51,0 °C та 49,0 °C, з наступними 20 циклами при 98,0 °C протягом 30 сек, 46,0 °C протягом 30 сек та 72,0 °C протягом 60 сек (4 цикли) та 72,0 °C протягом 5 хв. Продукти ампліфікації подавали на 2 % (маса/об’єм) агарозний гель і відокремлювали при 80 В. Продукти ПЛР видаляли з гелю й очищали за допомогою комплекту Qiagen Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Німеччина). Після рестрикції ДНК за допомогою рестрикційних ендонуклеаз NcoI (10 О/мкл) та KpnI (10 О/мкл) гідролізовані продукти знову очищали за допомогою комплекту Qiagen Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Німеччина). 1.3 Побудова вектора Застосовуючи систему Multisite Gateway (Invitrogen, Carlsbad, CA, США), касети промотор:NEENA:ген-репортер збирали у бінарні послідовності для трансформації рослин. Насінно-специфічний промотор A. thaliana p-AtPXR (At1g48130, GenBank AC023673.3; документ 21 UA 110018 C2 5 10 WO2006089950; з префіксом p-, який означає промотор) застосовували у послідовності генарепортера, і люциферазу світляка (Promega, Madison, WI, США) застосовували як білокрепортер для кількісного визначення ефекту посилення експресії, який забезпечується молекулами NEENA, що підлягають аналізові. Вектор pENTR/A, який містить промотор p-AtPXR, клонували через сайт-специфічну рекомбінацію (BP-реакцію) між вектором pDONR/A та продуктами ампліфікації p-AtPXR з праймерами p-AtPXR-for та p-AtPXR-rev (Таблиця 3) на геномній ДНК (див. вище) з сайтами сайт-специфічної рекомбінації на будь-якому з кінців згідно з інструкціями виробника (Invitrogen, Carlsbad, CA, США). Позитивні клони pENTR/A піддавали аналізові послідовності для перевірки правильності промотора p-AtPXR. Таблиця 3 Праймерні послідовності (p-AtPXR) Назва праймера p-AtPXR-for p-AtPXR-rev 15 20 Послідовність ggggacaactttgtatagaaaagttggccacatcatgtttagacttatc ggggactgcttttttgtacaaacttgtttaccttttatatttatatatag SEQ ID NO. 58 59 Генерували вектор ENTR/B, який містить кодуючу послідовність люциферази світляка (Promega, Madison, WI, США) з наступним термінатором транскрипції нопалінсинтази t-nos (Genbank V00087). ПЛР-фрагменти NEENA-кандидата (див. вище) клонували окремо перед кодуючою послідовністю люциферази світляка, застосовуючи рестрикційні ферменти KpnI та NcoI. Одержані в результаті вектори pENTR/B показано у Таблиці 4, з промоторними молекулами, які мають префікс p-, кодуючими послідовностями, які мають префікс c-, та термінуючими молекулами, які мають префікс t-. Таблиця 4 Усі вектори pENTR/B плюс та мінус NEENA-кандидати Вектор pENTR/B LJK01 LJK19 LJK20 LJK21 LJK22 LJK23 LJK24 LJK25 LJK26 LJK27 LJK28 LJK29 LJK30 LJK31 LJK32 LJK33 LJK34 LJK35 LJK36 LJK38 25 Склад касети часткової експресіїSEQ ID NO:ген-репортер:термінатор MCS:c-LUC:t-nos SEQ ID NO1:c-LUC:t-nos SEQ ID NO2:c-LUC:t-nos SEQ ID NO8:c-LUC:t-nos SEQ ID NO6:c-LUC:t-nos SEQ ID NO9:c-LUC:t-nos SEQ ID NO16:c-LUC:t-nos SEQ ID NO18:c-LUC:t-nos SEQ ID NO11:c-LUC:t-nos SEQ ID NO13:c-LUC:t-nos SEQ ID NO15:c-LUC:t-nos SEQ ID NO10:c-LUC:t-nos SEQ ID NO17:c-LUC:t-nos SEQ ID NO7:c-LUC:t-nos SEQ ID NO5:c-LUC:t-nos SEQ ID NO3:c-LUC:t-nos SEQ ID NO12:c-LUC:t-nos SEQ ID NO19:c-LUC:t-nos SEQ ID NO4:c-LUC:t-nos SEQ ID NO14:c-LUC:t-nos Вектор pENTR/C будували шляхом включення сайта множинного клонування (SEQ ID NO60) через сайти рестрикції KpnI та HindIII. Шляхом виконання сайт-специфічної рекомбінації (LRреакції) створені pENTR/A, pENTR/B та pENTR/C комбінували з вектором призначення pSUN (похідною pSUN) згідно з інструкціями Multisite Gateway від виробника (Invitrogen, Carlsbad, CA, США). Реакції забезпечували 1 бінарний вектор з промотором p-AtPXR, кодуючою 22 UA 110018 C2 5 послідовністю люциферази світляка c-LUC та термінатором t-nos і 19 векторів, які включали SEQ ID NO1, NO2, NO3, NO4, NO5, NO6, NO7, NO8, NO9, NO10, NO11, NO12, NO13, NO14, NO15, NO16, NO17, NO18 та NO19 безпосередньо перед кодуючою послідовністю люциферази світляка (Таблиця 5), прикладом якої є комбінація з SEQ ID NO1 (SEQ ID NO61). За винятком зміни SEQ ID NO2 на NO19, нуклеотидна послідовність є ідентичною в усіх векторах (Таблиця 5). Одержані в результаті вектори трансформації рослин показано у Таблиці 5: Таблиця 5 Рослинні вектори експресії для трансформації A. Thaliana Рослинний вектор експресії LJK134 LJK71 LJK72 LJK73 LJK74 LJK75 LJK76 LJK77 LJK78 LJK79 LJK80 LJK81 LJK82 LJK83 LJK84 LJK85 LJK86 LJK87 LJK88 LJK90 10 15 20 25 30 Склад експресійної касети Промотор:SEQ ID NO:ген-репортер:термінатор p-AtPXR:-:c-LUC:t-nos p-AtPXR:SEQ ID NO1:c-LUC:t-nos p-AtPXR:SEQ ID NO2:c-LUC:t-nos p-AtPXR:SEQ ID NO8:c-LUC:t-nos p-AtPXR:SEQ ID NO6:c-LUC:t-nos p-AtPXR:SEQ ID NO9:c-LUC:t-nos p-AtPXR:SEQ ID NO16:c-LUC:t-nos p-AtPXR:SEQ ID NO18:c-LUC:t-nos p-AtPXR:SEQ ID NO11:c-LUC:t-nos p-AtPXR:SEQ ID NO13:c-LUC:t-nos p-AtPXR:SEQ ID NO15:c-LUC:t-nos p-AtPXR:SEQ ID NO10:c-LUC:t-nos p-AtPXR:SEQ ID NO17:c-LUC:t-nos p-AtPXR:SEQ ID NO7:c-LUC:t-nos p-AtPXR:SEQ ID NO5:c-LUC:t-nos p-AtPXR:SEQ ID NO3:c-LUC:t-nos p-AtPXR:SEQ ID NO12:c-LUC:t-nos p-AtPXR:SEQ ID NO19:c-LUC:t-nos p-AtPXR:SEQ ID NO4:c-LUC:t-nos p-AtPXR:SEQ ID NO14:c-LUC:t-nos SEQ ID NO 61 Одержані в результаті вектори потім застосовували для одержання трансгенних рослин A. thaliana. Приклад 2: Відбір молекул NEENA, які посилюють експресію генів у трансгенних рослинах A. thaliana Цей приклад показує, що лише вибрані молекули NEENA-кандидатів здатні посилювати експресію генів. Усі бінарні послідовності, які містили вибрані молекули NEENA-кандидатів, описаних у Прикладі 1, стійко трансформували у рослини Arabidopsis thaliana разом з контрольною послідовністю без NEENA. Для одержання трансгенних рослин A. thaliana Agrobacterium tumefaciens (штам C58C1 pGV2260) трансформували різними описаними вище послідовностями векторів. Для трансформації A. thaliana застосовували спосіб Floral Dip (Clough and Bent, 1998, Plant Journal 16: 735-743). Трансгенні рослини T1 відбирали шляхом пророщування та вирощування сіянців на канаміцині. Через 12 днів сім’ядолі трансформантів та контрольних рослин дикого типу відбирали й розподіляли по 96-лункових планшетах, у які попередньо поміщали 50 мкл 0,5x середовища Мурасіге-Скуга і піддавали аналізам гена-репортера люциферази (змінений протокол Weigel and Glazebrook, 2002, Arabidopsis, лабораторний довідник, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Chapter 7, ISBN 0-87969-572-2). Люмінесцентність сім’ядоль визначали у розчині, який містив 0,1 мM D-люциферину (Кат. №: L-8220, BioSynth, Staad, Швейцарія) та 0,01 % Tween20 (Sigma Aldrich, St. Louis, США) у MicroLumat Plus LB96V (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Німеччина), і записували через 60 хв після додавання Dлюциферину. Інструментальні показання усереднювали для кожної послідовності і на основі цих середніх значень експресії розраховували значення кратних змін для оцінки впливу присутності гаданої NEENA порівняно з послідовностями гена-репортера без відповідної гаданої NEENA. Порівняно з послідовностями гена-репортера, які містили лише насінно-специфічний промотор p-AtPXR без NEENA, 19 випробуваних послідовностей, які містили NEENA-кандидати, 23 UA 110018 C2 5 10 15 20 25 30 демонстрували негативний, а також позитивний вплив, від 0,8-разової до 22,2-разової індукції активності люциферази (Фіг. 1). Загалом 15 гаданих молекул NEENA, які включали послідовності з SEQ ID NO1, NO2, NO3, NO4, NO5, NO6, NO7, NO8, NO9, NO10, NO11, NO12, NO13, NO14 та NO15, забезпечували більш, ніж 2,5-разове підвищення експресії генів на основі активності гена-репортера люциферази порівняно з послідовністю гена-репортера, що не містить NEENA і містить лише промотор (Фіг. 1), а отже, є функціональними молекулами NEENA. Оскільки багато випробуваних молекул NEENA-кандидатів мають незначний або навіть негативний вплив на посилення експресії генів, не всі гадані молекули NEENA опосередковують загальний стимулюючий вплив, а лише вибрані послідовності NEENA забезпечують значне посилення експресії генів (SEQ ID NO з 1 по 15). Приклад 3: Випробування молекул NEENA на посилення насінно-специфічної експресії генів у рослинах олійного рапсу Цей приклад показує, що молекули NEENA можуть застосовуватись у різних видах для посилення експресії генів тканинно-специфічного промотора порівняно з відсутністю NEENA і присутністю лише промотора. Молекули NEENA, які опосередковують найбільше посилення експресії генів у попередньому відборі (пор. Приклад 2, SEQ ID NO1, NO2, NO3, NO4, NO5, NO6 та NO7), вибирали для визначення посилення рівня експресії генів у трансгенних рослинах олійного рапсу. 3.1 Побудова вектора для трансформації рослин B. napus Для трансформації рослин олійного рапсу касети експресії генів-репортерів без молекул контролю експресії генів та з ними (SEQ ID NO1 - NO7) комбінували з касетою експресії генів, яка містила селектований маркерний ген, для виявлення ліній трансгенних рослин у межах вектора pENTR/C. Шляхом виконання сайт-специфічної рекомбінації (LR-реакції), як було описано вище (див. вище, 1.3), pENTR/A, pENTR/B та pENTR/C, які містили касету селектованого маркера, комбінували з вектором призначення pSUN згідно з інструкціями Multisite Gateway від виробника (Invitrogen, Carlsbad, CA, США). Реакції забезпечували один бінарний вектор з промотором p-AtPXR, кодуючою послідовністю люциферази світляка c-LUC, термінатором t-nos та касетою селектованого маркера, а також 7 векторів, які включали SEQ ID NO1, NO2, NO3, NO4, NO5, NO6 та NO7 безпосередньо перед кодуючою послідовністю люциферази світляка (Таблиця 6), прикладом якої є комбінація з SEQ ID NO1 (SEQ ID NO62). За винятком зміни SEQ ID NO2 на NO7, нуклеотидна послідовність є ідентичною в усіх векторах (Таблиця 6). Одержані в результаті вектори трансформації рослин показано у Таблиці 6: Таблиця 6 Рослинні вектори експресії для трансформації B. Napus Рослинний вектор експресії LJK148 LJK156 LJK157 LJK158 LJK159 LJK160 LJK161 LJK162 Склад експресійної касети Промотор:SEQ ID NO:ген-репортер:термінатор p-AtPXR:-:c-LUC:t-nos p-AtPXR:SEQ ID NO1:c-LUC:t-nos p-AtPXR:SEQ ID NO2:c-LUC:t-nos p-AtPXR:SEQ ID NO7:c-LUC:t-nos p-AtPXR:SEQ ID NO5:c-LUC:t-nos p-AtPXR:SEQ ID NO4:c-LUC:t-nos p-AtPXR:SEQ ID NO6:c-LUC:t-nos p-AtPXR:SEQ ID NO3:c-LUC:t-nos SEQ ID NO 62 35 40 45 3.2 Створення трансгенних рослин олійного рапсу (змінений протокол згідно з Moloney et al., 1992, Plant Cell Reports, 8: 238-242). При підготуванні до створення трансгенних рослин олійного рапсу бінарні вектори трансформували у Agrobacterium tumefaciens C58C1:pGV2260 (Deblaere et al., 1985, Nucl. Acids. Res. 13: 4777-4788). Розведену у пропорції 1:50 витриману протягом доби культуру Agrobacteria, яка містила відповідну послідовність, вирощували у середовищі Мурасіге-Скуга (Murashige and Skoog, 1962, Physiol. Plant 15, 473), доповненому 3 % сахарозою (3MS-середовище). Для трансформації рослин олійного рапсу черешки або гіпокотиль стерильних рослин інкубували з розчином 1:50 Agrobacterium протягом 5 – 10 хвилин з наступною триденною спільною інкубацією у темряві при 25 °C на 3 MS. Середовище доповнювали 0,8 % бактоагаром. Через три дні експлантати переносили до MS-середовища, яке містило 500 мг/л клафорану 24 UA 110018 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (Cefotaxime-Sodium), 100 нM імазетапіру, 20 мкM бензиламінопурину (BAP) та 1,6 г/л глюкози у світловому режимі 16 год світла / 8 год темряви, який повторювали з тижневою періодичністю. Паростки, що розвивалися, переносили до MS-середовища, яке містило 2 % сахарози, 250 мг/л клафорану та 0,8 % бактоагару. Через 3 тижні до середовища додавали гормон росту 2індолбутилову кислоту для сприяння формуванню коріння. Паростки переносили у ґрунт після початку розвитку коріння, вирощували протягом двох тижнів у камері штучного клімату і вирощували до дозрівання в оранжерейних умовах. 3.3 Аналіз рослин Зразки тканин збирали з листя, квіток та насіння одержаних трансгенних рослин на різних стадіях розвитку, які зберігали у морозильній камері при -80 °C, і піддавали аналізові генарепортера люциферази (змінений протокол Ow et al., 1986). Після подрібнення заморожені зразки тканин ресуспендували у 800 мкл буфера I (0,1 M фосфатного буфера, pH 7,8, 1 мM DTT (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, США), 0,05 % Tween 20 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, США) з наступним центрифугуванням при 10 000 g протягом 10 хв. 75 мкл водного супернатанту переносили до 96-лункових планшетів. Після додавання 25 мкл буфера II (80 мM гліцин-гліцилу (Carl Roth, Karlsruhe, Німеччина), 40 мM MgSO4 (Duchefa, Haarlem, Нідерланди), 60 мM ATP (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, США), pH 7,8) та D-люциферину до кінцевої концентрації 0,5 мM (Кат. №: L-8220, BioSynth, Staad, Швейцарія) записували люмінесценцію у MicroLumat Plus LB96V (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Німеччина), одержуючи показник у відносних світлових одиницях RLU за хвилину (RLU/хв). Для нормалізації активності люциферази між зразками визначали концентрацію білка у водному супернатанті паралельно активності люциферази (адаптований спосіб згідно з Bradford, 1976, Anal. Biochem. 72, 248). 5 мкл водного екстракту клітин у буфері I змішували з 250 мкл реагента Бредфорда (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, США), інкубували протягом 10 хв при кімнатній температурі. Поглинання визначали при 595 нм у планшет-ридері (Thermo Electron Corporation, Multiskan Ascent 354). Загальну кількість білка у зразках розраховували за попередньо побудованою стандартною кривою концентрації. Значення за результатами співвідношення RLU/хв та мг білка / мл зразка усереднювали для трансгенних рослин, які містили ідентичні послідовності, і розраховували значення кратних змін для оцінки впливу присутності молекули NEENA порівняно з послідовностями гена-репортера без NEENA. 3.4 Послідовності NEENA опосередковують значне посилення експресії генів у насінні олійного рапсу Для оцінки потенціалу вибраних молекул NEENA у посиленні експресії генів (SEQ ID NO1, NO2, NO3, NO4, NO5, NO6, NO7) у насінні олійного рапсу насіння на ідентичних стадіях розвитку збирали з окремих ліній трансгенних рослин олійного рапсу, які включали послідовність гена-репортера лише з промотором або послідовності гена-репортера люциферази з вмістом NEENA (SEQ ID NO1, NO2, NO3, NO4, NO5, NO6 або NO7). З кожної трансгенної події збирали 10 зерен, обробляли й аналізували на активність люциферази, як описано вище (Приклад 3.3). Порівняно з послідовностями гена-репортера, які містили лише насінно-специфічний промотор p-AtPXR без NEENA, усі 7 випробуваних молекул NEENA опосередковували значне посилення експресії генів, від 54-разової до 380-разової індукції активності люциферази у насінні каноли (Фіг. 2a). Порівнянне посилення експресії виявляли у насінні олійного рапсу на пізніших стадіях визрівання (дані не показано). 3.5 Молекули NEENA підвищують тканинно-специфічну експресію генів у насінні олійного рапсу Для оцінки посилення тканинно-специфічної експресії генів, опосередкованої молекулами NEENA (SEQ ID NO1, NO2, NO3, NO4, NO5, NO6 або NO7) визначали активність люциферази у повністю розвинутому листі та розкритих квітках трансгенних рослин олійного рапсу, які включали вищезазначені послідовності гена-репортера. Три зразки листя ідентичного розміру, а також цілі квітки збирали з кожноїрослини окремо і піддавали аналізам гена-репортера люциферази, як описано вище (Приклад 3.3). 5 (Seq ID NO1, NO2, NO3, NO4, NO5) із 7 випробуваних молекул NEENA демонстрували рівень експресії люциферази, який був порівнянним з рівнем послідовності промотора p-AtPXR, що не містить NEENA, у листі та квітках, і, таким чином, не змінює тканинну специфічність насінно-специфічного промотора pAtPXR (Фіг. 2, b та c). 2 молекули NEENA (SEQ ID NO6, NO7) дещо підвищували активність люциферази у листі та квітках підданих аналізові рослин олійного рапсу (Фіг. 2, b та c) порівняно з рослинами, які включали послідовність, що не містить NEENA. Отже, ці NEENA, SEQ ID NO 6 та 7, є насінно-селективними NEENA, а інші NEENA, SEQ ID NO з 1 по 5, є насінноспецифічними NEENA. 25 UA 110018 C2 5 10 Приклад 4: Аналіз NEENA для насінно-специфічного підвищення сильних насінноспецифічних промоторів Цей приклад показує, що здатність молекул NEENA до посилення експресії може використовуватись у комбінації з різними промоторними молекулами для підвищення рівня тканинно-специфічної експресії порівняно з застосуванням лише промоторів. 4.1 Побудова вектора для трансформації рослин B. napus Вибрані молекули NEENA з групи, яку випробували у Прикладі 3 (SEQ ID NO1, NO2, NO3, NO5 та NO6) випробували на їх вплив на посилення тканинно-специфічної експресії генів сильних насінно-специфічних промоторів p-LuPXR (документ WO2006089950, послідовність 9) та p-VfUSP (X56240, Baeumlein et al., 1991). Побудову вектора здійснювали, як описано вище (пор. Приклад 1.3 та 3.1), з праймерними послідовностями, вказаними у Таблиці 7, та вектором LJB765 (документ WO2009016202) як матричною ДНК. Позитивні клони pENTR/A піддавали аналізові послідовності для перевірки правильності промоторів p-LuPXR та p-VfUSP. Таблиця 7 Праймерні послідовності для p-LuPXR та p-VfUSP Назва праймера p-LuPXR-for p-LuPXR-rev p-VfUSP-for p-VfUSP-rev Послідовність ggggacaactttgtatagaaaagttcacgggcaggacatagggactactac ggggactgcttttttgtacaaacttggatttatgataaaaatgtcggtttc ggggacaactttgtatagaaaagttctgcagcaaatttacacattgccac ggggactgcttttttgtacaaacttgactggctatgaagaaattataatc SEQ ID NO. 63 64 65 66 15 20 25 Шляхом виконання сайт-специфічної рекомбінації (LR-реакції), як було описано вище (див. вище, 1.3), вектори pENTR/A, pENTR/B та вектор pENTR/C, який містив касету селектованого маркера, комбінували з вектором призначення pSUN згідно з інструкціями Multisite Gateway від виробника (Invitrogen, Carlsbad, CA, США). Реакції забезпечували 1 бінарний вектор з промотором p-LuPXR, кодуючою послідовністю люциферази світляка та термінатором t-nos, а також касетою селектованого маркера та 4 вектори, які включали SEQ ID NO1, NO2, NO3 та NO6 безпосередньо перед кодуючою послідовністю люциферази світляка (Таблиця 8), прикладом якої є комбінація з SEQ ID NO1 (SEQ ID NO67). За винятком зміни SEQ ID NO2, NO3 та NO6, нуклеотидна послідовність є ідентичною в усіх векторах (Таблиця 8). Подібним чином промотор p-VfUSP застосовували для одержання послідовності LJK219 лише з промотором, а також послідовностей LJK220, LJK221, LJK224 та LJK225, які містили SEQ ID NO1, NO2, NO3 та NO5 (Таблиця 8). Одержані в результаті вектори трансформації рослин показано у Таблиці 8: Таблиця 8 Рослинні вектори експресії для трансформації B. Napus рослинний вектор експресії LJK212 LJK213 LJK214 LJK215 LJK218 LJK219 LJK220 LJK221 LJK224 LJK225 30 35 Склад експресійної касети Промотор:SEQ ID NO:ген-репортер:термінатор p-LuPXR:-:c-LUC:t-nos p-LuPXR:SEQ ID NO1:c-LUC:t-nos p-LuPXR:SEQ ID NO2:c-LUC:t-nos p-LuPXR:SEQ ID NO6:c-LUC:t-nos p-LuPXR:SEQ ID NO3:c-LUC:t-nos p-VfUSP:-:c-LUC:t-nos p-VfUSP:SEQ ID NO1:c-LUC:t-nos p-VfUSP:SEQ ID NO2:c-LUC:t-nos p-VfUSP:SEQ ID NO5:c-LUC:t-nos p-VfUSP:SEQ ID NO3:c-LUC:t-nos SEQ ID NO 67 4.2 Послідовності NEENA опосередковують посилення тканинно-специфічної експресії генів сильних насінно-специфічних промоторів у насінні олійного рапсу Створення трансгенних рослин олійного рапсу та аналізи рослин здійснювали, як описано вище (приклад 3.2 та 3.3). Для випробування впливу вибраних молекул NEENA у комбінації з насінно-специфічними промоторами (SEQ ID NO1, NO2, NO3, NO5 та NO6) у насінні олійного рапсу насіння на 26 UA 110018 C2 5 10 ідентичних стадіях розвитку збирали з окремих ліній трансгенних рослин олійного рапсу, які включали послідовність гена-репортера лише з промотором (LJK212 та LJK219) або послідовності гена-репортера люциферази з вмістом NEENA (SEQ ID NO1, NO2, NO3, NO5 та NO6) (Таблиця 9). З кожної трансгенної події збирали 10 зерен, обробляли й аналізували на активність люциферази, як описано вище (Приклад 3.3). Порівняно з послідовностями гена-репортера, які містили лише насінно-специфічні промотори p-LuPXR та p-VfUSP без NEENA, усі випробувані молекули NEENA опосередковували значне посилення експресії генів у насінні олійного рапсу середньої зрілості у комбінації з обома промоторами, p-LuPXR та p-VfUSP (Таблиця 9). Подібне посилення експресії виявляли у насінні олійного рапсу на пізніших стадіях визрівання. Таблиця 9 Експресія LUC у насінні стійко трансформованих рослин олійного рапсу Рослинний вектор експресії LJK212 LJK213 LJK214 LJK215 LJK218 LJK219 LJK220 LJK221 LJK224 LJK225 15 20 25 30 Склад експресійної касети Промотор:SEQ ID NO:ген-репортер:термінатор p-LuPXR:-:c-LUC:t-nos p-LuPXR:SEQ ID NO1:c-LUC:t-nos p-LuPXR:SEQ ID NO2:c-LUC:t-nos p-LuPXR:SEQ ID NO6:c-LUC:t-nos p-LuPXR:SEQ ID NO3:c-LUC:t-nos p-VfUSP:-:c-LUC:t-nos p-VfUSP:SEQ ID NO1:c-LUC:t-nos p-VfUSP:SEQ ID NO2:c-LUC:t-nos p-VfUSP:SEQ ID NO5:c-LUC:t-nos p-VfUSP:SEQ ID NO3:c-LUC:t-nos Експресія LUC у насінні олійного рапсу* + 20%** ++++ 80% ++++ 80% ++++ 80% ++++ 80% ++ 40% +++++ 100% +++++ 100% ++++ 80% +++++ 100% * Експресія LUC, представлена як показник активності люциферази світляка (- від відсутності експресії до +++++ дуже високої експресії), відносна експресія LUC порівняно з експресією промотора p-LuPXR льону у відповідній тканині. ** Відносна експресія люциферази порівняно з експресією, контрольованою промотором пероксиредоксину льону p-LuPXR. Для оцінки посилення тканинно-специфічної експресії генів, опосередкованої молекулами NEENA (SEQ ID NO1, NO2, NO3, NO5 та NO6), активність люциферази визначали у повністю розвинутому листі трансгенних рослин олійного рапсу, які включали вищезазначені послідовності гена-репортера. 3 зразки листя ідентичного розміру збирали з кожної рослини окремо і піддавали аналізам гена-репортера люциферази, як описано вище (Приклад 3.2). Тканинна специфічність випробуваних молекул NEENA (SEQ ID NO1, NO2, NO3, NO5, NO6) у комбінації з промотором p-LuPXR та промотором p-VfUSP є подібною до показників, випробуваних з промотором p-AtPXR, який аналізували раніше (Приклад 3.5). Як і у разі промотора p-AtPXR (Приклад 3.5), молекули NEENA (SEQ ID NO1, NO2, NO3 та NO5) не демонстрували зміни тканинної специфічності промотора p-LuPXR або p-VfUSP (Таблиця 10). Подібно до активності з промотором p-AtPXR (Приклад 3.5), NEENA (SEQ ID NO6) забезпечувала посилення активності люциферази у насінні, але й опосередковувала експресію люциферази у листі підданих аналізові рослин олійного рапсу (Таблиця 10). 27 UA 110018 C2 Таблиця 10 Експресія LUC у листі стійко трансформованих рослин олійного рапсу Рослинний вектор експресії LJK212 LJK213 LJK214 LJK215 LJK218 LJK219 LJK220 LJK221 LJK224 LJK225 5 10 15 20 25 30 35 40 Склад експресійної касети Промотор:SEQ ID NO:ген-репортер:термінатор p-LuPXR:-:c-LUC:t-nos p-LuPXR:SEQ ID NO1:c-LUC:t-nos p-LuPXR:SEQ ID NO2:c-LUC:t-nos p-LuPXR:SEQ ID NO6:c-LUC:t-nos p-LuPXR:SEQ ID NO3:c-LUC:t-nos p-VfUSP:-:c-LUC:t-nos p-VfUSP:SEQ ID NO1:c-LUC:t-nos p-VfUSP:SEQ ID NO2:c-LUC:t-nos p-VfUSP:SEQ ID NO5:c-LUC:t-nos p-VfUSP:SEQ ID NO3:c-LUC:t-nos Експресія LUC у листі олійного рапсу* 0%** 0% 0% + 100% 0% 0% 0% 0% 0% 0% * Експресія LUC, представлена як показник активності люциферази світляка (- від відсутності експресії до +++++ дуже високої експресії), відносна експресія LUC порівняно з експресією промотора p-LuPXR льону у відповідній тканині. ** Відносна експресія люциферази порівняно з експресією, контрольованою промотором пероксиредоксину льону p-LuPXR. Приклад 5: Аналіз посилення тканинно-специфічної експресії генів у рослинах сої Цей приклад показує, що заявлені молекули NEENA можуть застосовуватися у багатьох видах рослин і у різних видах з різних родин рослин для посилення експресії генів тканинноспецифічно порівняно з відсутністю NEENA і присутністю лише промотора. Послідовності молекул NEENA, які опосередковують найбільше посилення експресії генів у попередньому відборі (пор. Приклад 2, SEQ ID NO1, NO2, NO4, NO5, NO6 та NO7), вибирали для визначення посилення рівня експресії генів у трансгенних рослинах сої. Рослинні вектори експресії LJK148, LJK156, LJK157, LJK158, LJK159, LJK160 та LJK161 (пор. приклад 3.1) застосовували для стійкої трансформації сої. 5.1 Одержання трансгенних рослин сої (змінений протокол згідно з документом WO2005/121345; Olhoft et al., 2007). Пророщування, розмноження насіння сої, приготування A. rhizogenes та додаткових експлантатів меристем, та інокуляцію здійснювали, як було описано вище (документ WO2005/121345; Olhoft et al., 2007), за винятком того, що послідовності LJK148, LJK156, LJK157, LJK158, LJK159, LJK160 та LJK161 (пор. Приклад 3.1) містила мутований ген AHAS під дією убіквітинового промотора петрушки PcUbi4-2, що опосередковує толерантність до імідазолінонових гербіцидів для відбору. 5.2 Послідовності NEENA опосередковують значне посилення експресії генів у рослинах сої зі збереженням тканинної специфічності промотора Зразки тканин збирали з листя, квіток та насіння одержаних трансгенних рослин. Зразки тканин обробляли й аналізували, як описано вище (пор. Приклад 3.3) Порівняно з насінно-специфічною послідовністю гена-репортера LJK148, що містить лише промотор p-AtPXR без NEENA, усі сім випробуваних молекул NEENA опосередковували значне посилення експресії генів у насінні сої на основі активності люциферази (Фіг. 3a). Натомість у листі та квітках сої не виявлялося значних змін активності люциферази, опосередкованої молекулами NEENA (SEQ ID NO1, NO2, NO4, NO5, NO6 та NO7) (Фіг. 3, b та c). Приклад 6: Аналіз активності NEENA в однодольних рослинах У цьому прикладі описується аналіз послідовностей NEENA з SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5, 6 та 7 в однодольних рослинах. 6.1 Побудова вектора Для аналізу послідовностей NEENA з SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5, 6 та 7 в однодольних рослинах застосовують вектор експресії на основі pUC, який містив експресійну касету, яка включала насінно-специфічний промотор p-KG86 °F однодольних, що не містить NEENA, з Z. mais, комбінують з кодуючою послідовністю гена бета-глюкуронідази (GUS) з наступним термінатором транскрипції нопалінсинтази (NOS). Геномну ДНК видобувають з зеленої тканини A. thaliana, застосовуючи комплект Qiagen DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Німеччина). Фрагменти геномної ДНК, які містять молекули NEENA, виділяють шляхом традиційної полімеразної 28