Резистентні до імідазолінонових гербіцидів рослини соняшнику , полінуклеотиди, що кодують резистентні до гербіцидів великі субодиниці білків ацетогідроксикислотної синтази

1. Соняшникова рослина, де зазначена соняшникова рослина: (а) являє собою рослину лінії MUT28, репрезентативний зразок насіння лінії депонований в АТСС під патентним депозитарним номером РТА-6084; (b) являє собою потомство рослини лінії MUT28; 2 (19) 1 3 ний з групи, яка включає: 2-(4-ізопропіл-4-метил-5оксо-2-імідазолін-2-іл)-нікотинову кислоту, 2-(4ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-3хінолінкарбонову кислоту, 5-етил-2-(4-ізопропіл-4метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-нікотинову кислоту, 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-5(метоксиметил)-нікотинову кислоту, 2-(4-ізопропіл4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-5метилнікотинову кислоту, суміш метил-6-(4ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-мтолуату та метил-2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2імідазолін-2-іл)-п-толуату та їх комбінації. 11. Спосіб за п. 9, у якому зазначений гербіцид на основі сульфонілсечовини вибраний з групи, яка включає: хлорсульфурон, метсульфурон-метил, сульфометурон-метил, хлорімурон-етил, тіфенсульфурон-метил, трибенурон-метил, бенсульфурон-метил, нікосульфурон, етаметсульфуронметил, римсульфурон, трифлусульфурон-метил, тріасульфурон, примісульфурон-метил, циносульфурон, амідосульфурон, флазасульфурон, імазосульфурон, піразосульфурон-етил, галосульфурон та їх суміші. 12. Ізольована молекула полінуклеотиду, що містить нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з: (а) нуклеотидних послідовностей, представлених у SEQ ID NO: 1 та 5; (b) нуклеотидних послідовностей, що кодують будь-яку з амінокислотних послідовностей, представлених у SEQ ID NO: 2 та 6; та (с) нуклеотидних послідовностей, що повністю комплементарні до будь-якої однієї послідовності, представленої у (а) - (b). 13. Ізольована молекула полінуклеотиду за п. 12, де зазначений білок, кодований за допомогою нуклеотидної послідовності, додатково має амінокислотне заміщення, вибране з групи, яка включає: (а) будь-яке одне з заміщень лейцином, аланіном, треоніном, гістидином, аргініном та ізолейцином у амінокислотному положенні 182 або еквівалентному положенні до нього відносно амінокислотної послідовності, представленої у SEQ ID NO: 4; (b) заміщення треоніном у амінокислотному положенні 107 або еквівалентному положенні до нього відносно амінокислотної послідовності, представленої у SEQ ID NO: 4; (с) будь-яке з заміщень аспартатом та валіном у амінокислотному положенні 190 та еквівалентному положенні до нього відносно амінокислотної послідовності, представленої у SEQ ID NO: 4; (d) заміщення лейцином у амінокислотному положенні 559 або еквівалентному положенні до нього відносно амінокислотної послідовності, представленої у SEQ ID NO: 4; та (e) будь-яке з заміщень аспарагіном, треоніном, фенілаланіном та валіном у амінокислотному положенні 638 або еквівалентному положенні до нього відносно амінокислотної послідовності, представленої у SEQ ID NO: 4. 14. Ізольована молекула полінуклеотиду за п. 12 або 13, що додатково містить функціонально зв'язаний промотор. 15. Ізольована молекула полінуклеотиду за п. 14, у якій зазначений промотор призначений для напра 97344 4 влення експресії генів у бактерії, грибковій клітині, тваринній клітині або рослинній клітині. 16. Нелюдська клітина-хазяїн, трансформована молекулою полінуклеотиду за п. 14 або 15. 17. Клітина-хазяїн за п. 16, де зазначена клітинахазяїн вибрана з групи, що включає бактерії, грибкові клітини, тваринні клітини або рослинні клітини. 18. Трансформована соняшникова рослина, що містить стійко інкорпорований у своєму геномі полінуклеотидний конструкт, який містить молекулу полінуклеотиду за п. 12 або 13, функціонально зв'язаний з промотором, для експресії генів у рослинній клітині. 19. Трансформована рослина за п. 18, де зазначений промотор вибирають з групи, що включає конститутивні промотори та бажані для тканин промотори. 20. Трансформована рослина за п. 18 або 19, де зазначений полінуклеотидний конструкт додатково включає функціонально зв'язану послідовність, що кодує спрямований на хлоропласт пептид. 21. Трансформована рослина за будь-яким з пп. 18-20, де АНАS активність зазначеної трансформованої рослини є підвищеною у порівнянні з нетрансформованою рослиною. 22. Трансформована рослина за будь-яким з пп. 18-21, де резистентність зазначеної трансформованої рослини до принаймні одного гербіциду є підвищеною у порівнянні з нетрансформованою рослиною. 23. Трансформована рослина за будь-яким з пп. 18-22, де зазначений гербіцид являє собою гербіцид на основі імідазолінону. 24. Трансформована рослина за п. 23, де зазначений гербіцид на основі імідазолінону вибирають з групи, що включає: 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо2-імідазолін-2-іл)-нікотинову кислоту, 2-(4ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-3хінолінкарбонову кислоту, 5-етил-2-(4-ізопропіл-4метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-нікотинову кислоту, 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-5(метоксиметил)-нікотинову кислоту, 2-(4-ізопропіл4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-5метилнікотинову кислоту, суміш метил-6-(4ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-мтолуату та метил-2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2імідазолін-2-іл)-п-толуату та їх комбінації. 25. Трансформована рослина за будь-яким з пп. 18-22, де зазначений гербіцид являє собою гербіцид на основі сульфонілсечовини. 26. Трансформована рослина за п. 25, де зазначений гербіцид на основі сульфонілсечовини вибирають з групи, що включає: хлорсульфурон, метсульфурон-метил, сульфометуронметил, хлорімурон-етил, тіфенсульфурон-метил, трибенурон-метил, бенсульфурон-метил, нікосульфурон, етаметсульфурон-метил, римсульфурон, трифлусульфурон-метил, тріасульфурон, примісульфурон-метил, циносульфурон, амідосульфурон, флазасульфурон, імазосульфурон, піразосульфурон-етил, галосульфурон та їх суміші. 27. Трансформована рослина за будь-яким з пп. 18-26, де зазначена рослина являє собою насіння. 28. Спосіб одержання соняшникової рослини, що має підвищену АНАS активність, який включає 5 трансформування соняшникової рослинної клітини за допомогою полінуклеотидного конструкту, що включає полінуклеотид за п. 12 або 13, функціонально зв'язаний з промотором, для направлення експресії у соняшниковій рослинній клітині, та відновлення трансформованої соняшникової рослини з зазначеної клітини трансформованої соняшникової рослини, де AHAS активність зазначеної трансформованої рослини є підвищеною у порівнянні з нетрансформованою рослиною. 29. Спосіб за п. 28, де зазначена трансформована рослина збільшила резистентність до принаймні одного гербіциду у порівнянні з резистентністю нетрансформованої рослини до зазначеного гербіциду. 30. Спосіб за п. 28 або 29, де зазначений промотор вибирають з групи, що включає конститутивні промотори та бажані для тканин промотори. 31. Спосіб за пп. 28-30, де зазначений полінуклеотидний конструкт додатково включає функціонально зв'язану послідовність, що кодує спрямований на хлоропласт пептид. 32. Спосіб за будь-яким з пп. 28-31, де АНАS активність зазначеної трансформованої рослини є підвищеною у порівнянні з нетрансформованою рослиною. 33. Спосіб за будь-яким з пп. 28-32, де зазначений гербіцид являє собою гербіцид на основі імідазолінону. 34. Спосіб за п. 33, де зазначений гербіцид на основі імідазолінону вибирають з групи, що включає: 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)нікотинову кислоту, 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо2-імідазолін-2-іл)-3-хінолінкарбонову кислоту, 5етил-2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2іл)-нікотинову кислоту, 2-(4-ізопропіл-4-метил-5оксо-2-імідазолін-2-іл)-5-(метоксиметил)нікотинову кислоту, 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо2-імідазолін-2-іл)-5-метилнікотинову кислоту, суміш метил-6-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2імідазолін-2-іл)-м-толуату та метил-2-(4-ізопропіл4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-п-толуату та їх комбінації. 35. Спосіб за будь-яким з пп. 28-32, де зазначений гербіцид являє собою гербіцид на основі сульфонілсечовини. 36. Спосіб за п. 35, де зазначений гербіцид на основі сульфонілсечовини вибирають з групи, що включає: хлорсульфурон, метсульфурон-метил, сульфометурон-метил, хлорімурон-етил, тіфенсульфурон-метил, трибенурон-метил, бенсульфурон-метил, нікосульфурон, етаметсульфуронметил, римсульфурон, трифлусульфурон-метил, тріасульфурон, примісульфурон-метил, циносульфурон, амідосульфурон, флазасульфурон, імазосульфурон, піразосульфурон-етил, галосульфурон та їх суміші. 37. Спосіб за будь-яким з пп. 28-36, де зазначена рослинна клітина має резистентність до принаймні 97344 6 одного гербіциду перед зазначеною стадією трансформування. 38. Спосіб за будь-яким з пп. 28-36, де зазначена рослина має гербіцид-резистентний АНАSL білок перед зазначеною стадією трансформування. 39. Спосіб за п. 38, де зазначена рослина не створена методами генної інженерії для експресування зазначеного гербіцид-резистентного АНАSL білка. 40. Спосіб за п. 38, де зазначена рослина створена методами генної інженерії для експресування зазначеного гербіцид-резистентного АНАSL білка. 41. Спосіб за будь-яким з пп. 28-36, де зазначена рослина являє собою стійку до імідазолінону рослину перед зазначеною стадією трансформування. 42. Спосіб боротьби з бур'янами поблизу з трансформованою рослиною, де зазначений спосіб включає застосування ефективної кількості композиції, що містить один або декілька гербіцидів на основі імідазолінону, гербіцидів на основі сульфонілсечовини або їх суміш, до бур'янів та до трансформованої рослини, де зазначена трансформована рослина є рослиною за будь-яким з пунктів 18-30. 43. Спосіб за п. 42, де зазначений гербіцид на основі імідазолінону вибирають з групи, що включає: 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)нікотинову кислоту, 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо2-імідазолін-2-іл)-3-хінолінкарбонову кислоту, 5етил-2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2іл)-нікотинову кислоту, 2-(4-ізопропіл-4-метил-5оксо-2-імідазолін-2-іл)-5-(метоксиметил)нікотинову кислоту, 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо2-імідазолін-2-іл)-5-метилнікотинову кислоту, суміш метил-6-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2імідазолін-2-іл)-м-толуату та метил-2-(4-ізопропіл4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-п-толуату та їх комбінації. 44. Спосіб за п. 42, де зазначений гербіцид на основі сульфонілсечовини вибирають з групи, що включає: хлорсульфурон, метсульфурон-метил, сульфометурон-метил, хлорімурон-етил, тіфенсульфурон-метил, трибенурон-метил, бенсульфурон-метил, нікосульфурон, етаметсульфуронметил, римсульфурон, трифлусульфурон-метил, тріасульфурон, примісульфурон-метил, циносульфурон, амідосульфурон, флазасульфурон, імазосульфурон, піразосульфурон-етил, галосульфурон та їх суміші. 45. Ізольований поліпептид, що кодується молекулою полінуклеотиду за п. 12 або 13. 46. Насіння рослини за будь-яким з пп. 1-7 та 1826, де зазначене насіння обробляється AHASінгібуючим гербіцидом. 47. Спосіб боротьби з небажаною рослинністю, який включає приведення у контакт насіння рослини за будь-яким з пп. 1-7 та 18-26 перед посівом та/або після попереднього пророщування з АНАSінгібуючим гербіцидом. 7 Галузь застосування винаходу Даний винахід відноситься до галузі сільськогосподарської біотехнології, особливо до гербіцидрезистентних соняшникових рослин та нових полінуклеотидних послідовностей, які кодують дикого типу та імідазолінон-резистентну велику субодиницю білків ацетогідроксикислотної синтази. Передумови створення винаходу Ацетогідроксикислотна синтаза (AHAS; EC 4.1.3.18, також відома як ацетолактат-синтаза або ALS), є першим ферментом, що каталізує біохімічний синтез амінокислот з розгалуженим ланцюгом: валіну, лейцину та ізолейцину (Singh (1999) "Biosynthesis of valine, leucine and isoleucine", у Plant Amino Acid, Singh, B.K., ред., Marcel Dekker Inc. New York, New York, стор. 227-247). AHAS - це місце дії п'яти структурно різних родин гербіцидів, включаючи сульфонілсечовини (Tan та ін. (2005) Pest Manag. Sei. 61: 246-57; Mallory-Smith та Retzinger (2003) Weed Technology 17: 620-626; LaRossa та Falco (1984) Trends Biotechnol 2: 158161), імідазолінони (Shaner та ін. (1984) Plant Physiol. 76: 545-546), триазолпіримідини (Subramanian та Gerwick (1989) "Inhibition of acetolactate synthase by triazolopyrimidines", у Biocatalysis in Agricultural Biotechnology, Whitaker, J.R. та Sonnet, P.E. ред., ACS Symposium Series, American Chemical Society, Washington, D. С, стор. 277-288), піримідинілоксибензоати (Subramanian та ін. (1990) Plant Physiol. 94: 239-244) і сульфоніламіно-карбоніл-триазолінони (Tan та ін. (2005) Pest Manag. Sei. 61: 246-57; Mallory-Smith та Retzinger (2003) Weed Technology 17:620-626). Гербіциди на основі імідазолінону та сульфонілсечовини широко використовуються в сучасному сільському господарстві завдяки їхній ефективності при дуже низьких нормах дозування і відносній нетоксичності у тварин. Інгібуючи активність AHAS, ці родини гербіцидів запобігають подальшому росту і розвитку сприйнятливих до їх дії рослин, включаючи багато видів бур'янів. До кількох прикладів комерційно доступних гербіцидів на основі імідазолінону належать PURSUIT (імазетапір), SCEPTER (імазахін) і ARSENAL (імазапір). Приклади гербіцидів на основі сульфонілсечовини включають хлорсульфурон, метсульфурон метил, сульфометурон метил, хлорімурон етил, тифенсульфурон метил, трибенурон метил, бенсульфурон метил, нікосульфурон, етаметсульфурон метил, римсульфурон, трифторсульфурон метил, триасульфурон, примісульфурон метил, циносульфурон, амідосульфурон, флазасульфурон, імазосульфурон, піразосульфурон етил і галосульфурон. Через їхню високу ефективність і низьку токсичність гербіцидам на основі імідазолінону надається перевага при застосуванні шляхом розпилення на широкій області вирощування рослин. Здатність розпилювати гербіцид на широкій області вирощування рослин зменшує витрати, пов'язані зі створенням та обслуговуванням посівної площі, та зменшує потребу в підготовці ділянки до використання таких хімікалій. Розпилення поверх бажаних стійких до дії гербіцидів видів також обумовлює можливість досягти максимально можливого врожаю бажаних видів через відсутність кон 97344 8 курентних видів. Однак, здатність використовувати такі розпилювальні методи залежить від наявності резистентних до імідазолінону видів бажаних рослин в області обробки шляхом розпилення. Серед головних сільськогосподарських культур, деякі стручкові види, такі як соя, є природно стійкими до гербіцидів на основі імідазолінону через їхню здатність швидко метаболізувати сполуки гербіцидів (Shaner та Robinson (1985) Weed Sei. 33: 469-471). Інші культури, такі як зернові (Newhouse та ін. (1992) Plant Physiol. 100: 882886) і рис (Barrette та ін. (1989) Crop Safeners for Herbicides, Academic Press, New York, стор. 195220) дещо сприйнятливі до гербіцидів на основі імідазолінону. Різна чутливість до гербіцидів на основі імідазолінону залежить від хімічної природи певного конкретного гербіциду та різного метаболізму сполуки від токсичної до нетоксичної форми в кожній рослині (Shaner та ін. (1984) Plant Physiol. 76: 545-546; Brown та ін., (1987) Pestic. Biochem. Physiol. 27: 24-29). Різні фізіологічні відмінності рослин, такі як абсорбція та переміщення, також відіграють важливу роль у чутливості (Shaner та Robinson (1985) Weed Sei. 33: 469-471). Рослини, стійкі до імідазолінонів, сульфонілсечовин та триазолпіримідинів, були успішно отримані за допомогою мутагенезу насіння, мікроспор, пилку та калусу в Zea mays, Arabidopsis thaliana, Brassica napus (тобто канола) Glycine max, Nicotiana tabacum та Oryza saliva, (Sebastian та ін. (1989) Crop Sei. 29: 1403-1408; Swanson та ін., 1989 Theor. Appl. Genet. 78: 525-530; Newhouse та ін. (1991) Theor. Appl. Genet. 83: 65-70: Sathasivan та ін. (1991) Plant Physiol. 97: 10441050; Mourand та ін. (1993) J. Heredity 84: 91-96; Патент США №. 5545822). У всіх випадках, єдиний, частково домінантний ген ядра обумовлював резистентність. Чотири стійких до імідазолінону рослини пшениці були також попередньо відокремлені після мутагенезу насіння Triticum aestivum L. cv. Fidel (Newhouse та ін. (1992) Plant Physiol. 100: 882-886). Дослідження спадковості підтвердили, що єдиний, частково домінантний ген обумовлював резистентність. На підставі досліджень алелей автори прийшли до висновку, що мутації в чотирьох ідентифікованих лініях були розташовані в тому ж локусі. Один з генів резистентності культивара Фіделя був позначений як FS-4 (Newhouse та ін. (1992) Plant Physiol 100: 882-886). Рослинні популяції природного походження, що, як виявили, були резистентними до гербіцидів на основі імідазолінону та/або сульфонілсечовини, також були використані для виведення резистентних до гербіцидів селективних ліній соняшника. Нещодавно, дві лінії соняшника, які є резистентними до гербіциду на основі сульфонілсечовини, були розроблені, використовуючи зародкову плазму, яку одержують з дикої популяції соняшника звичайного (Helianthus annuus) як джерела ознаки резистентності до гербіциду (Miller та A1-Khatib (2004) Crop Sci. 44: 1037-1038). Ρ, White та ін. ((2002) Weed Sci. 50: 432-437) заявили, що окремі рослини з дикої популяції соняшника звичайного зі штату Південна Дакота, США були поперечно резистентними до гербіцидів на основі імідазолінону 9 та сульфонілсечовини. Аналіз частини кодуючої області великої субодиниці генів ацетогідроксикислотної синтази (AHASL) окремих рослин з цієї популяції виявив точкову мутацію, що приводить до амінокислотного заміщення А1а-на-Val у соняшниковому AHASL білку, що відповідає А1а205 у AHASL білку Arabidopsis thaliana дикого типу (White та ін. (2003) Weed Sci. 51: 845-853). Комп'ютерне моделювання тривимірної конформації комплексу AHAS - інгібітор передбачає кілька амінокислот у запропонованій кишені зв'язування інгібітору як сайти, де спричинені мутації ймовірно обумовили б селективну резистентність до імідазолінонів (Ott та ін. (1996) J. Mol. Biol. 263: 359-368). Рослини пшениці, отримані за допомогою деяких із цих раціонально розроблених мутацій у запропонованих сайтах зв'язування ферменту AHAS фактично продемонстрували специфічну резистентність до окремого класу гербіцидів (Ott і ін. (1996) J. Mol. Biol. 263: 359-368). Про резистентність рослин до гербіцидів на основі імідазолінону також повідомлялось в низці патентів. В Патентах США №№ 4761373, 5331107, 5304732, 6211438, 6211439 і 6222100, як правило, описується використання зміненого гена AHAS, щоб викликати резистентність до гербіцидів у рослин, і, зокрема, розкриваються певні стійкі до імідазолінону лінії зернових. В Патенті США № 5013659 описуються рослини, що виявляють резистентність до гербіцидів внаслідок мутацій принаймні в одній амінокислоті в одній або більше консервативних ділянках. Мутації, описані в ньому, кодують або поперечну резистентність для імідазолінонів і сульфонілсечовин або специфічну резистентність до сульфонілсечовин, але специфічна резистентність до імідазолінону не описана. Крім того, в Патенті США № 5731180 і Патенті США № 5767361 обговорюється ізольований ген, що має єдину заміну амінокислоти в амінокислотній послідовності AHAS дикого типу, що призводить до імідазолінон-специфічної резистентності. Крім того, рослини рису, які є резистентними до гербіцидів, які перешкоджають AHAS, були виведені шляхом селекціонування мутаціями і також шляхом відбору резистентних до гербіцидів рослин з сукупності рисових рослин, одержаних шляхом культивування пильників. Дивись, Патенти США № 5545822, 5736629, 5773703, 5773704, 5952553 та 6274796. У рослин, як у всіх інших досліджуваних організмах, фермент AHAS складається із двох субодиниць: великої субодиниці (каталітична роль) і малої субодиниці (регуляторна роль) (Duggleby та Pang (2000) J. Biochem. Mol. Biol. 33: 1-36). AHAS велика субодиниця (також відома під назвою AHASL) може бути закодована єдиним геном як у випадку Arabidopsis та рису або багатьма членами генної родини як у кукурудзі, канолі та бавовнику. Специфічні заміни одного нуклеотиду у великій субодиниці надають ферменту ступінь нечутливості до одного або кількох класів гербіцидів (Chang та Duggleby (1998) Biochem J. 333: 765-777). Наприклад, пшениця звичайна, Triticum aestivum L., містить три гомологічних гени великої субодиниці ацетогідроксикислотної синтази. Кожен 97344 10 з генів виявляє значну експресію, засновану на відповіді гербіциду та біохімічних даних від мутантів у кожному із цих трьох генів (Ascenzi та ін. (2003) International Society of Plant Molecular Biologists Congress, Barcelona, Spain, Ref. No. S1017). Кодуючі послідовності всіх трьох генів поділяють велику гомологічність на нуклеотидному рівні (WO 03/014357). Шляхом секвенування генів AHASL від декількох різновидів Triticum aestivum молекулярною основою стійкості до гербіцидів в більшості ІМІ-стійких (імідазолінон-стійких) лініях, як встановлено, виявилась мутація S653(At)N, включаючи заміну серіну на аспарагін у положенні, еквівалентному серіну при амінокислоті 653 у Arabidopsis thaliana (WO 03/014356; WO 03/014357). Ця мутація відбувається внаслідок поліморфізму одного нуклеотиду (SNP - single nucleotide polymorphism) у послідовності ДНК, що кодує білок AHASL. Приймаючи до уваги їх високу ефективність та низьку токсичність, гербіциди на основі імідазолінону є кращими для застосування у сільському господарстві. Однак, можливість використовувати гербіциди на основі імідазолінону у певній системі вирощування сільськогосподарських культур залежить від наявності імідазолінон-резистентних видів зазначеної сільськогосподарської рослини. Для одержання таких імідазолінон-резистентних видів, селекціонери рослин повинні виводити селекційні лінії з імідазолiнон-резистентною властивістю. Таким чином, необхідні додаткові імідазолінон-резистентні селекційні лінії та види сільськогосподарських рослин, також як і способи та композиції для одержання та застосування імідазолінон-резистентних селекційних ліній та видів. Короткий опис винаходу Даний винахід забезпечує соняшникові рослини, що мають підвищену резистентність до гербіцидів у порівнянні з соняшниковою рослиною дикого типу. Зокрема, соняшникові рослини даного винаходу мають підвищену резистентність до принаймні одного гербіциду, що перешкоджає активності AHAS ферменту у порівнянні з соняшниковою рослиною дикого типу. Резистентні до гербіцидів соняшникові рослини даного винаходу включають принаймні одну копію гену або полінуклеотиду, що кодує гербіцид-резистентну велику субодиницю 1 ацетогідроксикислотної синтази (AHASL1). Такий гербіцид-резистентний AHASL1 білок включає лейцин, аланін, треонін, гістидин, аргінін, або ізолейцин у амінокислотному положенні 182 або еквівалентному положенні. Резистентні до гербіцидів соняшникові рослини даного винаходу можуть включати одну, дві, три, чотири або більше копій гену або полінуклеотиду, що кодує гербіцид-резистентний AHASL1 білок даного винаходу. Соняшникові рослини даного винаходу також включають насіння та потомствені рослини, які включають принаймні одну копію гену або полінуклеотиду, що кодує гербіцид-резистентний AHASL1 білок даного винаходу. У одному втіленні, даний винахід забезпечує гербіцид-резистентні соняшникові рослини, які походять з соняшникової лінії, яка виведена як MUT28. Зразок насіння MUT28 лінії був відданий 11 на зберігання у Американську колекцію типових культур (American Type Culture Collection - АТСС) як патентний депозитарний номер АТСС (АТСС Patent Deposit Number) № РТА-6084. Такі MUT28 соняшникові рослини містять у їх геномах AHASL1 ген, який включає нуклеотидну послідовність, представлену у SEQ ID №: 1, та який кодує AHASL1 білок, що включає амінокислотну послідовність, представлену у SEQ ID №: 2. У порівнянні з амінокислотною послідовністю AHASL1 білку (SEQ ID №: 4), яка кодується AHASL1 геном (SEQ ID №: 3) з дикої соняшникової рослини, амінокислотна послідовність, представлена у SEQ ID №: 2, має одну амінокислотну відмінність від амінокислотної послідовності дикого типу. У амінокислотній послідовності, представленій у SEQ ID №: 2, лейцин знаходиться у амінокислотному положенні 182. У амінокислотній послідовності дикого типу, представленій у SEQ ID №: 4, це саме амінокислотне положення має пролін. Більш того, даний винахід забезпечує виділені полінуклеотиди та виділені поліпептиди для соняшникових (Helianthus annuus) AHASL1 білків. Полінуклеотиди даного винаходу охоплюють нуклеотидні послідовності, які кодують гербіцидрезистентний та дикого типу AHASL1 білки. Гербіцид-резистентні AHASL1 білки даного винаходу являють собою гербіцид-резистентні AHASL1 білки, які мають заміну проліну на лейцин у положенні 182 у їх відповідних амінокислотних послідовностях, у порівнянні з відповідною амінокислотною послідовністю дикого типу. Полінуклеотиди даного винаходу охоплюють нуклеотидні послідовності, представлені у SEQ ID №№: 1 та 3, нуклеотидні послідовності, що кодують амінокислотні послідовності, представлені у SEQ ID №№: 2 та 4, та фрагменти та варіанти зазначених нуклеотидних послідовностей, що кодують білки, які включають AHAS активність. Крім того, полінуклеотиди даного винаходу включають нуклеотидні послідовності, які кодують зрілі форми AHASL1 білків, описані вище, особливо послідовності нуклеотидів SEQ ID №№: 5 та 7, нуклеотидні послідовності, які кодують амінокислотні послідовності, представлені у SEQ ID №№: 6 та 8, та фрагменти та варіанти зазначених нуклеотидних послідовностей, що кодують білки, які включають AHAS активність. У таких зрілих формах AHASL1 білків не вистачає транзитного пептиду хлоропласту, який є частиною повнорозмірних AHASL1 білків. Даний винахід пропонує касети експресії для експресії полінуклеотидів відповідно до винаходу у рослинах, рослинних клітинах та інших не людських клітинах-хазяїнах. Касети експресії містять промотор, що може експресуватися у рослині, рослинній клітині або інших клітинах-хазяїна, що розглядаються, функціонально зв'язаний з молекулою полінуклеотиду відповідно до винаходу, що кодує білок AHASL дикого типу або стійкий до імідазолінону білок AHASL. У разі необхідності для спрямування експресії на хлоропласт, касета експресії може також містити функціонально зв'язану спрямовану на хлоропласт послідовність, що кодує транзитний пептид хлоропласту, щоб спрямувати експресований білок AHASL1 на хлоропласт. Ка 97344 12 сети експресії відповідно до винаходу знаходять використання в способі для підвищення стійкості до гербіциду рослини та клітини-хазяїна. Зазначений спосіб включає трансформування рослини або клітини-хазяїна за допомогою касети експресії відповідно до винаходу, причому касета експресії містить промотор, що може експресуватися у рослині або клітині-хазяїні, що розглядається, і промотор функціонально зв'язаний із полінуклеотидом відповідно до винаходу, що кодує стійкий до гербіцидів білок AHASL1 даного винаходу. Зазначений спосіб додатково включає відновлення трансформованої рослини з трансформованої рослинної клітини. Даний винахід забезпечує спосіб підвищення AHAS активності у рослині, що включає трансформування рослинної клітини за допомогою полінуклеотидної конструкції, що включає нуклеотидну послідовність, функціонально зв'язану з промотором, який запускає експресію у рослинній клітині, та відновлення трансформованої рослини з трансформованої рослинної клітини. Нуклеотидну послідовність вибирають з тих нуклеотидних послідовностей, які кодують гербіцид-резистентний або дикий AHASL1 білки даного винаходу, особливо нуклеотидні послідовності, представлені у SEQ ID №№: 1, 3, 5 та 7, нуклеотидні послідовності, які кодують амінокислотні послідовності, представлені у SEQ ID №№: 2, 4, 6 та 8, та їх фрагменти та варіанти. Рослина, одержана за цим способом, має підвищену AHAS активність у порівнянні з нетрансформованою рослиною. Даний винахід забезпечує спосіб одержання резистентної до гербіциду рослини, що включає трансформування рослинної клітини за допомогою полінуклеотидної конструкції, що включає нуклеотидну послідовність, функціонально зв'язану з промотором, який керує експресією у рослинній клітині, та відновлення трансформованої рослини з трансформованої рослинної клітини. Нуклеотидну послідовність вибирають з тих нуклеотидних послідовностей, які кодують гербіцидрезистентний або дикий AHASL1 білки даного винаходу, особливо нуклеотидні послідовності, представлені у SEQ ID №№: 1 та 5, нуклеотидні послідовності, які кодують амінокислотні послідовності, представлені у SEQ ID №№: 2 та 6, та їх фрагменти та варіанти, включаючи, але не обмежуючись наведеними, зрілі форми резистентних до гербіциду AHASL1 білків даного винаходу. Резистентна до гербіциду рослина, одержана за цим способом, має підвищену резистентність, у порівнянні з нетрансформованою рослиною, до принаймні одного гербіциду, особливо гербіциду, який перешкоджає активності AHAS ферменту, такого як, наприклад, гербіцид на основі імідазолінону або гербіцид на основі сульфонілсечовини. Даний винахід забезпечує спосіб підвищення стійкості до гербіцидів у стійкої до гербіцидів рослини. Зазначений спосіб знаходить своє застосування у підвищенні резистентності рослини, яка вже є резистентною до рівня гербіциду, який би знищив або значно уразив рослину дикого типу. Така стійка до гербіцидів рослина може являти собою стійку до гербіцидів рослину, яка була ство 13 рена методами генетичної інженерії для стійкості до гербіцидів, або стійку до гербіцидів рослину, яка була розроблена за допомогою методів, які не залучають рекомбінантну ДНК, таку як, наприклад, MUT28 соняшникові рослини даного винаходу. Зазначений спосіб включає трансформування стійкої до гербіцидів рослини за допомогою полінуклеотидної конструкції, що включає нуклеотидну послідовність, функціонально зв'язану з промотором, який запускає експресію у рослинній клітині, та відновлення трансформованої рослини з трансформованої рослинної клітини. Нуклеотидну послідовність вибирають з тих нуклеотидних послідовностей, які кодують гербіцид-резистентні AHASL1 білки даного винаходу, особливо нуклеотидні послідовності, представлені у SEQ ID №: 1 та 5, нуклеотидні послідовності, які кодують амінокислотні послідовності, представлені у SEQ ID №: 2 та 6, та їх фрагменти та варіанти. Даний винахід пропонує вектори трансформації, що містять обираний ген-маркер відповідно до даного винаходу. Обираний ген-маркер містить промотор, що запускає експресію в клітині-хазяїні, функціонально зв'язаний із полінуклеотидом, що включає нуклеотидну послідовність, яка кодує резистентний до гербіцидів AHASL1 білок відповідно до винаходу. Вектор трансформації може додатково містити ген, який розглядається, що буде експресуватися у клітині-хазяїні, і може також, за бажанням, включати спрямовану на хлоропласт послідовність, що є функціонально зв'язаною із полінуклеотидом відповідно до винаходу. Крім того, даний винахід пропонує методи для використання векторів трансформації відповідно до винаходу для вибору клітин, трансформованих за допомогою гену, що розглядається. Такі методи включають трансформування клітини-хазяїна за допомогою вектора трансформації шляхом дії на клітину того рівня кількості гербіциду на основі імідазолінону або гербіциду на основі сульфонілсечовини, що зруйнувала б або інгібувала би ріст нетрансформованої клітини-хазяїна, і шляхом ідентифікації трансформованої клітини-хазяїна за її здатністю рости в присутності гербіциду. У одному втіленні даного винаходу, клітина-хазяїн - це рослинна клітина, і обираний ген-маркер містить промотор, що запускає експресію в рослинній клітині. Даний винахід пропонує спосіб для контролю бур'янів поблизу з резистентними до гербіцидів рослинами даного винаходу, включаючи гербіцидрезистентні соняшникові рослини, описані вище, та рослини, трансформовані за допомогою гербіцид-резистентних AHASL1 полінуклеотидів даного винаходу. Такі трансформовані рослини містять в своїх геномах принаймні одну касету експресії, що включає промотор, який запускає експресію гену у рослинній клітині, причому промотор функціонально зв'язаний з полінуклеотидом AHASL1 відповідно до винаходу. Зазначений спосіб включає застосування ефективної кількості гербіциду до бур'янів і до резистентної до гербіцидів рослини, причому резистентна до гербіцидів рослина, рослина має підвищену резистентність принаймні до одного гербіциду, особливо гербіциду на основі імідазолінону або гербіциду на основі сульфонілсечовини в 97344 14 порівнянні з дикою або нетрансформованою рослиною. Рослини даного винаходу можуть бути трансгенними або нетрансгенними. Приклад нетрансгенної соняшникової рослини, що має підвищену резистентність до гербіцидів на основі імідазолінону та/або гербіцидів на основі сульфонілсечовини, включає соняшникову рослину (MUT28), що має патентний депозитарний АТСС № РТА-6084; або мутантну, рекомбінантну або генетично модифіковану похідну рослини, що має патентний депозитарний АТСС № РТА-6084; або будь-якого потомства рослини, що має патентний депозитарний АТСС № РТА-6084; або рослину, яка є потомством будь-якої з цих рослин; або рослину, яка має характеристики гербіцидної резистентності рослини, що має патентний депозитарний АТСС № РТА-6084. Даний винахід також пропонує рослини, рослинні органи, рослинні тканини, рослинні клітини, насіння і не людські клітини-хазяїни, які трансформовані принаймні за допомогою одного полінуклеотиду, касети експресії або вектору трансформації відповідно до винаходу. Такі трансформовані рослини, рослинні органи, рослинні тканини, рослинні клітини, насіння і нелюдські клітини-хазяїни мають підвищену стійкість або резистентність до принаймні одного гербіциду, на рівнях гербіцидів, які руйнують або інгнібують ріст нетрансформованої рослини, рослинної тканини, рослинної клітини або не людської клітини-хазяїна, відповідно. Бажано, щоб трансформовані рослини, рослинні тканини, рослинні клітини і насіння відповідно до винаходу представляли собою Arabidopsis thaliana і сільськогосподарські рослини. Крім того, даний винахід забезпечує виділені поліпептиди, що включають імідазолінонрезистентний та дикого типу соняшникові AHASL1 білки. Виділені поліпептиди включають амінокислотні послідовності, представлені у SEQ ID №№: 2 та 4, амінокислотні послідовності, кодовані нуклеотидними послідовностями, представленими у SEQ ID №№: 1 та 3, та фрагменти та варіанти зазначених амінокислотних послідовностей, які кодують білки, що мають AHAS активність, включаючи, але не обмежуючись наведеними, зрілі форми AHASL1 білків даного винаходу, які представлені у SEQ ID №№: 6 та 8 та ті, які кодовані нуклеотидними послідовностями, представленими у SEQ ID №№: 5 та 7. Короткий опис малюнків На Фігурі 1 показана вирівняна нуклеотидна послідовність повних кодуючих ділянок резистентного до гербіцидів соняшникового AHASL1 гену (SEQ ID №: 1), дикого соняшникового AHASL1 гену (SEQ ID №: 3) та резистентного до гербіцидів AHASL1 гену з Xanthium sp. (SEQ ID №: 9, GenBank Accession No. U16280). На зазначеній фігурі, 1248-3, HA89, та Xanthium відноситься до SEQ ID №№: 1, 3, та 9, відповідно. Зірочка показує сайт однієї мутації, знайденої у резистентній до гербіцидів соняшниковій AHASL1 кодуючій послідовності. Мутація являє собою транзицію С-на-Т у нуклеотиді 545 (кодон 182) SEQ ID №: 1. Області ненасиченого кольору показують, що нуклеотид у 15 тому положенні збережений по всіх трьох вирівняних послідовностях. Області насиченого кольору показують, що нуклеотид у тому положенні збережений у двох з трьох послідовностей. На Фігурі 2 показана вирівнена амінокислотна послідовність гербіцид-резистентного соняшникового AHASL1 білку (SEQ ID №: 2), дикого соняшникового AHASL1 білку (SEQ ID №: 4) та резистентного до гербіцидів AHASL1 білку з Xanthium sp. (SEQ ID №: 10, GenBank Accession No. U16280). На зазначеній фігурі, 1248-3, HA89, та Xanthium відноситься до SEQ ID №№: 2, 4, та 10, відповідно. Зірочка показує сайт однієї амінокислотної заміни, знайденої у резистентному до гербіцидів соняшниковому AHASL1 білку. У резистентному до гербіцидів білку (SEQ ID №: 2) пролін з номером амінокислоти 182 дикого білку (SEQ ID №: 4) замінено на лейцин. Області ненасиченого кольору показують, що амінокислота у тому положенні збережена по всіх трьох вирівняних послідовностях. Області насиченого кольору показують, що амінокислота у тому положенні збережена у двох з трьох послідовностей. Амінокислоти, представлені жирним шрифтом, показують консервативні амінокислотні заміни. Список послідовностей Нуклеотидні та амінокислотні послідовності, перелічені в списку послідовностей, що прикладається, вказані з використанням стандартних літерних скорочень для нуклеотидних основ і трилітерного коду для амінокислот. При зображенні нуклеотидних послідовностей дотримуються стандартного методу, за яким початок знаходиться на 5' кінці послідовності та далі рухаються вперед (тобто, зліва направо у кожній лінії) до 3' кінця. Показаний тільки один ланцюг кожної послідовності нуклеїнових кислот, проте комплементарний ланцюг, як зрозуміло, включається за будь-яким посиланням на вказаний ланцюг. При зображенні амінокислотних послідовностей дотримуються стандартного методу, за яким початок знаходиться на кінці послідовності з аміногрупою, та далі рухаються вперед (тобто, зліва направо у кожній лінії) до кінця з карбоксигрупою. SEQ ID №: 1 являє собою нуклеотидну послідовність, що кодує резистентний до гербіцидів AHASL1 білок з соняшника. У порівнянні з GenBank Accession No. U16280, зріла форма AHASL1 білку кодується нуклеотидною послідовністю, що відповідає нуклеотидам 253-1965 SEQ ID №: 1, та транзитний пептид кодується нуклеотидами 1-252. SEQ ID №: 2 являє собою амінокислотну послідовність резистентного до гербіцидів AHASL1 білку з соняшника. У порівнянні з GenBank Accession No. U16280, амінокислотна послідовність зрілої форми AHASL1 білку відповідає амінокислотам 85-655 SEQ ID №: 2, та транзитний пептид відповідає амінокислотам 1-84. SEQ ID №: 3 являє собою нуклеотидну послідовність, що кодує AHASL1 білок з соняшника. У порівнянні з GenBank Accession No. U16280, зріла форма AHASL1 білку кодується нуклеотидною послідовністю, що відповідає нуклеотидам 253 97344 16 1965 SEQ ID №: 3, та транзитний пептид кодується нуклеотидами 1-252. SEQ ID №: 4 являє собою амінокислотну послідовність AHASL1 білку з соняшника. У порівнянні з GenBank Accession No. U16280, амінокислотна послідовність зрілої форми AHASL1 білку відповідає амінокислотам 85-655 SEQ ID №: 4, та транзитний пептид відповідає амінокислотам 1-84. SEQ ID №: 5 являє собою нуклеотидну послідовність, що кодує зрілий, резистентний до гербіцидів AHASL1 білок з соняшника. Зазначена нуклеотидна послідовність відповідає нуклеотидам 253-1965 SEQ ID №: 1. SEQ ID №: 6 являє собою амінокислотну послідовність зрілого, резистентного до гербіцидів AHASL1 білку з соняшника. Зазначена амінокислотна послідовність відповідає амінокислотам 85-655 SEQ ID №: 2. SEQ ID №: 7 являє собою нуклеотидну послідовність, що кодує зрілий AHASL1 білок з соняшника. Зазначена нуклеотидна послідовність відповідає нуклеотидам 253-1965 SEQ ID №: 3. SEQ ID №: 8 являє собою амінокислотну послідовність зрілого AHASL1 білку з соняшника. Зазначена амінокислотна послідовність відповідає амінокислотам 85-655 SEQ ID №: 4. SEQ ID №: 9 являє собою нуклеотидну послідовність GenBank Accession No. U16280. SEQ ID №: 10 являє собою амінокислотну послідовність GenBank Accession No. U16280. SEQ ID №: 11 являє собою нуклеотидну послідовність ALS1-1F праймеру, який описаний у Прикладі 2. SEQ ID №: 12 являє собою нуклеотидну послідовність ALS1-1R праймеру, який описаний у Прикладі 2. SEQ ID №: 13 являє собою нуклеотидну послідовність ALS1-2F праймеру, який описаний у Прикладі 2. SEQ ID №: 14 являє собою нуклеотидну послідовність ALS1-2R праймеру, який описаний у Прикладі 2. SEQ ID №: 15 являє собою нуклеотидну послідовність ALS1-3F праймеру, який описаний у Прикладі 2. SEQ ID №: 16 являє собою нуклеотидну послідовність ALS1-3R праймеру, який описаний у Прикладі 2. SEQ ID №: 17 являє собою нуклеотидну послідовність ALS-3F праймеру, який описаний у Прикладі 2. SEQ ID №: 18 являє собою нуклеотидну послідовність SUNALS1F праймеру, який описаний у Прикладі 2. SEQ ID №: 19 являє собою нуклеотидну послідовність ALS-6R праймеру, який описаний у Прикладі 2. Детальний опис винаходу Даний винахід стосується соняшникових рослин, що мають підвищену резистентність до гербіцидів у порівнянні з соняшниковою рослиною дикого типу. Резистентні до гербіцидів соняшникові рослини одержують, як описано у цьому описі нижче, шляхом піддавання соняшникових рослин дикого типу (що стосується резистентності до гер 17 біцидів) дії мутагену, дозволяючи рослинам дозріти та розмножитися, та вибираючи потомствені рослини, які показали підвищену резистентність до гербіциду на основі імідазолінону, у порівнянні з резистентністю соняшникової рослини дикого типу. Даний винахід забезпечує резистентну до гербіцидів соняшникову лінію, яка у цьому описі називається як MUT28. З MUT28 гербіцид-резистентних соняшникових рослин та соняшникових рослин дикого типу, кодуючу ділянку великої субодиниці гену ацетогідроксикислотної синтази (що позначається як AHASL1) виділяють за допомогою ампліфікації шляхом полімерної ланцюгової реакції (PCR) та секвенують. Шляхом порівняння полінуклеотидних послідовностей резистентних до гербіцидів та дикого типу соняшникових рослин, було відкрито, що кодуюча ділянка AHASL1 полінуклеотидної послідовності з резистентної до гербіцидів соняшникової рослини відрізнялася від AHASL1 полінуклеотидної послідовності рослини дикого типу на один нуклеотид, транзиція С на Τ у нуклеотиді 545 (Фігура 1). Зазначена транзиція С на Τ у AHASL1 полінуклеотидній послідовності приводить до заміни Pro на Leu у амінокислоті 182 у консервативній ділянці передбаченої амінокислотної послідовності AHASL1 білку, у порівнянні з амінокислотною послідовністю AHASL1 білку дикого типу (Фігура 2). Відомий цілий ряд амінокислотних заміщень для проліну у зазначеній консервативній ділянці рослинних AHASL білків, включаючи заміну Pro на Leu, для того, щоб надати рослині, яка включє такий AHASL білок, резистентність до гербіцидів на основі імідазолінону та/або сульфонілсечовини. Дивись, Boutsalis та ін. (1999) Pestic. Sci. 55: 507516; Guttieri та ін. (1992) Weed Sci. 40: 670-678; Guttieri та ін. (1995) Weed Sci. 43: 143-178; та Патент США № 5141870; всі з яких включені у даний опис шляхом посилання. Дивись також, Приклад 3, представлений нижче. Як використано у цьому описі, поки не зазначено інше або зрозуміло з контексту, термін "рослина" включає, не обмежуючись наведеними, рослинні клітини, рослинні протопласти, культури клітин тканин рослини, з яких рослини можуть бути відновлені, рослинні калі, рослинні групи, рослинні клітини, які є інтактними у рослинах, або частини рослин, такі як, наприклад, зав'язі, пилок, сім'язачатки, насіння, сім'ядолі, листя, стеблини, квітки, гілки, черешки, фрукт, коріння, кінцівки коріння, пильовики, та подібні. Крім того, даний винахід відноситься до виділених полінуклеотидних молекул, що включають нуклеотидні послідовності, які кодують велику субодиницю білків ацетогідроксикислотної синтази (AHASL) та до таких AHASL білків. Даний винахід розкриває виділення та нуклеотидну послідовність полінуклеотиду, що кодує резистентний до гербіцидів соняшниковий AHASL1 білок з резистентної до гербіцидів соняшникової рослини, яку одержують шляхом хімічного мутагенезу соняшникових рослин дикого типу. Резистентні до гербіцидів AHASL1 білки даного винаходу мають заміщення проліну на лейцин у положенні 182 у їх відповідних амінокислотних послідовностях у порівнянні з відповідною амінокислотною 97344 18 послідовністю дикого типу. Більш того, даний винахід розкриває виділення та нуклеотидну послідовність полінуклеотидної молекули, що кодує дикого типу соняшниковий AHASL1 білок. Даний винахід забезпечує виділені полінуклеотидні молекули, які кодують AHASL1 білки з соняшника (Helianthus annum L.). Зокрема, даний винахід забезпечує виділені полінуклеотидні молекули, що включають: нуклеотидні послідовності, представлені у SEQ ID №№: 1 та 3, нуклеотидні послідовності, що кодують AHASL1 білки, які включають амінокислотні послідовності, представлені у SEQ ID №№: 2 та 4, та фрагменти та варіанти таких нуклеотидних послідовностей, що кодують функціональні AHASL1 білки. Крім того, даний винахід забезпечує виділені полінуклеотиди, що кодують зрілі AHASL1 білки. У зазначених зрілих AHASL1 білках даного винаходу не вистачає транзитного пептиду хлоропласту, який знайдений на N-кінці кожного з AHASL1 білків, але вони зберігають AHAS активність. В особливості, полінуклеотиди даного винаходу включають нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що включає нуклеотидні послідовності, представлені у SEQ ID №№: 5 та 7, нуклеотидні послідовності, що кодують амінокислотні послідовності, представлені у SEQ ID №№: 6 та 8, та фрагменти та варіанти цих нуклеотидних послідовностей, які кодують зрілий AHASL1 поліпептид, що має AHAS активність. Виділені резистентні до гербіцидів AHASL1 полінуклеотидні молекули даного винаходу включають нуклеотидні послідовності, які кодують резистентні до гербіцидів AHASL1 білки. Такі полінуклеотидні молекули можуть бути використані у полінуклеотидних конструкціях для перетворення рослин, особливо сільськогосподарських рослин, для підвищення резистентності зазначених рослин до гербіцидів, зокрема гербіцидів, що, як відомо, інгібують AHAS активність, більш особливо гербіцидів на основі імідазолінону. Такі полінуклеотидні конструкції можуть бути використані у касетах експресії, векторах експресії, векторах трансформації, плазмідах та подібних. Трансгенні рослини, одержанні після трансформації за допомогою таких полінуклеотидних конструкцій, показують підвищену резистентність до AHAS-інгібуючих гербіцидів, таких як, наприклад, гербіциди на основі імідазолінону та гербіциди на основі сульфонілсечовини. Композиції даного винаходу включають нуклеотидні послідовності, які кодують AHASL1 білки. Зокрема, даний винахід забезпечує виділені полінуклеотидні молекули, що включають нуклеотидні послідовності, які кодують амінокислотні послідовності, показані у SEQ ID №№: 2, 4, 6 та 8, та їх фрагменти та варіанти, які кодують поліпептиди, якi мають AHAS активність. Додатково забезпечені поліпептиди, що мають амінокислотну послідовність, що кодується полінуклеотидною молекулою, описаною у цьому описі, наприклад, таку, що представлена у SEQ ID №№: 1, 3, 5 та 7, та їх фрагменти та варіанти, які кодують поліпептиди, що мають AHAS активність. Винахід охоплює виділені або значно очищені сполуки нуклеїнових кислот або білків. "Ізольова 19 на" або "очищена" полінуклеотидна молекула або білок, або їх біологічно активна частина, значно або суттєво вільна від компонентів, які звичайно супроводжують або взаємодіють із полінуклеотидною молекулою або білком в їх навколишньому природному середовищі. Таким чином, ізольована або очищена полінуклеотидна молекула або білок є значною мірою вільні від іншого клітинного матеріалу, або поживного середовища у випадку отримання за допомогою рекомбінантних методів, або значною мірою вільні від хімічних прекурсорів або інших хімічних сполук при хімічному синтезі. Бажано, щоб "ізольована" нуклеїнова кислота була вільною від послідовностей (бажано послідовностей, що кодують білок), що природно оточують нуклеїнову кислоту (тобто, послідовності, розташовані на 5' і 3' кінцях нуклеїнової кислоти) у геномній ДНК організму, з якого отримана нуклеїнова кислота. Наприклад, у різних варіантах втілення ізольована полінуклеотидна молекула може містити приблизно менше ніж 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb або 0,1 kb нуклеотидних послідовностей, які природно оточують полінуклеотидну молекулу в геномній ДНК клітини, з якої отримана нуклеїнова кислота. Білок, що є значною мірою вільним від клітинного матеріалу, включає препарати білку, що містять приблизно менше ніж 30%, 20%, 10%, 5% або 1% (за сухою масою) контамінуючого білку. При отриманні білку відповідно до винаходу або його біологічно активної частини за допомогою рекомбінантних методів, бажано, щоб поживне середовище містило приблизно менше ніж 30%, 20%, 10%, 5% або 1% (за сухою масою) хімічних прекурсорів або хімічних сполук, що "не є білком, який розглядається". Даний винахід забезпечує ізольовані поліпептиди, що включають AHASL1 білки. Ізольовані поліпептиди включають амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з амінокислотних послідовностей, представлених у SEQ ID №№: 2 та 4, амінокислотних послідовностей, що кодуються нуклеотидними послідовностями, представленими у SEQ ID №№: 1 та 3, та функціональні фрагменти та варіанти зазначених амінокислотних послідовностей, які кодують AHASL1 поліпептид, що має AHAS активність. Під "функціональними фрагментами та варіантами" розуміють фрагменти та варіанти показаних поліпептидів, що мають AHAS активність. Додатково забезпечуються ізольовані поліпептиди, що містять зрілі форми AHASL1 білків даного винаходу. Такі ізольовані поліпептиди включають амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що включає амінокислотні послідовності, представлені у SEQ ID №№: 6 та 8, амінокислотні послідовності, що кодуються нуклеотидними послідовностями, представленими у SEQ ID №№: 5 та 7, та функціональні фрагменти та варіанти зазначених амінокислотних послідовностей, які кодують поліпептиди, що мають AHAS активність. У певних втіленнях даного винаходу, способи включають застосування стійких до гербіцидів або резистентних до гербіцидів рослин. Під терміном "стійка до гербіцидів" або "резистентна до гербіцидів" рослина, слід розуміти рослину, яка є стійкою або резис 97344 20 тентною до принаймні одного гербіциду на рівні, який зазвичай зруйнував би або припиняв би ріст, нормальної або дикої рослини. У одному втіленні даного винаходу, стійкі до гербіцидів рослини даного винаходу включають стійкий до гербіцидів або резистентний до гербіцидів AHASL білок. Під терміном "стійкий до гербіцидів AHASL білок" або "резистентний до гербіцидів AHASL білок", слід розуміти, що такий AHASL білок показує більш високу AHAS активність у порівнянні з AHAS активністю дикого AHASL білку, у присутності принаймні одного гербіциду, що, як відомо, заважає AHAS активності, та при концентрації або рівні гербіциду, що, як відомо, інгібує AHAS активність AHASL білку дикого типу. Більш того, AHAS активність такого стійкого до гербіцидів або резистентного до гербіцидів AHASL білку може називатися у цьому описі як "стійка до гербіцидів" або "резистентна до гербіцидів" AHAS активність. Для даного винаходу, терміни "стійка до гербіцидів" та "резистентна до гербіцидів" використовуються взаємозамінно та, як передбачається, мають еквівалентне значення та еквівалентну область. Аналогічно, терміни "стійкість до гербіцидів" та "резистентність до гербіцидів" використовуються взаємозамінно та, як передбачається, мають еквівалентне значення та еквівалентну область. Подібним чином, терміни "імідазолінонрезистентний", "резистентний до імідазолінону" та "резистентність до імідазолінону" використовуються взаємозамінно та, як передбачається, мають еквівалентне значення та еквівалентну область, що і терміни "імідазолінон-стійкий", "стійкий до імідазолінону" та "стійкість до імідазолінону", відповідно. Даний винахід охоплює резистентні до гербіцидів AHASL1 полінуклеотиди та резистентні до гербіцидів AHASL1 білки. Під терміном "резистентний до гербіцидів AHASL1 полінуклеотид" слід розуміти полінуклеотид, який кодує білок, що має гербіцид-резистентну AHAS активність. Під терміном "резистентний до гербіцидів AHASL1 білок" слід розуміти білок або полінуклеотид, який має гербіцид-резистентну AHAS активність. Більш того, визнано, що стійкий до гербіцидів або резистентний до гербіцидів AHASL білок може бути введений у рослину шляхом трансформування рослини або її попередника за допомогою нуклеотидної послідовності, що кодує стійкий до гербіцидів або резистентний до гербіцидів AHASL білок. Такі стійкі до гербіцидів або резистентні до гербіцидів AHASL білки кодуються стійкими до гербіцидів або резистентними до гербіцидів AHASL полінуклеотидами. Альтернативно, стійкий до гербіцидів або резистентний до гербіцидів AHASL білок може зустрічатися у рослині як результат природного походження або може бути викликаний мутацією у ендогенному AHASL гені у геномі рослини або її попередника. Даний винахід забезпечує рослини, рослинні тканини, рослинні клітини та клітин-хазяїнів підвищеною резистентністю або стійкістю до принаймні одного гербіциду, особливо гербіциду, що заважає активності AHAS ферменту, більш особливо гербіциду на основі імідазолінону або сульфонілсечо 21 вини. Кількість або концентрація гербіциду, якій надається перевага, є "ефективною кількістю" або "ефективною концентрацією". Під терміном "ефективна кількість" і "ефективна концентрація" мається на увазі кількість і концентрація, відповідно, яка є достатньою для того, щоб знищити або інгібувати ріст подібної, нетрансформованої, рослини, рослинної клітини або клітини-хазяїна, але вказана кількість не знищує або не інгібує значною мірою ріст гербіцид-резистентних рослин, рослинних тканин, рослинних клітин та клітин-хазяїнів даного винаходу. Аналогічно, ефективна кількість гербіциду являє собою кількість, яка звичайно використовується у системах сільськогосподарського виробництва для знищення бур'янів, які розглядаються. Така кількість відома спеціалістам, кваліфікованим у даній галузі техніки. Гербіциди даного винаходу являють собою ті, які заважають активності AHAS ферменту, з умови, що AHAS активність знижена у присутності гербіциду. Такі гербіциди також можуть називатися у цьому описі як "AHAS-інгібуючі гербіциди" або просто "AHAS інгібітори". Як використано у цьому описі, "AHAS-інгібуючий гербіцид" або "AHAS інгібітор" не вважають обмеженим одним гербіцидом, що заважає активності AHAS ферменту. Таким чином, поки не зазначено інше або зрозуміло з контексту, "AHAS-інгібуючий гербіцид" або "AHAS інгібітор" може являти собою один гербіцид або суміш двох, трьох, чотирьох або більше гербіцидів, кожен з яких заважає активності AHAS ферменту. Під терміном "подібна, дикого типу (нетрансформована), рослина, рослинна тканина, рослинна клітина або клітина-хазяїн" мається на увазі рослина, рослинна тканина, рослинна клітина або клітина-хазяїн, відповідно, яка не має характеристик резистентності до гербіцидів та/або певного полінуклеотиду відповідно до винаходу, що описаний у цьому описі. Зважаючи на це, при використанні терміну "дикого типу (нетрансформований)" не мають на увазі, що рослина, рослинна клітина або інша клітина-хазяїн не мають рекомбінантної ДНК у своєму геномі, та/або не має характеристик резистентності до гербіцидів, які відрізняються від тих, що описані у цій заявці. Як використано у цьому описі, поки ясно не зазначено інше, під терміном "рослина" мається на увазі рослина будь-якої стадії розвитку, також як і будь-яка частина або частини рослини, яка може бути прикріплена до або відділена від цілої інтактної рослини. Такі частини рослини включають, не обмежуючись наведеними, органи, тканини та клітини рослини. Приклади певних частин рослини включають стеблину, листя, коріння, суцвіття, квітку, квітку компактного суцвіття, фрукт, квітконіжку, плодоніжку, тичинку, пильовик, рильце, стовпчик, зав'язь, пелюсток, чашолисток, плодолистик, кінцівка коріння, кореневий чехлик, кореневу волосинку, листові волосинки, волосинки насіння, а пилкове зернятко, мікроспору, сім'ядолю, гіпокотиль, епікотиль, ксилему, флоему, паренхіму, ендосперм, клітину-супутник, замикаючу клітину, та будь-які інші відомі органи, тканини та насіння рослини. Більш того, відомо, що насіння - це рослина. 97344 22 Рослини даного винаходу включають як нетрансгенні рослини, так і трансгенні рослини. Під терміном "нетрансгенна рослина" мають на увазі рослину, не вистачає рекомбінантної ДНК у її геномі. Під терміном "трансгенна рослина" мають на увазі рослину, що містить рекомбінантну ДНК у її геномі. Така трансгенна рослина може бути одержана шляхом введення рекомбінантної ДНК у геном рослини. Коли така рекомбінантна ДНК вбудована у геном трансгенної рослини, потомок рослини може також включати рекомбінантну ДНК. Потомок рослини, що включає принаймні частину рекомбінантної ДНК принаймні однієї попередньої трансгенної рослини, також являє собою трансгенну рослину. Даний винахід забезпечує гербіцидрезистентну соняшникову лінію, яка називається у цьому описі як MUT28. Відкладення на зберігання принаймні 650 насінин з соняшникової лінії MUT28 патентного депозитарію американської колекції типових культур (Patent Depository of the American Type Culture Collection - ATCC), Mansassas, VA 20110 USA було зроблено 18 червня 2004 та позначено патентним депозитарним номером американської колекції типових культур РТА-6084. 15 липня 2005, додаткове насіння MUT28 лінії було відкладено на зберігання АТСС для того, що досягти у сумі більше, ніж 2500 насінин з патентним депозитарним номером АТСС РТА-6084. Вклад буде утримуватися в умовах Будапештського договору про міжнародне визнання депонування мікроорганізмів для цілей патентної процедури. Вклад соняшникової лінії MUT28 був зроблений на термін принаймні 30 років та принаймні 5 років після останнього запиту для забезпечення зразку депозиту, одержаного АТСС. Крім того, Заявники задовольнили всі умови 37 C.F.R. §§ 1.801-1.809, включаючи забезпечення індикації життєздатності зразка. Даний винахід забезпечує резистентні до гербіцидів соняшникові рослини MUT28 лінії, які були одержані шляхом мутаційного селекціонування. Дикого типу соняшникові рослини були мутанізовані шляхом піддавання рослин дії мутагену, особливо хімічного мутагену, краще етилметансульфонату (EMS). Однак, даний винахід не обмежується гербіцид-резистентними соняшниковими рослинами, які одержують способами мутагенезу, включаючи хімічний мутаген EMS. Будьякий спосіб мутагенезу, відомий у даній галузі техніки, може бути використаний для одержання резистентних до гербіцидів соняшникових рослин даного винаходу. Такі способи мутагенезу можуть включати, наприклад, застосування будь-якого одного або більше з наступних мутагенів: випромінювання, таке як рентгенівське випромінювання, гамма випромінювання (наприклад, кобальту 60 або цезію 137), нейтрони, (наприклад, продукт ділення ядра ураном 235 у атомному реакторі), бета випромінювання (наприклад, емітоване з радіоізотопів, таких як фосфор 32 або вуглець 14), та ультрафіолетове випромінювання (переважно від 2500 до 2900 нм), та хімічні мутагени, такі як основні аналоги (наприклад, 5-бром-урацил), споріднені сполуки (наприклад, 8-етокси-кафеїн), антибіо 23 тики (наприклад, стрептонігрін), алкілюючі агенти (наприклад, сернисті іприти, азотисті іприти, епоксиди, етиленаміни, сульфати, сульфонати, сульфони, лактони), азид, гідроксиламін, азотиста кислота або акридини. Резистентні до гербіцидів рослини також можуть бути одержані шляхом застосування способів тканевих культур для того, щоб вибрати рослинні клітини, що містять резистентні до гербіцидів мутації, та потім відновити з них резистентні до гербіцидів рослини. Дивись, наприклад, Патенти США №№ 5773702 та 5859348, обидва з них включені у даний опис у їх повноті шляхом посилання. Додаткові деталі мутаційного селекціонування можуть бути знайдені у "Principals of Cultivar Development" Fehr, 1993 Macmillan Publishing Company, опис якої включено у даний опис шляхом посилання. Аналіз AHASL1 гену соняшникової рослини MUT28 лінії виявив ту мутацію, що приводить до заміни лейцину на пролін, яку знайдено у амінокислотному положенні 182 у дикого типу AHASL1 амінокислотній послідовності для SEQ ID №: 4. Таким чином, даний винахід описує, що заміщення іншої амінокислоти на пролін у положенні 182 може привести до того, що соняшникова рослина буде мати підвищену резистентність до гербіциду, особливо гербіциду на основі імідазолінону та/або сульфонілсечовини. Як описано у Прикладі 3, представленому нижче, пролін 182 знайдений у консервативній ділянці AHASL білків та були розкриті інші амінокислотні заміни, що, як відомо, надають гербіцидну резистентність рослині, що включає такий AHASL білок. Відповідно, гербіцидрезистентні соняшникові рослини даного винаходу включають, не обмежуючись наведеними, ті соняшникові рослини, які містять у їх геномах принаймні одну копію AHASL1 полінуклеотиду, який кодує гербіцид-резистентний AHASL1 білок, який містить лейцин, аланін, треонін, гістидин, аргінін або ізолейцин у амінокислотному положенні 182 або еквівалентному положенні. Соняшникові рослини даного винаходу додатково включають рослини, які містять, у порівнянні з AHASL1 білком дикого типу, лейцин, аланін, треонін, гістидин, аргінін або ізолейцин у амінокислотному положенні 182 або еквівалентному положенні та одну або більше додаткових амінокислотних замін у AHASL1 білку у порівнянні з AHASL1 білком дикого типу, при чому така соняшникова рослина має підвищену резистентність до принаймні одного гербіциду у порівнянні з соняшниковою рослиною дикого типу. Такі соняшникові рослини включають AHASL1 білки, які містять принаймні один член, вибраний з групи, що складається з таких як: треонін у амінокислотному положенні 107 або еквівалентному положенні; аспартат або валін у амінокислотному положенні 190 або еквівалентному положенні; лейцин у амінокислотному положенні 559 або еквівалентному положенні; та аспарагін, треонін, фенілаланін, або валін у амінокислотному положенні 638 або еквівалентному положенні. Даний винахід забезпечує AHASL1 білки з амінокислотними замінами у певних амінокислотних положеннях у межах консервативних ділянок со 97344 24 няшникових AHASL1 білків, розкритих у цьому описі. Поки не зазначено інше, певні амінокислотні положення відносяться до положення тієї амінокислоти у повній соняшниковій AHASL1 амінокислотній послідовності, представленій у SEQ ID №№: 2 та 4. Більш того, спеціалісти, кваліфіковані у даній галузі техніки, зрозуміє, що такі амінокислотні положення можуть змінюватися в залежності від того, чи амінокислоти додані або видалені з, наприклад, N-термінального кінця амінокислотної послідовності. Таким чином, даний винахід охоплює амінокислотні заміщення у описаному положенні або еквівалентному положенні (наприклад, "амінокислотне положення 182 або еквівалентне положення"). Під "еквівалентним положенням" мають на увазі положення, яке знаходиться у межах тієї самої консервативної ділянки, що і приведене амінокислотне положення. Наприклад, еквівалентне положення у SEQ ID №: 8 являє собою амінокислоту 98 для проліну, який зустрічається у амінокислотному положенні 182 у SEQ ID №: 4. Крім того, даний винахід забезпечує AHASL1 поліпептиди, що містять амінокислотні заміни, що, як відомо, надають рослині резистентність до принаймні одного гербіциду, особливо AHASінгібуючого гербіциду, краще гербіциду на основі імідазолінону та/або гербіциду на основі сульфонілсечовини. Такі AHASL1 поліпептиди включають, наприклад, ті, які містять принаймні один член, вибраний з групи, що складається з таких як: лейцин, аланін, треонін, гістидин, аргінін або ізолейцин у амінокислотному положенні 182 або еквівалентному положенні; треонін у амінокислотному положенні 107 або еквівалентному положенні; аспартат або валін у амінокислотному положенні 190 або еквівалентному положенні; лейцин у амінокислотному положенні 559 або еквівалентному положенні; та аспарагін, треонін, фенілаланін, або валін у амінокислотному положенні 638 або еквівалентному положенні. Даний винахід додатково забезпечує ізольовані полінуклеотиди, що кодують такі AHASL1 поліпептиди, також як і касети експресії, вектори трансформації, трансформовані клітини-хазяїва, трансформовані рослини та способи, що включають такі полінуклеотиди. Даний винахід забезпечує способи для підвищення стійкості або резистентності рослини, рослинної тканини, рослинної клітини або іншої клітини-хазяїна до принаймні одного гербіциду, що заважає активності AHAS ферменту. Переважно, такий AHAS-інгібуючий гербіцид являє собою гербіцид на основі імідазолінону, гербіцид на основі сульфонілсечовини, гербіцид на основі триазолопіримідину, гербіцид на основі піримідинілоксибензоату, гербіцид на основі сульфоніламінокарбонілтриазолінону або їх суміш. Більш переважно, такий гербіцид являє собою гербіцид на основі імідазолінону, гербіцид на основі сульфонілсечовини або їх суміш. Для даного винаходу, до гербіцидів на основі імідазолінону належать, не обмежуючись наведеними, PURSUIT (імазетапір), CADRE (імазапік), RAPTOR (імазамокс), SCEPTER (імазахін), ASSERT (імазетабенз), ARSENAL (імазапір), похідні будь-якого з вищезгаданих гербіцидів, або суміш двох або більшої 25 кількості згаданих вище гербіцидів, наприклад, таких як імазапір/імазамокс (ODYSSEY). Більш специфічно, гербіцид на основі імідазолінону може бути обраний з групи, що складається з 2-(4ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)нікотинової кислоти, 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо2-імідазолін-2-іл)-3-хінолінкарбонової кислоти, 5етил-2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2іл)-нікотинової кислоти, 2-(4-ізопропіл-4-метил-5оксо-2-імідазолін-2-іл)-5-(метоксиметил)нікотинової кислоти, 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо2-імідазолін-2-іл)-5-метилникотинової кислоти і суміші метил 6-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2імідазолін-2-іл)-м-толуату і метил 2-(4-ізопропіл-4метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-п-толуату, проте не обмежуються ними. Надається перевага використанню 5-етил-2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2імідазолін-2-іл)-нікотиновій кислоті та 2-(4ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-5(метоксиметил)-нікотиновій кислоті, надається особлива перевага використанню 2-(4-ізопропіл-4метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-5-(метоксиметил)нікотиновій кислоті. Для даного винаходу, гербіциди на основі сульфонілсечовини включають, не обмежуючись наведеними, хлорсульфурон, метсульфурон метил, сульфометурон метил, хлорімурон етил, тіфенсульфурон метил, трибенурон метил, бенсульфурон метил, нікосульфурон, етаметсульфурон метил, рімсульфурон, трифлусульфурон метил, триасульфурон, примісульфурон метил, циносульфурон, амідосульфурон, флазасульфурон, імазосульфурон, піразосульфурон етил, галосульфурон, азимсульфурон, циклосульфурон, етоксисульфурон, флазасульфурон, флупірсульфурон метил, форамсульфурон, йодсульфурон, оксасульфурон, мезосульфурон, просульфурон, сульфосульфурон, трифлоксисульфурон, тритосульфурон, похідну будь-якого зі зазначених вище гербіцидів, та суміш двох або більше зі зазначених вище гербіцидів. Гербіциди на основі триазолопіримідину даного винаходу включають, не обмежуючись наведеними, клорансулам, диклосулам, флорасулам, флуметсулам, метосулам та пеноксулам. Гербіциди на основі піримідинілоксибензоату даного винаходу включають, не обмежуючись наведеними, біспірибак, піритіобак, піримінобак, пірибензоксим та пірифталід. Гербіциди на основі сульфоніламіно-карбонілтриазолінону включають, не обмежуючись наведеними, флукарбазон та пропоксикарбазон. Відомо, що гербіциди на основі піримідинілоксибензоату тісно пов'язані з гербіцидами на основі піримідинілтіобензоату та узагальнені під заголовком назви останнього товариством Weed Sci ence Soci ety of America. Відповідно, гербіциди даного винаходу додатково включають гербіциди на основі піримідинілтіобензоату, включаючи, не обмежуючись наведеними, гербіциди на основі піримідинілоксибензоату, описані вище. Даний винахід забезпечує способи підвищення AHAS активності у рослини, що включає трансформування рослини за допомогою полінуклеотидної конструкції, що включає промотор, функціонально зв'язаний з AHASL1 нуклеотидною послідовністю даного ви 97344 26 находу. Зазначені способи включають ведення полінуклеотидної конструкції даного винаходу у принаймні одну рослинну клітину та відновлення з неї трансформованої рослини. Зазначені способи включають застосування промотору, який здатний спрямувати експресію гену у рослинній клітині. Переважно, такий промотор являє собою конститутивний промотор або бажаний для тканини промотор. Зазначені способи знаходять своє застосування у посиленні або підвищенні резистентності рослини до принаймні одного гербіциду, який заважає каталітичній активності AHAS ферменту, особливо гербіциду на основі імідазолінону. Даний винахід забезпечує касети експресії для експресування полінуклеотидів даного винаходу у рослинах, рослинних тканинах, рослинних клітинах та інших клітинах-хазяївах. Касети експресії включають промотор, що може експресуватися у рослині, рослинній тканині, рослинній клітині або іншій клітині-хазяїні, які розглядають, функціонально зв'язаний з полінуклеотидом даного винаходу, що включає нуклеотидну послідовність, що кодує або повний (тобто включаючи транзитний пептид хлоропласту) або зрілий AHASL1 білок (тобто без транзитного пептиду хлоропласту). Якщо експресія є бажаною у пластидах або хлоропластах рослин або рослинних клітин, касета експресії може також включати функціонально зв'язану хлоропластспрямовану послідовність, яка кодує транзитний пептид хлоропласту. Касети експресії даного винаходу знаходять своє застосування у способі посилення стійкості до гербіциду рослини або клітини-хазяїна. Зазначений спосіб включає трансформування рослини або клітини-хазяїна за допомогою касети експресії даного винаходу, при чому касета експресії включає промотор, що може експресуватися у рослині або клітині-хазяїні, що розглядають, та зазначений промотор і функціонально зв'язаний з полінуклеотидом даного винаходу, що включає нуклеотидну послідовність, що кодує резистентний до імідазолінону AHASL1 білок даного винаходу. Використання в даному винаході терміну "нуклеотидні конструкції" не обмежує даний винахід нуклеотидними конструкціями, що містять ДНК. Для спеціалістів, кваліфікованих у даній галузі техніки, буде очевидним, що нуклеотидні конструкції, особливо полінуклеотиди й олігонуклеотиди, що складаються з рибонуклеотидів та комбінацій рибонуклеотидів і дезоксирибонуклеотидів можуть також використовуватися в способах, розкритих в даному винаході. Таким чином, нуклеотидні конструкції відповідно до даного винаходу охоплюють всі нуклеотидні конструкції, які можуть використовуватися в способах відповідно до даного винаходу для трансформації рослин, включаючи, ті, що складаються з дезоксирибонуклеотидів, рибонуклеотидів та їх комбінацій, але не обмежуються ними. Такі дезоксирибонуклеотиди та рибонуклеотиди включають і молекули, що зустрічаються в природі, і синтетичні аналоги. Нуклеотидні конструкції відповідно до винаходу також охоплюють всі форми полінуклеотидних конструкцій, включаючи, одноланцюгові форми, дволанцюгові форми, шпильки, структури стебла-і-петлі, і т.п., проте не 27 обмежуючись ними. Більш того, спеціалістам, кваліфікованим у даній галузі техніки, стане зрозуміло, що кожна нуклеотидна послідовність, розкрита у цьому описі, також охоплює комплемент тієї приведеної нуклеотидної послідовності. Крім того, визнано, що способи відповідно до винаходу можуть використовувати нуклеотидну конструкцію, що здатна спрямовувати, в трансформованій рослині, експресію принаймні одного білку, або принаймні однієї РНК, такої як, наприклад, антисенсова РНК, що є комплементарною до принаймні частки іРНК. Типово така нуклеотидна конструкція складається з кодуючої послідовності для білку або РНК, функціонально зв'язаної з 5' і 3' транскрипційними регуляторними ділянками. Альтернативно, також визнано, що способи відповідно до винаходу можуть використовувати нуклеотидну конструкцію, що не здатна спрямовувати, в трансформованій рослині, експресію білку або РНК. Крім того, визнано, що для експресії полінуклеотидів даного винаходу у клітині-хазяїні, що розглядається, полінуклеотид є типово функціонально зв'язаним з промотором, який здатний спрямовувати ген експресії у клітині-хазяїні, що розглядається. Способи даного винаходу для експресування полінуклеотидів у клітині-хазяїні не залежить від певного промотору. Зазначені способи включають застосування будь-якого промотору, відомого у даній галузі техніки, та здатного спрямовувати ген експресії у клітині-хазяїні, що розглядається. Даний винахід охоплює AHASL1 полінуклеотидні молекули та їх фрагменти та варіанти. Полінуклеотидні молекули, які являють собою фрагменти цих нуклеотидних послідовностей, також включені у даний винахід. Під терміном "фрагмент" мають на увазі частину нуклеотидної послідовності, що кодує AHASL1 білок даного винаходу. Фрагмент AHASL1 нуклеотидної послідовності відповідно до даного винаходу може кодувати біологічно активну частину AHASL1 білку, або він може бути фрагментом, що може використовуватися як гібридизаційний зонд або праймер PCR, з використанням описаних нижче методів. Біологічно активна частина AHASL1 білку може бути отримана шляхом відокремлення частини однієї з AHASL1 нуклеотидних послідовностей відповідно до винаходу, експресії закодованої частини AHASL1 білку (наприклад, шляхом рекомбінантної експресії in vitro) і оцінки активності закодованої частини AHASL1 білку. Полінуклеотидні молекули, які є фрагментами AHASL1 нуклеотидної послідовності, містять принаймні приблизно 15, 20, 50, 75, 100, 200, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, або 1950 нуклеотидів, або аж до кількості нуклеотидів, присутніх у всій довжині нуклеотидної послідовності, розкритої у цьому описі (наприклад, 1968, 1968, 1716 та 1716 нуклеотидів для SEQ ID №№: 1, 3, 5 та 7, відповідно) в залежності від передбачуваного застосування. Фрагмент AHASL1 нуклеотидної послідовності, що кодує біологічно активну частину AHASL1 білку відповідно до даного винаходу, буде кодувати 97344 28 принаймні приблизно 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, або 650 суміжних амінокислот, або аж до загальної кількості амінокислот, присутніх у всій довжині AHASL1 білку відповідно до даного винаходу (наприклад, 655, 655, 571 та 571 амінокислот для SEQ ID №№: 2, 4, 6 та 8, відповідно). Фрагменти AHASL1 нуклеотидної послідовності, які є корисними як гібридизаційний зонд для PCR праймерів, в основному не повинні кодувати біологічно активну частину AHASL1 білку. Полінуклеотидні молекули, які являють собою варіанти нуклеотидних послідовностей, розкритих у цьому описі, також включені у даний винахід. "Варіанти" AHASL1 нуклеотидних послідовностей даного винаходу включають ті послідовності, які кодують AHASL1 білки, розкриті у цьому описі, але які консервативно відрізняються через виродженість генетичного коду. Зазначені алельні варіанти природного походження можуть бути визначені шляхом застосування добре відомих способів молекулярної біології, наприклад, за допомогою полімеразно ланцюгової реакції (PCR) і методів гібридизації, як описано нижче. Варіантні нуклеотидні послідовності також включають синтетично отримані нуклеотидні послідовності, такі як послідовності, отримані, наприклад, при використанні сайтспрямованого мутагенезу, але які усе ще кодують AHASL1 білок, розкритий у даному винаході, як описано нижче. Як правило, варіанти нуклеотидних послідовностей відповідно до винаходу будуть мати принаймні приблизно 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, або 99% ідентичності до певної нуклеотидної послідовності, розкритої у даному описі. Варіантна AHASL1 нуклеотидна послідовність буде кодувати AHASL1 білок, відповідно, який має амінокислотну послідовність, що містить принаймні приблизно 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, або 99% ідентичності до амінокислотної послідовності AHASL1 білку, розкритого у даному описі. Крім того, спеціаліст, кваліфікований у даній галузі техніки, далі зрозуміє, що шляхом мутації можуть бути введені зміни у нуклеотидні послідовності даного винаходу, що, таким чином, веде до змін у амінокислотній послідовності закодованих AHASL1 білків без зміни біологічної активності AHASL1 білків. Таким чином, ізольована полінуклеотидна молекула, що кодує AHASL1 білок, який має послідовність, що відрізняється від послідовності SEQ ID №№: 1, 3, 5 або 7, відповідно, може бути створена шляхом введення однієї або більше нуклеотидних замін, додавань або делецій у відповідну нуклеотидну послідовність, розкриту у даному описі, таким чином, що одну або більше амінокислотних замін, додавань або делецій вводяться у закодований білок. Мутації можуть бути введені шляхом стандартних способів, таких як сайт-направлений мутагенез та PCRопосередкований мутагенез. Такі варіантні нуклеотидні послідовності також включені у даний винахід. Наприклад, переважно, консервативні амінокислотні заміни можуть бути зроблені у одному 29 або більше передбачених, переважно замінних амінокислотних залишках. "Замінний" амінокислотний залишок являє собою залишок, який може бути змінений у послідовності дикого типу AHASL1 білку (наприклад, послідовність SEQ ID №№: 2, 4, 6 та 8, відповідно) без зміни біологічної активності, в той час як "незамінний" амінокислотний залишок є необхідним для біологічної активності. "Консервативна амінокислотна заміна" являє собою заміну, при якій амінокислотний залишок заміняють на амінокислотний залишок, що має подібний бічний ланцюг. Родини амінокислотних залишків, що мають подібні бічні ланцюги, визначені у даній галузі техніки. Зазначені родини включають амінокислоти з основними бічними ланцюгами (наприклад, такі як лізин, аргінін, гістидин), з кислотними бічними ланцюгами (наприклад, такі як аспарагінова кислота, глютамінова кислота), з незміненими полярними бічними ланцюгами (наприклад, такі як гліцин, аспарагін, глутамін, серін, треонін, тирозин, цистеїн), з неполярними бічними ланцюгами (наприклад, такі як аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін, триптофан), з бетарозгалуженими бічними ланцюгами (наприклад, такі як треонін, валін, ізолейцин) та з ароматичними бічними ланцюгами (наприклад, такі як тирозин, фенілаланін, триптофан, гістидин). Такі заміни могли б бути зроблені для консервативних амінокислотних залишків або для амінокислотних залишків, що знаходяться у межах консервативного фрагменту. Білки відповідно до винаходу можуть бути змінені різним чином, включаючи заміни, делеції, усікання і вставки амінокислот. Способи для таких маніпуляцій є загальновідомими в даній області техніки. Наприклад, варіанти амінокислотної послідовності AHASL1 білку можуть бути отримані шляхом мутацій в ДНК. Способи для мутагенезу і змін нуклеотидної послідовності відомі в даній області техніки. Див., наприклад, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-492; Kunkel та ін. (1987) Methods in Enzymol 154: 367-382; Патент США № 4873192; Walker and Gaastra, ред. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York) та літературу, зазначену в них. Керівництво щодо замін відповідної амінокислоти, що не впливає на біологічну активність білку, що розглядається, можна виявити в моделі Dayhoff та ін. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D. C), що включена в даний контекст шляхом посилання. Може бути надана перевага консервативним замінам, таким як обмін однієї амінокислоти на іншу, що має подібні властивості. Альтернативно, варіантні AHASL1 нуклеотидні послідовності можуть бути зроблені шляхом введення мутацій випадковим чином у всій або частині AHASL1 кодуючої послідовності, таких як мутагенез насичення, таотримані мутанти можуть бути відсортовані за AHAS активністю для визначення мутантів, що зберегли AHAS активність, включаючи AHAS активність резистентності до гербіцидів. Після мутагенезу, закодований білок може бути рекомбінантно експресований, та активність білку 97344 30 може бути визначена, використовуючи стандартні методи аналізу. Таким чином, нуклеотидні послідовності даного винаходу включають послідовності, розкриті у цьому описі, також як і їх фрагменти та варіанти. AHASL1 нуклеотидні послідовності даного винаходу, та їх фрагменти та варіанти, можуть бути використані як зонди та/або праймери для визначення та/або клонування AHASL гомологів у інших рослинах. Такі зонди можуть бути використані для виявлення транскриптів або геномних послідовностей, що кодують ті ж самі або ідентичні білки. Таким чином, способи, такі як PCR, гібридизація та подібні, можуть бути використані для визначення таких послідовностей, що мають значну ідентичність з послідовностями даного винаходу. Див., наприклад, Sambrook та ін. (1989) Molecular Cloning: Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY) та Innis, та ін. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY). AHASL нуклеотидні послідовності, ізольовані на основі ідентичності їх послідовностей до AHASL1 нуклеотидних послідовностей, представлені у цьому описі, або до їх фрагментів та варіантів, включені у даний винахід. У способі гібридизації, всі або частина з відомих AHASL1 нуклеотидних послідовностей можуть бути використані для відсортування кДНК або геномних бібліотек. Способи для конструювання таких кДНК та геномних бібліотек в основному відомі у даній галузі техніки та розкриті у Sambrook та ін. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY). Так звані гібридизаційні зонди можуть являти собою геномні ДНК фрагменти, кДНК фрагменти, РНК фрагменти, або інші олігонуклеотиди, та можуть бути міченими за допомогою груп, 32 що виявляються, таких як Р, або будь-який інший маркер, що виявляється, такий як інші радіоізотопи, флуоресцентна сполука, фермент, або ферментний ко-фактор. Зонди для гібридизації можуть бути зроблені шляхом мічення синтетичних оліголуклеотидів, що основані на відомій AHASL1 нуклеотидній послідовності, що розкриті у цьому описі. Додатково можуть бути використані вироджені праймери, розроблені на основі консервативних нуклеотидів або амінокислотних залишків у відомій AHASL1 нуклеотидній послідовності або закодованій амінокислотній послідовності. Зонд зазвичай включає ділянку нуклеотидної послідовності, яка гібридизується у жорстких умовах до принаймні приблизно 12, краще приблизно 25, ще краще приблизно 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350,400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, або 1800 консервативних нуклеотидів AHASL1 нуклеотидної послідовності даного винаходу або їх фрагменту або варіанту. Одержання зондів для гібридизації в основному відоме у даній галузі техніки та розкрите у Sambrook та ін. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York), що включене у даний опис шляхом посилання. 31 Наприклад, ціла AHASL1 послідовність, розкрита у цьому описі, або одна або більше її частин, може бути використана як зонд, здатний специфічно гібридизуватися до відповідних AHASL1 послідовностей та інформаційних РНК. Способи гібридизації включають гібридизаційний скринінг покритих бібліотек ДНК (або плями або колонії; див., наприклад, Sambrook та ін. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). Гібридизація таких послідовностей може бути виконана в жорстких умовах. Під "жорсткими умовами" або "жорсткими умовами гібридизації" маються на увазі умови, при яких зонд гібридизується до його цільової послідовності у відчутно більшому ступені, ніж до інших послідовностей (наприклад, принаймні 2-кратно у порівнянні з базовим рівнем). Жорсткі умови залежать від послідовності й будуть різними за різних обставин. Як правило, жорсткі умови будуть такими, за яких концентрація солі є меншою ніж приблизно 1,5 Μ іонів Na, зазвичай, приблизно від 0,01 до 1,0 Μ іонів Na (або інших солей) при рН 7,0-8,3 і температура становить принаймні приблизно 30°С для коротких зондів (наприклад, 10-50 нуклеотидів) і принаймні приблизно 60°С для довгих зондів (наприклад, більше ніж 50 нуклеотидів). Жорсткі умови можуть також бути досягнуті додаванням дестабілізуючих засобів, таких як формамід. Прикладом низьких умов жорсткості є гібридизація з буферним розчином, що містить 30-35% формаміду, 1 Μ NaCl, 1% SDS (натрію додецилсульфату) при 37°С, і промивка 1х до 2х SSC (20x SSC=3,0 Μ NaCl/0,3 Μ тринатрію цитрату) при 50-55°С. Зразком помірних умов жорсткості є гібридизація в 4045% формаміді, 1,0 Μ NaCl, 1% SDS при 37°С і промивка 0,5х до 1х SSC при 55-60°С. Зразок сильних умов жорсткості є гібридизація в 50% формаміді, 1 Μ NaCl, 1% SDS при 37°С і промивка в 0,1х SSC при 60-65°C. Довільно, промивні буфери можуть містити приблизно від 0,1% до 1% SDS. Тривалість гібридизація зазвичай становить менше ніж приблизно 24 години, звичайно приблизно від 4 до 12 годин. Специфічність типово є функцією постгібридизаційних промивок, критичними факторами є іонна сила й температура кінцевого промивочного розчину. Для гібридів ДНК-ДНК Tm може бути наближено визначена з рівняння Meinkoth і Wahl (1984) Anal. Biochem. 138: 267-284: Tm=81,5°C+16,6 (log M)+0,41 (% ГЦ)-0,61 (% форм)-500/L; де Μ - молярність одновалентних катіонів, % ГЦ - відсоток гуанозинових і цитозинових нуклеотидів у ДНК, % форм - відсоток формаміду у розчині для гібридизації і L - довжина гібриду в парах основ. Tm - температура (при визначеній іонній силі та рН), при якій 50% комплементарної цільової послідовності гібридизується до прекрасно підібраного зонду. Tm зменшується приблизно на 1°С для кожного 1% невідповідності; таким чином, Tm, гібридизація, та/або умови промивки можуть бути пристосовані таким чином, щоб гібридизуватися до послідовностей бажаної ідентичності. Наприклад, якщо розшукуються послідовності з 90% ідентичністю, Tm 97344 32 можна зменшити на 10°С. Взагалі, жорсткі умови обираються таким чином, щоб температура становила приблизно на 5°С нижче ніж температура топлення (Tm) для певної послідовності та її комплементу при певній іонній силі й рН. Однак, у сильно жорстких умовах можуть використовуватись гібридизація й/або промивка при 1, 2, 3, або 4°С нижче чим температура топлення (Tm); в умовах середньої жорсткості можуть використовуватись гібридизація й/або промивка при 6, 7, 8, 9 або 10°С нижче ніж температура топлення (Tm); в низьких умовах жорсткості можуть використовуватись гібридизація й/або промивка при 11, 12, 13, 14, 15 або 20°С нижче ніж температура топлення (Tm). За допомогою рівняння, гібридизації й складу розчинів для промивки і бажаної Tm, для спеціалістів, кваліфікованих у даній галузі техніки, зрозуміло, що зміни в жорсткості гібридизації й/або розчинах для промивки невід'ємно пов'язані. Якщо бажаний ступінь невідповідності призводить до Tm менше ніж 45°С (водний розчин) або 32°С (розчин формаміду), бажано збільшити концентрацію SSC таким чином, щоб могла використовуватися більш висока температура. Велика настанова щодо гібридизації нуклеїнових кислот виявлене в Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, Частина І, Глава 2 (Elsevier, New York); і Ausubel та ін., ред. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Глава 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York). Див. Sambrook та ін. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). Визнано, що полінуклеотидні молекули та білки даного винаходу включають полінуклеотидні молекули та білки, що містять нуклеотид або амінокислотну послідовність, яка є достатньо ідентичною з нуклеотидною послідовністю SEQ ID №№: 1, 3, 5 та/або 7, або з амінокислотною послідовністю SEQ ID №№: 2, 4, 5 та/або 8. Термін "достатньо ідентичною" використовують у даному описі для того, щоб віднести першу амінокислотну або нуклеотидну послідовність, що містить достатню або мінімальну кількість ідентичних або еквівалентних (наприклад, з однаковим бічним ланцюгом) амінокислотних залишків або нуклеотидів, до другої амінокислотної або нуклеотидної послідовності, таким чином, що перша та друга амінокислотна або нуклеотидна послідовності мають однаковий структурний домен та/або однакову функціональну активність. Наприклад, амінокислоті або нуклеотидні послідовності, які містять однаковий структурний домен, що має принаймні приблизно 45%, 55% або 65% ідентичності, краще 75% ідентичності, ще краще 85%, 95% або 98% ідентичності, визначені у цьому описі як достатньо ідентичні. Для визначення відсотку ідентичності між двома амінокислотними послідовностями або двома нуклеїновими кислотами, послідовності вирівнюють для цілей оптимального порівняння. Відсоток ідентичності між двома послідовностями являє собою функцію кількості однакових положень, поділену на послідовності (тобто відсоток ідентичності=кількість однакових положень/загальна кіль 33 кість положень (наприклад, положень, що перекриваються)x100). У одному втіленні, дві послідовності мають однакову довжину. Відсоток ідентичності між двома послідовностями може бути визначений, використовуючи технології, подібні до тих, що описані нижче, з або без дозволяючих інтервалів. У розрахунку відсотку ідентичності, зазвичай рахують точні пари збігів. Визначення відсотку ідентичності послідовності між двома послідовностями може бути зроблене, використовуючи математичний алгоритм. Кращий не обмежуючий приклад математичного алгоритму, що використовується для порівняння двох послідовностей, являє собою алгоритм Karlin та Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264, модифікований як у Karlin та Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877. Такий алгоритм включений у NBLAST та XBLAST програми Altschul та ін. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403. Пошуки нуклеотиду BLAST можуть бути виконані за допомогою програми NBLAST, бал=100, довжина=12, щоб одержати нуклеотидні послідовності, гомологічні до нуклеотидних молекул відповідно до винаходу. Пошуки білку BLAST можуть бути виконані за допомогою програми XBLAST, бал=50, довжина=3, щоб одержати амінокислотні послідовності, гомологічні до молекул білку відповідно до винаходу. Щоб одержати вирівнювання з проміжками з метою порівняння, може використовуватися Gapped BLAST, як описано в Altschul та ін. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389. Альтернативно, може використовуватися PSI-BLAST, щоб виконати повторний пошук, що виявляє віддалені взаємовідносини між молекулами. Див. Altschul та ін. (1997) вище. При застосуванні BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST програми, можуть використовуватися параметри за замовчуванням відповідних програм (наприклад, XBLAST та NBLAST). Див. http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Інший кращий не обмежуючий приклад математичного алгоритму, що використовується для порівняння послідовностей, являє собою алгоритм Myers та Miller (1988) CABIOS 4: 11-17. Такий алгоритм включений у ALIGN програму (версія 2.0), яка є частиною пакету програмного забезпечення GCG sequence alignment software package. При використанні ALIGN програми для порівняння амінокислотних послідовностей, РАМ 120 таблиця мас залишків, може бути використано штраф довжини проміжку 12, та штраф проміжку 4. Вирівнювання можуть також здійснюватися вручну шляхом перевірки. Якщо не зазначено інакше, значення ідентичності/схожості послідовності, представлені тут, стосуються значення, отриманого використовуючи всю довжину послідовностей відповідно до винаходу та використовуючи вирівнювання за допомогою алгоритму Clustal W (Nucleic Acid Research, 22(22): 4673-4680, 1994), використовуючи програму AlignX, включену у пакет програмного забезпечення Vector NTI Suite Версію 7 (InforMax, Inc., Bethesda, MD, USA) з використанням параметрів за замовчуванням; або будь яку еквівалентну програму. Під "еквівалентною програмою" мається на увазі будь-яка програма порівняння послідовності, що, для будь-яких двох розглянутих послідовнос 97344 34 тей, робить вирівнювання, що має ідентичні пари нуклеотидних або амінокислотних залишків й ідентичний відсоток ідентичності послідовності при порівнянні з відповідним вирівнюванням, зробленим за допомогою AlignX у пакеті програмного забезпечення Vector NTI Suite Версія 7. AHASL1 нуклеотидні послідовності даного винаходу включають як послідовності природного походження, так і мутантні форми, особливо мутантні форми, які кодують AHASL1 білки, що мають гербіцид-резистентну AHAS активність. Аналогічно, білки відповідно до винаходу охоплюють як білки, що зустрічаються в природі, так і їх варіанти та модифіковані форми. Такі варіанти продовжують мати бажану активність AHAS. Очевидно, мутації, які будуть зроблені в послідовності ДНК, що кодує цей варіант, не повинні містити послідовність поза рамкою зчитування й, бажано, не будуть створювати комплементарні ділянки, які могли створити вторинну структуру iРНК. Див., Публікацію патентної заявки ЕР № 75444. Делеції, вставки і заміни послідовностей білків, зазначені тут, як очікується, не вносять радикальних змін в характеристики білку. Однак, у разі, коли важко заздалегідь передбачити точний ефект заміни, делеції або вставки, для спеціаліста, кваліфікованого в даній області техніки, буде очевидним, що ефект буде оцінюватись за допомогою рутинних скринінгових аналізів. Таким чином, активність може бути оцінена за допомогою аналізів AHAS активності. Див., наприклад, Singh та ін. (1988) Anal. Biochem. 171: 173-179, що включено у даний опис шляхом посилання. Варіантні нуклеотидні послідовності й білки також охоплюють послідовності й білки, отримані мутагенними й рекомбінантними методами, такими як тасування ДНК. За таким методом, можна маніпулювати однією або більшою кількістю різних AHASL кодуючих послідовностей, щоб створити новий AHASL білок, що має бажані властивості. У такий спосіб, отримують бібліотеки рекомбінантних полінуклеотидів із сукупності полінуклеотидів зі спорідненими послідовностями, що містять ділянки послідовності, які мають істотну ідентичність послідовності й можуть бути гомологічно рекомбіновані in vitro або in vivo. Наприклад, використовуючи цей підхід, мотиви послідовності, що кодують домен, що розглядається, можуть бути перетасовані між геном AHASL1 відповідно до винаходу й іншими відомими генами AHASL для одержання нового гену, що кодує білок з поліпшеною властивістю, що розглядається, як, наприклад, збільшення Кm у випадку ферменту. Стратегії для такого тасування ДНК відомі в даній області. Див., наприклад, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370: 389-391; Crameri та ін. (1997) Nature Biotech. 15: 436-438; Moore та ін. (1997) J. Mol. Biol. 272: 336-347; Zhang та ін. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4504-4509; Crameri та ін. (1998) Nature 391: 288-291 і Патенти США № 5605793 і 5837458. Нуклеотидні послідовності відповідно до винаходу можуть використовуватися для ізолювання відповідних послідовностей із інших організмів, 35 особливо інших рослин, більш особливо інших дводольних. У такий спосіб можуть використовуватися методи, такі як PCR, гібридизація і т.п., для ідентифікації таких послідовностей на підставі гомологічності послідовностей до послідовностей, сформульованих тут. Послідовності, ізольовані на підставі їх ідентичності до всіх послідовностей AHASL1, сформульованих тут, або до їх фрагментів, охоплюються даним винаходом. Таким чином, ізольовані послідовності, які кодують AHASL білок і які гібридизуються в жорстких умовах до послідовності, описаної у цьому описі, або її фрагментів, охоплюються даним винаходом. В методі PCR можуть бути розроблені олігонуклеотидні праймери для використання в PCR реакціях для ампліфікації відповідних послідовностей ДНК з кДНК або геномної ДНК, вилученої з будьякої рослини, що розглядається. Методи для розробки PCR праймерів і клонування PCR є загальновідомими в даній області й розкриті в Sambrook та ін. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). Див. також Linis та інші, ред. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York); Innis та Gelfand, ред. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York); і Linis та Gelfand, ред. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York). Відомі способи PCR включають способи, що використовують парні праймери, гніздові (nested) праймери, окремі специфічні праймери, вироджені праймери, ген-специфічні праймери, векторспецифічні праймери, частково-неузгоджені праймери, і т.п., але не обмежуються ними. AHASL1 полінуклеотидні послідовності відповідно до винаходу пропонуються в касетах експресії для експресії в рослині, що розглядається. Касета буде містити 5' і 3' регуляторні послідовності, функціонально зв'язані з послідовністю AHASL1 відповідно до винаходу. Під терміном "функціонально зв'язаний" мається на увазі функціональний зв'язок між промотором і другою послідовністю, причому послідовність промотору ініціює й опосередковує транскрипцію послідовності ДНК, що відповідає другій послідовності. Зазвичай, функціонально зв'язаний означає, що послідовності нуклеїнових кислот, будучи зв'язаними, є замінимими й, у разі необхідності, приєднуються до двох кодуючих білки ділянок, замінимих й у тій же самій рамці зчитування. Касета може додатково містити принаймні один додатковий ген, для котрансформації в організмі. Альтернативно, додатковий ген(и) можуть бути представлені на багаторазових касетах експресії. Така касета експресії пропонується з безліччю сайтів рестрикції для вставки AHASL1 полінуклеотидної послідовності, щоб перебувати під транскрипційним регулюванням регуляторних ділянок. Касета експресії може додатково містити обирані гени-маркери. Касета експресії буде включати в 5'-3' напрямку транскрипції, транскрипційну й трансляційну ділянку ініціювання (тобто, промотор), AHASL1 полінуклеотидну послідовність відповідно до винаходу, і транскрипційну та трансляційну ділянку 97344 36 термінації (тобто, ділянку термінації), функціональну в рослинах. Промотор може бути нативним або аналогічним, або стороннім чи гетерологічним, до рослини-хазяїна й/або до AHASL1 полінуклеотидної послідовності відповідно до винаходу. Додатково, промотор може бути природною послідовністю або, альтернативно, синтетичною послідовністю. У випадку, коли промотор є "стороннім" або "гетерологічним" до рослини-хазяїна, вважається, що промотор не знайдений в нативній рослині, в яку вводиться промотор. У випадку, коли промотор є "стороннім" або "гетерологічним" до AHASL1 полінуклеотидної послідовності відповідно до винаходу, вважається, що промотор не є нативним промотором або промотор, що зустрічається в природі, для функціонально зв'язаної AHASL1 полінуклеотидної послідовності відповідно до винаходу. Як використовується в контексті даного винаходу, химерний ген містить кодуючу послідовність, функціонально зв'язану з ділянкою ініціювання транскрипції, що є гетерологічною до кодуючої послідовності. У той час як перевага надається експресії AHASL1 полінуклеотидів даного винаходу за допомогою гетерологічних промоторів, можуть використовуватися нативні промоторні послідовності. Такі конструкції змінили б рівні експресії AHASL1 білку відповідно до винаходу або в рослині або рослинній клітині. Таким чином, змінюється фенотип рослини або рослинної клітини. Ділянка термінації може бути нативною із ділянкою ініціювання транскрипції, може бути нативною з функціонально зв'язаною AHASL1 послідовністю, що розглядається, може бути нативною з рослиною-хазяїном, або може бути отримана з іншого джерела (тобто, сторонньою або гетерологічною до промотору, AHASL1 полінуклеотидної послідовності, що розглядається, рослини-хазяїна або будь-якої їх комбінації). Зручні ділянки термінації отримують із Ті-плазмід A. tumefaciens, такі як ділянки термінації октопінсинтази і нопалінсинтази. Див. також Guerineau та ін. (1991) Mol. Gen. Genet. 262: 141-144; Proudfoot (1991) Cell 64: 671-674; Sanfacon та ін. (1991) Genes Dev. 5: 141-149; Mogen та ін. (1990) Plant Cell 2: 1261-1272; Munroe та ін. (1990) Gene 91: 151-158; Ballas та ін. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 7891-7903; та Joshi та ін. (1987) Nucleic Acid Res. 15: 9627-9639. Де доцільно, ген(и) може бути оптимізований для збільшення експресії в трансформованій рослині. Таким чином, гени можуть бути синтезовані з використанням бажаних для рослин кодонів для поліпшення експресії. Див., наприклад, Campbell та Gowri (1990) Plant Physiol. 92: 1-11 для обговорення використання бажаного для хазяїна кодону. В даній області техніки наявні способи для того, щоб синтезувати бажані для рослин гени. Див., наприклад, Патенти США № 5380831 та 5436391, і Murray та ін. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 477-498, включені в даний контекст шляхом посилання. Додаткові модифікації послідовності, як відомо, збільшують експресію генів в клітинному хазяїні. До них належать вилучення послідовностей, що кодують підроблені сигнали поліадениляції, екзон-інтронні сигнали сайтів з'єднання, транспо 37 зон-подібні повторення та ін. такі добре охарактеризовані послідовності, які можуть бути шкідливими до експресії генів. Вміст Г-Ц послідовності може бути пристосований до рівнів, середніх для даного клітинного хазяїна, як обчислено відносно відомих генів, що експресуються у клітині-хазяїні. У разі можливості, послідовність модифікують, щоб уникнути передбачених шпилькових вторинних структур іРНК. Нуклеотидні послідовності для підвищення генної експресії також можуть бути використані у векторах експресії рослин. Вони включають інтрони кукурудзяного AdhI, інтронний ген (Callis та інші, Genes and Development 1: 1183-1200, 1987), та лідируючі послідовності, (W-послідовність) з вірусу тютюнової мозаїки (ВТМ), вірусу хлоротичної плямистості кукуруди та вірусу люцернової мозаїки (Gallie та ін. Nucleic Acid Res. 15: 8693-8711, 1987 та Skuzeski та ін. Plant Mol Biol. 15: 65-79, 1990). Перший інтрон з нерозвиненого t-Ι локусу кукурудзи, як показано, підвищує експресію генів у химерних генних конструкціях. Патенти США №№ 5424412 та 5593874 розкривають застосування специфічних інтронів у конструкціях генної експресії, та Gallie та ін. (Plant Physiol. 106: 929-939, 1994) також показали, що інтрони є корисними для регулювання генної експресії на тканинній специфічні основі. Для додаткового підвищення або для оптимізування AHAS малої субодиниці генної експресії, рослинні вектори експресії даного винаходу також можуть містити ДНК послідовності, що мають матричні ділянки прикріплення (MAR - matrix attachment region). Рослинні клітини, трансформовані за допомогою таких модифікованих систем експресії, далі, можуть показувати надекспресію або конститутивну експресію нуклеотидної послідовності даного винаходу. Касети експресії можуть додатково містити 5' лідируючих послідовностей в конструкції касети експресії. Такі лідируючі послідовності можуть функціонувати для збільшення трансляції. Лідери трансляції відомі в даній області та включають: лідери піконавірусу, наприклад, лідер EMCV (5' некодуюча ділянка Encephalomyocarditis) (ElroyStein та ін. (1989) Ргос. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6126-6130); лідери потівірусу, наприклад, лідер TEV (Вірус гравіровки тютюну - Tobacco Etch Virus) (Gallie та ін. (1995) Gene 165(2): 233-238), лідер MDMV (Вірус карликової мозаїки кукурудзи - Maize Dwarf Mosaic Virus) (Virology 154: 9-20) і білок, що зв'язує важкий ланцюг людського імуноглобуліну, (ВІР) (Macejak та ін. (1991) Nature 353: 90-94); нетрансльований лідер із іРНК білка оболонки вірусу мозаїки люцерни (AMV RNA 4) (Jobling та ін. (1987) Nature 325: 622-625); лідер вірусу мозаїки тютюну (TMV) (Gallie та ін. (1989) у Molecular Biology of RNA, ред. Cech (Liss, New York), стор. 237-256); і лідер вірусу хлоротичної плямистості кукуруди (MCMV - maize chlorotic mottle virus) (Lommel та ін. (1991) Virology 81: 382-385). Див. також, DellaCioppa та ін. (1987) Plant Physiol 84: 965-968. Можуть також використовуватися інші методи, які відомідля збільшення трансляції, наприклад, інтрони, і т. п. 97344 38 При підготовці касети експресії, можна маніпулювати різними фрагментами ДНК, для забезпечення послідовностей ДНК у належній орієнтації й, якщо доцільно, у належній рамці зчитування. До цього кінця, можуть застосовуватись адаптери або лінкери для приєднання фрагментів ДНК або можуть здійснюватися інші маніпуляції для того, щоб забезпечити зручні сайти рестрикції, видалення зайвої ДНК, видалення сайтів рестрикції і т.п. Із цією метою можуть застосовуватись in vitro мутагенез, репарація праймеру, рестрикція, отжиг, повторні заміни, наприклад, транзиції та трансверсії. В практиці винаходу може використовуватися низка промоторів. Промотори можуть обиратись на підставі бажаного результату. Нуклеїнові кислоти можуть бути комбіновані з конститутивними, бажаними для тканин, або іншими промоторами для експресії в рослинах. До таких конститутивних промоторів належать, наприклад, промотор оболонки Rsyn7 промотору та ін. конститутивні промотори, розкриті у WO 99/43838 та Патенті США № 6072050; промотор CaMV 35S оболонки (Odell та ін. (1985) Nature 313: 810-812); рисовий актин (McElroy та ін. (1990) Plant Cell 2: 163-171); убіквітин (Christensen та ін. (1989) Plant Mol. Biol. 12: 619- 632 та Christensen та ін. (1992) Plant MoІ. Biol. 18: 675-689); pEMU (Last та ін. (1991) Theor. Appl Genet. 81: 581-588); MAS (Velten та ін. (1984) EMBO J 3: 2723-2730); промотор ALS (Патент США № 5659026), і т.п. До інших конститутивних промоторів належать, наприклад, описані в Патентах США №№ 5608149; 5608144; 5604121; 5569597; 5466785; 5399680; 5268463, 5608142 та 6177611. Щоб спрямувати збільшену експресію AHASL1 у межах певної рослинної тканини можуть використовуватися бажані для тканин промотори. Такі бажані для тканин промотори включають, не обмежуючись наведеними, бажані для листя промотори, бажані для коріння промотори, бажані для насіння промотори, та бажані для стеблин промотори. До бажаних для тканин промоторів належать Yamamoto та ін. (1997) Plant J. 12(2): 255-265; Kawamata та ін. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7): 792-803; Hansen та ін. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3): 337-343; Russell та ін. (1997) Transgenic Res. 6(2): 157-168; Rinehart та ін. (1996) Plant Physiol. 112(3): 1331-1341; Van Camp та ін. (1996) Plant Physiol. 112(2): 525-535; Canevascini та ін. (1996) Plant Physiol. 112(2): 513-524; Yamamoto та ін. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5): 773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20: 181- 196; Orozco та ін. (1993) Plant Mol. Biol. 23(6): 11291138; Matsuoka та ін. (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20): 9586-9590; і Guevara-Garcia та ін. (1993) Plant J. 4(3): 495-505. Такі промотори можуть бути модифіковані, якщо необхідно, для слабкої експресії. В одному варіанті втілення нуклеїнові кислоти відповідно до винаходу направлені на хлоропласт для експресії. У такий спосіб, при якому нуклеїнова кислота, що розглядається, безпосередньо не вводиться в хлоропласт, касета експресія буде додатково містити направлену на хлоропласт послідовність, що містить нуклеотидну послідовність, 39 що кодує хлоропластний транзитний пептид для спрямовування генного продукту, що розглядається, на хлоропласти. Такі транзитні пептиди відомі в даній області техніки. Щодо направлених на хлоропласт послідовностей, "функціонально зв'язаний" означає, що послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує транзитний пептид (тобто, направлена на хлоропласт послідовність), зв'язується із полінуклеотидом AHASL відповідно до винаходу таким чином, що ці дві послідовності є замінимими й знаходяться у тій же рамці зчитування. Див., наприклад, Von Heijne та ін. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104-126; Clark та ін. (1989) J. Biol. Chem. 264: 17544-17550; Della-Cioppa та ін. (1987) Plant Physiol. 84: 965-968; Romer та ін. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 14141421; і Shah та ін. (1986) Science 233: 478-481. В той час як AHASL1 білки даного винаходу включають нативний хлоропластовий транзитний пептид, будь-який хлоропластовий транзитний пептид, відомий у даній галузі техніки, може бути сполучений з амінокислотною послідовністю зрілого AHASL1 білку даного винаходу шляхом функціонального зв'язування спрямованої на хлоропласт послідовності до 5'-кінця нуклеотидної послідовності, що кодує зрілий AHASL1 білок даного винаходу. Направлені на хлоропласт послідовності відомі в даній області та включають хлоропластну малу субодиницю рибулозо-1,5-біфосфат карбоксилази (Rubisco) (de Castro Silva Filho та ін. (1996) Plant Mol. Biol. 30: 769-780; Schnell та ін. (1991) J. Biol. Chem. 266(5): 3335-3342); 5(енолпірувіл)шикимат-3-фосфатсинтазу (EPSPS) (Archer та ін. (1990) J. Bioenerg. Biomemb. 22(6): 789-810); триптофансинтазу (Zhao та ін. (1995) J. Biol. Chem. 270(11): 6081-6087); пластоцианін (Lawrence та ін. (1997) J. Biol. Chem. 272(33): 20357-20363); хоризматсинтазу (Schmidt та ін. (1993) J. Biol. Chem. 268(36): 27447-27457); і білок, що зв'язує легкий хлорофіл a/b (LHBP) (Lamppa та ін. (1988) J. Biol. Chem. 263: 14996-14999). Див. також Von Heijne та ін. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104-126; Clark та ін. (1989) J. Biol. Chem. 264: 17544-17550; Della-Cioppa та ін. (1987) Plant Physiol. 84: 965-968; Romer та ін. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 1414-1421; і Shah та ін. (1986) Science 233: 478-481. Методи для трансформації хлоропластів відомі в даній області. Див., наприклад, Svab та ін. (1990) Ргос. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8526-8530; Svab та Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 913-917; Svab і Maliga (1993) EMBO J. 12: 601-606. Метод покладається на часткову поставку ДНК, що містить обираний маркер і спрямування ДНК на геном пластиди через гомологічну рекомбінацію. Додатково, можна досягти трансформації пластиди трансактивацією пластидного трансгену, що мовчить, шляхом експресії в певній тканині ядерно-закодованої та пластид-спрямованої РНКполімерази. Про таку систему повідомлялось в McBride та ін. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 7301-7305. Нуклеїнові кислоти, що розглядаються, що спрямовані на хлоропласт, можуть бути оптимізо 97344 40 вані для експресії в хлоропласті з врахуванням відмінностей у використанні кодону між ядром рослини та цим органоїдом. У цей спосіб, нуклеїнові кислоти, що розглядаються, можуть синтезуватись з використанням кодонів, бажаних для хлоропластів. Див., наприклад, Патент США № 5380831, що включений в даний документ шляхом посилання. Як розкрито у цьому описі, AHASL1 нуклеотидні послідовності даного винаходу знаходять своє застосування у підвищенні стійкості рослин до гербіцидів, які містять у їх геномах ген, що кодує стійкий до гербіцидів AHASL1 білок. Такий ген може являти собою ендогенний ген або трансген. Додатково, у певних втіленнях, послідовності нуклеїнових кислот даного винаходу можуть бути зібрані з будь-якою комбінацією полінуклеотидних послідовностей, що розглядаються, для того, щоб створити рослини з бажаним фенотипом. Наприклад, полінуклеотиди даного винаходу можуть бути скомпоновані з будь-якими іншими полінуклеотидами, що кодують поліпептиди, які мають пестицидну та/або інсектецидну активність, такими як, наприклад, білки Bacillus thuringiensis токсину (описані у Патентах США №№ 5366892; 5747450; 5737514; 5723756; 5593881; та Geiser та ін. (1986) Gene 48: 109). Створені комбінації також можуть включати множинні копії будь-якого одного з полінуклеотидів, що розглядаються. Визнано, що за допомогою цих нуклеотидних послідовностей можуть бути сконструйовані антисенсові конструкції, комплементарні до принаймні частини інформаційної РНК (іРНК) для AHASL1 полінуклеотидної послідовності. Антисенсові нуклеотиди конструюються для гібридизації з відповідною іРНК. Можна створити модифікації антисенсових послідовностей, поки послідовності гібридизуються із та взаємодіють з експресією відповідної іРНК. У цей спосіб можуть використовуватись антисенсові конструкції, що мають 70%, бажано 80%, більш бажано 85% ідентичності послідовності до відповідних антисенсових послідовностей. Крім того, можуть використовуватися частки антисенсових нуклеотидів для того, щоб порушити експресію цільового гену. Зазвичай, можуть використовуватися послідовності з принаймні 50 нуклеотидів, 100 нуклеотидів, 200 нуклеотидів або більше. Нуклеотидні послідовності відповідно до даного винаходу можуть також використовуватися в сенсовій орієнтації для того, щоб супресувати експресію ендогенних генів в рослинах. Способи для супресії генної експресії у рослинах з використанням нуклеотидних послідовностей в сенсовій орієнтації відомі в даній області техніки. Способи, як правило, включають трансформацію рослин за допомогою ДНК конструкції, що містить промотор, який запускає експресію в рослині, функціонально зв'язаний із принаймні часткою нуклеотидною послідовністю, що відповідає транскрипту ендогенного гену. Як правило, така нуклеотидна послідовність має істотну ідентичність послідовності до послідовності транскрипту ендогенного гену, бажано більше ніж приблизно 65% iдентичності послідовності, більш бажано більше ніж приблизно 85% ідентичності послідовності, найбільш бажано більше ніж приблизно 95% ідентичність послідов 41 ності. Див., Патенти США №№ 5283184 і 5034323; включені в даний документ шляхом посилання. У той час як резистентні до гербіцидів AHASL1 полінуклеотиди відповідно до винаходу знаходять використання як обирані гени-маркери для трансформації рослин відповідно до винаходу, касети експресії відповідно до винаходу можуть включати інший обираний ген-маркер для вибору трансформованих клітин. Обирані гени-маркери, включаючи такі з даного винаходу, використовуються для вибору трансформованих клітин або тканин. Генимаркери включають гени, що кодують резистентність до антибіотиків, такі як гени, які кодують неоміцинфосфотрансферазу II (ΝΕΟ) і гігроміцинфосфотрансферазу (HPT), a також гени, що обумовлюють резистентність до гербіцидних сполук, таких як глюфозинат амонію, бромоксиніл, імідазолінони і 2,4-дихлорофеноксиацетат (2,4-D). Див., в загальному, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3: 506-511; Christopherson та ін. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6314- 6318; Yao та ін. (1992) Cell 71: 63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6 2419-2422; Barkley та ін. (1980) у The Ореrоn, стор. 177-220; Нu та ін. (1987) Cell 48: 555566; Brown та ін. (1987) Cell 49: 603-612; Figge та ін. (1988) Cell 52: 713-722; Deuschle та ін. (1989) Proc. Natl. Acad. Асі USA 86: 5400-5404; Fuerst та ін. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2549-2553; Deuschle та ін. (1990) Science 248: 480-483; Gossen (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Reines та ін. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 1917-1921; Labow та ін. (1990) Mol. Cell. Biol. 10: 3343-3356; Zambretti та ін. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3952-3956; Baim та ін. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5072-5076; Wyborski та ін. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 46474653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10: 143-162; Degenkolb та ін. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595; Kleinschnidt та ін. (1988) Biochemistry 27:1094-1104; Bonin (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Gossen та ін. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-5551; Oliva та ін. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36: 913-919; Hlavka та ін. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, том 78 ( Springer-Verlag, Berlin); Gill та ін. (1988) Nature 334: 721-724. Такі розкриття включені в даний документ шляхом посилання. Вищезгаданий список обираних генів-маркерів не є обмежуючим. Будь-який обираний ген-маркер може використовуватися в даному винаході. Ізольовані полінуклеотидні молекули, що включають нуклеотидну послідовність, що кодують AHASL1 білки даного винаходу, можуть бути використані у векторах для трансформації рослин, таким чином, що створені рослини мають підвищену резистентність до гербіцидів, особливо гербіцидів на основі імідазолінону. Ізольовані AHASL1 полінуклеотидні молекули відповідно до даного винаходу можуть бути використані у векторах окремо або у комбінації з нуклеотидною послідовністю, що кодує малу субодиницю AHAS (AHASS) ферменту, у наданні рослинам резистентності до гербіцидів. Див., Патент США № 6348643; який включений в даний документ шляхом посилання. 97344 42 Даний винахід також відноситься до вектору експресії рослин, що включає промотор, який направляє експресію у рослині, функціонально зв'язаний з ізольованою полінуклеотидною молекулою даного винаходу. Ізольована полінуклеотидна молекула включає нуклеотидну послідовність, що кодує AHASL1 білок, особливо AHASL1 білок, що містить амінокислотну послідовність, яка представлена у SEQ ID №: 2, 4, 6 або 8, або її функціональний фрагмент та варіант. Вектор експресії рослин даного винаходу не залежить від певного промотору, за виключенням того, що такий промотор здатний направляти експресію гену у рослинній клітині. Кращі промотори включають конститутивні промотори та кращі для тканин промотори. Вектори трансформації даного винаходу можуть бути використані для одержання рослин, трансформованих за допомогою гену, що розглядається. Вектор трансформації буде включати обираний ген-маркер даного винаходу та ген, що розглядається, який буде введений і типово експресований в трансформованій рослині. Такий обираний ген-маркер включає резистентний до гербіцидів AHASL1 полінуклеотид даного винаходу, функціонально зв'язаний з промотором, що направляє експресію гену у клітині-хазяїні. Для застосування у рослинах та рослинних клітинах, вектор трансформації включає обираний генмаркер, що включає гербіцид-резистентний AHASL1 полінуклеотид даного винаходу, функціонально зв'язаний з промотором, що направляє експресію гену у рослинній клітині. Гени, що розглядаються у даному винаході, відрізняються залежно від бажаного результату. Наприклад, можуть представляти інтерес різні зміни у фенотипі, включаючи зміну складу жирних кислот в рослині, зміну вмісту амінокислот рослини, зміну захисних механізмів рослини до комах й/або патогенів і т.п. Цих результатів можна досягнути шляхом забезпечення експресії гетерологічних продуктів або збільшення експресії ендогенних продуктів в рослинах. Альтернативно, зазначених результатів можна досягнути шляхом забезпечення зниження експресії одного або кількох ендогенних продуктів, особливо ферментів або кофакторів в рослині. Ці зміни призводять до зміни у фенотипі трансформованої рослини. У одному втіленні даного винаходу, гени, що розглядаються, включають гени резистентності до комах, такі як, наприклад, гени токсичного білку Bacillus thuringiensis (Патенти США №№ 5366892; 5747450; 5736514; 5723756; 5593881; та Geiser та ін. (1986) Gene 48: 109). AHASL1 білки або поліпептиди даного винаходу можуть бути виділені, наприклад, з соняшникових рослин та можуть бути використані у композиції. Також, ізольована полінуклеотидна молекула, що кодує AHASL1 білок даного винаходу, може бути використана для експресування AHASL1 білку даного винаходу у мікробі, такому як Е. coli або дріжжі. Експресований AHASL1 білок може бути очищений від екстрактів Е. coli або дріжджів за допомогою будь-якого способу, відомого спеціалісту, кваліфікованому у даній галузі техніки. 43 Даний винахід також забезпечує спосіб створення трансгенної рослини, яка є резистентною до гербіцидів, що включає трансформування рослини за допомогою вектору експресії рослини, що включає промотор, який направляє експресію у рослині, функціонально зв'язаний з ізольованою полінуклеотидною молекулою даного винаходу. Ізольована полінуклеотидна молекула включає нуклеотидну послідовність, що кодує AHASL1 білок даного винаходу, зокрема AHASL1 білок, що містить: амінокислотну послідовність, яка представлена у SEQ ID №: 2 або 6, амінокислотну послідовність, що кодується SEQ ID №: 1 або 5, або функціональний фрагмент та варіант зазначених амінокислотних послідовностей. Даний винахід також відноситься до нетрансгенних соняшникових рослин, трансгенних рослин, одержаних за способами даного винаходу, та прямого потомку та інших потомків таких нетрансгенних та трансгенних рослин, де зазначені рослини показують посилену або підвищену резистентність до гербіцидів, що заважають AHAS ферменту, особливо гербіцидів на основі імідазолінону та сульфонілсечовини. AHASL1 полінуклеотиди даного винаходу, особливо ті, що кодують гербіцид-резистентні AHASL1 білки, знаходять застосування у способах підвищення резистентності стійких до гербіцидів рослин. У одному втіленні даного винаходу, стійкі до гербіцидів рослини містять стійкий до гербіцидів або резистентний до гербіцидів AHASL білок. Стійкі до гербіцидів рослини включають як рослини, трансформовані за допомогою стійких до гербіцидів AHASL нуклеотидних послідовностей, так і рослини, що містять у їх геномах ендогенний ген, що кодує стійкий до гербіцидів AHASL білок. Нуклеотидні послідовності, що кодують стійкі до гербіцидів AHASL білки та стійкі до гербіцидів рослини, що містять ендогенний ген, який кодує стійкий до гербіцидів AHASL білок, включають полінуклеотиди та рослини даного винаходу та ті, які відомі у даній галузі техніки. Див., наприклад, Патенти США №№ 5013659, 5731180, 5767361, 5545822, 5736629, 5773703, 5773704, 5952553 та 6274796; всі з яких включені у даний опис шляхом посилання. Такі способи підвищення резистентності стійких до гербіцидів рослин включають трансформування стійкої до гербіцидів рослини за допомогою принаймні однієї полінуклеотидної конструкції, що включає промотор, який направляє експресію у рослинній клітині, який функціонально зв'язаний з резистентним до гербіцидів AHASL1 полінуклеотидом даного винаходу, особливо таким як полінуклеотид, що кодує резистентний до гербіцидів AHASL1 білок, представлений у SEQ ID №: 1 або 5, полінуклеотиди, що кодують амінокислотну послідовність, представлену у SEQ ID №: 2 або 6, та фрагменти та варіанти зазначених полінуклеотидів, які кодують поліпептиди, що мають гербіцидрезистентну AHAS активність. Численні вектори трансформації рослин та способи трансформування рослин є доступними. Дивись, наприклад, An, G. та ін. (1986) Plant Pysiol, 81: 301-305; Fry, J., та ін. (1987) Plant Cell Rep. 6: 321-325; Block, M. (1988) Theor. Appl. Genet. 76: 97344 44 767-774; Hinchee, та ін. (1990) Stadler. Genet. Symp. 203212: 203-212; Cousins, та ін. (1991) Aust. J. Plant Physiol. 18: 481-494; Chee, P. P. та Slightom, J. L. (1992) Gene. 118: 255-260; Christou, та ін. (1992) Trends. Biotechnol. 10: 239-246; D'Halluin, та ін. (1992) Bio/Technol. 10: 309-314; Dhir, та ін. (1992) Plant Physiol. 99: 81-88; Casas та ін. (1993) Proc. Nat. Acad Sci. USA 90: 11212-11216; Christou, P. (1993) In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant; 29P: 119-124; Davies, та ін. (1993) Plant Cell Rep. 12: 180-183; Dong, J. А. та Mchughen, A. (1993) Plant Sci. 91: 139-148; Franklin, С І. та Trieu, T. N. (1993) Plant. Physiol. 102: 167; Golovkin, та ін. (1993) Plant Sci. 90: 41-52; Guo Chin Sci. Bull. 38: 2072-2078; Asano, та ін. (1994) Plant Cell Rep. 13; Ayeres N. M. та Park, W. D. (1994) Crit. Rev. Plant. Sci. 13: 219239; Barcelo, та ін. (1994) Plant. J. 5: 583-592; Becker, та ін. (1994) Plant. J. 5: 299-307; Borkowska та ін. (1994) Ada. Physiol Plant. 16: 225-230; Christou, P. (1994) Agro. Food. Ind. Hi Tech. 5: 1727; Еарепта ін. (1994) Plant Cell Rep. 13: 582-586; Hartman, та ін. (1994) Bio-Technology 12: 919923; Ritala, та ін. (1994) Plant. Mol. Biol. 24: 317-325; та Wan, Y. С. та Lemaux, P. G. (1994) Plant Physiol. 104: 3748. Способи відповідно до винаходу включають введення полінуклеотидної конструкції в рослину. Під "введенням" мається на увазі надання рослині полінуклеотидної конструкції у такий спосіб, що конструкція одержує доступ до внутрішньої частини рослинної клітини. Способи відповідно до винаходу не залежать від певного способу введення нуклеотидної конструкції в рослину, тільки полягають в тому, що нуклеотидна конструкція одержує доступ до внутрішньої частини принаймні однієї рослинної клітини. Способи для введення нуклеотидної конструкції в рослини відомі в даній області, включаючи способи стабільної трансформації, способи транзиторної трансформації і опосередковані вірусом способи, але не обмежуючись ними. Під терміном "стабільна трансформація" мається на увазі, що нуклеотидна конструкція, введена в рослину, інтегрується в геном рослини та здатна до успадкування її потомством. Під терміном "транзиторна трансформація" мається на увазі, що нуклеотидна конструкція, введена в рослину, не інтегрується в геном рослини. Для трансформування рослин та рослинних клітин, нуклеотидні послідовності даного винаходу вставляють з використанням стандартних технологій у будь-який вектор, відомий у даній галузі техніки, який є прийнятним для експресування нуклеотидних послідовностей у рослині або рослинній клітині. Вибір вектору залежить від кращого способу трансформування та виду цільової рослини, яку трансформують. У втіленні даного винаходу, AHASL1 нуклеотидна послідовність є функціонально зв'язаною з рослинним промотором, який є відомим для високо-рівневої експресії у рослинній клітині, та цю конструкцію далі вводять у рослину, яка є чутливою до гербіциду на основі імідазолінону, та трансформовану рослину регенерують. Трансформована рослина є стійкою до дії того рівня гербіциду на основі імідазолінону, який би 45 знищив або значно уразив нетрансформовану рослину. Зазначений спосіб може бути застосований до рослини будь-якого виду; однак, вважають за найкраще, коли застосовують до сільськогосподарських рослин, особливо сільськогосподарських рослин, які звичайно вирощують у присутності принаймні одного гербіциду, особливо гербіциду на основі імідазолінону. Методології для конструювання касет експресії рослин та введення сторонніх нуклеїнових кислот у рослини є в основному відомими у даній галузі техніки та були описані раніше. Наприклад, стороння ДНК може бути введена у рослини, використовуючи викликаючі пухлини (Ті) плазмідні вектори. Інші способи, що використовуються для доставки сторонньої ДНК, включають застосування PEG опосередкованого протопластного трансформування, електропорацію, мікроін'єкції та біолістику або бомбардування мікрочастками для прямого ДНК введення. Такі способи відомі у даній галузі техніки. (Патент США № 5405765, Vasil та ін.; Bilang та ін. (1991) Gene 100: 247-250; Scheid та ін., (1991) Mol. Gen. Genet., 228: 104-112; Guerche та ін., (1987) Plant Science 52: 111-116; Neuhause та ін., (1987) Theor. Appl Genet. 75: 3036; Klein та ін., (1987) Nature 327: 70-73; Howell та ін., (1980) Science 208: 1265; Horsch та ін., (1985) Science 227: 1229-1231; DeBlock та ін., (1989) Plant Physiology 91: 694-701; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach та Weissbach, ред.) Academic Press, Inc. (1988) та Methods in Plant Molecular Biology (Schuler та Zielinski, ред.) Academic Press, Inc. (1989). Спосіб трансформування залежить від рослинної клітини, яку трансформують, прийнятності використовуваних векторів, рівня експресії генних продуктів та інших параметрів. До інших придатних способів введення нуклеотидних послідовностей в рослинні клітини та наступної вставки в геном рослини належать: мікроін'єкція, як описано Crossway та ін. (1986) Biotechniques 4: 320-334, електропорація, як описано Riggs та ін. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5602-5606, Agrobacterium-опосередкована трансформація, як описано Townsend та ін., Патент США № 5563055, Zhao та ін., Патент США № 5981840, пряма передача гену, як описано Paszkowski та ін. (1984) ЕМВО J. 3: 2717-2722, та балістичне прискорення часток, як описано, наприклад, у Sanford та ін., Патент США № 4945050; Tomes та ін., Патент США № 5879918; Tomes та ін., Патент США № 5886244; Bidney та ін., Патент США № 5932782; Tomes та ін. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment", у Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ред. Gamborg та Phillips (Springer-Verlag, Berlin); McCabe та ін. (1988) Biotechnology 6: 923-926); та трансформація Lec1 (WO 00/28058). Також див., Weissinger та ін. (1988) Ann. Rev. Genet. 22: 421-477; Sanford та ін. (1987) Paniculate Science and Technology 5: 27-37 (цибуля); Christou та ін. (1988) Plant Physiol. 87: 671-674 (соя); McCabe та ін. (1988) Bio/Technology 6: 923-926 (соя); Finer та McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P: 175-182 (соя); Singh та ін. (1998) Theor. Appl. Genet. 96: 319-324 (соя); Datta 97344 46 та ін. (1990) Biotechnology 8: 736-740 (рис); Klein та ін. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4305-4309 (кукурудза); Klein та ін. (1988) Biotechnology 6: 559563 (кукурудза); Tomes, Патент США № 5240855; Buising та інші, Патенти США №№ 5322783 та 5324646; Tomes та ін. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment", у Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ред. Gamborg (Springer-Verlag, Berlin) (кукурудза); Klein та ін. (1988) Plant Physiol 91: 440-444 (кукурудза); Fromm та ін. (1990) Biotechnology 8: 833-839 (кукурудза); Hooykaas-Van Slogteren та ін. (1984) Nature (London) 311: 763-764; Bowen та ін., Патент США № 5736369 (зернові культури); Bytebier та ін. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5345-5349 (лілійні); De Wet та ін. (1985) у The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ред. Chapman та ін. (Longman, New York), стор. 197-209 (пилок); Kaeppler та ін. (1990) Plant Cell Reports 9: 415-418 та Kaeppler та ін. (1992) Theor. Appl. Genet. 84: 560-566 (нитковидно-опосередкована трансформація); D'Halluin та ін. (1992) Plant Cell 4: 14951505 (електропорація); Li та ін. (1993) Plant Cell Reports 12: 250-255 та Christou та Ford (1995) Annals of Botany 75: 407-413 (рис); Osjoda та ін. (1996) Nature Biotechnology 14: 745-750 (кукурудза через Agrobacterium tumefaciens); всі з них включені в даний документ шляхом посилання. Полінуклеотиди відповідно до винаходу можуть бути введені в рослини при контакті рослин з вірусами або вірусними нуклеїновими кислотами. Зазвичай, такі методи включають введення полінуклеотидної конструкції відповідно до винаходу у вірусну молекулу ДНК або РНК. Визнано, що AHASL1 білок відповідно до винаходу може спочатку синтезуватися як частина вірусного поліпротеїну, а пізніше внаслідок протеолізу in vivo або in vitro може утворюватися бажаний рекомбінантний білок. Крім того, визнано, що промотори відповідно до винаходу також охоплюють промотори, що використовуються для транскрипції вірусними РНК полімеразами. Способи для введення полінуклеотидних конструкцій в рослини та експресії білку, закодований в них, за участю вірусних молекул ДНК або РНК, відомі в даній області техніки. Див., наприклад, Патенти США №№ 5889191, 5889190, 5866785, 5589367 і 5316931; включені в даний документ шляхом посилання. Клітини, які були трансформовані, можуть бути вирощені в рослини у відповідності зі стандартними способами. Див., наприклад, McCormick та ін. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84. Після цього такі рослини можна вирощувати, і опилювати за допомогою тієї ж трансформованої лінії або різних ліній, та ідентифікувати отриманий гібрид, що має конститутивну експресію бажаної фенотипної характеристики. Можна виростити два або більше поколінь, щоб гарантувати стабільну підтримку та успадкування експресії бажаної фенотипної характеристики, а потім зібрати насіння, щоб гарантувати досягнення експресії бажаної фенотипної характеристики. У такий спосіб даний винахід пропонує трансформоване насіння (що також зазначається як "трансгенне насіння"), яке містить полінуклео 47 тидну конструкцію відповідно до винаходу, наприклад, касету експресії відповідно до винаходу, стійко включену в їх геном. Даний винахід може використовуватися для трансформації будь-яких видів рослин, включаючи однодольні і дводольні, але не обмежуючись ними. До прикладів видів рослин, що розглядаються, належать кукурудза або маїс (Zea mays), Brassica sp. (наприклад, В. napus, В. rapa, B. juncea), особливо ті види Brassica, що використовуються як джерела насінної олії, люцерна (Medicago sativa), рис (Oryza sativa), жито (Secale cereale), сорго (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), просо (наприклад, просо африканське (Pennisetum glaucum), просо культурне (Раnісum mitiaceum), просо італійське (Setaria italica), дагусса (Eleusine coracana), соняшник (Helianthus annuus), сафлор (Carthamus tinctorius), пшениця (Triticum aestivum, T. Turgidum ssp. durum), соя (Glycine max), тютюн (Nicotiana tabacum), картопля (Solarium tuberosum), арахіс (Arachis hypogaea), бавовник (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), батат (Іроmоеа batatus), маніока (Manihot esculenta), кава (Coffea spp.), кокосовий горіх (Cocos nucifera), ананас (Ananas comosus), цитрусові дерева (Citrus spp.), какао (Theobroma cacao), чай (Camellia sinensis), банан (Musa spp.), авокадо (Persea americana), фіга (Ficus casica), гуава (Psidium guajava), манго (Mangifera indica), олива (Olea europaea), папайя (Carica papaya), горіх кешью (Anacardium occidentale), макадамія (Macadamia integrifolia), мигдаль (Prunus amygdalus), цукровий буряк (Beta vulgaris), цукрова тростина (Saccharum spp.), овес, ячмінь, овочі, декоративні і хвойні рослини. Переважно, рослини даного винаходу являють собою сільськогосподарські рослини (наприклад, такі як соняшник, Brassica sp., бавовник, цукровий буряк, соя, арахіс, люцерна, сафлор, тютюн, кукурудза, рис, пшениця, жито, ячмінь, тритікале, сорго, просо, тощо). Резистентні до гербіцидів рослини даного винаходу знаходять застосування у способах боротьби з бур'янами. Таким чином, даний винахід додатково забезпечує спосіб боротьби з бур'янами поблизу з резистентною до гербіцидів рослиною даного винаходу. Спосіб включає застосування ефективної кількості гербіциду до бур'янів та до резистентної до гербіцидів рослини, при чому зазначена рослина має підвищену резистентність до принаймні одного гербіциду, особливо до гербіциду на основі імідазолінону або сульфонілсечовини, у порівнянні з рослиною дикого типу. У такому способі боротьби з бур'янами, резистентні до гербіцидів рослини даного винаходу являють собою переважно сільськогосподарські рослини, включаючи такі як: соняшник, люцерна, Brassica sp., соя, бавовник, сафлор, арахіс, тютюн, помідори, картопля, пшениця, рис, кукурудза, сорго, ячмінь, жито, просо, та сорго, не обмежуючись наведеними. При забезпеченні рослин, що мають підвищену резистентність до гербіцидів, особливо гербіцидів на основі імідазолінону та сульфонілсечовини, можна використовувати цілу низку препаратів для захисту рослин від бур'янів таким чином, щоб збільшити ріст рослини та зменшити конкуренцію за 97344 48 поживними речовинами. Гербіцид може використовуватися окремо для перед-екстренного, постекстренного контролю бур'янів, контролю бур'янів перед посадкою та при посадці на площах, що оточують рослини, описані тут, або може використовуватися гербіцидна композиція на основі імідазолінону, що містить інші добавки. Гербіцид може також використовуватися для обробки насіння. Тобто ефективна концентрація або ефективна кількість гербіциду або композиція, що містить ефективну концентрацію або ефективну кількість гербіциду, може бути застосована безпосередньо до насіння до або у процесі посіву насіння. До добавок, що містяться у складі гербіцидної композиції або складу на основі імідазолінону та сульфонілсечовини, належать інші гербіциди, детергенти, ад'юванти, засоби для розповсюдження, прикріплюючі засоби, стабілізатори і т.п. Гербіцид може бути вологим або сухим препаратом та може містити сипучі порошки, емульсифікуючі концентрати й рідкі концентрати, але не обмежуючись ними. Гербіциди і препарати гербіцидів можуть бути застосовані відповідно до стандартних способів, наприклад, шляхом розпилення, орошения, розпорошування, покривання або подібним способом. Даний винахід забезпечує нетрансгенне та трансгенне насіння з підвищеною резистентністю до принаймні одного гербіциду, особливо AHASінгібуючого гербіциду. Таке насіння включає, наприклад, нетрансгенне соняшникове насіння, що має характеристики резистентності до гербіцидів рослини з патентним депозитарним номером АТСС РТА-6084, та трансгенне насіння, що містить полінуклеотидну молекулу даного винаходу, яка кодує гербіцид-резистентний AHASL1 білок. Даний винахід забезпечує способи одержання резистентної до гербіцидів рослини, особливо резистентної до гербіцидів соняшникової рослини, шляхом звичайного селекціонування рослин, що включає статеве розмноження. Зазначені способи включають схрещення першої рослини, яка є резистентною до гербіциду, з другою рослиною, яка не є резистентною до гербіциду. Перша рослина може являти собою будь-яку з резистентних до гербіцидів рослин даного винаходу, включаючи, наприклад, трансгенні рослини, що містять принаймні один з полінуклеотидів даного винаходу, які кодують гербіцид-резистентний AHASL, та нетрансгенні соняшникові рослини, що мають характеристики резистентності до гербіцидів соняшникової рослини з патентним депозитарним номером АТСС РТА-6084. Друга рослина може являти собою будь-яку рослину, яка здатна давати життєздатні потомствені рослини (тобто насіння) при схрещуванні з першою рослиною. Як правило, але не обов'язково, перша та друга рослини є рослинами одного виду. Крім того, способи даного винаходу можуть включати одне або більше поколінь зворотного схрещування потомствених рослин першого кросу з рослиною тієї ж лінії або генотипу, що і перша або друга рослина. Альтернативно, потомок першого кросу або будь-якого наступного кросу може бути схрещений з третьою рослиною, яка є рослиною іншої лінії або генотипу, ніж перша або друга рослина. Способи даного винаходу мо 49 жуть додатково включати відбір рослин, що мають характеристики резистентності до гербіцидів першої рослини. Крім того, даний винахід забезпечує способи підвищення резистентності до гербіцидів рослини, особливо гербіцид-резистентної соняшникової рослини, шляхом звичайного селекціонування рослин, що включає статеве розмноження. Зазначені способи включають схрещення першої рослини, яка є резистентною до гербіциду, з другою рослиною, яка може бути резистентною або не резистентною до гербіциду, або може бути резистентною до іншого гербіциду або гербіцидів, ніж перша рослина. Перша рослина може являти собою будьяку з резистентних до гербіцидів рослин даного винаходу, включаючи, наприклад, трансгенні рослини, що містять принаймні один з полінуклеотидів даного винаходу, які кодують гербіцидрезистентний AHASL, та нетрансгенні соняшникові рослини, що мають характеристики резистентності до гербіцидів соняшникової рослини з патентним депозитарним номером АТСС РТА-6084. Друга рослина може являти собою будь-яку рослину, яка здатна давати життєздатні потомствені рослини (тобто насіння) при схрещуванні з першою рослиною. Як правило, але не обов'язково, перша та друга рослини є рослинами одного виду. Потомствені рослини, одержані за цим способом даного винаходу, мають підвищену резистентність до гербіциду у порівнянні з першою або другою рослиною або обома. Якщо перша та друга рослини є резистентними до різних гербіцидів, потомствені рослини будуть мати об'єднані характеристики резистентності до гербіцидів першої та другої рослини. Крім того, способи даного винаходу можуть включати одне або більше поколінь зворотного схрещування потомствених рослин першого кросу з рослиною тієї ж лінії або генотипу, що і перша або друга рослина. Альтернативно, потомок першого кросу або будь-якого наступного кросу може бути схрещений з третьою рослиною, яка є рослиною іншої лінії або генотипу, ніж перша або друга рослина. Способи даного винаходу можуть додатково включати відбір рослин, що мають характеристики резистентності до гербіцидів першої рослини, другої рослини, або як першої, так і другої рослини. Даний винахід забезпечує способи, що включають застосування AHAS-інгібуючого гербіциду. У зазначених способах, AHAS-інгібуючий гербіцид може бути застосований будь-яким зі способів, відомих у даній галузі техніки, включаючи, але не обмежуючись наведеними, обробку насіння, обробку грунту та обробку листя. Перед застосуванням, AH AS-інгібуючий гербіцид може бути перетворений у звичайно використовувані композиції, наприклад, такі як розчини, емульсії, суспензії, пудри, порошки, пасти та гранули. Форма застосування залежить від певної передбачуваної цілі; у кожному випадку, вона повинна забезпечити тонкодисперсне та рівномірне розподілення сполуки у відповідності з винаходом. Композиції одержують відомим способом (дивись, наприклад, огляд US 3060084, ЕР-А 707445 (для рідких концентратів), Browning, 97344 50 "Agglomeration", Chemical Engineering, Dec. 4, 1967, 147-48, Perry's Chemical Engineer's Handbook, 4th Ed., McGraw-Hill, New York, 1963, стор. 8-57 та наступні. WO 91/13546, US 4172714, US 4144050, US 3920442, US 5180587, US 5232701, US 5208030, GB 2095558, US 3299566, Klingman, Weed Control as a Science, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1961, Hance та ін., Weed Control Handbook, 8th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1989 та Mollet, H., Grubemann, Α., Formulation technology, Wiley VCH Verlag GmbH, Weinheim (Germany), 2001, 2. D. A. Knowles, Chemistry and Technology of Agrochemical Formulations, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 1998 (ISBN 0-7514-0443-8), наприклад, шляхом збільшення об'єму активної сполуки за допомогою допоміжних речовин, прийнятних для формулювання агрохімікалій, таких як розчинники та/або носії, при бажанні, емульгуючі агенти, поверхнево-активні речовини та диспергуючі агенти, консерванти, протиспінюючі агенти, засоби від замерзання, для композиції обробки насіння також необов'язково барвники та/або зв'язуючі речовини та/або гелеутворюючі агенти. Приклади прийнятних розчинників включають такі як: вода, ароматичні розчинники (наприклад, такі як Solvesso продукти, ксилол), парафіни (наприклад, мінеральні фракції), спирти (наприклад, такі як метанол, бутанол, пентанол, бензиловий спирт), кетони (наприклад, такі як циклогексанон, гама-бутиролактон), піролідони (NMP, NOP), ацетати (гліколю диацетат), гліколі, диметиламіди жирних кислот, жирні кислоти та складні ефіри жирних кислот. В принципі, також можуть застосовуватися суміші розчинників. Приклади прийнятних носіїв включають такі як: ґрунтові природні мінерали (наприклад, такі як каоліни, глини, тальк, крейда) та ґрунтові синтетичні мінерали (наприклад, високо диспергований кремнезем, силікати). Прийнятні емульгуючі агенти включають неіонні та аніонні емульгуючі агенти (наприклад, такі як поліоксиетиленові ефіри жирних спиртів, алкілсульфонати та арилсульфонати). Приклади диспергуючих агентів включають лігнінсульфітні відпрацьовані луги та метилцелюлозу. Як поверхнево-активні речовини придатні лужні, лужноземельні, амонієві солі таких як: лігносульфонієва кислота, нафталінсульфонієва кислота, фенолсульфонієва кислота, дибутилнафталінсульфонієва кислота, алкіларилсульфонати, алкілсульфати, алкілсульфонати, сульфати спиртів жирного ряду, жирні кислоти та сульфатовані глікольефіри спиртів жирного ряду, більш того, продукти конденсації сульфонованого нафталіну або похідних нафталіну з формальдегідом, продукти конденсації нафталіну або нафталінсульфонової кислоти з фенолом та формальдегідом, поліоксіетиленоктилфенольні ефіри, етоксильовані ізооктилфенол, октилфенол, нонілфенол, алкілфеніл-полігліколеві ефіри, трибутилфенілполігліколевий ефір, тристеарилфенілполігліколевий ефір, алкіларилполіефірні спирти, конденсати окису етилену/спирту жирного ряду та 51 спирту, етоксильована касторова олія, поліоксиетиленалкілові ефіри, етоксильований поліоксипропілен, поліглікольефірний ацетат лаурилових спиртів, складні ефіри сорбіту, лігнінсульфітні відпрацьовані луги або метилцелюлоза. Речовини, які є прийнятними для одержання розчинів, які можуть бути безпосередньо розпилені, емульсій, паст або масляних дисперсій, являють собою фракції мінерального масла з від середньої до високої точкою кипіння, такі як керосин або дизельне паливо, більш того, кам'яновугільні масла та масла рослинного або тваринного походження, аліфатичні, циклічні та ароматичні вуглеводні, наприклад, такі як толуол, ксилол, парафін, тетрагідронафталін, алкільовані нафталіни або їх похідні, метанол, етанол, пропанол, бутанол, циклогексанол, циклогексанон, ізофорон, сильно полярні розчинники, наприклад, диметилсульфоксид, N-метилпіролідон та вода. Засоби від замерзання, такі як гліцерин, етиленгліколь, пропіленгліколь, та бактерицидні агенти також можуть бути додані до композиції. Прийнятні протиспінюючі агенти являють собою, наприклад, протиспінюючі агенти на основі кремнію або стеарату магнію. Прийнятні консерванти являють собою, наприклад, дихлорофен та ензилалкохолнапівформаль (enzylalkoholhemiformal). Композиції для обробки насіння можуть додатково включати зв'язуючі речовини та необов'язково барвники. Зв'язуючі речовини можуть бути додані для покращення прилипання активних матеріалів до насіння після обробки. Прийнятні зв'язуючі речовини являють собою блок кополімери ЕО/РО поверхнево-активні речовини, але також полівінілові спирти, полівінілпіролідони, поліакрилати, поліметакрилати, полібутени, поліізобутилени, полістирол, поліетиленаміни, поліетиленаміди, поліетиленіміни (Lupasol, Polymin), поліефіри, поліуретани, полівінілацетат, тилоза та кополімери, що одержують із зазначених полімерів. Необов'язково, барвники також можуть бути включені у композицію. Прийнятні барвники або пігменти композицій для обробки насіння включають такі як: родамін В, СІ. червоний пігмент 112, СІ. червоний розчинник 1, блакитний пігмент 15:4, блакитний пігмент 15:3, блакитний пігмент 15:2, блакитний пігмент 15:1, блакитний пігмент 80, жовтий пігмент 1, жовтий пігмент 13, червоний пігмент 112, червоний пігмент 48:2, червоний пігмент 48:1, червоний пігмент 57:1, червоний пігмент 53:1, помаранчевий пігмент 43, помаранчевий пігмент 34, помаранчевий пігмент 5, зелений пігмент 36, зелений пігмент 7, білий пігмент 6, коричневий пігмент 25, основний фіолетовий 10, основний фіолетовий 49, кислотний червоний 51, кислотний червоний 52, кислотний червоний 14, кислотний блакитний 9, кислотний жовтий 23, основний червоний 10, основний червоний 108. Приклад прийнятного гелеутворюючого агенту являє собою караген (Satiagel). Порошки, матеріали для розсіювання та продукти для розпилювання можуть бути одержані 97344 52 шляхом змішування або одночасного подрібнювання активних речовин з твердим носієм. Гранули, наприклад, покриті гранули, імпрегновані гранули та гомогенні гранули, можуть бути одержані шляхом прикріплення активних сполук до твердих носіїв. Приклади твердих носіїв включають мінеральні землі, такі як силікагелі, силікати, тальк, каолін, атаклей, вапняк, вапно, крейда, болюс, лес, глина, доломіт, діатомова земля, кальцію сульфат, магнію сульфат, магнію оксид, ґрунтові синтетичні матеріали, добрива, такі як, наприклад, амонію сульфат, амонію фосфат, амонію нітрат, сечовини, та продукти рослинного походження, такі як борошно зі злакових рослин, борошно з деревної кори, деревне борошно та борошно з горіхової шкаралупи, целюлозні порошки та інші тверді носії. В основному, композиції включають від 0,01 до 95% за масою, переважно від 0,1 до 90% за масою, AHAS-інігбуючого гербіциду. У цьому випадку, AHAS-інігбуючі гербіциди використовують з чистотою від 90% до 100%, переважно від 95% до 100% (відповідно до спектру ЯМР). З метою обробки насіння, відповідні композиції можуть бути розведені у 2-10 разів з одержанням концентрацій у готових до застосування препаратах від 0,01 до 60% за масою активної сполуки, переважно від 0,1 до 40% за масою. AHAS-інгібуючий гербіцид може бути використаний окремо, у формі його композицій або формах застосування, одержаних з нього, наприклад, у формі безпосередньо розпилюємих розчинів, порошків, суспензій або дисперсій, емульсій, масляних дисперсій, паст, продуктів, що розпилюються, матеріалів для розповсюдження, або гранул, шляхом розбризкування, розпилювання, опилення, розсіювання або поливання. Форми застосування повністю залежать від намічених цілей; вони повинні забезпечити у кожному випадку найкраще можливе розповсюдження AHAS-інгібуючого гербіциду у відповідності з винаходом. Водні форми застосування можуть бути одержані з емульсійних концентратів, паст або порошків, що змочуються, (порошки, що розприскуються, масляні дисперсії) шляхом додавання води. Для одержання емульсій, паст або масляних дисперсій, речовини, у чистому вигляді або розчинені у маслі або розчиннику, можуть бути гомогенізовані у воді за допомогою зволожуючого засобу, речовини для підвищення клейкості, диспергуючої речовини або емульгуючої речовини. Однак, також можна одержати концентрати, що складаються з активної речовини, зволожуючого засобу, речовини для підвищення клейкості, диспергуючої речовини або емульгуючої речовини та, якщо прийнятно, розчиннику або масла, й такі концентрати є прийнятними для розведення водою. Концентрації активної сполуки у готових до застосування препаратах можуть змінюватися у відносно широких межах. В основному, вони становлять від 0,0001 до 10%, переважно від 0,01 до 1% за масою. AHAS-інгібуючий гербіцид також може бути успішно використаний у процесі надмалого об'єму (ULV), можна застосовувати композиції, що містять 53 понад 95% за масою активної сполуки, або навіть застосовувати активну сполуку без допоміжних речовин. Далі наведені приклади композицій: 1. Продукти для розведення водою для застосувань на листі. З метою обробки насіння, такі продукти можуть застосовуватися до насіння розведеними або нерозведеними. A) Водорозчинні концентрати (SL, LS) Десять частин за масою AHAS-інгібуючого гербіциду розчиняють у 90 частинах за масою води або водорозчинного розчиннику. Альтернативно, додають зволожуючі агенти або інші допоміжні агенти. AHAS-інгібуючий гербіцид розчиняють при розведенні водою, у відповідності з чим одержують композицію з 10% (мас./мас.) AHASінгібуючого гербіциду. B) Диспергуємі концентрати (DC) Двадцять частин за масою AHAS-інгібуючого гербіциду розчиняють у 70 частинах за масою циклогексанону з додаванням 10 частин за масою диспергуючої речовини, наприклад, полівінілпіролідону. Розведення водою приводить до одержання дисперсії, у відповідності з чим одержують композицію з 20% (мас./мас.) AHAS-інгібуючого гербіциду. C) Емульгіруємі концентрати (EC) П'ятнадцять частин за масою AHASінгібуючого гербіциду розчиняють у 7 частинах за масою ксилолу з додаванням кальцію додецилбензолсульфонату та етоксилату касторового масла (у кожному випадку 5 частин за масою). Розведення водою приводить до одержання емульсії, у відповідності з чим одержують композицію з 15% (мас./мас.) AHAS-інгібуючого гербіциду. D) Емульсії (EW, ЕО, ES) Двадцять п'ять частин за масою AHASінгібуючого гербіциду розчиняють у 35 частинах за масою ксилолу з додаванням кальцію додецилбензолсульфонату та етоксилату касторового масла (у кожному випадку 5 частин за масою). Зазначену суміш вводять у 30 частин за масою води за допомогою емульгуючої машини (наприклад, Ultraturax) та перетворюють у гомогенну емульсію. Розведення водою приводить до одержання емульсії, у відповідності з чим одержують композицію з 25% (мас./мас.) AHAS-інгібуючого гербіциду. E) Суспензії (SC, OD, FS) У шаровому млині з безперервним перемішуванням, 20 частин за масою AHAS-інгібуючого гербіциду подрібнюють з додаванням 10 частин за масою диспергуючих агентів, зволожуючих агентів та 70 частин за масою води або органічного розчиннику з одержанням тонкодисперсної суспензії AHAS-інгібуючого гербіциду. Розведення водою приводить до одержання стійкої суспензії AHASінгібуючого гербіциду, у відповідності з чим одержують композицію з 20% (мас./мас.) AHASінгібуючого гербіциду. F) Водо-диспергуємі гранули та водорозчинні гранули (WG, SG) П'ятдесят частин за масою AHAS-інгібуючого гербіциду ретельно подрібнюють з додаванням 50 частин за масою диспергуючих агентів та зволожуючих агентів та перетворюють у водо 97344 54 диспергуємі або водорозчинні гранули за допомогою технічних засобів (наприклад, таких як екструзія, скрубер з розпилюючим зрошенням, псевдозріджений шар). Розведення водою приводить до одержання стійкої дисперсії або розчину AHASінгібуючого гербіциду, у відповідності з чим одержують композицію з 50% (мас./мас.) AHASінгібуючого гербіциду. G) Водо-диспергуємі порошки та водорозчинні порошки (WP, SP, SS, WS) Сімдесят п'ять частин за масою AHASінгібуючого гербіциду подрібнюють у роторстаторному млині з додаванням 25 частин за масою диспергуючих агентів, зволожуючих агентів та силікагелю. Розведення водою приводить до одержання стійкої дисперсії або розчину AHASінгібуючого гербіциду, у відповідності з чим одержують композицію з 75% (мас./мас.) AHASінгібуючого гербіциду. І) гелеві композиції (GF) У шаровому млині з безперервним перемішуванням, 20 частин за масою AHAS-інгібуючого гербіциду подрібнюють з додаванням 10 частин за масою диспергуючих агентів, 1 частини за масою гелеутворюючих агентів, зволожуючих агентів та 70 частин за масою води або органічного розчиннику з одержанням тонкодисперсної суспензії AHAS-інгібуючого гербіциду. Розведення водою приводить до одержання стійкої суспензії AHASінгібуючого гербіциду, у відповідності з чим одержують композицію з 20% (мас./мас.) AHASінгібуючого гербіциду. Зазначена гелева композиціяє прийнятною для застосування при обробці насіння. 2. Продукти для застосування нерозведеними для листового застосування. З метою обробки насіння, такі продукти можуть застосовуватися до насіння розведеними. A) Порошки, що розпилюються (DP, DS) П'ять частин за масою AHAS-інгібуючого гербіциду тонкодисперсно подрібнюють та гомогенно змішують з 95 частинами за масою тонко подрібненого каоліну. Це приводить до одержання продуктів, що розпилюються, які мають 5% (мас./мас.) AHAS-інгібуючого гербіциду. B) Гранули (GR, FG, GG, MG) Половину частини за масою AHAS-інгібуючого гербіциду тонкодисперсно подрібнюють та змішують з 95,5 частинами за масою носіїв, у відповідності з чим одержують композицію з 0,5% (мас./мас.) AHAS-інгібуючого гербіциду. Найбільш розповсюдженими способами є екструзія, сушіння розпиленням або псевдозріджений шар. Це приводить до одержання гранул, які призначені для застосування нерозведеними для використання на листі. Звичайно застосовувані композиції для обробки насіння включають, наприклад, текучі концентрати FS, розчини LS, порошки для сухої обробки DS, водо-диспергуємі порошки для суспензійної обробки WS, водо-розчинні порошки SS та емульсію ES та ЕС та гелеву композицію GF. Зазначені композиції можуть бути застосовані до насіння розведеними або нерозведеними. Застосування 55 до насіння проводять перед посівом, або безпосередньо на насіння. У кращому втіленні FS композицію застосовують для обробки насіння. Як правило, FS композиція може містити 1-800 г/л активного інгредієнту, 1200 г/л поверхневоактивної речовини, від 0 до 200 г/л агенту від заморожування, від 0 до 400 г/л зв'язуючого агенту, від 0 до 200 г/л пігменту та до 1 літру розчиннику, переважно води. Даний винахід включає нетрансгенне та трансгенне насіння резистентних до гербіцидів рослин даного винаходу. Таке насіння включає, наприклад, нетрансгенне соняшникове насіння, що має характеристики резистентності до гербіцидів рослини з патентним депозитарним номером АТСС РТА-6084, та трансгенне насіння, що включає полінуклеотидну молекулу даного винаходу, яка кодує гербіцид-резистентний AHASL1 білок. Для обробки насіння, насіння резистентних до гербіцидів рослин відповідно до даного винаходу обробляють за допомогою гербіцидів, переважно гербіцидів, вибраних з групи, що включає AHASінгібуючі гербіциди, такі як амідосульфурон, азимсульфурон, бенсульфурон, хлорімурон, хлорсульфурон, циносульфурон, циклосульфамурон, етаметсульфурон, етоксисульфурон, флазасульфурон, флупірсульфурон, форамсульфурон, галосульфурон, імазосульфурон, йодсульфурон, мезосульфурон, метсульфурон, нікосульфурон, оксасульфурон, примісульфурон, просульфурон, піразосульфурон, римсульфурон, сульфометурон, сульфосульфурон, тіфенсульфурон, тріасульфурон, трибенурон, трифлоксисульфурон, трифлусульфурон, тритосульфурон, імазаметабенз, імазамокс, імазапік, імазапір, імазаквін, імазетапір, клорансулам, диклосулам, флорасулам, флуметсулам, метосулам, пеноксулам, біспірибак, піримінобак, пропоксикарбазон, флукарбазон, пірибензоксим, пірифталід, піритіобак, та їх суміші, або за допомогою композиції, що містить AHAS-інгібуючий гербіцид. Термін «обробка насіння» включає всі технології прийнятної обробки насіння, відомі у даній галузі техніки, такі як протравлення (дезінфекція) насіння, дражирування насіння, опудрювання насіння, вологе протравлення насіння та удобрення насіння. У відповідності з одним варіантом даного винаходу, додатковий об'єкт даного винаходу являє собою спосіб обробки ґрунту шляхом застосування, зокрема у рядовій сіялці, будь-якої гранульованої композиції, що містить AHAS-інгібуючий гербіцид у вигляді композиції/складу (наприклад, гранульована композиція, необов'язково з одним або більше твердими або рідкими, сільськогосподарськи прийнятними носіями та/або необов'язково з однією або більше сільськогосподарськи прийнятними поверхнево-активними речовинами. Зазначений спосіб переважно використовують, наприклад, у грядках злаків, кукурудзи, бавовнику та соняшнику. Даний винахід також включає насіння, яке покрите за допомогою або містить композицію для обробки насіння, що включає принаймні один ALS інгібітор, вибраний з групи, що включає амідосу 97344 56 льфурон, азимсульфурон, бенсульфурон, хлорімурон, хлорсульфурон, циносульфурон, циклосульфамурон, етаметсульфурон, етоксисульфурон, флазасульфурон, флупірсульфурон, форамсульфурон, галосульфурон, імазосульфурон, йодсульфурон, мезосульфурон, метсульфурон, нікосульфурон, оксасульфурон, примісульфурон, просульфурон, піразосульфурон, римсульфурон, сульфометурон, сульфосульфурон, тіфенсульфурон, тріасульфурон, трибенурон, трифлоксисульфурон, трифлусульфурон, тритосульфурон, імазаметабенз, імазамокс, імазапік, імазапір, імазаквін, імазетапір, клорансулам, диклосулам, флорасулам, флуметсулам, метосулам, пеноксулам, біспірибак, піримінобак, пропоксикарбазон, флукарбазон, пірибензоксим, пірифталід та піритіобак. Термін "насіння" включає насіння та рослинні паростки всіх видів, включаючи, але не обмежуючись наведеним, дійсне насіння, черешки, коріневі паростки, бульбоцибулини, цибулини, фрукт, бульби, зерна, відведення, паросткові черешки та подібні та у кращому втіленні означає дійсне насіння. Термін "покрите за допомогою та/або містить" в основному означає, що активний інгредієнт знаходиться, головним чином, на поверхні продукту розмноження під час застосування, хоча більша або менша частина цього інгредієнту може проникати у продукт розмноження, в залежності від способу застосування. Коли зазначений продукт розмноження садять (пересаджують), він може абсорбувати активний інгредієнт. Застосування для обробки насіння за допомогою AHAS-інгібуючого гербіциду або за допомогою композиції, що містить AHAS-інгібуючий гербіцид, проводять шляхом обприскування або опилення насіння перед посівом рослин та перед появою рослин. У обробці насіння, відповідні композиції застосовують шляхом обробки насіння за допомогою ефективної кількості AHAS-інгібуючого гербіциду або композиції, що містить AHAS-інгібуючий гербіцид. При цьому, норми застосування становлять в основному від 0,1 г до 10 кг активного інгредієнту (або суміші активного інгредієнту або композиції) на 100 кг насіння, переважно від 1 г до 5 кг на 100 кг насіння, зокрема від 1 г до 2,5 кг на 100 кг насіння. Для специфічних сільськогосподарських культур, таких як латук, зазначена норма може бути вищою. Даний винахід забезпечує спосіб боротьби з небажаною рослинністю або боротьби з бур'янами, що включає приведення у контакт насіння резистентних рослин відповідно до даного винаходу перед посівом та/або після попереднього пророщування за допомогою AHAS-інгібуючого гербіциду. Зазначений спосіб може додатково включати посів насіння, наприклад, у грунт у полі або у горщики у теплиці. Спосіб знаходить певне застосування у боротьбі з небажаною рослинністю або боротьбі з бур'янами у безпосередній близькості з насінням. Під боротьбою з небажаною рослинністю мають на увазі знищення бур'янів та/або інше упові 57 льнення або інгібування нормального росту бур'янів. Бур'яни, у найширшому сенсі, слід розуміти в значенні всіх рослин, які ростуть у місцях, де вони небажані. Бур'яни даного винаходу включають, наприклад, дводольні та однодольні бур'яни. Дводольні бур'яни включають, не обмежуючись наведеними, бур'яни роду: Sinapis, Lepidium, Galium, Stellaria, Matricaria, Anthemis, Galinsoga, Chenopodium, Urtica, Senecio, Amaranthus, Portulaca, Xanthium, Convolvulus, Ipomoea, Polygonum, Sesbania, Ambrosia, Cirsium, Carduus, Sonchus, Solarium, Rorippa, Rotala, Lindemia, Lamium, Veronica, Abutilon, Emex, Datura, Viola, Galeopsis, Papaver, Centaurea, Trifolium, Ranunculus, та Taraxacum. Однодольні бур'яни включають, не обмежуючись наведеними, бур'яни роду: Echinochloa, Setaria, Panicum, Digitaria, Phleum, Poa, Festuca, Eleusine, Brachiaria, Lolium, Bromus, Avena, Cyperus, Sorghum, Agropyron, Cynodon, Monochoria, Fimbristyslis, Sagittaria, Eleocharis, Scirpus, Paspalum, Ischaemum, Sphenoclea, Dactyloctenium, Agrostis, Alopecurus, Apera. Крім того, бур'яни даного винаходу можуть включати, наприклад, сільськогосподарські рослини, які ростуть у небажаному місці. Наприклад, самосів рослин кукурудзи, тобто у полі, яке переважно включає соєві рослини, може розглядатися як бур'ян, якщо рослина кукурудзи є небажаною у полі рослин сої. Форму однини використовують у цьому описі для позначення одного або більше ніж одного (тобто, принаймні одного) граматичного об'єкту. Наприклад, "елемент" означає один або більше елементів. Як використано у цьому описі, словосполучення "що включає", або варіанти, такі як "включає" або "який включає", слід розуміти в значенні включення зазначеного елементу, цілого числа або стадії, або групи елементів, цілих чисел або стадій, але не виключення будь-якого іншого елементу, цілого числа або стадії, або групи елементів, цілих чисел або стадій. Наступні приклади представлені шляхом ілюстрації та не обмежують даний винахід. Приклад 1: Мутагенез Helianthus annuus лінії НА89 та вибір імідазолінон-резистентних рослин Наприкінці періоду росту 1, соняшникові рослини (Helianthus annuus) підтримуваної лінії НА89 обробляють за допомогою етил метансульфонату (EMS, також називають як етиловий складний ефір метансульфонової кислоти). EMS являє собою відомий мутаген, який зазвичай спричиняє G-C-доА·Т транзиції у ДНК (Jander та ін. (2003) Plant Physiol. 131: 139-146). Проводять два окремі експерименти. У першому експерименті, використовують три концентрації EMS. Рослини обробляють за допомогою розчину, що включає 0,1%, 1% або 10% (маса/об'єм) EMS. Для кожної EMS обробки, 14 рядків насіння висіюють на відкритому повітрі у дослідницькій станції Advanta Semillas Biotech Research Station у Balcarce, BsAs, Argentina. У другому експерименті, 25 рядків лінії НА89 соняшникового насіння висіюють на відкритому повітрі у Advanta Winter Nursery у Oran, Salta, 97344 58 Argentina. З цих 25 рядків, 8 рядків обробляють за допомогою 5% EMS, як описано вище. Інші 17 рядків, що залишилися, не обробляють. Для кожного з цих експериментів, всі М0 рослини запаковують у мішок перед цвітінням для того, щоб упевнитися, що отримане М1 насіння являє собою продукт самозапилення. Насіннєві шапки з кожної EMS обробки збирають та молотять всі разом. У наступний період росту, мутоване М1 насіння з рослин, які обробили за допомогою 0,1%, 1,0%, 5,0% або 10,0% EMS, висіюють на відкритому повітрі, при цьому кожну обробку на окремій ділянці. Через двадцять днів, коли рослини досягають стадії розвитку, при якій з'являється 2-4 пари листя, всі з EMS-оброблених рослин обприскують за допомогою 2Х Sweeper 70DG (100 г а.і./га). Активний інгредієнт у Sweeper являє собою імазамокс. Після обприскування гербіцидом, загалом вижило 53 рослини та їх вибирають як можливо резистентні. Розподіл резистентних рослин на EMS обробку показаний у Таблиці 1. Таблиця 1 Кількість М1 імідазолінон-резистентних соняшникових рослин, що відновилися після кожної EMS обробки EMS концентра- Кількість резистентних рослин, ція (%) що відновилися 0,1 14 1 18 5 5 10 16 Зразки тканини беруть з кожної окремої М1 рослини, що вижила, та ДНК з кожного зразка вилучають для досліджень PCR ампліфікації та секвенування, описаного нижче у Прикладі 2. 53 можливо резистентні рослини (Таблиця 1) залишають дозрівати у полі. З цих 53 рослин, 29 принесли М2 насіння, та це насіння збирають. Невдовзі після цього кожну з цих М1:2 родин висіюють на окремих ділянках (тобто, 29 ділянок, 1-3 рядків кожна у Fargo, North Dakota, USA. Ці М1:2 родини, та чутливі (дикого типу) НА89 контрольні рослини, оприскують за допомогою 0,5 X Sweeper (25 г а.і./га). Через одинадцять днів після обробки гербіцидом, визначають три родини, у яких більше ніж 50% рослин перенесли гербіцидну обробку. Перед цвітінням, рослини, що вижили, у кожній з цих трьох М1:2 родин запаковують у мішок для того, щоб забезпечити самозапилення М3 насіння. Окремі шапки з кожної М1:2 рослини збирають та молотять. Збирають тканину окремих М2 рослин з вибраних родин. Приклад 2: PCR ампліфікації та секвенування соняшникових полінуклеотидів, що кодують імідазолінон-резистентні та дикого типу AHASL1 білки ДНК вилучають з М1 тканини однієї з трьох М1:2 родин, які описані вище у Прикладі 1. ДНК з цієї М1 рослини піддають ампліфікації шляхом полімеразної ланцюгової реакції (PCR) та встановлюють послідовність для визначення джерела стійкості до імідазолінону, що детально описано нижче. 59 97344 М1 рослину з цієї родини позначають як MUT28. Геномну ДНК виділяють з MUT28 тканини, а також з тканини НА89 рослини дикого типу. Виділені ДНК зразки з MUT28 та НА89 кожен розбавляють до вихідної концентрації 100 нг/мкл для застосування як матричну ДНК для PCR 60 ампліфікацій. Всю кодуючу область соняшникового AHASL1 гену ампліфікують з MUT28 та НА89 ДНК зразків. Специфічні праймери, що використовують для одержання кожного амплікону, представлені у Таблиці 2. Таблиця 2 PCR праймери для ампліфікування кодуючої області соняшникового AHASL1 гену Область AHAS1 1-ий амплікон (843 bp) 2-ий амплікон (739 bp) 3-ій амплікон (674 bp) Назва праймеру ALS1-1F ALS1-1R ALS1-2F ALS1-2R ALS1-3F ALS1-3R З порівнянь нуклеотидних послідовностей відомих AHASL1, AHASL2 та AHASL3 генів, PCR праймери розробляють для того, щоб специфічно ампліфікувати AHASL1 ген з соняшника. Наступні PCR умови використовують при загальному об'ємі реакції 25мкл: 1X буфер (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA), 0,2 мМ dNTP (Invitrogen), 2,5 мМ MgCl2 (Invitrogen), 0,2 мкМ кожного праймеру, 0,5 мкл Platinium Taq (5U/мкл) (Invitrogen) та 100 нг геномної ДНК. PCR реакції проводять у GeneAmp PCR System 9700 (PerkinElmer, Inc., Boston, MA, USA). Циклічні умови: початкова стадія денатурації при 94°С впродовж 1 хвилини, що супроводжується 35 циклами, що складаються з етапу при 94°С впродовж 45 секунд, етапу при 52°С впродовж 45 секунд та етапу при 72°С впродовж 70 секунд, та кінцева стадія елонгації при 72°С впродовж 10 хвилин. Два мікролітри кожного кінцевого PCR Послідовність праймеру CATCATCATTAAATAACCAGAC (SEQ ID №: 11) AACCCGGTAACCTCATCGGTTC (SEQ ID №: 12) CCCGGTTTTGATAGATGTACCG (SEQ ID №: 13) CTGAGCAGCCCACATCTGATGT (SEQ ID №: 14) CTGAGCAGCCCACATCTGATGT (SEQ ID №: 15) AATTACACAACAAAACATTAAC (SEQ ID №: 16) продукту далі аналізують шляхом електрофорезу в агарозному гелі та концентрацію ДНК оцінюють шляхом порівняння з Low DNA Mass Ladder (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA). PCR продукт, що залишився, очищують, використовуючи Wizard SV Gel та PCR Clean-Up System (Promega Corp., Madison, WI, USA). Очищені PCR продукти далі цикл-секвенують, використовуючи BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), слідуючи інструкціям виробника. На додаток до праймерів, що використовують для PCR ампліфікацій (Таблиця 2), додаткові праймери, представлені у Таблиці 3, використовують для повного секвенування (встановлення послідовності) всієї кодуючої області соняшникового AHASL1 гену. Таблиця 3 Додаткові праймери для встановлення послідовності кодуючої області соняшникового AHASL1 гену Область AHAS1 1-ий амплікон 2-ий амплікон 3-ій амплікон Назва праймеру ALS-3F SUNALS1F1 ALS-6R Флуоресцентно-мічені продукти з реакцій секвенування розділяють за допомогою капілярного електрофорезу на АВІ Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) та аналізують, використовуючи програмне забезпечення АВІ Prism DNA Sequencing Analysis, версію 3.7. Файли AHASL1 секвенування соняшника, отримані з кожного амплікону, збирають, використовуючи програмне забезпечення Vector NTI Suite-Contig Express, версію 7.0 (InforMax, Frederick, MD, USA). Отримані ДНК послідовності вистроюють у лінію з AHASL1 полінуклеотидними послідовностями НА89 соняшникової лінії та Xanthium sp. (Фігура 1). Передбачувану аміно-кислотну послідовність з нового мутантного AHASL1 гену соняшника вистроюють у лінію з AHASL1 аміно-кислотними послідовностями НА89 та Xanthium sp. (Фігура 2), використовую Послідовність праймеру GCGCTGTTAGACAGTGTCC (SEQ ID №: 17) ACTAATCTTGATTTTTCG (SEQ ID №: 18) CGGCAGATTTTCAACACGGA (SEQ ID №: 19) чи програмне забезпечення Vector NTI SuiteAlignX, версію 7.0 (InforMax), використовують з параметрами, встановленими за замовчанням. Потім ідентифікують одиночні нуклеотидні поліморфізми та аміно-кислотні зміни. Приклад 3: Резистентність до гербіцидів MUT28 соняшникових рослин Для оцінки резистентності MUT28 соняшникових рослин до імідазолінонових гербіцидів, НА89 (дикий тип), MUT28 (гомозиготна), та HA89/MUT28 (гетерозиготна) соняшникові рослини вирощують на відкритому повітрі у Balcarce, Argentina протягом періоду росту у польовому випробуванні рандомізованого повноблочного плану (RCBD) з двома реплікаціями для оцінки резистентності MUT28 та HA89/MUT28 рослин до трьох доз Sweeper 70DG: 1X, 2Х та 3Х. Активний інгредієнт у Sweeper