Пригнічення стрілкування та цвітіння рослини цукрового буряка

Реферат: Винахід належить до виділеної нуклеїнової кислоти, яка пригнічує стрілкування та цвітіння рослини цукрового буряка після яровизації. UA 110019 C2 (12) UA 110019 C2 UA 110019 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Цей винахід стосується ізольованої нуклеїнової кислоти для пригнічення стрілкування та цвітіння рослини цукрового буряка, а також застосування цієї нуклеїнової кислоти, білка, способу одержання трансгенної рослини цукрового буряка, у якої пригнічені утворення квітконіжки і цвітіння після яровизації, векторів або мобільних генетичних елементів, а також трансгенного цукрового буряка, у якого пригнічені стрілкування та цвітіння після яровизації, і насіння, а також їхніх частин. Для генетичного модифікування сільськогосподарських культур з метою зміни їхніх властивостей і, тим самим, поліпшення цих культур, можна застосовувати молекулярнобіологічні методи. Одна з важливих властивостей при культивуванні та використанні дворічних рослин, таких як цукровий буряк (Beta vulgaris), полягає у тому, що стрілкування та подальше цвітіння потребує індукування тривалим періодом холодної погоди, які звичайно трапляються у помірних широтах взимку. Цей перехід від вегетативної до генеративної фази, індукований тривалим періодом низької температури, називають яровизацією. Існує декілька метаболічних шляхів, якими контролюється цвітіння. До них належить, inter alia, фотоперіодичний метаболічний шлях, автономний шлях, що залежить від гіберелової кислоти та яровизації. Впродовж останніх років була ідентифікована велика кількість генів, які приймають участь у регуляції цвітіння. Зокрема, контролювання часу цвітіння екстенсивно досліджувалось на модельній рослині Arabidopsis (Boss P.K., Bastow R.M., Mylne J.S., and Dean C. (2004) Multiple pathways in the decision to flower: enabling, promoting, and resetting, Plant Cell 16 Suppl.: 18-31; He Y. and Amasino R.M. (2005) Role of chromatin modification in flowering-time control, Trends Plant Sci 10, 30-35; Bäurle I. and Dean C. (2006) The timing of developmental transitions in plants, Cell, 125(4): 655-664). Багато генів "раннього цвітіння" або "пізнього цвітіння" були ідентифіковані, головним чином, за допомогою мутантів Arabidopsis (Gazzani S., Gendall A.R., Lister C., and Dean C. (2003) Analysis of the molecular basis of flowering time variation in Arabidopsis accessions, Plant Physiol. 132: 1107-1114; Geraldo N., Bäurle I., Kidou S., Hu X., and Dean C. (2009), FRIGIDA Delays Flowering in Arabidopsis via a Cotranscriptional Mechanism Involving Direct Interaction with the Nuclear Cap-Binding Complex, Plant Physiology, July 1, 2009; 150(3): 1611-1618; Michaels S.D., Amasino R.M. (2001) Loss of FLOWERING LOCUS C activity eliminates the late-flowering phenotype of FRIGIDA and autonomous pathway mutations but not responsiveness to vernalization, Plant Cell 13: 935-942). У цукрового буряка до цього часу докладно були визначені лише характеристики гена BvFLC. Було показано, що цей ген не є головним контрольованим геном цвітіння або яровизації у цукрового буряка (Reeves P.A., He Y, Schmitz R.J., Amasino R.M., Panella L.W., Richards C.M. (2007), Evolutionary conservation of the FLOWERING LOCUS C-mediated vernalization response: evidence from the sugar beet (Beta vulgaris), Genetics 176(1): 295-307; Chia T.Y.P., Müller A., Jung C., and Mutasa-Göttgens E.S. (2008), Sugar beet contains a large CONSTANS-LIKE gene family including a CO homologue that is independent of the early-bolting (B) gene locus, J. Exp. Bot. 59(10): 2735-2748). Стрілкування і цвітіння рослин цукрового буряка є небажаним, оскільки цукровий буряк – це не насіння або фрукти, а скоріше підземна частина рослини, коренеплід, що використовується, а під час стрілкування і цвітіння рослини буде споживатись енергія, накопичена у коренеплоді. Більше того, у деяких рослин, які називають "цвітушними рослинами", відбувається небажане викидання квітконосів на першому році вирощування, що призводить до значних збитків при збиранні та переробці врожаю. Таким чином, метою цього винаходу є створення засобів, які уможливлюють пригнічення стрілкування та/або цвітіння цукрового буряка і навіть повне запобігання цьому. За цим винаходом згадана проблема вирішена із застосуванням ізольованої нуклеїнової кислоти, причому згадана нуклеїнова кислота включає в себе нуклеотидну послідовність, яка a) являє собою послідовність або часткову послідовність послідовностей SEQ ID NO: 1-3, або b) є комплементарною до послідовності або часткової послідовності послідовностей SEQ ID NO: 1-3, або c) являє собою у антисмисловому напрямку послідовність або часткову послідовність послідовностей SEQ ID NO: 1-3 або їхню комплементарну послідовність, або d) є гомологом послідовності або часткової послідовності послідовностей SEQ ID NO: 1-3, або e) є на щонайменше 80 % ідентичною послідовності або частковій послідовності послідовностей SEQ ID NO: 1-3, або f) кодує білок чи частину білка амінокислотною послідовністю послідовності SEQ ID NO: 4, або 1 UA 110019 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 g) кодує білок амінокислотною послідовністю Beta vulgaris, яка є гомологом послідовності SEQ ID NO: 4 або часткової послідовності SEQ ID NO: 4, або h) гібридизується за суворих умов з послідовністю або частковою послідовністю послідовностей SEQ ID NO: 1-3 або з комплементарною їм нуклеотидною послідовністю чи з нуклеотидною послідовністю, орієнтованою відносно них у антисмисловому напрямку. Нуклеїнову кислоту за цим винаходом можна застосовувати, наприклад, за методом інтерференції РНК (RNAi) або за методом інтерференції мікроРНК (miRNA) (Fire A., Xu S., Montgomery M., Kostas S., Driver S., Mello C. (1998). Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans, Nature 391 (6669): 806-811) для пригнічення стрілкування та цвітіння цукрового буряка і, зокрема, якщо це можливо, для повного запобігання стрілкуванню і цвітінню, наприклад, шляхом пригнічення генів, що кодують індуктори цвітіння, такі як FT, FUL, Co або VIN3. Згадана нуклеїнова кислота відрізняється, зокрема, тим, що із її застосуванням можна одержати трансгенні рослини, зокрема, цукровий буряк, із винятковими властивостями. Доцільно їх застосовувати, наприклад, у наведених нижче цілях або з одержанням наведених нижче переваг: - одержання цукрового буряка, що не стрілкується і не цвіте; - одержання озимого цукрового буряка; - одержання ярового цукрового буряка; - підвищення біомаси цукрового буряка; - підвищення виходу цукру; - уникнення появи цвітушного цукрового буряка; - подовження сезону збирання цукрового буряка; - уникнення втрат накопиченої поживної речовини цукрового буряка; - використання підвищеної вологості восени; - покриття ґрунту та використання накопиченого азоту; - захист корисних комах у полі. Цукровий буряк є дворічною рослиною. Після закінчення зими і яровизації, що є її результатом, цукровий буряк, як правило, на другий рік зацвітає. Нуклеїнова кислота за цим винаходом, наприклад, послідовність, яка відповідає послідовності SEQ ID NO: 5 та послідовності SEQ ID NO: 7, або інша нова послідовність чи часткова послідовність, введена за методом RNAi або мікроРНК, може пригнічувати гени, а також може пригнічувати вплив яровизації або повністю запобігати йому. Механізми та способи пригнічення або відключення генів є відомими фахівцю у цій галузі, наприклад, під назвою "глушіння гена", і охоплюють вже згадані і відомі фахівцям у цій галузі методи RNAi або miRNA (але без обмеження ними). За методом RNAi, наприклад, послідовності SEQ ID NO: 5-SEQ ID NO: 7 із застосуванням молекулярно-біологічних технологій, відомих у цій галузі, можуть бути введені до клітини цукрового буряка з антисмисловою орієнтацією і можуть бути експресовані у ній під контролем прийнятного промотору. За цим винаходом стрілкування і цвітіння рослини може бути повністю пригнічене. Насіння цукрового буряка можна висівати раніше, результатом чого, зрештою, є довший вегетаційний період, що, тим самим, призводить до одержання більшої біомаси і більшого виходу цукру. Цукровий буряк, який також має холодостійкість, можна, наприклад, вирощувати як так званий озимий цукровий буряк. У разі сівби насіння цукрового буряка у серпні, наступної весни його вже можна збирати як яровий цукровий буряк. Це надає фермеру можливість додаткової сівозміни. Завдяки застосуванню нуклеїнової кислоти за цим винаходом, навіть у випадку тривалих похолодань у полі після сівби, підвищене утворення цвітушного цукрового буряка більше не спостерігається. Навіть нормальній появі цвітушного цукрового буряка, що спостерігалась раніше без тривалих похолодань, можна запобігти або принаймні значно зменшити її. Застосовуючи цей винахід можна не лише досягти пригнічення або запобігання стрілкуванню і подальшому цвітінню цукрового буряка після початкової яровизації, тобто на другий рік, але цукровий буряк може також зазнавати впливу інших періодів похолодання без спостерігання результатів яровизації. Цукровий буряк вирощують, як правило, з квітня до жовтня/листопада. Оскільки не весь зібраний цукровий буряк може бути одночасно перероблений, його необхідно постійно або тимчасово зберігати. Під час зберігання, наприклад, у буртах, відбуваються великі втрати накопиченої поживної речовини (втрати цукрози) як результат розщеплення цукрози на глюкозу та фруктозу. При застосуванні нуклеїнової кислоти за цим винаходом, зокрема, за методом RNAi, строки засівання та збирання врожаю можуть бути змінені так, що сезон збиральних робіт (збирання врожаю) у цілому може бути подовжений без втрат врожаю. Це дозволяє 2 UA 110019 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 переробляти більшу кількість цукрового буряка впродовж тривалішого періоду з меншою втратою накопиченої поживної речовини. Термін "цукровий буряк" або "рослина цукрового буряка" означає рослину роду Beta vulgaris, наприклад, Beta vulgaris ssp. vulgaris var. altissima (цукровий буряк звичайний), Beta vulgaris ssp. maritima (буряк приморський), Beta vulgaris ssp. vulgaris var. vulgaris (буряк листовий, мангольд), Beta vulgaris ssp. vulgaris var. conditiva (буряк червоний/столовий), Beta vulgaris ssp. vulgaris var. crassa/alba (буряк кормовий). Термін "виділена нуклеїнова кислота" означає нуклеїнову кислоту, виділену з її природного або вихідного середовища. Цей термін означає також нуклеїнову кислоту, одержану синтетичним шляхом. Термін "пригнічення стрілкування і цвітіння" рослини цукрового буряку означає зменшення частки рослин цукрового буряку, що стрілкуються і, можливо, утворюють квіти, порівняно з модифікованою не за цим винаходом рослиною цукрового буряку на порівнянній стадії розвитку, зокрема, на другий рік після проходження через відповідний холодний період, тобто після яровизації. Зокрема, це поняття охоплює зменшення частки цвітушних рослин так, щоб вона становила не більше ніж 80 %, за варіантом, якому віддається перевага, щонайбільше 70 %, 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 % або 10 %, за варіантом, якому віддається більша перевага, щонайбільше 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,4 %, 0,3 %, 0,2 % або 0,1 % від частки цвітушних рослин у порівнянні з контрольними рослинами, які не відповідають цьому винаходу. "Контрольними рослинами" за варіантом, якому віддається перевага, є рослини того самого сорту, але вони не змінені за цим винаходом і демонструють, наприклад, частку цвітушних рослин на рівні щонайбільше 0,01 %. Термін "пригнічення" або "повне пригнічення" стрілкування і цвітіння означає пригнічення на щонайменше 99 %, за варіантом, якому віддається перевага, щонайменше 99,5 %, за варіантом, якому віддається більша перевага, щонайменше 99,8 % або щонайменше 99,9 %, тобто зниження частки цвітушних рослин до щонайбільше 1 %, щонайбільше 0,5 %, щонайбільше 0,2 % або щонайбільше 0,1 %, особливо на другий рік після яровизації, у порівнянні з модифікованою не за цим винаходом рослиною цукрового буряка, наприклад, до відсотка цвітушних рослин щонайбільше 0,01 %. Поняття інгібування або пригнічення стрілкування та цвітіння означає, головним чином, інгібування/пригнічення викидання квітконосів, незалежно від того, відбувається цвітіння рослини або ні. Термін "трансгенний" у цьому описі означає генетично модифікований. При вживанні в цьому описі цей термін охоплює також випадок, коли видоспецифічну нуклеїнову кислоту у певній формі, розміщенні або кількості вводять до клітини, у якій згадана нуклеїнова кислота за природних умов не зустрічається. Термін "гомологія" означає аналоги або подібності у нуклеотидній послідовності молекул двох нуклеїнових кислот або амінокислотній послідовності двох білків або пептидів. Наявність гомології між двома нуклеїновими кислотами або білками може бути виявлена шляхом порівняння одного положення у одній послідовності з відповідним положенням у другій послідовності і визначення, чи є присутніми у цьому разі ідентичні або подібні залишки. Дві порівнювані послідовності є гомологічними, якщо має місце мінімальний рівень ідентичних або подібних нуклеотидів. Термін "ідентичний" означає, що при порівнянні двох послідовностей у еквівалентних точках у кожному разі знаходиться той самий нуклеотид або та сама амінокислота. Може виникнути необхідність прийняття до уваги розривів у послідовності для здійснення найкращого можливого порівняння послідовностей шляхом вирівнювання. Подібні нуклеотиди/амінокислоти не є ідентичними нуклеотидами/амінокислотами з однаковими або еквівалентними фізичними та хімічними властивостями. Заміна нуклеотиду (амінокислоти) на інший нуклеотид (іншу амінокислоту) з такими або еквівалентними фізичними та хімічними властивостями називається "консервативною заміною". До прикладів фізико-хімічних властивостей амінокислоти належать, наприклад, гідрофобність або заряд. У контексті нуклеїнових кислот, під консервативною або подібною заміною нуклеотиду також мається на увазі заміна нуклеотиду у кодувальній послідовності кодону на інший, однак, унаслідок виродження генетичного коду, на таку саму амінокислоту або подібну амінокислотну послідовність, оскільки у відповідній послідовності кодується кодон, що зазнав заміни. Фахівець у цій галузі знає, яка нуклеотидна або амінокислотна заміна є консервативною заміною. Для визначення ступеня подібності або ідентичності двох нуклеїнових кислот до уваги беруть мінімальну довжину у 60 нуклеотидів або пар основ, за варіантом, якому віддається перевага, мінімальну довжину у 70, 80, 90, 100, 110, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350 або 400 нуклеотидів чи пар основ, за варіантом, якому віддається більша перевага, повну довжину порівнюваних нуклеїнових кислот, а у випадку білків/пептидів беруть мінімальну довжину у 20 амінокислот, за варіантом, якому віддається перевага, мінімальну довжину у 25, 30, 35, 40, 45, 3 UA 110019 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 50, 60, 80, 100, 150, 200, 250 або 300 амінокислот, і, за варіантом, якому віддається особлива перевага, повну довжину порівнюваних амінокислот. Ступінь подібності ("позитивність") або ідентичності двох послідовностей можна визначати за допомогою, наприклад, комп'ютерної програми BLAST (Altschul S.F. et al. (1990), Basic Local Alignment Search Tool, J. Mol. Biol. 215: 403-410; дивись, наприклад, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), застосовуючи стандартні параметри. Визначення гомології залежить від довжини порівнюваних послідовностей. Для цілей цього винаходу гомологія між двома нуклеїновокислотними послідовностями, довжина коротшої з яких становить щонайменше 100 нуклеотидів, встановлюється, якщо щонайменше 70 %, щонайменше 75 %, щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 97 %, щонайменше 98 % або щонайменше 99 % нуклеотидів є ідентичними та/або подібними ("ідентичність" або "позитивність" за BLAST), а за варіантом, якому віддається перевага, є ідентичними. У випадку послідовності, довжина якої становить 5099 нуклеотидів, гомологія між послідовностями встановлюється при ідентичності або подібності щонайменше 80 %, за варіантом, якому віддається перевага, – щонайменше 85 %, 86 %, 87 %, 88 % або 89 %, у разі послідовності, довжина якої становить 15-49 нуклеотидів, – при ідентичності або подібності щонайменше 90 %, за варіантом, якому віддається перевага, – щонайменше 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 %. У випадку білків гомологія приймається, якщо за допомогою комп'ютерної програми BLAST із застосуванням стандартних параметрів та матриці заміщення BLOSUM62 (Henikoff S., and Henikoff J., Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919, 1992) одержують ступінь ідентичності ("ідентичність") та/або подібності ("позитивність"), за варіантом, якому віддається перевага, ідентичності, на рівні щонайменше 25 %, щонайменше 26 %, щонайменше 27 %, щонайменше 28 %, щонайменше 29 %, щонайменше 30 %, за варіантом, якому віддається перевага, на рівні щонайменше 35 %, щонайменше 40 %, щонайменше 45 %, щонайменше 50 %, щонайменше 55 %, щонайменше 60 %, щонайменше 65 %, щонайменше 70 %, щонайменше 75 %, щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 97 %, щонайменше 98 % або щонайменше 99 %, за варіантом, якому віддається перевага, на всій довжині білка/пептиду, який порівнюють з іншим білком, наприклад, на довжині у 653 амінокислоти у випадку послідовності SEQ ID NO: 4. Фахівець у цій галузі, завдяки своїм фаховим знанням, може застосовувати легкодоступні програми BLAST (наприклад, BLASTn, BLASTp, BLASTx, tBLASTn або tBLASTx) для визначення згаданої гомології. Крім того, існують інші програми, відомі фахівцю, які можуть бути застосовані ним для визначення гомології двох або більше порівнюваних послідовностей або часткових послідовностей. До таких програм належать програми, які можна знайти, наприклад, на веб-сайті Європейського інституту біоінформатики (EMBL) (дивись, наприклад, http://www.ebi.ac.uk/Tools/similarity.html). Термін "гібридизація" або "гібридизування" означає процес приєднання однониткової нуклеїновокислотної молекули до комплементарної нуклеїновокислотної нитки, тобто узгодження парування основ. Стандартні методики проведення гібридизації описані, наприклад, у Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition 2001). За варіантом, якому віддається перевага, під цим розуміється, що щонайменше 50 %, за варіантом, якому віддається більша перевага, – щонайменше 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 % або 85 %, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, – 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, і, як правило, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % основ нуклеїновокислотної нитки демонструють парування основ з комплементарною нуклеїновокислотною ниткою. Можливість такого приєднання залежить від суворості умов гібридизації. Термін "суворість" означає умови гібридизації. Про високу суворість говорять у разі труднішого парування основ, про знижену суворість говорять у разі полегшеного парування основ. Суворість умов гібридизації залежить, наприклад, від концентрації солі або іонної сили і температури. Як правило, суворість можна підвищити шляхом підвищення температури та/або зниження солоності. Термін "суворі умови гібридизації" означає умови, за яких гібридизація відбувається, головним чином, лише між молекулами гомологічних нуклеїнових кислот. Термін "умови гібридизації" стосується не лише фактичного приєднання нуклеїнових кислот за переважних умов, але також і переважних умов подальших етапів промивання. Суворими умовами гібридизації є, наприклад. умови, за яких гібридизуються, головним чином, лише молекули тих нуклеїнових кислот, які мають щонайменше 70 %, за варіантом, якому віддається перевага, – щонайменше 75 %, щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 % або щонайменше 95 % ідентичність послідовностей. Менш суворі умови гібридизації охоплюють: гібридизацію у 4× SSC (стандартний цитратний фізіологічний розчин) при температурі 37C з подальшим повторним промиванням 1× SSC при кімнатній температурі. Суворі умови 4 UA 110019 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 гібридизації охоплюють: гібридизацію у 4× SSC при температурі 65C з подальшим повторним промиванням 0,1× SSC при температурі 65C, протягом у цілому приблизно 1 год. Термін "комплементарність" означає здатність пуринових та піримідинових нуклеотидів утворювати пари основ між собою через місткові водневі зв'язки. Комплементарними парами основ є, наприклад, гуанін та цитозин, аденін та тимін і аденін та урацил. Комплементарною ниткою нуклеїнової кислоти є, відповідно, нитка нуклеїнової кислоти, яка може утворювати подвійну нитку шляхом парування з комплементарними основами нитки іншої нуклеїнової кислоти. Термін "фрагмент" або "часткова послідовність" нуклеїнової кислоти у цьому описі означає суміжний відрізок нуклеїнової кислоти, тобто ділянку послідовності, яка складається з послідовно розміщених нуклеотидів нуклеїнової кислоти. Фрагменти можуть, наприклад, застосовуватись переважно у методі RNAi або miRNA, де згадана послідовність може застосовуватись, наприклад, у антисмисловому напрямку. Терміни "антисмисловий напрямок" або "антисмислова орієнтація" нуклеїновокислотної послідовності, наприклад, послідовності ДНК, означають у цьому описі, наприклад, що результатом транскрипції послідовності ДНК є одержання мРНК, нуклеотидна послідовність якої є комплементарною природній (ендогенній) мРНК, завдяки чому шляхом приєднання комплементарної РНК їх трансляцію утруднюють або запобігають їй. Термін "антисмислова РНК" означає одну конкретну мРНК або інші РНК, комплементарні відносно конкретної РНК. Терміни "антисмисловий напрямок" або "антисмислова орієнтація" послідовності мРНК, таким чином, означає, що ця мРНК має послідовність, яка є комплементарною послідовності мРНК, в результаті чого її трансляцію можна утруднити або запобігти їй шляхом приєднання. Частковими послідовностями, які можуть бути застосовані у контексті цього винаходу, наприклад, з антисмисловою орієнтацією, є, наприклад, нуклеїнові кислоти, які мають послідовність, яка відповідає послідовностям SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 або SEQ ID NO: 7. Ці часткові послідовності є ділянками нуклеїнової кислоти, яка відповідає послідовності SEQ ID NO: 3. Однак можуть бути застосовані будь-які інші нуклеїнові кислоти з послідовностями або частковими послідовностями послідовностей SEQ ID 1-3, наприклад, у антисмисловому напрямку. Часткова послідовність, за варіантом, якому віддається перевага, містить нуклеїнову кислоту із щонайменше 15, за варіантом, якому віддається перевага, – щонайменше 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 або щонайменше 100 послідовних нуклеотидів, за варіантом, якому віддається більша перевага, – щонайменше 150, 200, 250, 300, 350, 400 або 450 послідовних нуклеотидів. Частина білка (дивись, наприклад, пункт f) вище) за варіантом, якому віддається перевага, містить щонайменше 5, за варіантом, якому віддається перевага, – щонайменше 10, 15, 20, 25, 30, 40 або 50, за варіантом, якому віддається більша перевага, – щонайменше 60, 70, 80, 90 або щонайменше 100 послідовних амінокислот послідовності SEQ ID NO: 4. Ділянка послідовності SEQ ID NO: 4 (дивись, наприклад, пункт g) вище) за варіантом, якому віддається перевага, містить щонайменше 50, 60, 70, 80 або 90, за варіантом, якому віддається більша перевага, – щонайменше 100, 120, 150, 200 або 250 послідовних амінокислот послідовності SEQ ID NO: 4. Необхідна або корисна довжина часткової послідовності нуклеїнової кислоти або білка чи відрізка послідовності може бути вибрана фахівцем у цій галузі із застосуванням загальних технічних навичок і, у разі необхідності, шляхом виконання традиційних для цього методу тестів з одержанням очікуваного результату, що не потребує винахідницького рівня. Нуклеїнова кислота, за варіантом, якому віддається перевага, є на щонайменше 85 %, за варіантом, якому віддається перевага, – на щонайменше 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 %, за варіантом, якому віддається більша перевага, – на щонайменше 99,5 %, 99,6 %, 99,7 %, 99,8 % або 99,9 % ідентичною послідовності або частковій послідовності послідовностей SEQ ID NO: 1-3. За іншим аспектом цей винахід стосується застосування однієї або декількох нуклеїнових кислот за цим винаходом для пригнічення стрілкування та цвітіння рослини цукрового буряка. Як вже вказувалось вище, нуклеїнову кислоту можна ввести до рослини цукрового буряка, наприклад, з антисмисловою орієнтацією, спричиняючи тим самим пригнічення генів, які відповідають за стрілкування та цвітіння. Способи, придатні для введення нуклеїнової кислоти за цим винаходом до клітини цукрового буряка, є відомими фахівцю і охоплюють, наприклад, трансформацію, опосередковану Agrobacterium. Введення нуклеїнової кислоти з антисмисловою орієнтацією до рослини є лише одним із відомих способів інгібування або пригнічення активності генів. Нуклеїнові кислоти за цим винаходом можуть також бути застосовані у контексті інших процедур або механізмів, які можуть спричинювати інгібування або пригнічення стрілкування/цвітіння. 5 UA 110019 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Крім того, нуклеїнові кислоти за цим винаходом застосовують також як зонд для розпізнавання інших факторів, генів або генних продуктів, за допомогою яких можна інгібувати та/або пригнічувати цвітіння і стрілкування рослин цукрового буряка. За іншим аспектом цей винахід стосується білка, який має амінокислотну послідовність, яка відповідає послідовності SEQ ID NO: 4, або білка, який має амінокислотну послідовність, яка містить ділянку послідовності SEQ ID NO: 4, за варіантом, якому віддається перевага, – щонайменше 50, 60, 70, 80 або 90, за варіантом, якому віддається перевага, – щонайменше 100, 120, 150, 200 або щонайменше 250 послідовних амінокислот послідовності SEQ ID NO: 4, або білка Beta vulgaris, гомологічного білку з амінокислотною послідовністю ділянки послідовності SEQ ID NO: 4. Згаданий білок або будь-яка його частина чи відповідні амінокислотні послідовності можуть/могли б застосовуватись, наприклад, як зонд на амінокислотному рівні для розпізнавання інших факторів, генів або генних продуктів, які можуть бути застосовані для інгібування та/або пригнічення цвітіння та стрілкування рослин цукрового буряка. За ще одним аспектом цей винахід стосується способу одержання трансгенної рослини цукрового буряка, який включає стадії (a) трансформації клітини цукрового буряка однією або декількома нуклеїновими кислотами за цим винаходом та (b) регенерації рослини цукрового буряка з трансформованої клітини цукрового буряка. Трансформацію клітини цукрового буряка можна здійснювати, наприклад, із застосуванням відомих векторів, наприклад, Ti-плазміди, і вона є відомою фахівцю у цій галузі. Нуклеїнові кислоти за цим винаходом можна контролювати у такому векторі переважно за допомогою прийнятного промотора. Цей винахід стосується також вектора або мобільного генетичного елемента, який містить одну або декілька нуклеїнових кислот за цим винаходом. Вектори та мобільні генетичні елементи є відомими у цій галузі і охоплюють, наприклад, плазміди, такі як Ti-плазміда. Згаданий вектор або мобільний генетичний елемент може переважно містити контрольні елементи, наприклад, промотор. Крім того, цей винахід стосується рослини цукрового буряка, яка містить одну або декілька нуклеїнових кислот за цим винаходом, за варіантом, якому віддається перевага, під контролем прийнятного промотора, у якої пригнічене стрілкування і цвітіння, а також насіння та/або частин рослини цукрового буряка за цим винаходом, трансформованих однією або декількома нуклеїновими кислотами за цим винаходом. Нижче винахід описаний з посиланням на приклади здійснення і супровідні фігури виключно з ілюстративними цілями. Короткий опис фігур Фіг. 1. Схематичне порівняння (BLAST) відповідного положення доменів PHD, FNIII та VID у BvVIL, AtVIL1 та AtVIN3. Показаний також відсоток ідентичних або подібних нуклеотидів ("ідентичність"/"позитивність" у відсотках). VIN3_Ath=AtVIN3, VIL1_Ath=AtVIL1, VIL_Bv=BvVIL. Фіг. 2. Цукровий буряк, стійкий до стрілкування та цвітіння. Зліва: стійкий до стрілкування трансформант BvVIL WB4-7 (зліва на фігурі) у порівнянні з контролем стрілкування (зображеним праворуч). Справа: BvVIL трансформант WB4-7 у віці декількох місяців. Фіг. 3. Схематичне зображення структури використаної касети RNAi. Фіг. 4-6. Схематичне зображення фрагментів Sal-SMA-775>1077 (Фіг. 4), Sal-SMA-779>1197 (Фіг. 5) та Sal-SMA-971>1466 (Фіг. 6), застосованих для продукування вектора pRNAi. Фіг. 7-9. Схематичне зображення генно-інженерних конструкцій pRNAi bvvil-775→1077sas (Фіг. 7), pRNAi bvvil-779→1197sas (Фіг. 8) та pRNAi bvvil-971→1466sas (Фіг. 9), застосованих для продукування векторів RNAi. Фіг. 10-12. Схематичне зображення бінарних Ti-плазмід-pLHRNAi bvvil-775-1077sas (Фіг. 10), pLHRNAi-bvvil-779-1197sas (Фіг. 11) та pLHRNAi-bvvil_971-1446sas (Фіг. 12), застосованих у процесі трансформації, опосередкованій Agrobacterium. Фіг. 13. Схематичне зображення інтрон-екзонної структури геномної ДНК BvVIL з позначенням сайтів рестрикції. Фіг. 14. Структура послідовності кДНК BvVIL. Приклади здійснення Iдентифікація/ізоляція повної кДНК буряка для пригнічення стрілкування та цвітіння Шляхом аналізу із застосуванням спеціально створеної власної бази даних EST цукрового буряка була ідентифікована неповна кДНК (послідовність SEQ ID NO: 3) довжиною 1499 пн. Ця послідовність була завершена за допомогою банку клонів цієї неповної кДНК. Одержана послідовність згаданої кДНК (послідовність SEQ ID NO: 2) містила 1962 пн (2285 пн, в тому числі 3'UTR). Білок, одержаний із застосуванням цієї послідовності, містить 653 амінокислоти 6 UA 110019 C2 5 10 (послідовність SEQ ID NO: 4). Відповідна послідовність геномної ДНК (послідовність SEQ ID NO: 1) містить 2366 пн. Вирівнювання геномної ДНК і кДНК показує структуру повної ДНК, що містить чотири екзони і три інтрони (Фіг. 13). Згадана кДНК схематично зображена на Фіг. 14. Визначення характеристик/анотація послідовності Порівняння (BLAST) одержаного непроцесованого клону і послідовності трансльованого білка показує лише низький рівень подібності послідовності з "генами цвітіння" Arabidopsis (наприклад, родина AtVIL- і AtVIN-). До них належать гени VIN3 (VRN7), VIL1 (VRN5), VIL2 (VEL1), VIL3 (VEL2) та VIL4 (VEL3). Найбільша подібність (57,2 %) по усій довжині послідовності спостерігається з AtVIL1 (дивись Таблицю 1). Таблиця 1:Порівняння послідовності Bv-VIL з (At)-VIL-кандидатами Arabidopsis thaliana на рівні ДНК. Порівняння здійснювали з At-VIN3 на довжині 2343 пн., з At-VIL1 на довжині 2163 пн., з At-VIL2 на довжині 2555 пн., з At-VIL3 на довжині 1700 пн. і з At-VIL4 на довжині 1251 пн. із застосуванням програми AlignX (ClustalW). 15 Таблиця 1 AtVIN3 46,0 % BvVIL 20 AtVIL1 57,2 % AtVIL2 51,5 % AtVIL3 49,8 % AtVIL4 45,9 % Порівняння послідовностей на білковому рівні з родиною генів AtVIL і VIN як на всій довжині послідовності у цілому, так і із зосередженням на різних доменах (характерними для родини генів VIL та VIN є домени PHD, FNIII та VID) і ділянках між доменами також показує низьку гомологію (дивись Таблицю 2). Таблиця 2: Послідовність BvVIL на білковому рівні у порівнянні з генами VIL Arabidopsis (порівняння з послідовностями у повному об'ємі та індивідуальними доменами). At – Arabidopsis thaliana, Bv – Beta vulgaris, Ком. – коментар, AA – амінокислоти, ідент. – ідентична ("ідентичні"), подіб. – подібна ("позитивні "), Конс.-L. AА – довжина консенсусної AА, розр. – розриви. 25 Таблиця 2 Повна послідовність Pre-PHD AtVIL1 AtVIL2 AtVIL3 AtVIN3 30 35 40 45 ідент. % 46,1 30,9 23,4 28,6 PHD-Домени подіб. Конс. -L. ідент. подіб. ідент. % AA % % % 57,3 641 28,8 48,5 66,7 42,8 688 34,7 43,2 50,8 33,6 692 16,4 25,9 55,2 39,2 696 27,6 30,1 50 подіб. % 78,8 62,3 65,7 62,1 Порівняння доменів Inter-PHDFN3 Inter-FN3-VID VID FN3 ідент. подіб. ідент. подіб. ідент. подіб. ідент. подіб. Ком. % % % % % % % % 58,9 67,9 44,7 62,4 34,9 41,3 49,6 61,7 39,4 53,8 24,7 43,5 13 21,9 41,6 58,4 36,3 46 20,7 42,5 3,6 8,3 розр. 44 55 46,4 67,9 21,2 40 11,9 18 розр. 40,2 54,9 Порівняння (BLAST) окремих доменів показує, що нова послідовність є VIL-подібною послідовністю (Фіг. 1). Тому згадана послідовність (SEQ ID NO: 1) позначена у цьому описі як BvVIL (Beta vulgaris vernalization vin3-like). Порівняння послідовності BvVIL з AtVIL-кандидатами на рівні повної ДНК показує лише максимальну 57,2 % гомологію з AtVIL1. З іншими генами VIL-родини спостерігається ще нижча подібність послідовностей. Дослідження нетрансгенного цукрового буряка на транскрипцію BvVIL перед, під час та після яровизації показало, що ген транскрибується не лише після яровизації, але він був конститутивно активним навіть перед, під час та після яровизації. У протилежність до цього, наприклад, VIN3 активується лише після тривалої яровизації. Продукування генно-інженерних конструкцій RNAi Для продукування генно-інженерних конструкцій RNAi були застосовані три ділянки послідовності SEQ ID NO: 3: нуклеотиди 775-1077 (послідовність SEQ ID NO: 5); нуклеотиди 779-1197 (послідовність SEQ ID NO: 6); нуклеотиди 971-1446 (послідовність SEQ ID NO: 7). Послідовність, яка відповідає послідовності SEQ ID NO: 5, була ампліфікована полімеразною ланцюговою реакцією (ПЛР) із застосуванням пари праймерів F_PLT3 ~ 1:775U27, CTgggATACTTgggTgTTggAAAAAgC (послідовність SEQ ID NO: 8) та F_PLT3 ~ 1:1050L28, TAgAAACATTggCgAgCCATTCATTAgC (послідовність SEQ ID NO: 9). 7 UA 110019 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Послідовність, яка відповідає послідовності SEQ ID NO: 6, була ампліфікована полімеразною ланцюговою реакцією із застосуванням пари праймерів F_PLT3 ~ 1:779U24, gATACTTgggTgTTggAAAAAgCA (послідовність SEQ ID NO: 10) та F_PLT3 ~ 1:1175L23, AATCAgTCATTggTgTggggATA (послідовність SEQ ID NO: 11). Послідовність, яка відповідає послідовності SEQ ID NO: 7, була ампліфікована полімеразною ланцюговою реакцією із застосуванням пари праймерів F_PLT3 ~ 1:971 U21, CAAgATggCCAgAggTATTgT (послідовність SEQ ID NO: 12) та F_PLT3 ~ 1:1426 L21, CTTCCTTTTTACAgCCCACTg (послідовність SEQ ID NO: 13). ПЛР здійснювали із застосуванням 10 нг геномної ДНК цукрового буряка з концентрацією праймерів 0,2 мкМ при температурі "відпалу" 55C на установці Multicycler PTC-200 (компанія MJ Research, Watertown, США). Кожен із продуктів ПЛР інтегрували до вектора pRTRNAi (Hirner A., Ladwig F., Stransky H., Okumoto S., Keinath M., Harms A., Frommer W.B., Koch W. (2006) Arabidopsis LHT1 is a High-Affinity Transporter for Cellular Amino Acid Uptake in Both Root Epidermis and Leaf Mesophyll Plant Cell. 18(8):1931-46) у генно-інженерній конструкції з інвертованим повторенням. Основу згаданого вектора становить плазміда pRT100, і цей вектор сконструйований для продукування "інтронсплайсованих" шпилькових структур. Цей вектор містить промотор 35S для конститутивної експресії (Odell J.T., Nagy F., and Chua N.-H. (1985) Identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter, Nature 313, 810-812), інтрон ATAAP6, одержаний з Arabidopsis, і один поліA термінатор. Інтрон ATAAP6 фланкують сайтами розщеплення Xho1/Ecl 136II на 5'-кінці або сайтами рестрикції розщеплення Sma1/Sal1 на 3'-кінці, відповідно. Це надає можливість інтеграції ідентичних фрагментів у "смисловому" та "антисмисловому" напрямках у разі, якщо ці фрагменти мають сумісні сайти рестрикції Xho1 або Sal1 чи є тупими на іншому кінці ("тупий кінець"). Для цього вихідні продукти ПЛР реампліфікували з новими ПЛР праймерами, подовженими такими сайтами рестрикції: Sal-SMA-775>1077 gagaggacgtcgacctgggatacttgggtg (послідовність SEQ ID NO: 14) та ccccccgggtagaaacattggcgagc (послідовність SEQ ID NO: 15), SAL-SMA-779>1197 gagaggacgtcgacgatacttgggtgttgg (послідовність SEQ ID NO: 16) та ccccccgggaatcagtcattggtgtggggata (послідовність SEQ ID NO: 17), XHO-SMA-971>1446 gagaggacctcgagcaagatggccagaggt (послідовність SEQ ID NO: 18) та gtcgacccccccgggcttccttttt (послідовність SEQ ID NO: 19). Для подальшого застосування фрагменти ПЛР клонували у TA клонувальному векторі pCR2.1 (набір TOPO TA Cloning Kit (компанія Invitrogen, Carlsbad, США)) і трансформували у E. coli. Біло-голуба селекція надала можливість ідентифікування рекомбінантних плазмід (Sambrook J., Fritsch E.F., and Maniatis T., 1989, In Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). У білих колоніях експресію ssгалактозидази пригнічували інсертом, в результаті чого одержували колонії білого кольору, оскільки ферментативний субстрат, доданий до середовища, більше не розщеплювався. Подальше секвенування із застосуванням M13-fwd/rev-Primern здійснювали на установці Eurofins MWG Operon (компанія Ebersberg, Німеччина). Аналіз і вирівнювання даних, що стосуються послідовностей, здійснювали із застосуванням програми Vector NTI (компанія Invitrogen, Carlsbad, США). Кожен із фрагментів Sal-SMA-775>1077, SAL-SMA-779>1197 і XHO-SMA-971>1446 (Фіг. 4-6) був вирізаний з Topovector за допомогою Sal1/Sma1 або Xho1/Sma1, після чого був спочатку лігований у "смисловому" напрямку з вирізаним за допомогою Sal1/Sma1 або Xho1/Ecl 136II вектором pRTRNAi. Потім ті самі фрагменти були ліговані вдруге у "антисмисловому" напрямку у сумісних Xho1/Ecl 136II або Sal1/Sma1. В результаті процедур клонування одержали вектори pRNAi-bvvil-775-1077sas, pRNAi-bvvil-779-1197sas та pRNAi-bvvil_971 1446sas (Фіг. 3, 7-9). Одержання трансформаційних генно-інженерних конструкцій Для одержання трансформаційних генно-інженерних конструкцій застосували бінарний трансформаційний вектор pLH9000 (Hausmann L. and Töpfer R. (1999) Entwicklung von PlasmidVektoren. Vorträge zur Pflanzenzüchtung: Bioengineering für Rapssorten nach Maß 45: 155-172) (Номер доступу NCBI: AF458478). Після рестрикції плазмід pRNAi за допомогою HindIII полігенні експресійні кластери ізолювали, клонували до бінарного вектора pLH9000, і одержані плазміди позначали як pLHRNAi-bvvil-775-1077sas, pLHRNAi-bvvil-779-1197sas та pLHRNAi-bvvil-9711446sas. Трансформація і перевірка трансгенності цукрового буряка Для трансформації рослин застосовували бінарні вектори pLHRNAi-bvvil-775-1077sas, pLHRNAi-bvvil-779-1197sas та pLHRNAi-bvvil-971-1446sas. Бінарні вектори трансформували у штамі C58C1 Agrobacterium tumefaciens резидентною плазмідою pGV3101 шляхом прямої трансформації ДНК (An G. (1987), Binary Ti vectors for plant transformation and promoter analysis, Methods Enzymol. 153, 292-305). Селекцію рекомбінантних клонів A. tumefaciens здійснювали із 8 UA 110019 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 застосуванням антибіотика стрептоміцину (50 мг/л). Трансформацію цукрового буряка здійснювали за методом Lindsey et al. (1991) із застосуванням антибіотика канаміцину (Lindsey K., Gallois P., Eady C. (1991), Regeneration and transformation of sugar beet by Agrobacterium tumefaciens, Plant Tissue Culture Manual B7: 1-13, Kluwer Academic Publishers). Трансгенність рослин перевіряли за допомогою ПЛР. Застосування праймерів GTGGAGAGGCTATTCGGTA (послідовність SEQ ID NO: 20) та CCACCATGATATTCGGCAAG (послідовність SEQ ID NO: 21) призвело до ампліфікації фрагмента ДНК (553 пн) з гена nptII. ПЛР здійснювали із застосуванням 10 нг геномної ДНК з концентрацією праймерів 0,2 мкМ при температурі відпалу 55C на установці Multicycler PTC-200 (компанія MJ Research, Watertown, США). Перевірка поведінки трансформантів у процесі цвітіння і стрілкування Приблизно 40 незалежних трансформантів разом із нетрансгенними ізогенними контрольними рослинами розмножили in vitro і перенесли до теплиці. Після періоду пристосування трансформанти піддавали яровизації впродовж 3 місяців при температурі 8C у камері охолодження (імітація зимових умов). У подальшому трансформанти, а також ідентично оброблені нетрансгенні контрольні рослини, знову перенесли у теплицю (25C). Невдовзі після перенесення, вже через 10 днів, контрольні рослини почали стрілкуватись. Через приблизно 4 тижні контрольні рослини почали цвісти. На відміну від цього, 10 із 40 трансформантів (25 %) несподівано не продемонстрували реакції на індукцію яровизацією стрілкування і цвітіння. Рослини, які не стрілкуються і не цвітуть, можна було одержати від трансформантів усіх трьох генно-інженерних конструкцій. Положення застосованої послідовності у гені не було фактором функціонування. Одержані трансформанти поводили себе як неяровизований цукровий буряк. Вони не починали ні стрілкуватись, ні цвісти. Для кожного незалежного трансформанту були досліджені 30 рослин. Усі рослини без виключення були стійкими до стрілкування та цвітіння. Жодна з рослин не виявила відхилень від нормального фенотипу. Рослини культивували далі, вони продовжували розвиток до нормальних буряків із нормальними буряковими коренеплодами. Стійкість до стрілкування і цвітіння зберігалась впродовж експериментального періоду тривалістю більше ніж 4 місяці (Фіг. 2). Деякі з рослин яровизували вдруге впродовж ще трьох місяців. Навіть після другої яровизації у цих рослин після перенесення до теплиці при температурі 25C було неможливо індукувати стрілкування або цвітіння. Несподівано, шляхом застосування трансгенного підходу за цим винаходом, яровизація або її вплив, а саме стрілкування і цвітіння, у цукрового буряка були повністю блоковані або змінювали напрямок розвитку. Дані щодо пригнічення BvVIL у цукрового буряка методом RNAi із застосуванням аналізу експресії рослин під час і після яровизації З культивованого у теплиці впродовж семи тижнів цукрового буряка ліній 3DC4156-wb5-1, 3DC4156-wb4-1, 3DC4156-wb4-14, 3DC4156-wb4-5, 3DC4156-wb5-18, 3DC4156-wb4-9, 3DC4156wb4-7, 3DC4156-wb3-4, 3DC4156-wb3-4, 3DC4156-wb7-1, 3DC4156-wb18-1 та нетрансгенної лінії 3DC4156, які впродовж трьох останніх тижнів піддавали яровизації, виділяли РНК із застосуванням реактиву TRI (компанія Sigma, St. Louis, США) за інструкціями виробника. РНК, застосовану для синтезу кДНК, перевіряли на наявність небажаної ДНК із застосуванням ПЛР з одночасним паралельним дослідженням результатів синтезу кДНК. У цьому випадку застосовували ДНК-полімеразу FIREPol (компанія Solis Biodyne, Tartu, Естонія) за інструкціями виробника. Як контроль застосовували ДНК з повною послідовністю. Програма ПЛР була розрахована для фрагмента розміром 369 пн. Праймери синтезували за допомогою Eurofins MWG Operon (компанія Ebersberg, Німеччина); вони наведені у Таблиці 3. Таблиця 3 Праймери для аналізу РНК/кДНК vin3fwd1994 vin3rev2317 50 tgacctaaatgtagtttcagttcc (послідовність SEQ ID NO: 22) tcaaagttaccgtctagagaacc (послідовність SEQ ID NO: 23) Повна ДНК була виділена з чотиритижневих, культивованих у теплиці, рослин цукрового буряка лінії 3DC4156 за допомогою набору DNeasy-Plant-Mini-Kit (компанія Qiagen, Hilden, Німеччина) за інструкціями виробника. Синтез кДНК здійснювали за допомогою набору RevertAid first-strand-cDNA-Synthes-kit від компанії Fermentas (Vilnius, Литва), дотримуючись інструкцій виробника. 9 UA 110019 C2 5 Для проведення qПЛР аналізу на установці ABI StepOnePlus Real-time PCR machine застосовували кДНК у розведенні 1:10; була проведена qПЛР з SYBR зеленим. Як реакційний буфер застосували POWER SYBR green PCR mix від компанії ABI (Foster City, США). При одержанні реакційного препарату дотримувались інструкцій виробника із проведенням трьох повторень. Праймери для qПЛР були синтезовані із застосуванням Eurofins MWG Operon (компанія Ebersberg, Німеччина); вони перелічені у Таблиці 4. Для нормалізації була застосована пара праймерів nlosrealt1 та nlosrealt2. Таблиця 4 Праймери для qПЛР аналізу nlosrealt1 nlosrealt2 vin3realt1 vin3realt2 10 GAGGAACTAGACATGGGGATACAT (послідовність SEQ ID NO: 24) GCGATACAAAGTAGACATTAGAACTC (послідовність SEQ ID NO: 25) TAGGAAGCAAAGCAGGAAGGGA (послідовність SEQ ID NO: 26) CCTCCGACAGAACGCATCATCT (послідовність SEQ ID NO: 27) QПЛР здійснили, як показано у Таблиці 5. Таблиця 5 qПЛР/програма протягом 10 хв 95C протягом 15 с 95C протягом 30 с 58C протягом 30 c 72C протягом 15 c 95C протягом 1 хв 60C від +0,5 °C/с з визначенням точки плавлення до 95 °C 15 Етапи 2-4 повторили 40 разів, вимірювання здійснювали після етапу 4 і після кожного етапу визначення точки плавлення. За результатами qПЛР аналізу визначали відносні рівні експресії BvVIL. Рівень експресії нетрансгенного контролю приймали за 1. Результати для рослин, які зазнали яровизації, наведені у Таблиці 6. Таблиця 6 Відносна експресія BvVIL у яровизованих ліній wb Лінія wb k 5121 wb k 411 wb k 4141 wb k 451 wb k 5181 wb k 491 wb k 472 wb k 341 wb k 716 wb k 1811 3DC WT 20 Відносний рівень експресії 0,154 0,191 0,21 0,238 0,269 0,289 0,384 0,423 0,529 0,673 1 РНК також виділяли з культивованих у теплиці впродовж декількох місяців рослин цукрового буряка ліній 3DC4156-wb5-1, 3DC4156-wb4-1, 3DC4156-wb4-14, 3DC4156-wb4-5, 3DC4156-wb518, 3DC4156-wb4-9, 3DC4156-wb4-7, 3DC4156-wb3-4, 3DC4156-wb3-4, 3DC4156-wb7-1, які не 10 UA 110019 C2 5 стрілкувались і не цвіли після декількох яровизацій, та з нетрансгенної рослини лінії 3DC4156, яку культивували у теплиці впродовж чотирьох тижнів, із застосуванням реактиву TRI (компанія Sigma, St. Louis, США) за інструкціями виробника. Для синтезу кДНК застосовували той самий процес, який описаний вище для яровизованих рослин. Для вже декілька разів яровизованих рослин з теплиці, які все ще не стрілкувались і не цвіли, qПЛР аналіз проводили за тією самою методикою. За результатами цього qПЛР аналізу також визначали відносні рівні експресії для BvVIL. Рівень експресії нетрансгенного контролю приймали за 1. Результати для цих рослин наведені у Таблиці 7. Таблиця 7 Відносна експресія BvVIL у ліній wb, які не цвітуть і не стрілкуються Лінія wb k 5122 wb k 4142 wb k 5183 wb k 496 wb k 412 wb k 451 wb k 711 wb k 471 wb k 342 3DC WT Відносний рівень експресії 0,11 0,15 0,17 0,21 0,24 0,24 0,35 0,36 0,44 1 10 15 У обох експериментах значне зниження транскрипту BvVIL корелювало з тенденцією до стрілкування та цвітіння, а саме зниження транскрипту BvVIL нижче 60 % видається достатнім для повного пригнічення стрілкування та цвітіння. Загальний огляд послідовностей, наведених у цій заявці, включений до наведеної нижче Таблиці 8: Таблиця 8 Загальний огляд послідовностей Послідовність Примітка SEQ ID NO: 1 BvVIL, геномна ДНК, 2366 nt BvVIL, кДНК, у тому числі 3'2 UTR, 2285 (3'-UTR=nt 19632285) 3 BvVIL, неповна кДНК, 1499 nt BvVIL, білкова послідовність, 4 653 AA nt 775-1077 послідовності SEQ 5 ID NO: 3, 303 nt nt 779-1197 послідовності SEQ 6 ID NO: 3, 419 nt nt 971-1446 послідовності SEQ 7 ID NO: 3, 476 nt 8-27 Праймер 20 Лістинг послідовностей – вільний текст Праймер Термін "artificial sequence" (англ.) у лістингу послідовностей означає "штучна послідовність". 11 UA 110019 C2 12 UA 110019 C2 13 UA 110019 C2 14 UA 110019 C2 15 UA 110019 C2 16 UA 110019 C2 17 UA 110019 C2 18 UA 110019 C2 19 UA 110019 C2 20 UA 110019 C2 21 UA 110019 C2 22 UA 110019 C2 23 UA 110019 C2 24 UA 110019 C2 25 UA 110019 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 15 20 25 30 35 1. Виділена нуклеїнова кислота для пригнічення стрілкування та цвітіння рослини цукрового буряка, причому ця нуклеїнова кислота включає в себе нуклеотидну послідовність, яка: a) являє собою послідовність SEQ ID NO: 1-3 або часткову послідовність, яка містить щонайменше 20 послідовних нуклеотидів послідовностей SEQ ID NO: 1-3, або b) є комплементарною до послідовності SEQ ID NO: 1-3 або до часткової послідовності, яка містить щонайменше 20 послідовних нуклеотидів послідовностей SEQ ID NO: 1-3, або c) являє собою у антисмисловому напрямку послідовність SEQ ID NO: 1-3 або часткову послідовність, яка містить щонайменше 20 послідовних нуклеотидів послідовностей SEQ ID NO: 1-3, або їхню комплементарну послідовність, або d) є щонайменше на 90 % ідентичною до послідовності SEQ ID NO: 1-3 або щонайменше на 90 % ідентичною до часткової послідовності послідовностей SEQ ID NO: 1-3, яка має довжину щонайменше 100 нуклеотидів, або щонайменше на 95 % ідентичною до часткової послідовності послідовностей SEQ ID NO: 1-3, яка має довжину щонайменше 50-99 нуклеотидів, або e) кодує білок з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO: 4 або частину цього білка, яка має щонайменше 30 послідовних амінокислот послідовності SEQ ID NO: 4, або f) кодує білок з амінокислотною послідовністю з Beta vulgaris, яка щонайменше на 90 % ідентична до послідовності SEQ ID NO: 4, або щонайменше на 90 % ідентична до часткової послідовності, яка має щонайменше 50 послідовних амінокислот послідовності SEQ ID NO: 4, або g) гібридизується за суворих умов з послідовністю SEQ ID NO: 1-3, або з комплементарною їм нуклеотидною послідовністю, або з нуклеотидною послідовністю, орієнтованою відносно них у антисмисловому напрямку. 2. Нуклеїнова кислота за п. 1, яка відрізняється тим, що згадана часткова послідовність містить щонайменше 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 або 450 послідовних нуклеотидів послідовностей SEQ ID NO: 1-3 та/або згадана частина білка містить щонайменше 40, 50, 60, 70, 80, 90 або 100 послідовних амінокислот послідовності SEQ ID NO: 4, та/або сегмент послідовності містить щонайменше 60, 70, 80, 90, 100, 120, 150, 200 або 250 послідовних амінокислот послідовності SEQ ID NO: 4. 3. Нуклеїнова кислота за п. 1 або п. 2, яка на щонайменше 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,6 %, 99,7 %, 99,8 % або 99,9 % є ідентичною послідовності або частковій послідовності послідовностей SEQ ID NO: 1-3. 26 UA 110019 C2 5 10 15 4. Нуклеїнова кислота за будь-яким із попередніх пунктів, яка містить одну з послідовностей SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 та SEQ ID NO: 7 або одну з послідовностей SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 та SEQ ID NO: 7 з антисмисловою орієнтацією. 5. Застосування однієї або декількох нуклеїнових кислот за пп. 1-4 для пригнічення стрілкування та цвітіння рослини цукрового буряка. 6. Спосіб одержання трансгенної рослини цукрового буряка, в якої пригнічено стрілкування та цвітіння після яровизації, який включає стадії (а) трансформації клітини цукрового буряка однією або декількома нуклеїновими кислотами за будь-яким із пп. 1-4 і (b) регенерації рослини цукрового буряка з трансформованої клітини цукрового буряка. 7. Вектор або мобільний генетичний елемент, який містить одну або декілька нуклеїнових кислот за будь-яким із пп. 1-4. 8. Трансгенна рослина цукрового буряка, яка містить одну або декілька нуклеїнових кислот за будь-яким із пп. 1-4, як трансген, в якої пригнічені стрілкування і цвітіння. 9. Насіння або частини трансгенної рослини цукрового буряка за п. 8, трансформовані однією або декількома нуклеїновими кислотами за будь-яким із пп. 1-4 та які містять одну або декілька нуклеїнових кислот як трансген. 27 UA 110019 C2 28