Резистентні до ahas гербіцидів рослини brassica

Реферат: Винахід належить трансгенних або нетрансгенних рослин Brassica з підвищеними рівнями стійкості до AHAS-інгібуючих гербіцидів, що забезпечується наявністю першого та другого геному, які включають мутантні полінуклеотиди AHAS, що кодують толерантні до гербіцидів поліпептиди, і застосування зазначених рослин для боротьби з бур'янами. Винахід також належить до нуклеїнових кислот, які кодують мутанти великої субодиниці синтази ацетогідроксикислот. UA 100122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ПЕРЕХРЕСНЕ ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ Дана заявка заявляє про пріоритет на підставі попередньої заявки на видачу патенту США № 60/910008, поданої 4 квітня 2007 року, що включена у даний опис у вигляді посилання у повному обсязі. ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ, ДО ЯКОЇ НАЛЕЖИТЬ ВИНАХІД Даний винахід стосується резистентних до гербіцидів рослин Brassica і нових полінуклеотидних послідовностей, які кодують білки великої субодиниці синтази ацетогідроксикислоти рослин Brassica дикого типу, і резистентних до імідазолінонів, насіння і способів застосування таких рослин. РІВЕНЬ ТЕХНІКИ Синтаза ацетогідроксикислоти (AHAS; EC 4.1.3.18, також відома як ацетолактатсинтаза або ALS) є першим ферментом, що каталізує біохімічний синтез амінокислот з розгалуженим ланцюгом валіну, лейцину та ізолейцину (Singh (1999) "Biosynthesis of valine, leucine and isoleucine", у Plant Amino Acid, Singh, B.K., ed., Marcel Dekker Inc. New York, New York, pp. 227247). AHAS є місцем дії п'яти структурно відмінних сімейств гербіцидів, включаючи сульфонілсечовини (Tan et al. (2005) Pest Manag. Sci. 61: 246-57; Mallory-Smith і Retzinger (2003) Weed Technology 17: 620-626; 'LaRossa і Falco (1984) Trends Biotechnol. 2: 158-161), імідазолінони (Shaner et al. (1984) Plant Physiol. 76: 545-546), триазолопіримідини (Subramanian і Gerwick (1989) "Inhibition of acetolactate synthase by triazolopyrimidines", у Biocatalysis in Agricultural Biotechnology, Whitaker, J.R. і Sonnet, P.E. eds., ACS Symposium Series, American Chemical Society, Washington, D.C., pp. 277-288), Tan et al. (2005) Pest Manag. Sci. 61: 246-57; Mallory-Smith і Retzinger (2003) Weed Technology 17: 620-626, сульфоніламінокарбонілтриазолінони (Tan et al. (2005) Pest Manag. Sci. 61: 246-57; Mallory-Smith і Retzinger (2003) Weed Technology 17: 620-626). Гербіциди на основі імідазолінону і сульфонілсечовини широко використовуються у наш час у сільському господарстві завдяки їх ефективності при дуже низьких нормах внесення і відносній нетоксичності для тварин. За допомогою інгібування активності AHAS зазначені сімейства гербіцидів запобігають подальшому росту і розвитку чутливих рослин, включаючи багато видів бур'янів. Деякими прикладами комерційно доступних імідазолінонових гербіцидів є PURSUIT® (імазетапір), SCEPTER® (імазахін) і ARSENAL® (імазапір). Прикладами гербіцидів на основі сульфонілсечовин є хлорсульфурон, метсульфуронметил, сульфометуронметил, хлоримуронетил, тифенсульфуронметил, трибенуронметил, бенсульфуронметил, нікосульфурон, етаметсульфуронметил, римсульфурон, трифлусульфуронметил, триасульфурон, примісульфуронметил, циносульфурон, амідосульфурон, флузасульфурон, імазосульфурон, піразосульфуронетил і галосульфурон. Внаслідок високої ефективності і низької токсичності, імідазолінонові гербіциди є переважними для застосування за допомогою обприскування зверху великої площі поверхні, зайнятої рослинністю. Можливість розпилювати гербіцид зверху над великою площею рослинності знижує витрати, пов'язані з посадкою і підтримкою насаджень, і знижує необхідність у підготовці місця перед застосуванням таких хімікатів. Запилення зверху необхідного толерантного виду також дає можливість досягати максимального потенційно можливого врожаю необхідного виду завдяки відсутності конкуруючих видів. Однак, можливість застосування такої методики запилення зверху залежить від присутності резистентного до імідазолінону виду потрібних рослин на запилюваній площі. Серед основних сільськогосподарських культур деякі види бобових, такі як соя, резистентні до імідазолінонових гербіцидів від природи, завдяки своїй здатності швидко метаболізувати гербіцидні сполуки (Shaner і Robinson (1985) Weed Sd. 33: 469-471). Інші культури, такі як кукурудза (Newhouse et al. (1992) Plant Physiol. 100: 882886) і рис (Barrett et al. (1989) Crop Safeners for Herbicides, Academic Press, New York, pp. 195-220) деякою мірою чутливі до імідазолінонових гербіцидів. Різна чутливість до імідазолінонових гербіцидів залежить від хімічної природи конкретного гербіциду і різного метаболізму сполуки з токсичної у нетоксичну форму у кожній рослині (Shaner et al. (1984) Plant Physiol. 76: 545-546; Brown et al., (1987) Pestic. Biochem. Physiol. 27: 24-29). Інші фізіологічні відмінності рослин, такі як всмоктування і пересування речовини, також відіграють важливу роль у чутливості (Shaner і Robinson (1985) Weed Sd. 33: 469-471). Рослини, резистентні до імідазолінонів, сульфонілсечовин і триазолопіримідинів, були успішно одержані з використанням мутагенезу насіння, мікроспори, пилка і калуса Zea mays, Arabidopsis thaliana, Brassica napus (тобто каноли), Glycine max, Nicotiana tabacum і Oryza sativa (Sebastian et al. (1989) Crop. Sci. 29: 1403-1408; Swanson et al., 1989 Theor. Appl. Genet. 78: 525530; Newhouse et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 83: 65-70; Sathasivan et al. (1991) Plant Physiol. 97: 1 UA 100122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 1044-1050; Mourand et al. (1993) J. Heredity 84: 91-96; патент США № 5545822). У всіх випадках резистентність надає один не повністю домінантний ядерний ген. Чотири резистентних до імідазолінону рослини пшениці також були раніше виділені після мутагенезу насіння Triticum aestivum L. cv. Fidel (Newhouse et al. (1992) Plant Physiol. 100: 882-886). Дослідження успадковування підтвердили, що резистентність надає один не повністю домінантний ген. На підставі досліджень алелів автори прийшли до висновку, що мутації у чотирьох ідентифікованих лініях знаходилися у тому самому локусі. Один з генів резистентності культурного сорту Fidel названий FS-4 (Newhouse et al. (1992) Plant Physiol. 100: 882-886). У результаті комп'ютерного моделювання тривимірної конформації комплексу AHASінгібітор прогнозована наявність декількох амінокислот у передбачуваному кармані зв'язування інгібітору як сайтів, індуковані мутації в яких ймовірно могли б надавати вибірну резистентність до імідазолінонів (Ott et al. (1996) J. Mol. Biol. 263: 359-368). Рослини пшениці, одержані з деякими з таких раціонально сконструйованих мутацій, у передбачуваних сайтах зв'язування ферменту AHAS, дійсно мали специфічну резистентність до одного класу гербіцидів (Ott et al. (1996) J. Mol. Biol. 263: 359-368). Про резистентність рослин до імідазолінонових гербіцидів також повідомлялося у декількох патентах. У патентах США № 4761373, 5331107, 5304732, 6211438, 6211439 і 6222100 загалом описане застосування зміненого гена AHAS для того, щоб викликати резистентність до гербіцидів у рослин, і зокрема, описані деякі резистентні до імідазолінонів лінії кукурудзи. У патенті США № 5013659 описані рослини, що мають резистентність до гербіцидів внаслідок мутацій, щонайменше, в одній амінокислоті в одній або декількох консервативних областях. Описані у зазначеній публікації мутації кодують або перехресну резистентність до імідазолінонів і сульфонілсечовин, або специфічну резистентність до сульфонілсечовин, але специфічна до імідазолінонів резистентність не описана. У патенті США № 5731180 і патенті США № 5767361 обговорюється ізольований ген, що має одну амінокислотну заміну в амінокислотній послідовності AHAS однодольної рослини дикого типу, що приводить до специфічної до імідазолінонів резистентності. Крім того, були створені рослини рису, які резистентні до гербіцидів, що негативно впливають на AHAS, у результаті селекції мутацій, а також за допомогою відбору резистентних до гербіцидів рослин з пулу рослин рису, одержаних у результаті культивування пиляка. Дивіться патенти США №№ 5545822, 5736629, 5773703, 5773704, 5952553 і 6274796. У рослинах, також як у всіх інших досліджених організмах, фермент AHAS складається з двох субодиниць: великої субодиниці (каталітична роль) і малої субодиниці (регуляторна роль) (Duggleby і Pang (2000) J. Biochem. Mol. Biol. 33: 1-36). Велика субодиниця AHAS (також називана у даному описі AHASL) може кодуватися одним геном, як у випадку Arabidopsis і рису, або декількома представниками сімейства генів, як у кукурудзи, каноли і бавовни. Специфічні однонуклеотидні заміни у великій субодиниці надають ферменту деякий ступінь нечутливості до одного або декількох класів гербіцидів (Chang і Duggleby (1998) Biochem J. 333: 765-777). Наприклад, пшениця звичайна, Triticum aestivum L., містить три гомологічних гени великої субодиниці синтази ацетогідроксикислот. Кожний з генів експресується на значному рівні, про що свідчить реакція на гербіциди і біохімічні дані, одержані для мутантів по кожному з трьох генів (Ascenzi et al. (2003) International Society of Plant Molecular Biologists Congress, Barcelona, Spain, Ref. No. S10-17). Кодуючі послідовності всіх трьох генів мають велику гомологію на нуклеотидному рівні (WO 03/014357). За допомогою секвенування генів AHASL декількох сортів Triticum aestivum виявлено, що молекулярною основою толерантності до гербіцидів у більшості IMI-толерантних (толерантних до імідазолінонів) ліній є мутація Ser653(At)Asn, що означає заміну серину на аспарагін у положенні, еквівалентному присутності серину у положенні амінокислоти 653 в Arabidopsis thaliana (WO 03/014357). Зазначена мутація є наслідком однонуклеотидного поліморфізму (SNP) у послідовності ДНК, що кодує білок AHASL. Також відомо, що численні гени AHASL зустрічаються у видів дводольних рослин. Нещодавно, Kolkman et al. ((2004) Theor. Appl. Genet. 109: 1147-1159) повідомили про ідентифікацію, клонування і секвенування трьох генів AHASL (AHASL1, AHASL2 і AHASL3) з резистентних до гербіцидів генотипів і генотипів дикого типу соняшника (Helianthus annuus L.). Kolkman et al. повідомили, що резистентність до гербіцидів є наслідком або заміни Pro197Leu (використовується позначення положень амінокислот AHASL), або заміни Ala205Val у білку AHASL1, і що кожна із зазначених замін надавала резистентність як до імідазолінонових гербіцидів, так і гербіцидів на основі сульфонілсечовини. Беручи до уваги високу ефективність і низьку токсичність, імідазолінонові гербіциди є переважними для застосування у сільському господарстві. Однак, можливість застосування імідазолінонових гербіцидів у конкретній системі обробляння сільськогосподарських культур залежить від можливості використання резистентних до імідазолінонів сортів культурної 2 UA 100122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 рослини, що представляє інтерес. Щоб фермери могли більш гнучко використовувати типи і норми внесення імідазолінонових гербіцидів і гербіциди на основі сульфонілсечовини, часто потрібен більш високий ступінь толерантності до гербіцидів. Також для селекціонерів рослин, які розробляють толерантні до гербіцидів сорти, бажана робота з мутаціями, які забезпечують більш високу толерантність до гербіцидів, що забезпечують для селекціонерів більшу гнучкість у підборі вихідної зародкової плазми, яку вони використовують для створення нових сортів. Щоб одержати такі резистентні до імідазолінонів сорти, селекціонерам рослин необхідно створювати додаткові селекційні лінії, переважно з підвищеною резистентністю до імідазолінонів. Таким чином, необхідні додаткові резистентні до імідазолінонів селекційні лінії і сорти культурних рослин, а також способи і композиції для одержання і застосування резистентних до імідазолінонів селекційних ліній і сортів. СУТЬ ВИНАХОДУ Даний винахід стосується рослин Brassica, які мають підвищену резистентність до гербіцидів, у порівнянні з рослиною Brassica дикого типу. Зокрема, рослини Brassica відповідно до винаходу мають підвищену резистентність, щонайменше, до одного гербіциду, що негативно впливає на активність ферменту AHAS у порівнянні з рослиною Brassica дикого типу. Рослина Brassica містить у своєму геномі, щонайменше, одну копію полінуклеотиду великої субодиниці синтази ацетогідроксикислот (AHASL), що кодує резистентний до гербіциду поліпептид AHASL, при цьому поліпептид AHASL вибраний з групи, що складається з: a) поліпептиду, що має аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 653 у послідовності SEQ ID NO:1 або положенню 638 у послідовності SEQ ID NO:2, або положенню 635 у послідовності SEQ ID NO:3; b) поліпептиду, що має треонін у положенні, яке відповідає положенню 122 у послідовності SEQ ID NO:1 або положенню 107 у послідовності SEQ ID NO:4, або положенню 104 у послідовності SEQ ID NO:5; і c) поліпептиду, що має лейцин у положенні, яке відповідає положенню 574 у послідовності SEQ ID NO:1 або положенню 556 у послідовності SEQ ID NO:6. Даний винахід також стосується підвищеної стійкості до гербіцидів, яка досягається у випадку поєднання мутацій AHAS з різних геномів у рослині B. juncea. В одному прикладі рослини поєднують у собі мутацію bR (AHAS1) (у геномі B Brassica juncea) з введеною у результаті інтрогресії мутацією PM2 (AHAS3) (у геномі A Brassica napus, інтрогресованою у Brassica juncea). Одержана стійкість гібридів значно підвищена і здійснює несподіваний синергетичний ефект у порівнянні з ефектом, що спостерігається у сучасному комерційному продукті, в якому поєднуються PM1 і PM2. В іншому прикладі пропонується рослина B. juncea, в якій поєднуються мутації aR (AHAS1) (у геномі A B. juncea) з мутацією A107T (у геномі B B. juncea), які також забезпечують синергетичні рівні стійкості до гербіцидів у порівнянні з рослинами, що поєднують у собі мутації PM1 і PM2. В одному варіанті даний винахід стосується резистентних до гербіцидів подвійних мутантних рослин Brassica, які походять з лінії Brassica, що була названа J05Z-07801. В іншому варіанті даний винахід стосується резистентних до гербіцидів рослин Brassica, які походять з лінії Brassica, що була названа J04E-0139. У ще одному варіанті даний винахід стосується резистентних до гербіцидів рослин Brassica, які походять з лінії Brassica, що була названа J04E0130. У ще одному варіанті даний винахід стосується резистентних до гербіцидів рослин Brassica, які походять з лінії Brassica, що була названа J04E-0122. Резистентна до гербіцидів рослина Brassica відповідно до винаходу може містити одну, дві, три, чотири або більше копій гена або полінуклеотиду, що кодує резистентний до гербіцидів білок AHASL відповідно до винаходу. Резистентна до гербіцидів рослина Brassica відповідно до винаходу може містити ген або полінуклеотид, що кодує резистентний до гербіцидів білок AHASL, що містить одиночну, подвійну або більшу кількість мутацій. Рослини Brassica відповідно до винаходу також включають насіння і рослини-потомки, які містять, щонайменше, одну копію гена або полінуклеотиду, що кодує резистентний до гербіцидів білок AHASL відповідно до винаходу. Насіння або одержані з них рослини-потомки, які містять один полінуклеотид, що кодує поліпептид AHASL, що містить одиночну, подвійну або більшу кількість мутацій, або два або більше полінуклеотидів, що кодують поліпептиди AHASL з одиночною мутацією, мають несподівано більш високий рівень стійкості до AHAS-інгібуючого гербіциду, наприклад, імідазолінонового гербіциду або гербіциду на основі сульфонілсечовини, ніж передбачається на підставі даних про наявність поліпептидів AHASL з одиночною мутацією в одній рослині. У рослинах і їх потомстві спостерігається синергетичний ефект, а не адитивний ефект відносно стійкості до гербіцидів, при цьому рівень стійкості до гербіцидів у рослин і їх потомства, що містять множинні мутації, вищий, ніж рівень стійкості до гербіцидів у рослини, що містить білок AHASL з одиничною мутацією. 3 UA 100122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід стосується способу боротьби з бур'янами, що ростуть поряд з нетрансгенними і трансгенними резистентними до гербіцидів рослинами відповідно до винаходу. Такі рослини включають, наприклад, резистентні до гербіцидів рослини Brassica, описані вище, і рослини, трансформовані молекулою полінуклеотиду, що кодує резистентний до гербіцидів білок AHASL відповідно до винаходу. Трансформовані рослини містять у своїх геномах, щонайменше, одну касету експресії, що містить промотор, який керує експресією гена у рослинній клітині, при цьому промотор оперативно зв'язаний з полінуклеотидом AHASL відповідно до винаходу. Спосіб включає в себе застосування ефективної кількості гербіциду відносно бур'янів і резистентної до гербіцидів рослини, при цьому резистентна до гербіцидів рослина має підвищену резистентність, щонайменше, до одного гербіциду, зокрема, до імідазолінонового або сульфонілсечовинного гербіциду, у порівнянні з рослиною дикого типу або нетрансформованою рослиною. Даний винахід стосується способів підвищення активності AHAS у рослині для одержання резистентної до гербіцидів рослини і для підвищення стійкості до гербіцидів уже стійкої до гербіцидів рослини. У деяких варіантах здійснення винаходу способи включають в себе трансформацію рослинної клітини полінуклеотидної конструкції, що містить нуклеотидну послідовність, оперативно зв'язану з промотором, що керує експресією у рослинній клітині, і регенерацію трансформованої рослини з трансформованої рослинної клітини. Нуклеотидна послідовність вибрана з таких нуклеотидних послідовностей, які кодують резистентні до гербіцидів білки AHASL відповідно до винаходу. В інших варіантах способи включають в себе звичайну селекцію рослин, що полягає у перехресному запиленні резистентної до гербіцидів рослини відповідно до винаходу з іншою рослиною і, крім того, можуть включати в себе відбір потомства, яке має властивості резистентності до гербіцидів батьківської рослини, що є резистентною до гербіцидів рослиною відповідно до винаходу. Даний винахід, крім того, стосується ізольованих молекул полінуклеотидів та ізольованих поліпептидів білків AHASL Brassica. Молекули полінуклеотидів відповідно до винаходу містять нуклеотидні послідовності, які кодують резистентні до гербіцидів білки AHASL відповідно до винаходу. Резистентні до гербіцидів білки AHASL відповідно до винаходу містять поліпептид, що кодується нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, що складається з a) нуклеотидної послідовності, зазначеної у SEQ ID NO:13; b) нуклеотидної послідовності, зазначеної у SEQ ID NO:14; c) нуклеотидної послідовності, зазначеної у SEQ ID NO:15; d) нуклеотидної послідовності, яка має, щонайменше, 90 % ідентичність послідовності з нуклеотидною послідовністю, зазначеною у SEQ ID NO:13, при цьому білок має аспарагін у положенні, що відповідає положенню 653 у послідовності SEQ ID NO:1, або положенню 638 у послідовності SEQ ID NO:2, або положенню 635 у послідовності SEQ ID NO:3; e) нуклеотидної послідовності, яка має, щонайменше, 90 % ідентичність послідовності з нуклеотидною послідовністю, зазначеною у SEQ ID NO:14, при цьому білок має треонін у положенні, що відповідає положенню 122 у послідовності SEQ ID NO:1, або положенню 107 у послідовності SEQ ID NO:4, або положенню 104 у послідовності SEQ ID NO:5; f) нуклеотидної послідовності, яка має, щонайменше, 90 % ідентичність послідовності з нуклеотидною послідовністю, зазначеною у SEQ ID NO:15, при цьому білок має треонін у положенні, що відповідає положенню 122 у послідовності SEQ ID NO:1, або положенню 107 у послідовності SEQ ID NO:4, або положенню 104 у послідовності SEQ ID NO:5. Вказаний вище білок AHASL додатково містить, щонайменше, одну мутацію, вибрану з групи, що складається з a) аспарагіну у положенні, яке відповідає положенню 653 у послідовності SEQ ID NO:1, або положенню 638 у послідовності SEQ ID NO:2, або положенню 635 у послідовності SEQ ID NO:3; b) треоніну у положенні, яке відповідає положенню 122 у послідовності SEQ ID NO:1, або положенню 107 у послідовності SEQ ID NO:4, або положенню 104 у послідовності SEQ ID NO:5; і c) лейцину у положенні, яке відповідає положенню 574 у послідовності SEQ ID NO:1 або положенню 556 у послідовності SEQ ID NO:6. Також пропонуються касети експресії, вектори для трансформації, трансформовані клітинихазяїни, відмінні від клітин людини, і трансформовані рослини, частини рослин і насіння, які містять одну або декілька молекул полінуклеотидів відповідно до винаходу. КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ На Фіг. 1 зображене вирівнювання нуклеотидних послідовностей кодуючих областей гена AHASL дикого типу з Arabidopsis thaliana (AtAHASL, SEQ ID NO:11), резистентного до гербіцидів гена BjAHASL1B-S653N Brassica juncea з лінії J04E-0044 (J04E-0044, SEQ ID NO:12), резистентного до гербіцидів гена BjAHASL1A-S653N Brassica juncea з лінії J04E-0139 (J04E0139, SEQ ID NO:13), резистентного до гербіцидів гена BjAHASL1B-A122T Brassica juncea з лінії J04E-0130 (J04E-0130, SEQ ID NO:14), резистентного до гербіцидів гена BjAHASL1A-A122T Brassica juncea з лінії J04E-0122 (BjAHASL1A, SEQ ID NO:15), резистентного до гербіцидів гена BnAHASL1A-W574L Brassica napus з лінії PM2 (BnAHASL1A, SEQ ID NO:16), гена BjAHASL1A 4 UA 100122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 дикого типу Brassica juncea (BjAHASL1A, SEQ ID NO:17), гена BjAHASL1B дикого типу Brassica juncea (BjAHASL1B, SEQ ID NO:18), гена BnAHASL1A дикого типу Brassica napus (BnAHASL1A, SEQ ID NO:19), гена BnAHASL1C дикого типу Brassica napus (BnAHASL1C, SEQ ID NO:20). Аналіз здійснювали за допомогою пакету програм Vector NTI, які використовують алгоритм Fast Algorithm (відкриття пробілу 15, продовження пробілу 6,66 і розділення пробілів 8, матриця swgapdnamt). На Фіг. 2 зображене вирівнювання амінокислотних послідовностей гена AHASL дикого типу з Arabidopsis thaliana (AtAHASL, SEQ ID NO:1), резистентного до гербіцидів гена BjAHASL1BS653N Brassica juncea з лінії J04E-0044 (J04E-0044, SEQ ID NO:2), резистентного до гербіцидів гена BjAHASL1A-S653N Brassica juncea з лінії J04E-0139 (J04E-0139, SEQ ID NO:3), резистентного до гербіцидів гена BjAHASL1B-A122T Brassica juncea з лінії J04E-0130 (J04E0130, SEQ ID NO:4), резистентного до гербіцидів гена BjAHASL1A-A122T Brassica juncea з лінії J04E-0122 (J04E-0122, SEQ ID NO:5), резистентного до гербіцидів гена BnAHASL1A-W574L Brassica napus з лінії PM2 (BnAHASL1A, SEQ ID NO:6), гена BjAHASL1A дикого типу Brassica juncea (BjAHASL1A, SEQ ID NO:7), гена BjAHASL1B дикого типу Brassica juncea (BjAHASL1B, SEQ ID NO:8), гена BnAHASL1A дикого типу Brassica napus (BnAHASL1A, SEQ ID NO:9), гена BnAHASL1C дикого типу Brassica napus (BnAHASL1C, SEQ ID NO:10). Аналіз здійснювали, використовуючи пакет програм Vector NTI (штраф за відкриття пробілу дорівнює 10, штраф за продовження пробілу дорівнює 0,05, штраф за розділення пробілів дорівнює 8, матриця blosum 62MT2). Фіг. 3 являє собою стовпчасту діаграму, що показує результати аналізу активності ферменту AHAS для ліній рослин B. juncea. Фіг. 4 являє собою діаграму, що показує результати аналізу обприскування у теплиці ліній рослин B. juncea. На Фіг. 5 наведена таблиця, що показує ідентифікаційні номери відповідних послідовностей ДНК або білка. На Фіг. 6 показана активність ферменту AHAS у білкових екстрактах, виділених з гомозиготних ліній B. juncea, ліній, що містять поєднання мутацій aR, bR, A107T і A104T B. juncea одна з одною та з інтрогресованою у B. juncea мутацією PM2, при концентрації імазамоксу 100 мкМ. На Фіг. 7 показане середнє значення ушкодження рослин (фітотоксичність) ліній F2 B. juncea, що мають різну зиготність і різні поєднання мутацій AHAS aR і A107T, через 2 тижні після обприскування теплиці 35 г активного інгредієнта імазамоксу/га. На Фіг. 8 показане середнє значення фітотоксичності для рослин ліній DH B. juncea, що містять поєднання мутацій B. juncea aR, bR, A107T і A104T одна з одною та з інтрогресованою у B. juncea мутацією PM2, після обприскування 35 г активного інгредієнта імазамоксу/га (Raptor®). ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Даний винахід стосується рослин Brassica, які мають підвищену резистентність до гербіцидів у порівнянні з рослиною Brassica дикого типу. Резистентні до гербіцидів рослини Brassica одержували як докладно описано нижче, впливаючи на ізольовані мікроспори Brassica дикого типу (у відношенні резистентності до гербіцидів) мутагеном, культивуючи мікроспори у присутності ефективної кількості імідазолінонового гербіциду і відбираючи зародки, що вижили. Із зародків, що вижили, одержували гаплоїдні рослини Brassica і потім хромосоми подвоювали, щоб одержати здатні до розмноження дигаплоїдні рослини Brassica, які мають підвищену резистентність до імідазолінонового гербіциду у порівнянні з резистентністю рослини Brassica дикого типу. В одному варіанті даний винахід стосується резистентної до гербіцидів лінії Brassica, називаної у даному описі J04E-0139, що була одержана у результаті мутагенезу мікроспор, як докладно описано нижче. В іншому варіанті даний винахід стосується резистентної до гербіцидів лінії Brassica, називаної у даному описі J04E-0130, що була одержана у результаті мутагенезу мікроспор. У ще одному варіанті даний винахід стосується резистентної до гербіцидів лінії Brassica, називаної у даному описі J04E-0122, що була одержана у результаті мутагенезу мікроспор. У ще одному варіанті даний винахід стосується резистентної до гербіцидів лінії Brassica, називаної у даному описі J05Z-07801, що була одержана схрещуванням мутантної лінії B. juncea bR (U.S. 2005/0283858) з мутантною лінією PM2 (дивіться US2004/0142353 і US2004/0171027; також дивіться Hattori et al., Mol. Gen. Genet. 246: 419-425, 1995), яка початково була одержана у результаті інтрогресії у Brassica juncea з Brassica napus. Таким чином, даний винахід стосується рослин Brassica juncea, що мають резистентність до AHAS-інгібуючих гербіцидів. Пропонуються лінії B. juncea, які містять одиночну мутацію, щонайменше, в одному полінуклеотиді AHASL, при цьому одиночна мутація вибрана з групи, 5 UA 100122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 що складається з трансверсії G-на-A, що відповідає амінокислоті у положенні 653 послідовності AHASL1 Arabidposis thaliana, і трансверсії G-на-A, що відповідає амінокислоті у положенні 122 послідовності AHASL1 A. thaliana. З резистентних до гербіцидів рослин Brassica juncea J04E-0139 і рослин Brassica juncea дикого типу виділяли кодуючу область гена великої субодиниці синтази ацетогідроксикислот (що називають AHASL1) за допомогою ампліфікації у полімеразній ланцюговій реакції (ПЛР) і секвенували. У результаті порівняння полінуклеотидних послідовностей резистентних до гербіцидів рослин Brassica і рослин Brassica дикого типу було виявлено, що кодуюча область полінуклеотидної послідовності AHASL1 з резистентної до гербіцидів рослини Brassica локалізована у геномі A Brassica juncea і відрізняється від полінуклеотидної послідовності AHASL1 рослини дикого типу одним нуклеотидом у результаті трансверсії G-на-A (Фіг. 1). Зазначена трансверсія G-на-A у полінуклеотидній послідовності AHASL1 приводить до нової заміни Ser на Asn у положенні амінокислоти 635 (що відповідає амінокислоті 653 AHASL1 A. thaliana) у консервативній області розрахованої амінокислотної послідовності білка AHASL1 у порівнянні з амінокислотною послідовністю білка AHASL1 дикого типу (Фіг. 2). З резистентних до гербіцидів рослин Brassica juncea J04E-0130 і рослин Brassica juncea дикого типу виділяли кодуючу область гена великої субодиниці синтази ацетогідроксикислот (що називають AHASL1) за допомогою ампліфікації у полімеразній ланцюговій реакції (ПЛР) і секвенували. У результаті порівняння полінуклеотидних послідовностей резистентних до гербіцидів рослин Brassica і рослин Brassica дикого типу було виявлено, що кодуюча область полінуклеотидної послідовності AHASL1 з резистентної до гербіцидів лінії Brassica J04E-0130 локалізована у геномі B Brassica juncea і відрізняється від полінуклеотидної послідовності AHASL1 рослини дикого типу одним нуклеотидом у результаті трансверсії G-на-A (Фіг. 1). Зазначена трансверсія G-на-A у полінуклеотидній послідовності AHASL1 приводить до нової заміни Ala на Thr у положенні амінокислоти 107 (що відповідає амінокислоті 122 AHASL1 A. thaliana) у консервативній області розрахованої амінокислотної послідовності білка AHASL1 у порівнянні з амінокислотною послідовністю білка AHASL1 дикого типу (Фіг. 2). З резистентних до гербіцидів рослин Brassica juncea J04E-0122 і рослин Brassica juncea дикого типу виділяли кодуючу область гена великої субодиниці синтази ацетогідроксикислот (називаного AHASL1) за допомогою ампліфікації у полімеразній ланцюговій реакції (ПЛР) і секвенували. У результаті порівняння полінуклеотидних послідовностей резистентних до гербіцидів рослин Brassica і рослин Brassica дикого типу було виявлено, що кодуюча область полінуклеотидної послідовності AHASL1 з резистентної до гербіцидів лінії Brassica J04E-0122 локалізована у геномі A Brassica juncea і відрізняється від полінуклеотидної послідовності AHASL1 рослини дикого типу одним нуклеотидом у результаті трансверсії G-на-A (Фіг. 1). Зазначена трансверсія G-на-A у полінуклеотидній послідовності AHASL1 приводить до нової заміни Ala на Thr у положенні амінокислоти 104 (що відповідає амінокислоті 122 AHASL1 A. thaliana) у консервативній області розрахованої амінокислотної послідовності білка AHASL1 у порівнянні з амінокислотною послідовністю білка AHASL1 дикого типу (Фіг. 2). Даний опис також стосується рослин B. juncea, які містять, щонайменше, два мутантних полінуклеотиди AHASL. Такі рослини також називають у даному описі рослинами, що містять "сукупні" мутації. Мутації можуть бути у тому самому або у різних геномах рослини B. juncea. Рослини B. juncea можуть містити будь-яку кількість мутантних полінуклеотидів AHASL і будьяке поєднання мутацій, включаючи без обмеження мутації, що відповідають положенню 653 у послідовності SEQ ID NO:1, положенню 638 у послідовності SEQ ID NO:2, положенню 635 у послідовності SEQ ID NO:3, положенню 122 у послідовності SEQ ID NO:1, положенню 107 у послідовності SEQ ID NO:4, положенню 104 у послідовності SEQ ID NO:5, положенню 574 у послідовності SEQ ID NO:1 або положенню 556 у послідовності SEQ ID NO:6. Також у даному винаході пропонуються рослини B. juncea, що мають два мутантних полінуклеотиди AHASL у різних геномах, один мутантний полінуклеотид AHASL у геномі A і другий мутантний полінуклеотид AHASL у геномі B. Такі рослини B. juncea, що мають два мутантних полінуклеотиди AHASL, включають рослини, що містять мутацію bR і мутацію PM2. До таких рослин належать рослини B. juncea лінії J05Z-07801, а також їх насіння і потомство, а також потомки, одержані від схрещувань з лінією B. juncea J05Z-07801. В іншому аспекті рослини B. juncea, що мають дві мутації AHASL, включають рослини, в яких поєднується мутація aR (наприклад, з лінії J04E-0139) з мутацією A122T (наприклад, з лінії J04E-0130), у лінії потомків B. juncea. В одному аспекті такі рослини, що поєднують у собі дві мутації AHASL1, мають синергетичний рівень стійкості до гербіцидів у порівнянні з адитивними рівнями стійкості до гербіцидів рослин B. juncea, що містять відповідні окремі мутації. 6 UA 100122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Мутації PM1 і PM2 одержували, використовуючи мутагенез мікроспор Brassica napus, як описано у Swanson et al. (Plant Cell Reports 7: 83-87(1989)). Мутація PM2 характеризується заміною одного нуклеотиду (G на T) на 3'-кінці гена AHAS3, приблизно у геномі A Brassica napus (Rutledge et al. Mol. Gen. Genet. 229: 31-40 (1991)), що приводить до амінокислотної заміни Trp на Leu, Trp556(Bn)Leu (Hattori et al., Mol. Gen. Genet. 246: 419-425, 1995). Мутація PM1, яка за припущенням є присутньою у геномі C Brassica napus (Rutledge et al. Mol. Gen. Genet. 229: 31-40 (1991)), характеризується заміною одного нуклеотиду у геномі AHAS1 (G на A), що приводить до амінокислотної заміни Ser на Asn, Ser638(Bn)Asn (дивіться Sathasivan et al., Plant Physiol. 97: 1044-1050, 1991, і Hattori et al., Mol. Gen. Genet. 232: 167-173, 1992; також дивіться US2004/0142353 і US2004/0171027). Повідомлялося, що мутантні гени PM1 (AHAS1) і PM2 (AHAS3) діють адитивно, забезпечуючи стійкість до імідазолінонових гербіцидів (Swanson et al., Theor. Appl. Genet. 78: 525-530, 1989). Оскільки вважають, що PM2 локалізована у геномі A Brassica napus, і обидва види: Brassica juncea і Brassica rapa, містять геном A, то перенесення мутантного гена PM2 з napus або в juncea, або в rapa можна здійснити, використовуючи схрещування видів (інтрогресію) і відбір при селекції в умовах низьких рівнів гербіциду. Оскільки вважають, що PM1 локалізована у геномі C Brassica napus, то інтрогресія такого мутанта з B. napus у Brassica juncea (A, B) або Brassica rapa (A, A) набагато складніша, оскільки вона залежить від того, чи відбудеться рідка подія хромосомної транслокації (між геномом C Brassica napus і або геномом A, або геномом B Brassica juncea). Така подія хромосомної транслокації часто може бути обтяжена відсутністю стабільності, а також нездатністю виключити опір зв'язуванню, що часто має місце при використанні такого способу. У патенті США № 6613963 описані стійкі до гербіцидів рослини Brassica juncea PM1/PM2, одержані з використанням такого способу інтрогресії. Виходячи з адитивної стійкості, забезпечуваної мутаціями PM1 і PM2 у B. napus, можна очікувати, що інтрогресія двох мутацій, PM1 і PM2, у Brassica juncea також приведе до адитивної стійкості до гербіцидів. Щоб подолати проблеми, пов'язані з перенесенням ознаки стійкості до гербіцидів з геному C Brassica napus у геноми A або B Brassica rapa і/або Brassica juncea, переважним є пряме одержання мутації у необхідному геномі. У заявці на видачу патенту США 2005/0283858 описана стійка до гербіцидів мутація AHAS1 Brassica juncea, bR, яку одержували прямим мутагенезом, що приводить до SNP у гені AHAS1, що викликало заміну Ser638Asn (положення 653 на підставі використання номенклатури положень амінокислот в AHASL Arabidopsis) у гені AHASL у геномі B. Рослини B. juncea, що мають дві або більше мутацій AHASL, пропоновані у даному винаході, можуть мати підвищені рівні резистентності до гербіцидів у порівнянні з адитивними рівнями резистентності у випадку окремих мутацій. Рослини, що мають дві або більше мутацій AHASL, можуть мати рівні резистентності, які на 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 %, або ще вищі у порівнянні з адитивним рівнями резистентності, що забезпечуються окремими мутаціями AHASL. Збільшення резистентності можна виміряти, використовуючи будь-який спосіб визначення резистентності AHAS. Наприклад, резистентність можна виміряти, визначаючи резистентність у B. juncea у відсотках через період часу, що складає 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 або 28 днів, після обробки AHAS-інгібуючим гербіцидом. Потім резистентність у відсотках можна порівняти з рівнями, одержаними підсумовуванням резистентності у відсотках рослин, що містять відповідні окремі мутації AHASL. В одному аспекті резистентність визначають вимірюванням резистентності рослин у відсотках через 14 днів після обробки 2-кратною кількістю AHASінгібуючого гербіциду. Винахід, крім того, стосується ізольованих молекул полінуклеотидів, що містять нуклеотидні послідовності, які кодують білки великої субодиниці синтази ацетогідроксикислот (AHASL), і таких білків AHASL. Винахід розкриває виділення і нуклеотидну послідовність полінуклеотиду, що кодує резистентний до гербіцидів білок AHASL1 Brassica, з резистентної до гербіцидів рослини Brassica, яка була одержана за допомогою хімічного мутагенезу рослин Brassica дикого типу. Резистентні до гербіцидів білки AHASL1 відповідно до винаходу мають заміну серину на аспарагін у положенні 635 гена AHASL1 B. juncea, локалізованого у геномі A, або заміну аланіну на треонін у положенні 107 гена AHASL1 B. juncea, локалізованого у геномі B, або заміну аланіну на треонін у положенні 104 гена AHASL1 B. juncea, локалізованого у геномі A. У винаході, крім того, розкриті виділення і нуклеотидна послідовність молекули полінуклеотиду, що кодує білок AHASL1 дикого типу Brassica. Даний винахід стосується ізольованих молекул полінуклеотидів, які кодують білки AHASL1 з Brassica, зокрема Brassica juncea. Зокрема, винахід стосується ізольованих молекул полінуклеотидів, що містять: нуклеотидну послідовність, зазначену у SEQ ID NO:13, нуклеотидні 7 UA 100122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 послідовності, що кодують білок AHASL1, що містить амінокислотну послідовність, зазначену у SEQ ID NO:3, нуклеотидну послідовність, зазначену у SEQ ID NO:14, нуклеотидні послідовності, що кодують білок AHASL1, що містить амінокислотну послідовність, зазначену у SEQ ID NO:4, нуклеотидну послідовність, зазначену у SEQ ID NO:15, нуклеотидні послідовності, що кодують білок AHASL1, що містить амінокислотну послідовність, зазначену у SEQ ID NO:5, і фрагменти, і варіанти таких нуклеотидних послідовностей, які кодують функціональні білки AHASL1. Ізольовані резистентні до гербіцидів молекули полінуклеотидів AHASL1 відповідно до винаходу містять нуклеотидні послідовності, які кодують резистентні до гербіцидів білки AHASL1. Такі молекули полінуклеотидів можна використовувати у полінуклеотидних конструкціях для трансформації рослин, зокрема культурних рослин, щоб підвищити резистентність рослин до гербіцидів, зокрема, гербіцидів, які, як відомо, інгібують активність AHAS, більш конкретно, до імідазолінонових гербіцидів. Такі полінуклеотидні конструкції можна використовувати у касетах експресії, експресуючих векторах, векторах для трансформації, плазмідах і тому подібному. Трансгенні рослини, одержані після трансформації такими полінуклеотидними конструкціями, проявляють підвищену резистентність до AHAS-інгібуючих гербіцидів, таких як, наприклад, імідазолінонові і сульфонілсечовинні гербіциди. Композиції відповідно до винаходу включають в себе нуклеотидні послідовності, які кодують білки AHASL1. Зокрема, даний винахід стосується ізольованих молекул полінуклеотидів, що містять нуклеотидні послідовності, що кодують амінокислотну послідовність, показану у SEQ ID NO:3, 4 або 5, і їх фрагменти і варіанти, які кодують поліпептиди, що мають активність AHAS. Крім того, пропонуються поліпептиди, що мають амінокислотну послідовність, яка кодується полінуклеотидною молекулою, описаною у даній публікації, наприклад, нуклеотидною послідовністю, зазначеною у SEQ ID NO:13, 14 або 15 та її фрагментами і варіантами, які кодують поліпептиди, що мають активність AHAS. Даний винахід стосується білків AHASL з амінокислотними замінами у конкретних амінокислотних положеннях у консервативних областях білків AHASL Brassica, розкритих у даному описі. Якщо у даному описі не зазначено особливо, конкретні амінокислотні положення стосуються положення такої амінокислоти у повнорозмірній амінокислотній послідовності AHASL A. thaliana, зазначеній у SEQ ID NO:1. Крім того, фахівцям у даній галузі буде зрозуміло, що такі амінокислотні положення можуть варіювати в залежності від того, додаються або видаляються амінокислоти, наприклад, на N-кінці амінокислотної послідовності. Таким чином, винахід охоплює амінокислотні заміни у зазначеному положенні або еквівалентному положенні (наприклад, "у положенні амінокислоти 653 або еквівалентному положенні"). Мається на увазі, що "еквівалентне положення" означає положення, що знаходиться у тій самій консервативній області, що і зазначене положення амінокислоти. Наприклад, амінокислота 122 у послідовності SEQ ID NO:1 знаходиться у положенні, еквівалентному положенню амінокислоти 107 у послідовності SEQ ID NO:4, та у положенні, еквівалентному положенню амінокислоти 104 у послідовності SEQ ID NO:5. Подібним чином, амінокислота 653 у білку AHASL Arabidopsis thaliana, що має амінокислотну послідовність, зазначену у SEQ ID NO:1, знаходиться у положенні, еквівалентному положенню амінокислоти 638 в AHASL1B Brassica і положенню амінокислоти 635 у білках AHASL1A Brassica, що мають амінокислотну послідовність, зазначену у SEQ ID NO:2 і 3, відповідно. Винахід охоплює ізольовані або по суті очищені композиції нуклеїнових кислот або білків. "Ізольована" або "очищена" молекула полінуклеотиду або білка, або його біологічно активна частина у значній мірі або по суті не містить компонентів, які звичайно супроводжують або взаємодіють з молекулою полінуклеотиду або білком і виявлені в його природному оточенні. Таким чином, ізольована або очищена молекула полінуклеотиду або білка по суті не містить інших клітинних компонентів або культурального середовища при одержанні способами, що базуються на рекомбінації, або по суті не містить хімічних попередників або інших хімічних речовин при хімічному синтезі. Переважно, "ізольована" нуклеїнова кислота не містить послідовностей (переважно, послідовностей, що кодують білок), які у природі фланкують нуклеїнову кислоту (тобто послідовностей, розташованих на 5'- і 3'-кінцях нуклеїнової кислоти) у геномній ДНК організму, з якого нуклеїнова кислота одержана. Наприклад, у різних варіантах ізольована молекула полінуклеотиду може містити менше, ніж приблизно 5, 4, 3, 2, 1, 0,5 або 0,1 т.п.н. нуклеотидних послідовностей, які у природі фланкують молекулу полінуклеотиду у геномній ДНК клітини, з якої нуклеїнова кислота одержана. Білок, що по суті не містить клітинного матеріалу, включає препарати білка, які містять менше, ніж приблизно 30, 20, 10, 5 або 1 % (сухої маси) забруднюючого білка. У тому випадку, коли білок відповідно до винаходу або його біологічно активну частину одержують способами на основі рекомбінації, переважно 8 UA 100122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 культуральне середовище складає менше, ніж приблизно 30, 20, 10, 5 або 1 % (сухої маси) хімічних попередників або хімічних речовин, відмінних від білка, що представляє інтерес. Даний винахід стосується ізольованих поліпептидів, що складають білки AHASL1. Ізольовані поліпептиди містять амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з амінокислотних послідовностей, зазначених у SEQ ID NO:3, 4 або 5, амінокислотних послідовностей, що кодуються нуклеотидними послідовностями, зазначеними у SEQ ID NO:13, 14 або 15, і функціональних фрагментів і варіантів зазначених амінокислотних послідовностей, які кодують поліпептид AHASL1, що має активність AHAS. Під "функціональними фрагментами і варіантами" мають на увазі фрагменти і варіанти зазначених поліпептидів, які мають активність AHAS. У деяких варіантах здійснення винаходу способи включають в себе застосування стійких до гербіцидів або резистентних до гербіцидів рослин. Під "стійкою до гербіцидів" або "резистентною до гербіцидів" рослиною мають на увазі рослину, яка стійка або резистентна, щонайменше, до одного гербіциду на рівні, який звичайно може вбивати або інгібувати ріст нормальної рослини або рослини дикого типу. В одному варіанті здійснення винаходу стійкі до гербіцидів рослини відповідно до винаходу містять стійкий до гербіцидів або резистентний до гербіцидів білок AHASL. Під "стійким до гербіцидів білком AHASL" або "резистентним до гербіцидів білком AHASL" мають на увазі, що такий білок AHASL має більш високу активність AHAS у порівнянні з активністю AHAS білка AHASL дикого типу у присутності, щонайменше, одного гербіциду, який, як відомо, перешкоджає прояву активності AHAS, і при концентрації або рівні гербіциду, що, як відомо, інгібує активність AHAS білка AHASL дикого типу. Крім того, активність AHAS такого стійкого до гербіцидів або резистентного до гербіцидів білка AHASL може бути названа у даному описі "стійкою до гербіцидів" або "резистентною до гербіцидів" активністю AHAS. Для даного винаходу терміни "стійкий до гербіцидів" і "резистентний до гербіцидів" використовують взаємозамінно, і мається на увазі, що терміни мають еквівалентне значення і еквівалентний діапазон використання. Подібним чином, терміни "стійкість до гербіцидів" і "резистентність до гербіцидів" використовують взаємозамінно, і мається на увазі, що терміни мають еквівалентне значення і еквівалентний діапазон. Подібним чином, терміни "резистентний до імідазолінонів" і "резистентність до імідазолінонів" використовують взаємозамінно, і мається на увазі, що терміни мають еквівалентне значення і еквівалентний діапазон як і терміни "стійкий до імідазолінонів" і "стійкість до імідазолінонів", відповідно. Винахід охоплює резистентні до гербіцидів полінуклеотиди AHASL1 і резистентні до гербіцидів білки AHASL1. Під "резистентним до гербіцидів полінуклеотидом AHASL1" мають на увазі полінуклеотид, що кодує білок, який має резистентну до гербіцидів активність AHAS. Під "резистентним до гербіцидів білком AHASL1" мають на увазі білок або поліпептид, що має резистентну до гербіцидів активність AHAS. Крім того, зрозуміло, що стійкий гербіцидів або резистентний до гербіцидів білок AHASL може бути введений у рослину у результаті трансформації рослини або її предка нуклеотидною послідовністю, що кодує стійкий до гербіцидів або резистентний до гербіцидів білок AHASL. Такі стійкі до гербіцидів або резистентні до гербіцидів білки AHASL кодуються стійкими до гербіцидів або резистентними до гербіцидів полінуклеотидами AHASL. Альтернативно, стійкий до гербіцидів або резистентний до гербіцидів білок AHASL може зустрічатися у рослині у результаті мутації, що відбувається у природі, або індукованої мутації в ендогенному гені AHASL у геномі рослини або її предка. Даний винахід стосується рослин, рослинних тканин, рослинних клітин і клітин-хазяїнів зі збільшеною і/або підвищеною резистентністю або стійкістю, щонайменше, до одного гербіциду, зокрема, гербіциду, що перешкоджає прояву активності ферменту AHAS, більш конкретно імідазолінонового або сульфонілсечовинного гербіциду. Термін "підвищена" стосується збільшення резистентності або стійкості у більшій мірі, ніж очікується. Переважна кількість або концентрація гербіциду є "ефективною кількістю" або "ефективною концентрацією". "Під ефективною кількістю" і "ефективною концентрацією" мають на увазі кількість і концентрацію, відповідно, яких достатньо для того, щоб вбити або інгібувати ріст подібної рослини дикого типу, рослинної тканини, рослинної клітини, мікроспори або клітини-хазяїна, але така зазначена кількість не вбиває або не інгібує так сильно ріст резистентної до гербіцидів рослини, рослинної тканини, рослинних клітин, мікроспор і клітин-хазяїнів відповідно до даного винаходу. Звичайно ефективна кількість гербіциду являє собою кількість, яку звичайно використовують у системах виробництва сільськогосподарської продукції, щоб вбити бур'яни, які представляють інтерес. Така кількість відома фахівцям у даній галузі або може бути легко визначена способами, відомими у даній галузі. Крім того, зрозуміло, що ефективна кількість гербіциду у системах виробництва сільськогосподарської продукції може у значній мірі відрізнятися від ефективної 9 UA 100122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кількості гербіциду для системи культивування рослин, такої як, наприклад, система культивування мікроспор. Гербіциди відповідно до даного винаходу являють собою гербіциди, які перешкоджають прояву активності ферменту AHAS, наприклад, активність AHAS знижується у присутності гербіциду. Такі гербіциди також можуть бути названі у даному описі "AHAS-інгібуючими гербіцидами" або просто "інгібіторами AHAS". У використовуваному у даному описі значенні "AHAS-інгібуючий гербіцид" або "інгібітор AHAS" не означає обмеження одним гербіцидом, що перешкоджає прояву активності ферменту AHAS. Таким чином, якщо не зазначено або не очевидно з контексту інше, "AHAS-інгібуючий гербіцид" або "інгібітор AHAS" може означати один гербіцид або суміш двох, трьох, чотирьох або більше гербіцидів, кожний з яких перешкоджає прояву активності ферменту AHAS. Під "подібною рослиною дикого типу, рослинною тканиною, рослинною клітиною або клітиною-хазяїном" мають на увазі рослину, рослинну тканину, рослинну клітину або клітинухазяїна, відповідно, які не мають властивостей резистентності до гербіцидів і/або які не мають конкретного полінуклеотиду відповідно до винаходу, що розкритий у даному описі. Отже, використання терміну "дикого типу" не означає, що рослина, рослинна тканина, рослинна клітина або інша клітина-хазяїн не має рекомбінантної ДНК у своєму геномі і/або не має властивостей резистентності до гербіцидів, які відрізняються від властивостей, описаних у даній публікації. У використовуваному у даному описі значенні і якщо чітко не зазначено інше, термін "рослина" означає рослину на будь-якій стадії розвитку, а також будь-яку частину або частини рослини, які можуть бути не відділеніабо відділені від цілої інтактної рослини. Такі частини рослини включають без обмеження органи, тканини і клітини рослини, включаючи калуси рослин, скупчення рослинних клітин, протопласти рослин і культури рослинних клітин, з яких рослини можуть бути регенеровані. Приклади конкретних частин рослини включають стебло, листок, корінь, суцвіття, квітку, квітку компактного суцвіття, плід, квітконіжку, плодоніжку, тичинку, пиляк, приймочку, стовпчик, зав'язь, пелюстку, чашолисток, плодолистик, кінчик кореня, кореневий чохлик, кореневий волосок, волосок насінини, пальцеве зерно, мікроспору, зародок, насінний зачаток, сім'ядолю, гіпокотиль, епікотиль, ксилему, флоему, паренхіму, ендосперм, клітину-супутницю, замикаючу клітину і будь-які інші відомі органи, тканини і клітини рослини. Крім того, зрозуміло, що насіння стосується поняття "рослина". Рослини відповідно до даного винаходу включають як нетрансгенні рослини, так і трансгенні рослини. Мається на увазі, що "нетрансгенна рослина" означає рослину, що не має рекомбінантної ДНК у своєму геномі. "Трансгенна рослина" означає рослину, що містить рекомбінантну ДНК у своєму геномі. Така трансгенна рослина може бути одержана введенням рекомбінантної ДНК у геном рослини. У тому випадку, коли таку рекомбінантну ДНК вводять у геном трансгенної рослини, потомство рослини також може містити рекомбінантну ДНК. Рослина-потомок, яка містить, щонайменше, частину рекомбінантної ДНК, щонайменше, однієї трансгенної рослини-предка, також є трансгенною рослиною. Даний винахід стосується резистентної до гербіцидів лінії Brassica, яку називають у даному описі J04E-0122. Депоновано, щонайменше, 2500 насінин Brassica лінії J04E-0122 у депозитарії для потреб патентування Американської колекції типових культур (ATCC), Mansassas, VA 20110 USA, 19 жовтня 2006 року з номером депозиту, що патентується, ATCC PTA-7944. Даний винахід стосується резистентної до гербіцидів лінії Brassica, яку називають у даному описі J04E0130. Депоновано, щонайменше, 2500 насінин Brassica лінії J04E-0130 19 жовтня 2006 року з номером депозиту, що патентується, ATCC PTA-7945. Даний винахід стосується резистентної до гербіцидів лінії Brassica, яку називають у даному описі J04E-0139. Депоновано щонайменше 2500 насінин Brassica лінії J04E-0139 19 жовтня 2006 року з номером депозиту, що патентується, ATCC PTA-7946. Даний винахід стосується резистентної до гербіцидів подвійної мутантної лінії Brassica, яку називають у даному описі J05Z-07801. Щонайменше, 625 насінин лінії Brassica J05Z-07801 депоновано 2 квітня 2007 року, інші 1875 депоновані 15 січня 2008 року з номером депозиту, що патентується, ATCC PTA-8305. Депозит буде зберігатися за умовами Будапештського договору про визнання депонування мікроорганізмів для цілей патентної процедури. Депозит ліній Brassica J04E-0122, J04E-0130, J04E-0130 і J05Z-07801 вміщений на строк, щонайменше, 30 років і буде зберігатися, щонайменше, 5 років з моменту останнього запиту про видачу зразка депозиту, одержаного ATCC. Крім того, заявники задовольнили всі вимоги статті 37 C.F.R. §§ 1.801-1.809, включаючи надання свідоцтва про життєздатність зразка. Резистентні до гербіцидів лінії Brassica J04E-0122, J04E-0130 і J04E-0139, що мають одиночну мутацію, відповідно до даного винаходу, одержували у результаті мутаційної селекції. 10 UA 100122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Мікроспори Brassica дикого типу піддавали мутагенезу, впливаючи мутагеном, зокрема хімічним мутагеном, більш конкретно етилнітрозосечовиною (ENU). Однак, даний винахід не обмежений резистентними до гербіцидів рослинами Brassica, які одержані способом мутагенезу з використанням хімічного мутагену ENU. Будь-який спосіб мутагенезу, відомий у даній галузі, може бути використаний для одержання резистентних до гербіцидів рослин Brassica відповідно до даного винаходу. Такі способи мутагенезу можуть включати в себе, наприклад, використання будь-якого одного або декількох з наведених далі мутагенів: випромінювання, такого як рентгенівське випромінювання, гамма-випромінювання (наприклад, кобальт-60 або цезій-137), нейтрони (наприклад, продукт поділу ядра урану-235 в атомному реакторі), бетавипромінювання (наприклад, що випромінюється радіоактивними ізотопами, такими як фосфор32 або вуглець-14) і ультрафіолетове випромінювання (переважно від 250 до 290 нм), і хімічні мутагени, такі як етилметансульфонат (EMS), аналоги основ (наприклад, 5-бромурацил), споріднені сполуки (наприклад, 8-етоксикофеїн), антибіотики (наприклад, стрептонігрин), алкілувальні агенти (наприклад, сірчистий іприт, азотистий іприт, епоксиди, етиленаміни, сульфати, сульфонати, сульфони, лактони), азид, гідроксиламін, азотиста кислота або акридини. Резистентні догербіцидів рослини також можуть бути одержані з використанням способів культивування тканин, щоб відібрати рослинні клітини, що містять мутації резистентності до гербіцидів, і потім з них регенерувати резистентні до гербіцидів рослини. Дивіться, наприклад, патенти США № 5773702 і 5859348, які включені у даний опис у вигляді посилання у повному об'ємі. Додаткові подробиці мутаційної селекції можна знайти у публікації "Principals of Cultivar Development", Fehr, 1993 Macmillan Publishing Company, зміст якої включений у даний опис у вигляді посилання. Аналіз гена AHASL1 рослини Brassica лінії J04E-0139 виявив мутацію, що приводить до заміни серину на аспарагін у положенні амінокислоти 635 у гені AHASL геному A B. juncea і надає підвищену резистентність до гербіциду. Таким чином, даний винахід розкриває той факт, що заміна серину іншою амінокислотою у положенні 635 (що відповідає положенню амінокислоти 653 в AHASL1 A. thaliana) може бути причиною того, що рослина Brassica набуває підвищену резистентність до гербіциду, зокрема, до імідазолінонового і/або сульфоналсечовинного гербіциду. Резистентні до гербіцидів рослини Brassica відповідно до винаходу включають без обмеження такі рослини Brassica, які містять у своїх геномах, щонайменше, одну копію полінуклеотиду AHASL1, що кодує резистентний до гербіцидів білок AHASL1, що містить аспарагін у положенні амінокислоти 635 або еквівалентному положенні. Аналіз гена AHASL1 рослини Brassica лінії J04E-0130 виявив мутацію, що приводить до заміни аланіну на треонін у положенні амінокислоти 107 у гені AHASL у геномі B B. juncea і надає підвищену резистентність до гербіциду. Таким чином, даний винахід розкриває той факт, що заміна аланіну іншою амінокислотою у положенні 107 (що відповідає положенню амінокислоти 122 в AHASL1 A. thaliana) може бути причиною того, що рослина Brassica набуває підвищену резистентність до гербіциду, зокрема, до імідазолінонового і/або сульфонілсечовинного гербіциду. Резистентні до гербіцидів рослини Brassica відповідно до винаходу включають без обмеження такі рослини Brassica, які містять у своїх геномах, щонайменше, одну копію полінуклеотиду AHASL1, що кодує резистентний до гербіцидів білок AHASL1, що містить треонін у положенні амінокислоти 107 або еквівалентному положенні. Аналіз гена AHASL1 рослини Brassica лінії J04E-0122 виявив мутацію, що приводить до заміни аланіну на треонін у положенні амінокислоти 104 у гені AHASL у геномі A B. juncea і надає підвищену резистентність до гербіциду. Таким чином, даний винахід розкриває той факт, що заміна аланіну іншою амінокислотою у положенні 104 (що відповідає положенню амінокислоти 122 в AHASL1 A. thaliana) може бути причиною того, що рослина Brassica набуває підвищену резистентність до гербіциду, зокрема, до імідазолінонового і/або сульфонілсечовинного гербіциду. Резистентні до гербіцидів рослини Brassica відповідно до винаходу включають без обмеження такі рослини Brassica, які містять у своїх геномах, щонайменше, одну копію полінуклеотиду AHASL1, що кодує резистентний до гербіцидів білок AHASL1, що містить треонін у положенні амінокислоти 104 або еквівалентному положенні. Рослини Brassica відповідно до винаходу додатково включають рослини, які містять, у порівнянні з білком AHASL1 дикого типу, аспарагін у положенні амінокислоти 653 (номенклатура для A. thaliana), треонін у положенні амінокислоти 122 (номенклатура для A. thaliana) і одну або декілька додаткових замін у білку AHASL1 у порівнянні з білком AHASL1 дикого типу, при цьому така рослина Brassica має підвищену резистентність, щонайменше, до одного гербіциду у порівнянні з рослиною Brassica дикого типу. Даний винахід стосується рослин і способів одержання рослин Brassica, резистентних до гербіцидів, що діють на AHAS, рослин Brassica, що мають підвищену стійкість до AHAS 11 UA 100122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гербіцидів, і насіння таких рослин. Таким чином, рослини, описані у даній публікації, можуть бути використані у програмах селекції, щоб створити додаткові стійкі до гербіцидів рослини B. juncea, такі як комерційні сорти B. juncea. Відповідно до таких способів, перша батьківська рослина Brassica може бути використана у схрещуваннях з другою батьківською рослиною Brassica, при цьому, щонайменше, одна із зазначених двох батьківських рослин Brassica має, щонайменше, одну мутацію, що надає резистентність AHAS до гербіцидів. Одним із застосувань способу є застосування для одержання гібридних рослин F 1. Інший важливий аспект такого способу полягає у тому, що спосіб може бути використаний для створення нових батьківських дигаплоїдних або інбредних ліній. Наприклад, лінія Brassica, що описана у даній публікації, може бути схрещена з будь-якою другою рослиною, і одержане гібридне потомство піддане самозапиленню і/або схрещуванню між сибсами протягом приблизно 5-7 поколінь або більшої кількості поколінь, з одержанням таким чином великої кількості окремих батьківських ліній. Потім зазначені батьківські лінії можуть бути схрещені з іншими лініями, і одержане гібридне потомство може бути піддане аналізу відносно наявності корисних властивостей. Таким чином можуть бути ідентифіковані нові лінії, що надають необхідні властивості. У зазначених способах можна використовувати різні методики селекції, включаючи гаплоїдію, спосіб відбору "педігрі", спосіб відбору однієї насінини у потомстві, модифікований спосіб відбору однієї насінини у потомстві, відбір, що повторюється, і зворотне схрещування. Лінії Brassica можна схрещувати, використовуючи будь-які природні або механічні методики. Механічне запилення може бути здійснене за допомогою контролювання типів пилка, який може бути перенесений на приймочку, або ручним запиленням. Рослини-потомки Brassica можна оцінювати будь-яким способом, щоб визначити присутність мутантного полінуклеотиду або поліпептиду AHASL. Такі способи включають фенотипічну оцінку, генотипічну оцінку або їх поєднання. Потомство рослин Brassica можна оцінити у наступних поколіннях відносно резистентності до гербіцидів та інших необхідних властивостей. Резистентність до AHAS-інгібуючих гербіцидів можна оцінити, піддаючи рослини впливу одного або декількох придатних AHAS-інгібуючих гербіцидів і оцінюючи ушкодження гербіцидами. Деякі властивості, такі як стійкість до полягання і висоту рослини, можна оцінювати за допомогою візуального огляду рослин, тоді як здатність швидко дозрівати може бути оцінена у результаті візуального огляду насіння у стручках. Інші властивості, такі як процентний вміст олії, процентний вміст білка і загальний вміст глюкозинолатів у насінні, можуть бути оцінені з використанням таких методик, як спектроскопія у ближній інфрачервоній області і/або рідинна хроматографія, і/або газова хроматографія. Генотипічна оцінка рослин Brassica включає в себе застосування таких методик, як електрофорез ізоферментів, оцінка поліморфізму довжин рестрикційних фрагментів (RFLP), оцінка випадково ампліфікованих поліморфних ДНК (RAPD), випадково праймована полімеразна ланцюгова реакція (AP-ПЛР), фінгерпринтинг амліфікованої ДНК (DAF), оцінка ампліфікованої області з охарактеризованою послідовністю (SCAR), поліморфізм довжин ампліфікованих фрагментів (AFLP), оцінка повторів простих послідовностей (SSR), які також називають "мікросателітами". Додаткові композиції і способи аналізу генотипу рослин Brassica, пропонованих у даному винаході, включають способи, описані у публікації патенту США № 2004/0171027, публікації патенту США № 2005/02080506 і публікації патенту США № 2005/0283858, повний зміст яких включений у даний опис у вигляді посилання. Оцінка і обробка (за допомогою впливу одного або декількох придатних AHAS-інгібуючих гербіцидів) може бути здійснена протягом декількох поколінь. Ефективність нових ліній можна оцінити, використовуючи об'єктивні критерії у порівнянні з контрольними сортами. Лінії, що мають необхідні поєднання властивостей, або схрещують з іншою лінією, або піддають самозапиленню, щоб одержати насіння. Самозапилення стосується перенесення пилка з однієї квітки на ту саму квітку або іншу квітку на тій же рослині. Рослини, які були піддані самозапиленню і селекції стосовно типу протягом багатьох поколінь, стають гомозиготними майже по всіх локусах і дають однорідну популяцію гомозиготного потомства. Будь-який спосіб селекції можна використовувати у способах відповідно до даного винаходу. В одному прикладі резистентні до гербіцидів рослини відповідно до даного винаходу можна розводити, використовуючи спосіб на основі гаплоїдів. У таких способах батьків, що мають генетичну базу для необхідного доповнення властивостей, схрещують, використовуючи просте або складне схрещування. Схрещування (або перехресне запилення) стосується перенесення пилка з однієї рослини на іншу рослину. Потомство від схрещування вирощують і мікроспори (незрілі пилкові зерна) відділяють і фільтрують, використовуючи методики, відомі фахівцям у даній галузі [(наприклад, Swanson, E. B. et al., "Efficient isolation of microspores and the production of microspore-derived embryos in Brassica napus", L. Plant Cell Reports, 6: 94-97 (1987); і Swanson, E. B., Microspore culture in Brassica, pp. 159-169 in Methods in Molecular 12 UA 100122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Biology, vol. 6, Plant Cell and Tissue Culture, Humana Press, (1990)]. У вказаних мікроспорах спостерігається розщеплення генів. Мікроспори культивують у присутності придатного AHASінгібуючого гербіциду, такого як імазетапір (наприклад, PURSUIT.TM.) або імазамокс (наприклад, RAPTOR.TM.) або суміш 50/50 імазетапіру та імазамоксу (наприклад, ODYSSEY.TM.), що вбиває мікроспори, в яких відсутні мутації, що відповідають за резистентність до гербіциду. Мікроспори, що несуть гени, які відповідають за резистентність до гербіциду, виживають і дають зародки, які утворюють гаплоїдні рослини. Потім їх хромосоми подвоюють, одержуючи подвоєні гаплоїди. Інші способи селекції також використовують відповідно до даного винаходу. Наприклад, відбір способом "педігрі" можна використовувати для поліпшення в основному самозапилюваних культур, таких як Brassica і канола. Селекцію "педігрі" починають зі схрещування двох генотипів, кожний з яких може мати одну або декілька необхідних властивостей, які відсутні в іншій або які доповнюють іншу властивість. Якщо два вихідних батьки не забезпечують всіх необхідних властивостей, то у план схрещувань можна включати додаткових батьків. Таких батьків можна схрещувати у вигляді простого або складного схрещування, щоб одержати прості або складні гібриди F1. Популяцію F2 одержують з F1 у результаті самозапилення однієї або декількох рослин F1 або взаємного схрещування двох рослин F1 (тобто схрещування між сибсами). Відбір найкращих варіантів можна починати в F 2-поколінні, і починаючи з F3 відбирають кращі родини, і найкращих представників у найкращих родинах. Повторне тестування родин можна починати в F4-поколінні, щоб підвищити ефективність селекції відносно властивостей з низькою спадковістю. На пізній стадії інбридингу (тобто F 6 і F7) найкращі лінії або суміші фенотипічно подібних ліній можна тестувати стосовно можливого випуску нових сортів. Однак, спосіб селекції педігрі більш трудомісткий, ніж спосіб на основі гаплоїдії, для створення поліпшених рослин з резистентною до гербіцидів AHAS, оскільки рослини дають розщеплення протягом декількох поколінь і вихід необхідних властивостей є відносно низьким. Спосіб відбору однієї насінини у потомстві (SSD) також можна використовувати для селекції поліпшених сортів. Спосіб SSD у точному значенні стосується посадки сегрегуючої популяції, збору зразка у вигляді однієї насінини від рослини і використання популяції з одиночних насінин для посадки з метою одержання наступного покоління. Коли популяція буде доведена від F 2 до необхідного рівня інбридингу, кожну з рослин, з яких одержані лінії, можна буде простежити до різних особин F2. Кількість рослин у популяції знижується у кожному поколінні внаслідок нездатності деяких насінин прорости або нездатності деяких рослин дати, щонайменше, одну насінину. У результаті не всі рослини, зразки яких були початково взяті у популяції F 2, будуть представлені потомством, коли просування поколінь буде завершено. У випадку способу, що базується на використанні декількох насінин, селекціонери каноли звичайно збирають один або декілька стручків з кожної рослини у популяції і молотять їх разом, одержуючи загальну масу. Частину загальної маси використовують для посадки наступного покоління, а частину відкладають у запас. Спосіб був названий модифікованим способом відбору однієї насінини у потомстві або способом відбору маси насіння одного стручка у потомстві. Спосіб відбору декількох насінин використовували для того, щоб зменшити затрати праці на збір. Значно швидше обмолотити стручки машиною, ніж діставати одну насінину з кожного стручка вручну у випадку способу відбору однієї насінини у потомстві. Спосіб відбору декількох насінин також дозволяє висаджувати однакову кількість насінин у популяції кожного покоління при інбридингу. Збирають достатню кількість насіння, щоб компенсувати рослини, які не проростають або не дають насіння. Зворотне схрещування можна використовувати для перенесення гена або генів легко і у високій мірі наслідуваної ознаки від вихідного сорту або лінії (батько-донор) в інший необхідний культурний сорт або інбредну лінію (рекурентного батька, тобто батьківську форму, з якою гібрид схрещується знову). Після початкового схрещування особини, що мають фенотип батькадонора, відбирають і повторно схрещують (піддають зворотному схрещуванню) з рекурентним батьком. Очікується, що після виконання зворотного схрещування одержана рослина буде мати ознаки рекурентного батька і необхідну властивість, перенесену від батька-донора. У результаті повторюваного відбору також можуть бути створені поліпшені сорти. Генетично різноманітну популяцію гетерозиготних особин або ідентифікують, або створюютьу результаті взаємного схрещування декількох різних батьків. Найкращі рослини відбирають на підставі їх власної переваги, визначного потомства або чудової здатності до схрещування. Відібрані рослини піддають взаємному схрещуванню, одержуючи нову популяцію, в якій продовжують наступні цикли селекції. 13 UA 100122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В іншому аспекті даний винахід стосується способу одержання рослини Brassica, що має резистентність до AHAS-гербіцидів, що включає в себе: (a) схрещування першої лінії Brassica з другою лінією Brassica, щоб одержати сегрегуючу популяцію, при цьому перша лінія Brassica представлена резистентною до AHAS-гербіцидів рослиною Brassica; (b) скринінг популяції стосовно підвищеної резистентності до AHAS-гербіцидів; і (c) відбір одного або декількох представників популяції, що мають підвищену резистентність AHAS у порівнянні з рослиною Brassica дикого типу. В іншому аспекті даний винахід стосується способу інтрогресії ознаки резистентності до гербіцидів, що діють на AHAS, у рослину Brassica, що включає в себе: (a) схрещування, щонайменше, першої лінії Brassica, резистентної до гербіцидів, що діють на AHAS, з другою лінією Brassica з одержанням сегрегуючої популяції; (b) скринінг популяції стосовно підвищеної резистентності до гербіцидів, що діють на AHAS; і (c) відбір, щонайменше, одного представника популяції, що має резистентність до гербіцидів, що діють на AHAS. Альтернативно, в іншому аспекті винаходу і перша, і друга батьківські рослини Brassica можуть бути резистентними до гербіциду, що діє на AHAS, рослинами Brassica, які описані у даній публікації. Таким чином, будь-яка рослина Brassica, одержана з використанням рослини Brassica, що має підвищену резистентність до гербіциду, що діє на AHAS, що описана у даній публікації, становить частину винаходу. У використовуваному у даному описі значенні схрещування може означати самозапилення, схрещування сибсів, зворотне схрещування, схрещування з іншою або тією самою батьківською лінією, схрещування з популяціями тощо. Даний винахід також стосується способів одержання резистентної до гербіцидів рослини, зокрема резистентної до гербіцидів рослини Brassica, за допомогою звичайної селекції рослин, що базується на статевому розмноженні. Способи включають в себе схрещування першої рослини, яка є резистентною до гербіциду, з другою рослиною, яка не є резистентною до гербіциду. Перша рослина може бути будь-якою резистентною до гербіцидів рослиною відповідно до даного винаходу, включаючи, наприклад, трансгенні рослини, які містять, щонайменше, один з полінуклеотидів відповідно до даного винаходу, що кодують резистентну до гербіцидів AHASL, і нетрансгенні рослини Brassica, які мають властивості резистентності до гербіцидів рослини Brassica J05Z-07801, J04E-0139, J04E-0130 або J04E-0122. Друга рослина може бути будь-якою рослиною, яка здатна давати життєздатне потомство (тобто насіння) при схрещуванні з першою рослиною. Звичайно, але не обов'язково, перша і друга рослини належать до того самого виду. Способи відповідно до винаходу додатково можуть включати в себе одне або декілька зворотних схрещувань рослин-потомків від першого схрещування з рослиною такої ж лінії або генотипу, як і перша або друга рослина. Альтернативно, потомство від першого схрещування або будь-якого наступного схрещування може бути схрещене з третьою рослиною, що є рослиною іншої лінії або іншого генотипу, ніж у випадку першої або другої рослини. Способи відповідно до винаходу додатково можуть включати в себе відбір рослин, які мають властивості резистентності до гербіцидів першої рослини. Даний винахід, крім того, стосується способів підвищення резистентності до гербіцидів рослини, зокрема, резистентної до гербіцидів рослини Brassica, за допомогою звичайної селекції рослин, що базується на статевому розмноженні. Способи включають в себе схрещування першої рослини, яка є резистентною до гербіциду, з другою рослиною, яка може бути або не бути резистентною до гербіциду, або може бути резистентною до іншого гербіциду або гербіцидів, відмінних від гербіциду, до якого резистентна перша рослина. Перша рослина може являти собою будь-яку резистентну до гербіцидів рослину відповідно до даного винаходу, включаючи, наприклад, трансгенні рослини, які містять, щонайменше, один з полінуклеотидів відповідно до даного винаходу, які кодують резистентну до гербіциду AHASL, і нетрансгенні рослини Brassica, які мають властивості резистентності до гербіцидів рослини Brassica J05Z07801, J04E-0139, J04E-0130 або J04E-0122. Другою рослиною може бути будь-яка рослина, що здатна давати життєздатні рослини-потомки (тобто насіння) при схрещуванні з першою рослиною. Звичайно, але не обов'язково, перша і друга рослини належать до того самого виду; а також перша і друга рослини можуть належати до різних видів, але у межах одного роду (приклад: Brassica juncea×Brassica napus, Brassica juncea×Brassica rapa, Brassica juncea×Brassica oleracea, Brassica juncea×Brassica nigra і т.д.), а також перша і друга рослини належать до різних родів (приклад: Brassica×Sinapis). Рослини-потомки, одержані таким способом відповідно до даного винаходу, мають підвищену резистентність до гербіциду у порівнянні або з першою, або з другою рослиною, або з обома рослинами. У тому випадку, коли перша і друга рослини резистентні до різних гербіцидів, рослини-потомки будуть мати комбіновані властивості резистентності до гербіцидів першої і другої рослин. Способи відповідно до винаходу додатково можуть включати в себе одне або декілька зворотних 14 UA 100122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 схрещувань рослин-потомків від першого схрещування з рослиною такої ж лінії або генотипу, як і перша або друга рослина. Альтернативно, потомство від першого схрещування або будь-якого наступного схрещування може бути схрещене з третьою рослиною, що є рослиною іншої лінії або іншого генотипу, ніж у випадку першої або другої рослини. Способи відповідно до винаходу додатково можуть включати в себе відбір рослин, які мають властивості резистентності до гербіцидів першої рослини, другої рослини або обох рослин. Рослини відповідно до даного винаходу можуть бути трансгенними або нетрансгенними. Прикладом нетрансгенної рослини Brassica, що має підвищену резистентність до імідазолінонових і/або сульфонілсечовинних гербіцидів є рослина Brassica J05Z-07801, J04E0139, J04E-0130 або J04E-0122; або мутантне, рекомбінантне або генетично сконструйоване похідне рослини J05Z-07801, J04E-0139, J04E-0130 або J04E-0122; або будь-яке потомство рослини J05Z-07801, J04E-0139, J04E-0130 або J04E-0122; або рослина, яка є потомком будьякої з вказаних рослин; або рослина, яка має властивості резистентності до гербіцидів рослини J05Z-07801, J04E-0139, J04E-0130 або J04E-0122. Даний винахід також стосується рослин, органів рослини, рослинних тканин, рослинних клітин, насіння і клітин-хазяїнів, відмінних від клітин людини, які трансформовані, щонайменше, однією молекулою полінуклеотиду, касетою експресії або вектором для трансформації відповідно до винаходу. Такі трансформовані рослини, органи рослин, рослинні тканини, рослинні клітини, насіння і клітини-хазяїни, відмінні від клітин людини, мають підвищену стійкість або резистентність, щонайменше, до одного гербіциду, при використанні рівнів гербіциду, які вбивають або інгібують ріст нетрансформованої рослини, рослинної тканини, рослинної клітини або клітини-хазяїна, відмінної від клітини людини, відповідно. Переважно, трансформовані рослини, рослинні тканини, рослинні клітини і насіння відповідно до винаходу являють собою рослини Brassica і сільськогосподарські рослини. Даний винахід також стосується насіння рослини Brassica, здатного давати рослину Brassica, що має резистентність до AHAS-гербіциду, одержаного з рослин Brassica, які одержані способами відповідно до даного винаходу. В іншому аспекті даний винахід також стосується рослини, вирощеної з насіння рослини Brassica, що має резистентність до AHAS-гербіциду, одержаного з рослин Brassica, вирощених для одержання насіння, що має властивість резистентності до гербіцидів, а також частин рослин і культур тканин з таких рослин. Також у даному винаході пропонуються ємності з насінням Brassica, при цьому насіння здатне надавати резистентну до AHAS-гербіциду рослину Brassica. Ємність з насінням Brassica може містити будь-яку кількість, масу або об'єм насіння. Наприклад, ємність може містити, щонайменше або більше, ніж приблизно 10, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 або більше насінин. Альтернативно, ємність може містити, щонайменше або більше, ніж приблизно 1 унцію (28,3 г), 5 унцій (141,5 г), 10 унцій (283 г), 1 фунт (0,453 кг), 2 фунти (0,906 кг), 3 фунти (1,359 кг), 4 фунти (1,812 кг), 5 фунтів (22665 кг) або більшу масу насіння. Ємності з насінням Brassica можуть являти собою будь-яку ємність, наявну у даній галузі. Як необмежувальний приклад, ємність може являти собою коробку, мішок, пачку, пакет, стрічковий рулон, відро, кришку чашки Петрі або пробірку. В іншому аспекті насіння, що знаходиться в ємностях з насінням Brassica, може являти собою оброблене або необроблене насіння. В одному аспекті насіння може бути оброблене для поліпшення проростання, наприклад, за допомогою пророщення насіння, або за допомогою дезінфекції, щоб захистити проти наявних у насінні патогенів. В іншому аспекті насіння може бути покрите будь-яким доступним покриттям, щоб поліпшити, наприклад, сіяння, проростання насіння і захист від патогенів, наявних на насінні. Покриття насіння може являти собою будь-яку форму покриття для насіння, включаючи без обмеження дражирування, плівкове покриття та інкрустацію. Даний винахід також стосується способів підвищення активності AHAS у рослині, що включають в себе трансформацію рослини полінуклеотидною конструкцією, що містить промотор, оперативно зв'язаний з нуклеотидною послідовністю AHASL1 відповідно до винаходу. Способи включають в себе введення полінуклеотидної конструкції відповідно до винаходу, щонайменше, в одну рослинну клітину і регенерацію з її трансформованої рослини. Полінуклеотидна конструкція містить, щонайменше, один нуклеотид, що кодує резистентний до гербіцидів білок AHASL відповідно до винаходу, зокрема, нуклеотидну послідовність, зазначену у SEQ ID NO:13, 14 або 15, нуклеотидні послідовності, що кодують амінокислотну послідовність, зазначену у SEQ ID NO:3, 4 або 5, і їх фрагменти і варіанти. Способи, крім того, включають в себе використання промотору, який здатний керувати експресією генів у рослинній клітині. 15 UA 100122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Переважно такий промотор є конститутивним промотором або тканино-специфічним промотором. Рослина, одержана зазначеним способом, має підвищену активність AHAS, зокрема, стійку до гербіцидів активність AHAS, у порівнянні з нетрансформованою рослиною. Таким чином, способи застосовні для посилення або підвищення резистентності рослини, щонайменше, до одного гербіциду, який перешкоджає прояву каталітичної активності ферменту AHAS, зокрема, до імідазолінонового гербіциду. Даний винахід стосується способу одержання резистентної до гербіцидів рослини, що включає в себе трансформацію рослинної клітини полінуклеотидною конструкцією, що містить нуклеотидну послідовність, оперативно зв'язану з промотором, що керує експресією у рослинній клітині, і регенерацію трансформованої рослини із зазначеної трансформованої рослинної клітини. Нуклеотидна послідовність вибрана з таких нуклеотидних послідовностей, які кодують резистентні до гербіцидів білки AHASL відповідно до винаходу, зокрема, нуклеотидних послідовностей, зазначених у SEQ ID NO:13, 14 або 15, нуклеотидних послідовностей, що кодують амінокислотну послідовність, зазначену у SEQ ID NO:3, 4 або 5, і їх фрагментів і варіантів. Резистентна до гербіцидів рослина, одержана таким способом, має підвищену резистентність у порівнянні з нетрансформованою рослиною, щонайменше, до одного гербіциду, зокрема, до гербіциду, який перешкоджає прояву активності ферменту AHAS, такого як, наприклад, імідазоліноновий гербіцид або сульфонілсечовинний гербіцид. Даний винахід стосується касет експресії для експресії полінуклеотидних молекул відповідно до винаходу у рослинах, рослинних клітинах та інших клітинах-хазяїнах, відмінних від клітин людини. Касети експресії містять промотор, що експресується у рослині, рослинній клітині або інших клітинах-хазяїнах, що представляють інтерес, оперативно зв'язаний з молекулою полінуклеотиду відповідно до винаходу, яка кодує резистентний до гербіцидів білок AHASL. У випадку необхідності цілеспрямованої експресії у хлоропласті, касета експресії також може містити оперативно зв'язану послідовність, що направляє у хлоропласт, яка кодує транзитний пептид хлоропласта, щоб направити експресований білок AHASL у хлоропласт. Касети експресії відповідно до винаходу застосовні у способі підвищення стійкості до гербіцидів рослини або клітини-хазяїна. Спосіб полягає у трансформації рослини або клітинихазяїна касетою експресії відповідно до винаходу, при цьому касета експресії містить промотор, що експресується у рослині або клітині-хазяїні, що представляє інтерес, і промотор оперативно зв'язаний з полінуклеотидом відповідно до винаходу, який містить нуклеотидну послідовність, що кодує резистентний до гербіцидів білок AHASL1 відповідно до винаходу. Крім того, спосіб включає в себе регенерацію трансформованої рослини з трансформованої рослинної клітини. Використання у даному описі терміну "полінуклеотидні конструкції" не означає обмеження даного винаходу полінуклеотидними конструкціями, що містять ДНК. Фахівцям у даній галузі буде зрозуміло, що полінуклеотидні конструкції, зокрема, полінуклеотиди і олігонуклеотиди, що складаються з рибонуклеотидів і поєднань рибонуклеотидів і дезоксирибонуклеотидів, також можуть бути використані у способах, розкритих у даному описі. Таким чином, полінуклеотидні конструкції відповідно до даного винаходу охоплюють всі полінуклеотидні конструкції, які можуть бути використані у способах відповідно до даного винаходу для трансформації рослин, включаючи без обмеження полінуклеотидні конструкції, що складаються з дезоксирибонуклеотидів, рибонуклеотидів і їх поєднань. Такі дезоксирибонуклеотиди і рибонуклеотиди включають як молекули, що зустрічаються у природі, так і синтетичні аналоги. Полінуклеотидні конструкції відповідно до винаходу також охоплюють всі форми полінуклеотидних конструкцій, включаючи без обмеження однониткові форми, двохниткові форми, шпильки, структури типу "стебло-петля" і тому подібне. Крім того, фахівцям у даній галузі зрозуміло, що кожна з нуклеотидних послідовностей, описаних у даній публікації, також охоплює комплемент такої описаної нуклеотидної послідовності. Крім того, зрозуміло, що у способах відповідно до винаходу може бути використана полінуклеотидна конструкція, яка здатна у трансформованій рослині керувати експресією, щонайменше, одного білка або, щонайменше, однієї РНК, такої як, наприклад, антисмислова РНК, яка комплементарна, щонайменше, частині мРНК. Звичайно така полінуклеотидна конструкція складається з послідовності, що кодує білок або РНК, оперативно зв'язаної з 5'- і 3'областями регуляції транскрипції. Альтернативно також зрозуміло, що у способах відповідно до винаходу можна використовувати полінуклеотидну конструкцію, яка не здатна керувати експресією білка або РНК у трансформованій рослині. Крім того, зрозуміло, що для експресії полінуклеотидів відповідно до винаходу у клітиніхазяїні, що представляє інтерес, полінуклеотид звичайно оперативно зв'язаний з промотором, який здатний керувати експресією гена у клітині-хазяїні, що представляє інтерес. Способи відповідно до винаходу для експресії полінуклеотидів у клітинах-хазяїнах не залежать від 16 UA 100122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 конкретного промотору. Способи охоплюють застосування будь-якого промотору, який відомий у даній галузі і який здатний керувати експресією гена у клітині-хазяїні, що представляє інтерес. Даний винахід охоплює молекули полінуклеотидів AHASL1 і їх фрагменти і варіанти. Молекули полінуклеотидів, які являють собою фрагменти таких нуклеотидних послідовностей, також входять в обсяг даного винаходу. "Фрагмент" означає частину нуклеотидної послідовності, що кодує білок AHASL1 відповідно до винаходу. Фрагмент нуклеотидної послідовності AHASL1 відповідно до винаходу може кодувати біологічно активну частину білка AHASL1 або може являти собою фрагмент, що може бути використаний як зонд для гібридизації або праймер ПЛР з використанням описаних нижче способів. Біологічно активна частина білка AHASL1 може бути одержана за допомогою виділення частини однієї з нуклеотидних послідовностей AHASL1 відповідно до винаходу, експресії частини, що кодується, білка AHASL1 (наприклад, у результаті експресії рекомбінантів in vitro) і оцінки активності частини, що кодується, білка AHASL1. Молекули полінуклеотидів, які являють собою фрагменти нуклеотидної послідовності AHASL1, містять, щонайменше, приблизно 15, 20, 50, 75, 100, 200, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 або 900 нуклеотидів, або аж до кількості нуклеотидів, присутніх у повнорозмірній нуклеотидній послідовності, розкритій у даному описі, в залежності від передбачуваного застосування. Фрагмент нуклеотидної послідовності AHASL1, яка кодує біологічно активну частину білка AHASL1 відповідно до винаходу, буде кодувати, щонайменше, приблизно 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225 або 250 сусідніх амінокислот або аж до загальної кількості амінокислот, які є присутніми у повнорозмірному білці AHASL1 відповідно до винаходу. Фрагменти нуклеотидної послідовності AHASL1, які застосовні як зонди гібридизації для ПЛР-праймерів, звичайно не повинні кодувати біологічно активну частину білка AHASL1. Молекули полінуклеотидів, які являють собою варіанти нуклеотидних послідовностей, описаних у даній публікації, також входять в обсяг даного винаходу. До "варіантів" нуклеотидних послідовностей AHASL1 відповідно до винаходу належать послідовності, які кодують білки AHASL1, описані у даній публікації, але які мають консервативні відмінності внаслідок виродженості генетичного коду. Такі алельні варіанти, що зустрічаються у природі, можуть бути ідентифіковані з використанням добре відомих способів молекулярної біології, таких як полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) і способи гібридизації, які описані нижче. Варіанти нуклеотидних послідовностей також включають синтетично одержані нуклеотидні послідовності, які були створені, наприклад, з використанням сайт-специфічного мутагенезу, але які все ще кодують білок AHASL1, розкритий у даному винаході, як обговорюється нижче. Звичайно варіанти нуклеотидних послідовностей відповідно до винаходу будуть, щонайменше, приблизно на 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 або 99 % ідентичні конкретній нуклеотидній послідовності, розкритій у даному описі. Варіант нуклеотидної послідовності AHASL1 буде кодувати білок AHASL1, відповідно, який має амінокислотну послідовність, яка, щонайменше, приблизно на 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 або 99 % ідентична амінокислотній послідовності білка AHASL1, розкритого у даному описі. Крім того, фахівцю буде зрозуміло, що зміни можуть бути введені у результаті мутації у нуклеотидних послідовностях відповідно до винаходу, які таким чином приводять до змін в амінокислотній послідовності білків AHASL1, що кодуються, без зміни біологічної активності білків AHASL1. Таким чином, ізольована молекула полінуклеотиду, що кодує білок AHASL1, який має послідовність, що відрізняється від послідовності, зазначеної у SEQ ID NO:11, може бути створена введенням однієї або декількох нуклеотидних замін, додатків або делецій у відповідну нуклеотидну послідовність, описану у даній публікації, таким чином одна або декілька амінокислотних замін, додатків або делецій вводяться у білок, що кодується. Мутації можуть бути введені стандартними способами, такими як сайт-специфічний мутагенез і ПЛРопосередкований мутагенез. Такі варіанти нуклеотидних послідовностей також входять в обсяг даного винаходу. Наприклад, переважно консервативні амінокислотні заміни можуть бути здійснені в одному або декількох вирахуваних неістотних амінокислотних залишках. "Неістотним" амінокислотним залишком є залишок, що може бути змінений у порівнянні з послідовністю дикого типу білка AHASL1 (наприклад, послідовністю SEQ ID NO:1) без зміни біологічної активності, тоді як "істотний" амінокислотний залишок необхідний для біологічної активності. "Консервативна амінокислотна заміна" являє собою заміну, у випадку якої амінокислотний залишок заміняють амінокислотним залишком, що має подібний бічний ланцюг. Сімейства амінокислотних залишків, що мають подібні бічні ланцюги, визначені у даній галузі. Такі сімейства включають в себе амінокислоти з основними бічними ланцюгами (наприклад, лізин, аргінін, гістидин), кислими бічними ланцюгами (наприклад, аспарагінова кислота, глутамінова кислота), 17 UA 100122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 незарядженими полярними бічними ланцюгами (наприклад, гліцин, аспарагін, глутамін, серин, треонін, тирозин, цистеїн), неполярними бічними ланцюгами (наприклад, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін, триптофан), бета-розгалуженими бічними ланцюгами (наприклад, треонін, валін, ізолейцин) і ароматичними бічними ланцюгами (наприклад, тирозин, фенілаланін, триптофан, гістидин). Такі заміни не можуть бути здійснені у випадку консервативних амінокислотних залишків або у випадку амінокислотних залишків, що знаходяться у консервативному мотиві. Білки відповідно до винаходу можуть бути змінені різними шляхами, включаючи амінокислотні заміни, делеції, укорочення та інсерції. Способи таких обробок, загалом, відомі у даній галузі. Наприклад, варіанти амінокислотних послідовностей білків AHASL1 можуть бути одержані у результаті мутацій у ДНК. Способи мутагенезу і змін нуклеотидних послідовностей добре відомі у даній галузі. Дивіться, наприклад, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154: 367-382; патент США № 4873192; Walker і Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York) і наведені у зазначених публікаціях посилання. Інструкції стосовно відповідних амінокислотних замін, які не впливають на біологічну активність білка, що представляє інтерес, можна знайти в описі моделі Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), включеному у даний опис у вигляді посилання. Переважними можуть бути консервативні заміни, такі як заміна однієї амінокислоти іншою амінокислотою, що має подібні властивості. Альтернативно, варіанти нуклеотидних послідовностей AHASL1 можуть бути одержані у результаті випадкового введення мутацій протягом всієї або частини кодуючої послідовності AHASL1, наприклад за допомогою насичуючого мутагенезу і одержані мутанти можуть бути піддані скринінгу стосовно активності AHAS, щоб ідентифікувати мутанти, які зберігають активність AHAS, включаючи резистентну до гербіцидів активність AHAS. Після мутагенезу білок, що кодується, може бути експресований рекомбінантно, і активність білка може бути визначена стандартними способами аналізу. Таким чином, нуклеотидні послідовності відповідно до винаходу включають послідовності, розкриті у даному описі, а також їх фрагменти і варіанти. Нуклеотидні послідовності AHASL1 відповідно до винаходу і їх фрагменти і варіанти можуть бути використані як зонди і/або праймери для ідентифікації і/або клонування гомологів AHASL в інших рослинах. Такі зонди можуть бути використані для виявлення транскриптів або геномних послідовностей, що кодують однакові або ідентичні білки. Таким чином, способи, такі як ПЛР, гібридизація і тому подібні, можуть бути використані для ідентифікації таких послідовностей, що мають значну ідентичність з послідовностями відповідно до винаходу. Дивіться, наприклад, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual nd (2 ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY) і Innis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY). Нуклеотидні послідовності AHASL, виділені на основі ідентичності їх послідовності з нуклеотидними послідовностями AHASL1, зазначеними у даному описі, або їх фрагменти і варіанти входять в обсяг даного винаходу. У способі гібридизації вся або частина відомої нуклеотидної послідовності AHASL1 може бути використана для скринінгу кДНК або геномних бібліотек. Способи конструювання такої кДНК і геномних бібліотек, загалом, відомі у даній галузі і описані у Sambrook et al. (1989) nd Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2 ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY). Так звані зонди гібридизації можуть являти собою фрагменти геномної ДНК, фрагменти кДНК, фрагменти РНК або інші олігонуклеотиди, і їх можна мітити групою, що реєструється, 32 такою як P або будь-яким іншим маркером, що реєструється, таким як інші радіоізотопи, флуоресціююча сполука, фермент або кофактор ферменту. Зонди для гібридизації можуть бути одержані міченням синтетичних олігонуклеотидів, що базуються на відомій нуклеотидній послідовності AHASL1, описаній у даній публікації. Крім того, можуть бути використані вироджені праймери, сконструйовані на основі консервативних нуклеотидів або амінокислотних залишків у відомій нуклеотидній послідовності AHASL1. Зонд звичайно містить область нуклеотидної послідовності, що гібридизується у жорстких умовах, щонайменше, приблизно з 12, переважно приблизно з 25, більш переважно приблизно з 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800 або 900 нуклеотидами, що йдуть один за одним, нуклеотидної послідовності AHASL1 відповідно до винаходу або її фрагмента або варіанта. Одержання зондів для гібридизації загалом відоме у даній галузі і описане у публікації nd Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2 ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York), включеній у даний опис у вигляді посилання. 18 UA 100122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Наприклад, повна послідовність AHASL1, описана у даній публікації, або одна або декілька з її частин можуть бути використані як зонд, здатний специфічно гібридизуватися з відповідними послідовностями AHASL1 і матричними РНК. Способи гібридизації включають скринінг, що базується на гібридизації, посіяних на чашках бібліотек ДНК (або бляшок, або колоній; дивіться, nd наприклад, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2 ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). Гібридизацію таких послідовностей можна здійснювати у жорстких умовах. Під "жорсткими умовами" або "жорсткими умовами гібридизації" мають на увазі умови, в яких зонд буде гібридизуватися зі своєю послідовністю-мішенню у більш високій мірі, що реєструється, ніж з іншими послідовностями (наприклад, щонайменше у 2 рази вище фону). Умови жорсткості залежать від послідовності і будуть відрізнятися у різних випадках. Звичайно жорсткі умови можуть являти собою умови, при яких концентрація солі менша, ніж приблизно 1,5 М іона Na, звичайно концентрація солі складає приблизно від 0,01 до 1,0 М іона Na (або інших солей) при pH від 7,0 до 8,3, і температура складає, щонайменше, приблизно 30 °C у випадку коротких зондів (наприклад, від 10 до 50 нуклеотидів) і, щонайменше, приблизно 60 °C у випадку довгих зондів (наприклад, більше 50 нуклеотидів). Жорстких умов також можна досягти за допомогою додавання дестабілізуючих засобів, таких як формамід. Приклади умов низької жорсткості включають гібридизацію з використанням буферного розчину, що містить від 30 до 35 % формаміду, 1 М NaCl, 1 % SDS (додецилсульфат натрію), при 37 °C і промивання в 1×-2× SSC (20× SSC=3,0 М NaCl/0,3 М цитрат тринатрію) при 50-55 °C. Приклади умов помірної жорсткості включають гібридизацію у 40-45 % формаміді, 1,0 М NaCl, 1 % SDS при 37 °C і промивання в 0,5×-1× SSC при 55-60 °C. Приклади умов високої жорсткості включають гібридизацію у 50 % формаміді, 1 М NaCl, 1 % SDS при 37 °C і промивання в 0,1× SSC при 60-65 °C. Необов'язково буфери для промивання містять приблизно від 0,1 % до приблизно 1 % SDS. Тривалість гібридизації звичайно складає менше, ніж приблизно 24 години, звичайно приблизно від 4 до приблизно 12 годин. Специфічність звичайно залежить від промивань після гібридизації, при цьому вирішальними факторами є іонна сила і температура кінцевого розчину для промивання. У випадку гібридів ДНК-ДНК Tm може бути апроксимована з рівняння Meinkoth і Wahl (1984) Anal. Biochem. 138: 267-284: Tm=81,5ºC+16,6 (log M)+0,41 (%GC)-0,61 (% form)-500/L; де M означає молярність одновалентних катіонів, %GC означає процентний вміст гуанозинових і цитозинових нуклеотидів у ДНК, % form означає процентний вміст формаміду у розчині для гібридизації, і L означає довжину гібриду у парах нуклеотидів. T m означає температуру (при визначеній іонній силі і pH), при якій 50 % комплементарної послідовності-мішені гібридизується з ідеально співпадаючим зондом. Tm знижують приблизно на 1ºC для кожного 1 % помилкових спарювань; таким чином, Tm, умови гібридизації і/або промивання можна коригувати для послідовностей, що мають необхідну ідентичність. Наприклад, якщо необхідно знайти послідовності з >90 % ідентичністю, то Tm може бути знижена на 10ºC. Звичайно умови жорсткості вибирають так, щоб температура була на 5ºC нижча, ніж температура точки плавлення (T m) для конкретної послідовності і її комплементу при визначеній іонній силі і pH. Однак, при дуже жорстких умовах можна використовувати гібридизацію і/або промивання при температурі на 1, 2, 3 або 4ºC нижче, ніж температура точки плавлення (T m); у випадку помірковано жорстких умов можна використовувати гібридизацію і/або промивання при температурі на 6, 7, 8, 9 або 10ºC нижче, ніж температура точки плавлення (T m); у випадку умов низької жорсткості можна використовувати гібридизацію і/або промивання при температурі на 11, 12, 13, 14, 15 або 20ºC нижче, ніж температура точки плавлення (T m). При використанні рівняння, сполук для гібридизації і промивання, і необхідної T m, фахівцям у даній галузі буде зрозуміло, що варіанти жорсткості розчинів для гібридизації і/або промивання по суті описані. Якщо необхідний ступінь помилкового спарювання приводить до T m меншої, ніж 45ºC (водний розчин) або 32 °C (розчин формаміду), то переважно збільшити концентрацію SSC так, щоб можна було використовувати більш високу температуру. Всебічний посібник з гібридизації нуклеїнових кислот наведений у публікації Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York); і Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York). nd Дивіться Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2 ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). Зрозуміло, що молекули полінуклеотидів і білки відповідно до винаходу охоплюють молекули полінуклеотидів і білки, що містять нуклеотидну або амінокислотну послідовність, яка у достатній мірі ідентична нуклеотидній послідовності SEQ ID NO:13, 14 і/або 15 або амінокислотній послідовності SEQ ID NO:3, 4 і/або 5. Термін "у значній мірі ідентична" 19 UA 100122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 використовують у даному описі стосовно першої амінокислотної або нуклеотидної послідовності, що містить достатню або мінімальну кількість ідентичних або еквівалентних (наприклад, з подібним бічним ланцюгом) амінокислотних залишків або нуклеотидів у порівнянні з другою амінокислотною або нуклеотидною послідовністю, таким чином перша і друга амінокислотні або нуклеотидні послідовності мають спільний структурний домен і/або мають спільну функціональну активність. Наприклад, амінокислотні або нуклеотидні послідовності, які містять спільний структурний домен, що мають, щонайменше приблизно 45, 55 або 65 % ідентичність, переважно 75 % ідентичність, більш переважно 85, 95 або 98 % ідентичність, визначають у даному описі як ідентичні у достатній мірі. Щоб визначити ідентичність у відсотках двох амінокислотних послідовностей або двох нуклеїнових кислот, послідовності вирівнюють з метою оптимального порівняння. Ідентичність у відсотках між двома послідовностями є функцією кількості ідентичних положень, наявних у послідовностях (тобто ідентичність у відсотках = кількість ідентичних положень/загальна кількість положень (наприклад, положень, що перекриваються) × 100). В одному варіанті дві послідовності мають однакову довжину. Ідентичність у відсотках між двома послідовностями може бути визначена за допомогою способів, подібних до способів, описаних нижче, з врахуванням або без врахування пробілів. При розрахунку ідентичності у відсотках звичайно підраховують точні збіги. Визначення ідентичності у відсотках між двома послідовностями можна здійснити, використовуючи математичний алгоритм. Переважним необмежувальним прикладом математичного алгоритму, використовуваного для порівняння двох послідовностей, є алгоритм, описаний у Karlin і Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264, модифікований як описано у Karlin і Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877. Такий алгоритм включений у програми NBLAST і XBLAST Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403. Пошуки нуклеотидів BLAST можуть бути здійснені з використанням програми NBLAST, рахунок дорівнює 100, довжина слова дорівнює 12, щоб одержати нуклеотидні послідовності, гомологічні молекулам полінуклеотидів відповідно до винаходу. Пошуки білків BLAST можуть бути здійснені з використанням програми XBLAST, рахунок дорівнює 50, довжина слова дорівнює 3, щоб одержати амінокислотні послідовності, гомологічні молекулам білків відповідно до винаходу. Щоб одержати вирівнювання з пробілами з метою порівняння, можна використовувати Gapped BLAST, що описаний в Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389. Альтернативно можна використовувати PSI-Blast, щоб здійснити ітераційний пошук, який дозволяє виявляти віддалені взаємозв'язки між молекулами. Дивіться Altschul et al. (1997) вище. У випадку застосування програм BLAST, Gapped BLAST і PSI-Blast можна використовувати параметри за умовчанням відповідних програм (наприклад, XBLAST і NBLAST). Іншим переважним необмежувальним прикладом математичного алгоритму, використовуваного для порівняння послідовностей, є алгоритм, описаний у Myers і Miller (1988) CABIOS 4: 11-17. Такий алгоритм включений у програму ALIGN (версія 2.0), що є частиною пакету комп'ютерних програм для вирівнювання послідовностей GCG. У випадку застосування програми ALIGN для порівняння амінокислотних послідовностей, можна використовувати матрицю ваг залишків PAM120, штраф за довжину пробілу 12 і штраф за пробіл 4. Вирівнювання також можна здійснювати вручну за допомогою перегляду. Якщо не зазначено інше, значення ідентичності/подібності послідовностей, наведені у даному описі, стосуються значення, одержаного з використанням повнорозмірних послідовностей відповідно до винаходу і з використанням множинного вирівнювання за допомогою алгоритму Clustal W (Nucleic Acid Research, 22(22): 4673-4680, 1994), використовуючи програму AlignX, що входить у пакет комп'ютерних програм Vector NTI, версія 9 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) з параметрами за умовчанням; або будь-яку еквівалентну програму. Під "еквівалентною програмою" мають на увазі будь-яку програму для порівняння послідовностей, яка у випадку будь-яких двох розглянутих послідовностей здійснює вирівнювання, що дає ідентичні збіги нуклеотидів або амінокислотних залишків і однакову ідентичність послідовностей у відсотках у порівнянні з відповідним вирівнюванням, яке здійснюється за допомогою AlignX, що входить у пакет комп'ютерних програм Vector NTI, версія 9. Нуклеотидні послідовності AHASL1 відповідно до винаходу включають як послідовності, що зустрічаються у природі, так і мутантні форми, зокрема, мутантні форми, які кодують білки AHASL1, що мають резистентну до гербіцидів AHAS-активність. Подібним чином білки відповідно до винаходу охоплюють як білки, що зустрічаються у природі, так і їх варіанти і модифіковані форми. Такі варіанти продовжують мати необхідну AHAS-активність. Очевидно, що мутації, які можуть бути здійснені у ДНК, що кодує варіант, не повинні виводити 20 UA 100122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 послідовність з рамки зчитування і переважно не будуть створювати комплементарні області, які можуть викликати утворення вторинної структури мРНК. Дивіться заявку на видачу патенту EP № 75444. Передбачається, що делеції, інсерції і заміни послідовностей білків, що входять у даний винахід, не викликають корінних змін властивостей білка. Однак, у тому випадку, коли складно передбачити точний ефект заміни, делеції або інсерції до їх здійснення, фахівцеві у даній галузі буде зрозуміло, що ефект можна оцінити у звичайних скринінгових аналізах. Тобто, активність можна оцінити за допомогою аналізів активності AHAS. Дивіться, наприклад, публікацію Singh et al. (1988) Anal. Biochem. 171: 173-179, включену у даний опис у вигляді посилання. Варіанти нуклеотидної послідовності і білки також охоплюють послідовності і білки, одержані за допомогою способів мутагенезу і рекомбінації, таких як перетасування ДНК. У випадку такого способу, одну або декілька різних кодуючих послідовностей AHASL можна піддати обробці, щоб створити новий білок AHASL, який має необхідні властивості. Таким чином створюють бібліотеки рекомбінантних полінуклеотидів з популяції споріднених полінуклеотидних послідовностей, що містять області послідовності, які мають істотну ідентичність і можуть бути піддані гомологічній рекомбінації in vitro або in vivo. Наприклад, з використанням зазначеного способу мотиви послідовності, що кодують домен, що представляє інтерес, можуть бути перетасовані між геном AHASL1 відповідно до винаходу та іншими відомими генами AHASL, щоб одержати новий ген, що кодує білок з поліпшеною властивістю, що представляє інтерес, такою як підвищений Km у випадку ферменту. Методики такого перетасування ДНК відомі у даній галузі. Дивіться, наприклад, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370: 389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15: 436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272: 336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391: 288-291 і патенти США № 5605793 і 5837458. Нуклеотидні послідовності відповідно до винаходу можуть бути використані для виділення відповідних послідовностей з інших організмів, зокрема, з інших рослин, більш конкретно - інших дводольних рослин. Таким чином, способи, такі як ПЛР, гібридизація і тому подібні, можуть бути використані для ідентифікації таких послідовностей на основі гомології їх послідовностей з послідовностями, зазначеними у даному описі. Послідовності, виділені на основі ідентичності їх послідовностей з повними послідовностями AHASL1, зазначеними у даному описі, або з їх фрагментами, входять в обсяг даного винаходу. Таким чином, ізольовані послідовності, які кодують білок AHASL і які гібридизуються у жорстких умовах з послідовністю, описаною у даній публікації, або з її фрагментами, входять в обсяг даного винаходу. У випадку застосування способу ПЛР можуть бути сконструйовані олігонуклеотидні праймери для використання у реакціях ПЛР, щоб ампліфікувати відповідні послідовності ДНК з кДНК або геномною ДНК, екстрагованою з будь-якої рослини, що представляє інтерес. Способи конструювання праймерів для ПЛР і ПЛР-клонування, загалом, відомі у даній галузі і описані у nd Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2 ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). Дивіться також Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York); Innis і Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York); та Innis і Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York). Відомі способи ПЛР включають без обмеження способи з використанням спарених праймерів, вкладених праймерів, окремих специфічних праймерів, вироджених праймерів, специфічних для гена праймерів, специфічних для вектора праймерів, праймерів, що частково помилково спарюються, і тому подібних. Полінуклеотидні послідовності AHASL1 відповідно до винаходу пропонуються у касетах експресії для експресії у рослині, що представляє інтерес. Касета буде містити 5'- і 3'регуляторні послідовності, оперативно зв'язані з полінуклеотидною послідовністю AHASL1 відповідно до винаходу. Під "оперативно зв'язаною" мається на увазі функціональний зв'язок між промотором і другою послідовністю, при цьому промоторна послідовність ініціює і опосередковує транскрипцію послідовності ДНК, що відповідає другій послідовності. Звичайно, оперативно зв'язана означає, що зв'язані послідовності нуклеїнової кислоти є сусідніми і, у випадку необхідності зв'язати дві області, що кодують білки, є сусідніми і знаходяться в одній і тій же рамці зчитування. Касета додатково може містити, щонайменше, один додатковий ген, який необхідний для котрансформації організму. Альтернативно, додатковий ген (гени) може знаходитися у касетах для множинної експресії. Така касета експресії обладнана множиною сайтів рестрикції для інсерції полінуклеотидної послідовності AHASL1 під транскрипційним контролем регуляторних областей. Касета експресії додатково може містити гени маркерів, що селектуються. 21 UA 100122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Касета експресії може містити у 5'-3'-напрямку транскрипції область ініціації транскрипції і трансляції (тобто промотор), полінуклеотидну послідовність AHASL1 відповідно до винаходу і область термінації транскрипції і трансляції (тобто область термінації), що функціонують у рослинах. Промотор може бути нативним або аналогічним, або чужорідним, або гетерологічним стосовно рослини-хазяїна і/або полінуклеотидної послідовності AHASL1 відповідно до винаходу. Крім того, промотор може являти собою природну послідовність або альтернативно синтетичну послідовність. У тому випадку, коли промотор є "чужорідним" або "гетерологічним" стосовно рослини-хазяїна, мається на увазі, що промотор не зустрічається у нативній рослині, в яку вводять промотор. У тому випадку, коли промотор є "чужорідним" або "гетерологічним" стосовно полінуклеотидної послідовності AHASL1 відповідно до винаходу, мається на увазі, що промотор не є нативним або промотором, що зустрічається у природі, для оперативно зв'язаної полінуклеотидної послідовності AHASL1 відповідно до винаходу. У використовуваному у даному описі значенні, химерний ген містить кодуючу послідовність, оперативно зв'язану з областю ініціації транскрипції, яка є гетерологічною відносно кодуючої послідовності. Хоча переважно можна експресувати полінуклеотиди AHASL1 відповідно до винаходу з використанням гетерологічних промоторів, можна використовувати нативні промоторні послідовності. Такі конструкції можуть змінювати рівні експресії білка AHASL1 у рослині або рослинній клітині. Таким чином, змінюється фенотип рослини або рослинної клітини. Область термінації може бути нативною стосовно області ініціації транскрипції, може бути нативною стосовно оперативно зв'язаної послідовності AHASL1, що представляє інтерес, може бути нативною стосовно рослини-хазяїна або може бути одержана з іншого джерела (тобто бути чужорідною або гетерологічною стосовно промотору, полінуклеотидної послідовності AHASL1, що представляє інтерес, рослини-хазяїна або будь-якого їх поєднання). Придатні області термінації доступні з Ti-плазміди A. tumefaciens, такі як області термінації октопінсинтази і нопалінсинтази. Дивіться також Guerineau et al. (199I) Mol. Gen. Genet. 262: 141-144; Proudfoot (1991) Cell 64: 671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5: 141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2: 1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91: 151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 7891-7903; і Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15: 9627-9639. У придатних випадках ген (гени) може(уть) бути оптимізований(і) для підвищеної експресії у трансформованій рослині. Тобто гени можуть бути синтезовані з використанням переважних для рослини кодонів для підвищеної експресії. Дивіться, наприклад, публікацію Campbell і Gowri (1990) Plant Physiol. 92: 1-11, в якій обговорюється переважне для хазяїна використання кодонів. У даній галузі є способи синтезу переважних для рослини генів. Дивіться, наприклад, патенти США № 5380831 і 5436391 і Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 477-498, включені у даний опис у вигляді посилання. Відомо, що додаткові модифікації послідовності посилюють експресію генів у клітині-хазяїні. Такі модифікації включають виключення послідовностей, що кодують помилкові сигнали поліаденілювання, сигналів сайтів екзон-інтронного сплайсингу, подібних до транспозонів повторів та інших добре охарактеризованих послідовностей, які шкодять експресії генів. Вміст G-C у послідовності можна коригувати до середніх рівнів для даної клітини-хазяїна, які розраховують на підставі відомих генів, що експресуються у клітині-хазяїні. Коли це можливо, послідовність модифікують так, щоб уникнути утворення передбачуваних вторинних структур мРНК у вигляді шпильок. Нуклеотидні послідовності для посилення експресії генів також можуть бути використані в експресуючих векторах рослин. До таких послідовностей належать інтрони гена AdhI intronl кукурудзи (Callis et al. Genes and Development 1: 1183-1200, 1987) і лідерні послідовності (Wпослідовність) з вірусу мозаїки тютюну (TMV), вірусу хлоротичної плямистості кукурудзи і вірусу мозаїки люцерни (Gallie et al. Nucleic Acid Res. 15: 8693-8711, 1987 і Skuzeski et al. Plant Mol. Biol. 15: 65-79, 1990). Показано, що перший інтрон з локусу shrunkent-1 кукурудзи збільшує експресію генів у химерних генних конструкціях. У патентах США № 5424412 і 5593874 розкрите застосування специфічних інтронів в експресуючих генних конструкціях, і в Gallie et al. (Plant Physiol. 106: 929-939, 1994) також показано, що інтрони застосовні для регуляції експресії генів на тканино-специфічній основі. Щоб додатково підсилити або оптимізувати експресію гена малої субодиниці AHAS, експресуючі вектори рослин відповідно до винаходу також можуть містити послідовності ДНК, що містять області прикріплення до матриксу (MAR). Рослинні клітини, трансформовані такими модифікованими системами експресії, потім можуть здійснювати надекспресію або конститутивну експресію нуклеотидної послідовності відповідно до винаходу. Касети експресії додатково можуть містити 5'-лідерні послідовності у конструкції касети експресії. Такі лідерні послідовності можуть діяти, посилюючи трансляцію. Лідери трансляції 22 UA 100122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 відомі у даній галузі і включають: лідери пікорнавірусів, наприклад, лідер EMCV (5'-некодуюча область енцефаломіокардиту) (Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6126-6130); лідери потивірусів, наприклад, лідер TEV (вірусу гравіровки тютюну) (Gallie et al. (1995) Gene 165(2): 233-238), лідер MDMV (вірусу карликової мозаїки кукурудзи) (Virology 154: 9-20) і білок, що зв'язує важкий ланцюг імуноглобуліну людини (BiP) (Macejak et al. (1991) Nature 353: 90-94); нетрансльований лідер з мРНК білка оболонки вірусу мозаїки люцерни (AMV RNA 4) (Jobling et al. (1987) Nature 325: 622-625); лідер вірусу мозаїки тютюну (TMV) (Gallie et al. (1989) у Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, New York), pp. 237-256); і лідер вірусу хлоротичної плямистості кукурудзи (MCMV) (Lommel et al. (1991) Virology 81: 382-385). Також дивіться Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84: 965-968. Також можна використовувати інші способи, які як відомо посилюють трансляцію, наприклад, з використанням інтронів і тому подібного. При одержанні касети експресії можна піддавати обробці різні фрагменти ДНК так, щоб одержати послідовності ДНК у правильній орієнтації і, у відповідному випадку, у правильній рамці зчитування. Для цієї мети можна використовувати адаптери і лінкери, щоб зв'язати фрагменти ДНК, або можна використовувати інші маніпуляції, щоб ввести придатні сайти рестрикції, видалити надлишкову ДНК, видалити сайти рестрикції або тому подібне. Для зазначеної мети можна використовувати мутагенез in vitro, репарацію з праймерами, рестрикцію, відпал, повторні заміни, наприклад, транзиції і трансверсії. Ряд промоторів можна використовувати при практичному здійсненні винаходу. Промотори можуть бути вибрані на основі необхідного результату. Нуклеїнові кислоти можна поєднувати з конститутивними, переважними для визначеної тканини або іншими промоторами для експресії у рослинах. Такі конститутивні промотори включають, наприклад, коровий промотор Rsyn7 та інші конститутивні промотори, описані у WO 99/43838 і патенті США № 6072050; коровий промотор CaMV 35S (Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812); промотор актину рису (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2: 163-171); убіквітину (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12: 619-632 і Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81: 581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3: 2723-2730); промотор ALS (патент США № 5659026) і тому подібні. Інші конститутивні промотори включають, наприклад, промотори, описані у патентах США №№ 5608149, 5608144, 5604121, 5569597, 5466785, 5399680, 5268463, 5608142 і 6177611. Переважні для тканини промотори можуть бути використані для забезпечення цілеспрямованої посиленої експресії AHASL1 у конкретній рослинній тканині. Такі переважні для тканини промотори включають без обмеження переважні для листя промотори, переважні для коріння промотори, переважні для насіння промотори і переважні для стебла промотори. Переважні для тканини промотори описані в Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803; Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343; Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6(2):157-168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112(3):1331-1341; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):525-535; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):513-524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco et al. (1993) Plant Mo I Biol. 23(6):1129-1138; Matsuoka et al. (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590; і Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4(3):495-505. Такі промотори за необхідності можуть бути модифіковані відносно слабкої експресії. В одному варіанті нуклеїнові кислоти, що представляють інтерес, направляють у мішень хлоропласт, для експресії. Таким чином, коли нуклеїнова кислота, що представляє інтерес, безпосередньо не вбудована у хлоропласт, касета експресії буде додатково містити послідовність, що направляє у хлоропласт, яка містить нуклеотидну послідовність, що кодує транзитний пептид хлоропласта, для того, щоб направити продукт гена, що представляє інтерес, у хлоропласти. Такі транзитні пептиди відомі у даній галузі. Що стосується послідовностей, що направляють у хлоропласт, то "оперативно зв'язана" означає, що послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує транзитний пептид (тобто послідовність, що направляє у хлоропласт), зв'язана з полінуклеотидом AHASL відповідно до винаходу так, що дві послідовності безпосередньо йдуть одна за одною і знаходяться в одній і тій же рамці зчитування. Дивіться, наприклад, Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84: 965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 1414-1421; і Shah et al. (1986) Science 233: 478-481. Хоча білки AHASL1 відповідно до винаходу включають в себе нативний транзитний пептид хлоропласта, будь-який транзитний пептид хлоропласта, відомий у даній галузі, може бути злитий з амінокислотною послідовністю зрілого білка AHASL1 відповідно до 23 UA 100122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 винаходу за допомогою оперативного зв'язування послідовності, що направляє у хлоропласт, з 5'-кінцем нуклеотидної послідовності, що кодує зрілий білок AHASL1 відповідно до винаходу. Послідовності, що направляють у хлоропласт, відомі у даній галузі і включають малу субодиницю рибулозо-1,5-біфосфаткарбоксилази хлоропласта (Rubisco) (de Castro Silva Filho et al. (1996) Plant Mol. Biol. 30: 769-780; Schnell et al. (1991) J. Biol. Chem. 266(5): 3335-3342); 5(енолпірувіл)шикімат-3-фосфатсинтазу (EPSPS) (Archer et al. (1990) J. Bioenerg. Biomemb. 22(6): 789-810); триптофансинтазу (Zhao et al. (1995) J. Biol. Chem. 270(11): 6081-6087); пластоціанін (Lawrence et al. (1997) J. Biol. Chem. 272(33): 20357-20363); хоризматсинтазу (Schmidt et al. (1993) J. Biol Chem. 268(36): 27447-27457); і світлозбираючий хлорофіл a/b-зв'язувальний білок (LHBP) (Lamppa et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:14996-14999). Дивіться також Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 17544-17550; DellaCioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84: 965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 1414-1421; і Shah et al. (1986) Science 233: 478-481. Способи трансформації хлоропластів відомі у даній галузі. Дивіться, наприклад, Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8526-8530; Svab і Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 913-917; Svab і Maliga (1993) EMBOJ. 12: 601-606. Спосіб базується на використанні гармати для частинок для доставки ДНК, яка містить маркер, що селектується, і цілеспрямованому вбудовуванні ДНК у геном пластид за допомогою гомологічної рекомбінації. Крім того, трансформація пластид може бути здійснена за допомогою трансактивації трансгена, що мовчить, який несуть пластиди, у результаті тканино-специфічної експресії РНК-полімерази, що кодується в ядрі і спрямована у пластиди. Така система описана у McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 7301-7305. Нуклеїнові кислоти, що представляють інтерес, які необхідно направити у хлоропласт, можуть бути оптимізовані для експресії у хлоропласті з врахуванням відмінностей у використанні кодонів між ядром рослини і даним органоїдом. Таким чином, нуклеїнові кислоти, що представляють інтерес, можуть бути синтезовані з використанням переважних для хлоропластів кодонів. Дивіться, наприклад, патент США № 5380831, включений у даний опис у вигляді посилання. Як зазначено у даному описі, нуклеотидні послідовності AHASL1 відповідно до винаходу застосовні для посилення стійкості до гербіцидів рослин, які містять у своїх геномах ген, що кодує стійкий до гербіцидів білок AHASL1. Такий ген може являти собою ендогенний ген або трансген. Крім того, у деяких варіантах послідовності нуклеїнових кислот відповідно до даного винаходу можна комплектувати з будь-яким поєднанням полінуклеотидних послідовностей, що представляють інтерес, щоб створити рослини з необхідним фенотипом. Наприклад, полінуклеотиди відповідно до даного винаходу можна поєднувати з будь-якими іншими полінуклеотидами, що кодують поліпептиди, які мають пестицидну і/або інсектицидну активність, такі як, наприклад, білки токсини Bacillus thuringiensis (описані у патентах США №№ 5366892, 5747450, 5737514, 5723756, 5593881 і Geiser et al. (1986) Gene 48: 109). Одержані комбінації також можуть включати в себе множинні копії будь-якого одного з полінуклеотидів, що представляють інтерес. Зрозуміло, що поряд з такими нуклеотидними послідовностями можуть бути сконструйовані антисмислові конструкції, комплементарні, щонайменше, частині полінуклеотидних послідовностей матричної РНК (мРНК) для AHASL1. Антисмислові нуклеотиди конструюють для гібридизації з відповідними мРНК. Можуть бути здійснені модифікації антисмислових послідовностей за умови, що послідовності гібридизуються і перешкоджають експресії відповідної мРНК. Таким чином, можуть бути використані антисмислові конструкції, що мають 70 %, переважно 80 %, більш переважно 85 % ідентичність послідовності з відповідними антисмисловими послідовностями. Крім того, частини антисмислових нуклеотидів можуть бути використані для порушення експресії гена-мішені. Звичайно можна використовувати послідовності довжиною, щонайменше, 50 нуклеотидів, 100 нуклеотидів, 200 нуклеотидів або більше. Нуклеотидні послідовності відповідно до даного винаходу також можна використовувати у смисловій орієнтації, щоб придушити експресію ендогенних генів у рослинах. Способи придушення експресії генів у рослинах з використанням нуклеотидних послідовностей у смисловій орієнтації відомі у даній галузі. Способи звичайно включають в себе трансформацію рослин конструкцією ДНК, що містить промотор, який керує експресією у рослині, оперативно зв'язаний, щонайменше, з частиною нуклеотидної послідовності, що відповідає транскрипту ендогенного гена. Звичайно така нуклеотидна послідовність має значну ідентичність послідовності з послідовністю транскрипту ендогенного гена, переважно більшу, ніж приблизно 65 % ідентичність послідовності, більш переважно більшу, ніж приблизно 85 % ідентичність 24 UA 100122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовності, найбільш переважно більшу, ніж приблизно 95 % ідентичність послідовності. Дивіться патенти США № 5283184 і 5034323, включені у даний опис у вигляді посилання. Хоча резистентні до гербіцидів полінуклеотиди AHASL1 відповідно до винаходу застосовні як гени маркерів, що селектуються, для трансформації рослин, касети експресії відповідно до винаходу можуть містити інший ген маркера, що селектується, для селекції трансформованих клітин. Гени маркерів, що селектуються, включаючи гени відповідно до даного винаходу, застосовують для селекції трансформованих клітин або тканин. Маркерні гени включають без обмеження гени, що кодують резистентність до антибіотиків, такі як гени, що кодують неоміцинфосфотрансферазу II (NEO) і гігроміцинфосфотрансферазу (HPT), а також гени, що надають резистентність до гербіцидних сполук, таких як глюфосинат амонію, бромоксиніл, імідазолінони і 2,4-дихлорфеноксіацетат (2,4-D). Загалом, дивіться Yarranton(1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506-511; Christopherson et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6314-6318; Yao et al. (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419-2422; Barkley et al. (1980) in The Operon, pp. 177-220; Hu et al. (1987) Cell 48:555-566; Brown et al. (1987) Cell 49:603-612; Figge et al. (1988) Cell 52:713-722; Deuschle et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Aci. USA 86:5400-5404; Fuerst et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2549-2553; Deuschle et al. (1990) Science 248:480-483; Gossen (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Reines et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1917-1921; Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-3356; Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3952-3956; Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072-5076; Wyborski et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143-162; Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595; Kleinschnidt et al. (1988) Biochemistry 27:1094-1104; Bonin (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551; Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavka et al. (1985) Handbook of' Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlin); Gill et al. (1988) Nature 334:721-724. Зазначені публікації включені у даний опис у вигляді посилання. Наведений вище список генів маркерів, що селектуються, не слід розглядати як обмежувальний. У даному винаході можна використовувати будь-який ген маркера, що селектується. Ізольовані молекули полінуклеотидів, що містять нуклеотидну послідовність, яка кодує білки AHASL1 відповідно до винаходу, можна використовувати у векторах для трансформації рослин для того, щоб створені рослини мали підвищену резистентність до гербіцидів, зокрема, до імідазолінонових гербіцидів. Ізольовані молекули полінуклеотидів AHASL1 відповідно до винаходу можна використовувати у векторах окремо або у поєднані з нуклеотидною послідовністю, що кодує малу субодиницю ферменту AHAS (AHASS), для надання рослинам резистентності до гербіцидів. Дивіться патент США № 6348643, що включений у даний опис у вигляді посилання. Таким чином, даний винахід стосується векторів для трансформації, які містять ген маркера, що селектується, відповідно до винаходу. Ген маркера, що селектується, містить промотор, що керує експресією у клітині-хазяїні, оперативно зв'язаний з полінуклеотидом, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує резистентний до гербіцидів білок AHASL відповідно до винаходу. Вектор для трансформації додатково може містити ген, що представляє інтерес, який необхідно експресувати у клітині-хазяїні, а також, за необхідності, може містити послідовність, що направляє у хлоропласт, яка оперативно зв'язана з полінуклеотидом відповідно до винаходу. Даний винахід, крім того, стосується способів застосування векторів для трансформації відповідно до винаходу для селекції відносно клітин, трансформованих геном, що представляє інтерес. Такі способи полягають у трансформації клітини-хазяїна трансформуючим вектором, впливі на клітину визначеним рівнем імідазолінонового або сульфонілсечовинного гербіциду, що може вбивати або інгібувати ріст нетрансформованої клітини-хазяїна, та ідентифікації трансформованої клітини-хазяїна за її здатністю рости у присутності гербіциду. В одному варіанті відповідно до винаходу клітина-хазяїн являє собою рослинну клітину, і ген маркера, що селектується, містить промотор, який керує експресією у рослинній клітині. Вектори для трансформації відповідно до винаходу можна застосовувати для одержання рослин, трансформованих геном, що представляє інтерес. Вектори для трансформації будуть містити ген маркера, що селектується, відповідно до винаходу і ген, що представляє інтерес, який необхідно ввести і, як правило, експресувати у трансформованій рослині. Такий ген маркера, що селектується, містить резистентний до гербіцидів полінуклеотид AHASL1 відповідно до винаходу, оперативно зв'язаний з промотором, що керує експресією у клітиніхазяїні. У випадку застосування у рослинах і рослинних клітинах, вектор для трансформації 25 UA 100122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 містить ген маркера, що селектується, який включає в себе резистентний до гербіцидів полінуклеотид AHASL1 відповідно до винаходу, оперативно зв'язаний з промотором, що керує експресією у рослинній клітині. Винахід також стосується експресуючого вектора рослин, що містить промотор, який керує експресією у рослині, оперативно зв'язаний з ізольованою молекулою полінуклеотиду відповідно до винаходу. Ізольована молекула полінуклеотиду містить нуклеотидну послідовність, що кодує білок AHASL1, зокрема білок AHASL1, що містить амінокислотну послідовність, яка зазначена у SEQ ID NO:2, 3, 4, 5 або 6, або її функціональний фрагмент і варіант. Експресуючий вектор рослин відповідно до винаходу не залежить від конкретного промотору, за винятком того, що такий промотор повинен мати здатність керувати експресією генів у рослинній клітині. Переважні промотори включають конститутивні промотори і переважні для тканин промотори. Гени, що представляють інтерес, відповідно до винаходу варіюють в залежності від необхідного результату. Наприклад, інтерес можуть представляти різні зміни фенотипу, включаючи модифікацію складу жирних кислот у рослині, зміну вмісту амінокислот у рослині, зміну механізмів захисту рослини від комах і/або патогенів, і тому подібні. Зазначені результати можуть бути досягнуті у результаті експресії гетерологічних продуктів або підвищеної експресії ендогенних продуктів у рослинах. Альтернативно, результати можуть бути досягнуті у результаті зниження експресії одного або декількох ендогенних продуктів у рослині, зокрема, ферментів або кофакторів. Такі зміни приводять до зміни фенотипу трансформованої рослини. В одному варіанті здійснення винаходу генами, що представляють інтерес, є гени резистентності до комах, наприклад, такі як гени білка токсину Bacillus thuringiensis (патенти США №№ 5366892, 5747450, 5736514, 5723756, 5593881 і Geiser et al. (1986) Gene 48: 109). Білки або поліпептиди AHASL1 відповідно до винаходу можуть бути очищені, наприклад, з рослин Brassica і можуть бути використані у композиціях. Також ізольована молекула полінуклеотиду, що кодує білок AHASL1 відповідно до винаходу, може бути використана для експресії білка AHASL1 відповідно до винаходу у мікроорганізмі, такому як E. coli або дріжджі. Експресований білок AHASL1 можна очистити з екстрактів E. coli або дріжджів будь-яким способом, відомим фахівцеві у даній галузі. Винахід також стосується способу створення трансгенної рослини, яка є резистентною до гербіцидів, що включає в себе трансформацію рослини експресуючим вектором рослин, що містить промотор, який керує експресією у рослині, оперативно зв'язаний з ізольованою молекулою полінуклеотиду відповідно до винаходу. Ізольована молекула полінуклеотиду містить нуклеотидну послідовність, що кодує білок AHASL1 відповідно до винаходу, зокрема, білок AHASL1, що містить: амінокислотну послідовність, яка зазначена у SEQ ID NO:2, 3, 4, 5 або 6, амінокислотну послідовність, що кодується послідовністю SEQ ID NO:12, 13, 14, 15 або 16, або функціональний фрагмент і варіант зазначених амінокислотних послідовностей. Винахід також стосується нетрансгенних рослин Brassica, трансгенних рослин, одержаних способами відповідно до винаходу, і потомства та інших потомків таких нетрансгенних і трансгенних рослин, при цьому рослини мають посилену або підвищену резистентність до гербіцидів, які негативно впливають на фермент AHAS, зокрема, імідазолінонових і сульфонілсечовинних гербіцидів. Полінуклеотиди AHASL1 відповідно до винаходу, зокрема, полінуклеотиди, що кодують резистентні до гербіцидів білки AHASL1, застосовні у способах посилення резистентності стійких до гербіцидів рослин. В одному варіанті здійснення винаходу стійкі до гербіцидів рослини містять стійкий до гербіцидів або резистентний до гербіцидів білок AHASL. Стійкі до гербіцидів рослини включають як рослини, трансформовані стійкими до гербіцидів нуклеотидними послідовностями AHASL, так і рослини, які містять у своїх геномах ендогенний ген, що кодує стійкий до гербіцидів білок AHASL. Така стійка до гербіцидів рослина може являти собою стійку до гербіцидів рослину, яка була генетично сконструйована для одержання стійкості до гербіцидів, або стійку до гербіцидів рослину, яка була створена способами, в яких не використовують рекомбінантну ДНК, наприклад, такі як рослини Brassica відповідно до даного винаходу. Нуклеотидні послідовності, що кодують стійкі до гербіцидів білки AHASL, і стійкі до гербіцидів рослини, що містять ендогенний ген, що кодує стійкий до гербіцидів білок AHASL, включають полінуклеотиди і рослини відповідно до даного винаходу або полінуклеотиди і рослини, які відомі у даній галузі. Дивіться, наприклад, патенти США №№ 5013659, 5731180, 5767361, 5545822, 5736629, 5773703, 5773704, 5952553 і 6274796, які всі включені у даний опис у вигляді посилання. Такі способи посилення резистентності стійких до гербіцидів рослин включають в себе трансформацію стійкої до гербіцидів рослини, щонайменше, однією полінуклеотидною конструкцією, що містить промотор, який керує експресією у рослинній 26 UA 100122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 клітині, оперативно зв'язаний з резистентним до гербіцидів полінуклеотидом AHASL1 відповідно до винаходу, зокрема, полінуклеотидом, що кодує резистентний до гербіцидів білок AHASL1, зазначений у SEQ ID NO:12, 13, 14, 15 або 16, полінуклеотидами, що кодують амінокислотну послідовність, зазначену у SEQ ID NO:2, 3, 4, 5 або 6, і фрагментами і варіантами зазначених полінуклеотидів, які кодують поліпептиди, що мають резистентну до гербіцидів активність AHAS. Рослина, одержана таким способом, має підвищену резистентність, щонайменше, до одного гербіциду у порівнянні з резистентною до гербіцидів рослиною до трансформації полінуклеотидною конструкцією відповідно до винаходу. Доступні численні вектори для трансформації рослин і способи трансформації рослин. Дивіться, наприклад, An, G. et al. (1986) Plant Pysiol, 81: 301-305; Fry, J., et al. (1987) Plant Cell Rep. 6: 321-325; Block, M. (1988) Theor. Appl Genet. 16: 161-114; Hinchee, et al. (1990) Stadler. Genet. Symp. 203212.203-212; Cousins, et al. (1991) Aust. J. Plant Physiol. 18: 481-494; Chee, P.P. і Slightom, J.L. (1992) Gene. 118: 255-260; Christou, et al. (1992) Trends. Biotechnol. 10: 239-246; D'Halluin, et al. (1992) Bio/Technol. 10: 309-314; Dhir, et al. (1992) Plant Physiol. 99: 81-88; Casas etal. (1993) Proc, Nat. Acad Sci. USA 90: 11212-11216; Christou, P. (1993) In Vitro Cell. Dev. Biol.Plant; 29P: 119-124; Davies, et al. (1993) Plant Cell Rep. 12: 180-183; Dong, J.A. і Mchughen, A. (1993) Plant Sci. 91: 139-148; Franklin, C.I. і Trieu, T.N. (1993) Plant. Physiol. 102: 167; Golovkin, et al. (1993) Plant Sci. 90: 41-52; Guo Chin Sci. Bull. 38: 2072-2078; Asano, et al. (1994) Plant Cell Rep. 13; Ayeres N.M. і Park, W.D. (1994) Crit. Rev. Plant. Sci. 13: 219-239; Barcelo, et al. (1994) Plant. J. 5: 583-592; Becker, et al. (1994) Plant. J. 5: 299-307; Borkowska et al. (1994) Acta. Physiol Plant. 16: 225-230; Christou, P. (1994) Agro. Food. Ind. Hi Tech. 5: 17-27; Eapen et al. (1994) Plant Cell Rep. 13: 582-586; Hartman, et al. (1994) Bio-Technology 12: 919923; Ritala, et al. (1994) Plant. Mol. Biol. 24: 317-325; і Wan, Y.C. і Lemaux, P.G. (1994) Plant Physiol. 104: 3748. Способи відповідно до винаходу полягають у введенні полінуклеотидної конструкції у рослину. Під "введенням" мають на увазі вплив на рослину полінуклеотидною конструкцією таким чином, щоб конструкція одержала доступ всередину клітини рослини. Способи відповідно до винаходу не залежать від конкретного способу введення полінуклеотидної конструкції у рослину за умови, що полінуклеотидна конструкція одержує доступ всередину, щонайменше, однієї клітини рослини. Способи введення полінуклеотидних конструкцій у рослини відомі у даній галузі, включаючи без обмеження способи стабільної трансформації, способи тимчасової трансформації і опосередковані вірусами способи. Під "стабільною трансформацією" мають на увазі, що полінуклеотидна конструкція, введена у рослину, інтегрується у геном рослини і може успадковуватися її потомством. Під "тимчасовою трансформацією" мають на увазі, що полінуклеотидна конструкція, введена у рослину, не інтегрується у геном рослини. Для трансформації рослин і рослинних клітин нуклеотидні послідовності відповідно до винаходу вбудовують, використовуючи стандартні методики, у будь-який вектор, відомий у даній галузі, що підходить для експресії нуклеотидних послідовностей у рослині або рослинній клітині. Вибір вектора залежить від переважної методики трансформації і виду рослини-мішені, яку необхідно трансформувати. В одному варіанті здійснення винаходу нуклеотидна послідовність AHASL1 оперативно зв'язана з промотором рослин, який, як відомо, забезпечує високі рівні експресії у рослинній клітині, і таку конструкцію потім вводять у рослину, яка є чутливою до імідазолінонового гербіциду, і регенерують трансформовану рослину. Трансформована рослина є стійкою до впливу такого рівня імідазолінонового гербіциду, що вбиває або у значній мірі ушкоджує нетрансформовану рослину. Зазначений спосіб може бути застосовний для будь-якого виду рослини; однак, він найбільш корисний для застосування відносно культурних рослин, зокрема, культурних рослин, які звичайно вирощують у присутності, щонайменше, одного гербіциду, зокрема, імідазолінонового гербіциду. Методики конструювання касет експресії у рослинах і введення чужорідних нуклеїнових кислот у рослини, загалом, відомі у даній галузі і описані раніше. Наприклад, чужорідну ДНК можна вводити у рослини, використовуючи вектори на основі (Ti)-плазмід, що індукують пухлини. Способи трансформації на основі Agrobacterium добре відомі у даній галузі. Штам Agrobacterium (наприклад, Agrobacterium tumefaciens або Agrobacterium rhizogenes) містить плазміду (Ti- або Ri-плазміду) і елемент T-ДНК, який переносять у рослину у результаті інфекції Agrobacterium. T-ДНК (ДНК, що переноситься) інтегрується у геном рослинної клітини. T-ДНК може бути локалізована в Ri- або Ti-плазміді або міститься окремо у так званому бінарному векторі. Способи опосередкованої Agrobacterium трансформації описані, наприклад, у Horsch RB et al. (1985) Science 225: 1229f. Опосередкована Agrobacterium трансформація може бути використана як для дводольних рослин, так і для однодольних рослин. Трансформація рослин за допомогою Agrobacteria описана у White FF, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in 27 UA 100122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, edited by S.D. Kung і R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15-38; Jenes B et al. (1993) Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, edited by S.D. Kung і R. Wu, Academic Press, pp. 128-143; Potrykus (1991) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol 42: 205-225. Інші способи, використовувані для доставки чужорідної ДНК, включають в себе застосування опосередкованої ПЕГ трансформації протопластів, електропорації, мікроін'єкції ниткоподібних кристалів і балістичні способи або бомбардування мікрочастинками для прямого захоплення ДНК. Такі способи відомі у даній галузі (патент США № 5405765, Vasil et al.; Bilang et al. (1991) Gene 100: 247-250; Scheid et al., (1991) Mol Gen. Genet, 228: 104-112; Guerche et al., (1987) Plant Science 52: 111-116; Neuhause et al., (1987) Theor. Appl Genet. 75: 30-36; Klein et al., (1987) Nature 327: 70-73; Howell et al., (1980) Science 208:1265; Horsch et al., (1985) Science 227: 1229-1231; DeBlock et al., (1989) Plant Physiology 91: 694-701; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach і Weissbach, eds.) Academic Press, Inc. (1988) і Methods in Plant Molecular Biology (Schuler і Zielinski, eds.) Academic Press, Inc. (1989). Спосіб трансформації залежить від рослинної клітини, яку необхідно трансформувати, стабільності використовуваних векторів, рівня експресії генних продуктів та інших параметрів. Інші придатні способи введення нуклеотидних послідовностей у рослинні клітини і подальше вбудовування у геном рослини включають мікроін'єкцію, як описано у Crossway et al. (1986) Biotechniques 4: 320-334, електропорацію, як описано у Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5602-5606, опосередковану Agrobacterium трансформацію, як описано Townsend et al. у патенті США № 5563055, Zhao et al. у патенті США № 5981840, пряме перенесення генів, як описано у Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3: 2717-2722, і балістичне прискорення частинок, як описано, наприклад, Sanford et al. у патенті США № 4945050; Tomes et al. у патенті США № 5879918; Tomes et al. у патенті США № 5886244; Bidney et al. у патенті США № 5932782; Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment, " in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg і Phillips (Springer-Verlag, Berlin); McCabe et al. (1988) Biotechnology 6: 923-926); і трансформацію Lec1 (WO 00/28058). Також дивіться Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22: 421-477; Sanford et al. (1987) Paniculate Science and Technology 5: 27-37 (цибуля); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87: 671674 (соя); McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6: 923-926 (соя); Finer і McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P: 175-182 (соя); Singh et al. (1998) Theor. Appl Genet. 96: 319-324 (соя); Datta et al. (1990) Biotechnology 8: 736-740 (рис); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 43054309 (кукурудза); Klein et al. (1988) Biotechnology 6: 559-563 (кукурудза); Tomes, патент США № 5240855; Buising et al., патенти США №№ 5322783 і 5324646; Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment, " в Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg (Springer-Verlag, Berlin) (кукурудза); Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91: 440-444 (кукурудза); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8: 833-839 (кукурудза); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (London) 311: 763-764; Bowen et al., патент США № 5736369 (злакові); Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5345-5349 (лілейні); De Wet et al. (1985) у The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, New York), pp. 197-209 (пилок); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9: 415-418 і Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84: 560-566 (опосередкована ниткоподібними кристалами трансформація); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4: 1495-1505 (електропорація); Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12: 250-255 і Christou і Ford (1995) Annals of Botany 75: 407-413 (рис); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 745-750 (кукурудза за допомогою Agrobacterium tumefaciens); всі публікації включені у даний опис у вигляді посилання. Полінуклеотиди відповідно до винаходу можуть бути введені у рослини у результаті контактування рослин з вірусом або вірусними нуклеїновими кислотами. Загалом, такі способи полягають у введенні полінуклеотидної конструкції відповідно до винаходу у молекулу вірусної ДНК або РНК. Зрозуміло, що білок AHASL1 відповідно до винаходу може бути початково синтезований у вигляді частини вірусного полібілка, який пізніше процесується у результаті протеолізу in vivo або in vitro з утворенням необхідного рекомбінантного білка. Крім того, зрозуміло, що промотори відповідно до винаходу також охоплюють промотори, використовувані для транскрипції вірусними РНК-полімеразами. Способи введення полінуклеотидних конструкцій у рослини і експресії у рослинах білка, що кодується, включаючи введення молекул вірусних ДНК або РНК, відомі у даній галузі. Дивіться, наприклад, патенти США №№ 5889191, 5889190, 5866785, 5589367 і 5316931, включені у даний опис у вигляді посилання. З клітин, які були трансформовані, можна виростити рослини відповідно до звичайних способів. Дивіться, наприклад, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84. Такі рослини потім можуть бути вирощені і запилені або такою ж трансформованоюлінією, або іншою лінією, 28