Мотиви хімічних модифікацій для інгібіторів і міметиків мкрнк

Реферат: Винахід належить до полінуклеотидів, що забезпечують поліпшену стабільність, активність і/або токсичність при їх застосуванні як інгібіторів або міметиків мкРНК, та способів лікування пацієнтів зі станом, пов'язаним з експресією мкРНК або мРНК. UA 105390 C2 (12) UA 105390 C2 UA 105390 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ПЕРЕХРЕСНЕ ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ За даною заявкою вимагається пріоритет попередньої заявки США № 61/185033, поданої 8 червня 2009 року, яка включена як посилання в повному об'ємі. ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ Даний винахід стосується хімічних мотивів інгібіторів і міметиків мікроРНК (мкРНК або miR), а конкретно хімічно модифікованих смислових і антисмислових полінуклеотидів мкРНК, перевагами яких є активність, стабільність і/або токсичність при введенні пацієнту. ПОПЕРЕДНІЙ РІВЕНЬ ТЕХНІКИ МікроРНК (miR) беруть участь в ряді біологічних процесів, включаючи регуляцію і підтримку серцевої функції (див., Chien KR, Molecular Medicine: MicroRNAs and the tell-tale heart, Nature 447, 389-390 (2007)). Таким чином, miR являють собою відносно новий клас терапевтичних мішеней для таких станів, як, нарівні з іншими, гіпертрофія серця, інфаркт міокарда, серцева недостатність, пошкодження судин і патологічний серцевий фіброз. miR являють собою невеликі, некодуючі білок РНК, довжиною приблизно від 18 до приблизно 25 нуклеотидів, діючі як репресори мРНК-мішеней сприяючи їх руйнуванню, коли їх послідовності повністю комплементарні, або за допомогою інгібування трансляції, коли їх послідовності містять невідповідності. Зрілий ланцюг мкРНК, коли вона пов'язана зі своєю РНК-мішенню за рахунок комплементарності пар основ, вбудований в індукований РНК комплекс сайленсингу (RISC). На функцію мкРНК можна впливати терапевтично за допомогою антисмислових полінуклеотидів або полінуклеотидів, які імітують функцію мкРНК ("міметик мкРНК"). Однак якщо полінуклеотиди вводять в інтактні клітини, їх атакують і руйнують нуклеази, що приводить до втрати активності. Хоча в спробі уникнути їх руйнування отримані аналоги полінуклеотидів, наприклад, за допомогою замін в 2'-положенні (В. Sproat et al., Nucleic Acids Research 17 (1989), 3373-3386), модифікації часто впливають на активність полінуклеотиду відносно його біологічної дії, що планується. Така знижена активність, в кожному випадку, може бути результатом нездатності модифікованого полінуклеотиду формувати стабільний дуплекс з РНК-мішенню і/або зникнення взаємодії з клітинним апаратом. Для ефективного впливу на функцію мкРНК в терапевтичному значенні необхідні хімічні характеристики або мотиви для поліпшених характеристик стабільності, активності і/або токсичності інгібіторів мкРНК і міметиків мкРНК. СУТЬ ВИНАХОДУ Даний винахід стосується полінуклеотидів, що містять хімічні характеристики, які забезпечують поліпшену стабільність, активність і/або токсичність при використанні їх як інгібіторів мкРНК або міметиків мкРНК. Винахід, крім того, стосується фармацевтичних композицій і складів, що містять полінуклеотиди, і способів лікування пацієнтів з станом, пов'язаним з експресією мкРНК або мРНК. В одному з аспектів винахід стосується полінуклеотиду з однією або декількома модифікаціями нуклеотидів в положеннях 2', і щонайменше з однією кінцевою або "кепуючою" модифікацією. Мотив хімічних модифікацій може усунути необхідність в цілком пов'язаних фосфотіоатними зв'язками полінуклеотидах і/або повнорозмірних антисмислових або смислових послідовностях мкРНК. Полінуклеотид являє собою інгібітор мкРНК або міметик мкРНК, і, як продемонстровано в цьому документі, забезпечує поліпшену активність в порівнянні з немодифікованими полірибонуклеотидами і/або в порівнянні з іншими можливими модифікаціями полінуклеотидів. Наприклад, полінуклеотид може являти собою інгібітор мкРНК або міметик мкРНК з однією або з комбінацією модифікацій в положенні 2', як описано в цьому документі, таких як модифікації, вибрані з О-алкілу (наприклад, О-метилу або "OMe"), галогену (наприклад, фтору), дезокси (Н) і закритої нуклеїнової кислоти, а в деяких варіантах здійснення по суті всі, або всі, положення 2' нуклеотидів модифіковані. У деяких варіантах здійснення кінцева або кепуюча модифікація може являти собою 5' і/або 3' фосфотіоатний монофосфат, і/або групу без основи, або іншу кепуючу структуру, як описано в цьому документі. Полінуклеотид не обов'язково повинен бути повністю пов'язаний фосфотіоатними зв'язками, але там, де такі зв'язки присутні, такі зв'язки можна створювати, наприклад, між двома кінцевими нуклеотидами на 5'-кінці і двома кінцевими нуклеотидами на 3'-кінці. Нуклеотидна послідовність може бути повнорозмірною відносно зрілої мкРНК або повнорозмірною антисмисловою мкРНК (зріла форма), але в деяких варіантах здійснення полінуклеотид містить укорочену послідовність мкРНК або укорочену антисмислову послідовність мкРНК. Такі модифіковані укорочені послідовності можуть демонструвати високі рівні активності, навіть при порівнянні з більш довгими (немодифікованими або модифікованими звичайним способом) аналогами. Полінуклеотид може являти собою антагомір з антисмисловою послідовністю, 1 UA 105390 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 комплементарною (всім або частинам) miR-15b, miR-21, miR-208a або іншим, як описано в цьому документі. У другому аспекті винахід стосується фармацевтичної композиції або складу, що містять полінуклеотид за винаходом і фармацевтично прийнятний носій. Фармацевтичну композицію можна отримати у вигляді фармацевтично прийнятних форм, включаючи колоїдну дисперсну систему, макромолекулярний комплекс, нанокапсулу, мікросферу, гранулу, емульсію "масло-вводі", міцелу, змішану міцелу або ліпосому. Композиція може містити кон’югати з холестерином і іншими молекулами, таким як спрямовані ліганди, для доставки полінуклеотиду в клітинимішені ссавців. У третьому аспекті винахід стосується способу лікування пацієнта з станом, пов'язаним з експресією мкРНК або мРНК. Наприклад, стан може являти собою один або декілька з гіпертрофії серця, інфаркту міокарда, серцевої недостатності, пошкодження судин і патологічний серцевий фіброз. Такі стани піддають лікуванню, запобігають або полегшують за допомогою введення полінуклеотидів і композицій за винаходом. Таким чином, винахід стосується застосування модифікованих полінуклеотидів і композицій за винаходом для лікування станів, пов'язаних з експресією мкРНК або мРНК. ОПИС МАЛЮНКІВ Фігура 1 являє собою таблицю, в якій наведені характерні параметри модифікацій мкРНК. Представлена послідовність являє собою антисмислову послідовність (повнорозмірну і укорочену) зрілої miR-15b. Опис скорочень наданий в таблиці 3. "Умовне позначення" для кожної ілюстративної РНК включає: мкРНК-мішень (наприклад, 15b); структуру в 2' (О-метил, "OMe"; або О-метил і фтор, "Me/F"; або О-метил і дезокси, "Me/Н"; або закрита нуклеїнова кислота "ЗНК"); розмір полінуклеотиду (FL для повнорозмірного або 16-членного олігонуклеотиду); і структуру на кінці або внутрішні зв'язки, включаючи: PO для пов'язаних фосфодіефіром, PS для пов'язаних фосфотіоатом, PS_EO для пов'язаних фосфотіоатом почергово, PS_EC для фосфотіоатного кінцевого кепа, структуру без основи і POS для 5' і 3' фосфотіоатного монофосфату. На фігурі 2 представлені результати тестів in vitro для модифікованих полінуклеотидів на фігурі 1 в клітинах HeLa при двох концентраціях, 10 нМ (лівий стовпчик в кожному наборі) і 0,1 нМ (правий стовпчик в кожному наборі), з використанням аналізу з двома люциферазами. Чим більше значення відношення люцифераз, тим краще активність інгібітору. Результати згруповані по довжині, 16-членних і повнорозмірних олігонуклеотидів. Хімічні сполуки з найкращою ефективністю представлені в таблиці 4. На фігурі 3 представлені результати для модифікованих фосфотіоатним монофосфатом полінуклеотидів при прямому порівнянні з фосфодіефірним або фосфотіоатним каркасом при 10 нМ (лівий стовпчик в наборі) і 0,1 нМ (правий стовпчик в наборі) в аналізі з двома люциферазами. PO пов'язані фосфодіефіром, PS пов'язані фосфотіоатом і PO_POS пов'язані фосфодіефіром з кінцевим фосфотіоатним монофосфатом на 3' і 5'-кінцях. На фігурі 4 представлений нокаут miR-15b у мишей з полінуклеотидами 5-14 з таблиці 5. Визначали надлишок miR-15b в печінці (лівий стовпчик в наборі) і серце (правий стовпчик в наборі) і дані порівнювали з даними мишей з ін'єкцією фізіологічного розчину. На фігурі 5 представлене інгібування miR-208a модифікованими антисмисловими полінуклеотидами в кардіоміоцитах неонатальних щурів. Результати на фігурі 5 являють собою кількісну ПЛР для експресії βMHC. У лівому стовпчику представлені результати при 100 нМ інгібітору, а в правому стовпчику представлені результати при 1 нМ інгібітору. На фігурі 6 представлене інгібування miR-21 антисмисловими полінуклеотидами з різними модифікаціями в аналізі з двома люциферазами. На фігурі 7 представлений розподіл чотирьох різних модифікованих антисмислових полінуклеотидів miR-15b в тканині in vivo після ін'єкції мишам у вказаних дозах. ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Даний винахід стосується полінуклеотидів, що містять хімічні характеристики, які забезпечують поліпшену стабільність, активність і/або токсичність відносно їх застосування як інгібіторів мкРНК або міметиків мкРНК. Винахід додатково стосується фармацевтичних композицій і складів, що містять полінуклеотиди, і способів лікування пацієнтів з станом, пов'язаним з експресією мкРНК або мРНК. Модифіковані полінуклеотиди Полінуклеотид містить одну або декілька модифікацій нуклеотидів в положеннях 2' і щонайменше одну кінцеву модифікацію або "кеп", як детальніше описано нижче. Полінуклеотид являє собою інгібітор мкРНК або міметик мкРНК і демонструє поліпшену активність в порівнянні 2 UA 105390 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 з немодифікованими полірибонуклеотидами і/або в порівнянні з іншими можливими модифікаціями полінуклеотидів. Як використовується в цьому документі, "інгібітор мкРНК" являє собою полінуклеотид з послідовністю, яка є антисмисловою, комплементарною або частково комплементарною, як описано в цьому документі, зрілій одноланцюжковій мкРНК або її частині. "Міметик мкРНК" являє собою полінуклеотид з послідовністю, відповідною (ідентичною або по суті ідентичною, як описано в цьому документі) зрілій одноланцюжковій мкРНК або її частині. Полінуклеотид містить одну або декілька модифікацій нуклеотидів (у відношенні 2'гідроксилу) в положеннях 2'. Введення модифікованих в положенні 2' нуклеотидів в антисмислові олігонуклеотиди, наприклад, може збільшити стійкість олігонуклеотидів до нуклеаз і їх термостабільність з комплементарній РНК. Різні модифікації в положеннях 2' можуть бути незалежно вибрані з модифікацій, що забезпечують підвищену чутливість до нуклеаз, без небезпеки для молекулярних взаємодій з РНК-мішенню або з клітинним апаратом. Такі модифікації можна вибирати на основі їх підвищеної активності in vitro або in vivo. У цьому документі описані характерні способи визначення збільшеної активності (наприклад, IC 50) інгібування мкРНК. У деяких варіантах здійснення модифікацію в положенні 2' можна незалежно вибирати з Оалкілу (який може бути заміщеним), галогену, дезокси (Н) і закритої нуклеїнової кислоти. У певних варіантах здійснення по суті всі або всі положення 2' нуклеотидів модифіковані, наприклад, у вигляді незалежно вибраних з О-алкілу (наприклад, О-метилу), галогену (наприклад, фтору), дезокси (Н) і закритої нуклеїнової кислоти. Наприклад, кожну з модифікацій в положенні 2' можна незалежно вибрати з О-метилу і фтору. У характерних варіантах здійснення кожний з пуринових нуклеотидів містить 2'-OMe, а кожний з піримідинових нуклеотидів містить 2'-F. У певних варіантах здійснення від одного до приблизно п'яти положень 2' або приблизно від одного до приблизно трьох положення 2' залишені немодифікованими (наприклад, у вигляді 2'-гідроксилів). Модифікації в положенні 2' за винаходом також включають невеликі вуглеводневі замісники. Вуглеводневі замісники включають алкіл, алкеніл, алкініл і алкоксіалкіл, де алкіл (включаючи алкільну частину алкокси), алкеніл і алкініл можуть бути заміщеними або незаміщеними. Алкіл, алкеніл і алкініл можуть являти собою алкіл, алкеніл або алкініл від C1 до C10, такими як C2 або C3. Вуглеводневі замісники можуть містити один, або два, або три невуглецевих атоми, які можна незалежно вибирати з N, О і/або S. Модифікації в положенні 2' можуть додатково включати алкіл, алкеніл і алкініл у вигляді О-алкілу, О-алкенілу і О-алкінілу. Характерні модифікації в положенні 2' за винаходом включають заміни на 2'-O-алкіл (C1-3 алкіл, такий як 2'-OMe або 2'-OEt), 2'-O-метоксіетил (2'-O-MOE), 2'-O-амінопропіл (2'-O-AP), 2'-Oдиметиламіноетил (2'-O-DMAOE), 2'-O-диметиламінопропіл (2'-O-DMAP), 2'-Oдиметиламіноетилоксіетил (2'-O-DMAEOE) або 2'-O-N-метилацетамідо (2'-O-NMA). Модифікація в положенні 2' може являти собою OMe у всіх залишках нуклеотидів, або у всіх пуринових нуклеотидах. У певних варіантах здійснення полінуклеотид містить щонайменше одну модифікацію 2'галогеном (наприклад, замість 2'-гідроксилу), таку як 2'-фтор, 2'-хлор, 2'-бром і 2'-йод. У деяких варіантах здійснення модифікація 2'-галогеном являє собою фтор. Полінуклеотид може містити від 1 до приблизно 20 модифікації 2'-галогеном (наприклад, фтором), або від 1 до приблизно 10, або від 1 до приблизно 5 модифікацій 2'-галогеном (наприклад, фтором). У деяких варіантах здійснення полінуклеотид містить все нуклеотиди з 2'-фтором, або 2'-фтор на всіх піримідинових нуклеотидах. У певних варіантах здійснення групи 2'-фтор є незалежно ди-, триабо неметилованими. Полінуклеотид може містити одну або декілька модифікацій 2'-дезокси (наприклад, Н для 2'гідроксилу), але може містити від 1 до приблизно 20 модифікацій 2'-дезокси, або від 1 до приблизно 10, або від 1 до приблизно 5 модифікацій 2'-дезокси. У деяких варіантах здійснення полінуклеотид містить всі нуклеотиди з 2'-дезокси. У певних варіантах здійснення полінуклеотид містить одну або декілька "конформаційно загальмованих" або модифікацій нуклеозидом з біциклічним цукром (BSN), які додають збільшену термостабільність комплексам, сформованим полінуклеотидом, що містить BSN і комплементарним йому ланцюгом мікроРНК-мішені. Наприклад, в одному з варіантів здійснення полінуклеотид містить один або декілька залишків закритих нуклеїнових кислот (LNA). LNA описані, наприклад, в патенті США 6268490, патенті США 6316198, патенті США 6403566, патенті США 6770748, патенті США 6998484, патенті США 6670461 і в патенті США 7034133, які, таким чином, всі в повному об'ємі включені як посилання. "Закриті нуклеїнові кислоти" (LNA) являють собою модифіковані нуклеотиди або рибонуклеотиди, що містять додатковий місток 3 UA 105390 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 між 2' і 4' атомами вуглецю в групі цукру рибози, що приводить до "закритої" конформації. В одному з варіантів здійснення полінуклеотид містить одну або декілька LNA зі структурою, представленою в структурі A. В іншому варіанті здійснення полінуклеотид містить одну або декілька LNA зі структурою, представленою в структурі B. В ще одному варіанті здійснення полінуклеотид містить одну або декілька LNA зі структурою, представленою в структурі С. Інші відповідні модифікації BSN, які можна використати в полінуклеотидах за винаходом, включають модифікації, описані в патенті США 6403566 і патенті США 6833361, які обидва повністю включені в цей документ як посилання. У певних варіантах здійснення полінуклеотид містить приблизно від 1 до приблизно 10 закритих нуклеїнових кислот або від 2 до приблизно 5 закритих нуклеїнових кислот. У характерних варіантах здійснення полінуклеотид містить положення 2', модифіковані у вигляді 2'-OMe. Альтернативно, в положенні 2' у вигляді 2'-OMe модифіковані пуринові нуклеотиди, при цьому піримідинові нуклеотиди модифіковані в положенні 2' у вигляді 2'-фтору. Полінуклеотид додатково містить щонайменше одну кінцеву модифікацію або "кеп". Кеп може являти собою 5'- і/або 3'-кепуючу структуру. Терміни "кеп" або "кінцевий кеп" включають хімічні модифікації по будь-якому кінцю полінуклеотиду (відносно рибонуклеотидів з кінцями), і включають модифікації по зв'язку між двома останніми нуклеотидами на 5'-кінці і двома останніми нуклеотидами на 3'-кінці. Як описано в цьому документі, кепуюча структура підвищує стійкість олігонуклеотиду до екзонуклеаз без небезпеки для молекулярних взаємодій з РНКмішенню або клітинним апаратом. Такі модифікації можна вибирати на основі їх збільшеної активності in vitro або in vivo. У цьому документі описані характерні способи визначення збільшеної активності (наприклад, IC50) інгібування мкРНК. Кеп може знаходитися на 5'-кінці (5'-кеп), або на 3'-кінці (3'-кеп) або може бути присутнім на обох кінцях. У певних варіантах здійснення 5'- і/або 3'-кеп незалежно вибраний з фосфотіоатного монофосфату, залишку (групи) без основи, фосфотіоатного зв'язку, 4'тіонуклеотиду, карбоциклічного нуклеотиду, фосфодитіоатного зв'язку, інвертованого нуклеотиду або інвертованої групи без основи (2'-3' або 3'-3'), фосфодитіоатного монофосфату і метилфосфонатної групи. Фосфотіоатний або фосфодитіоатний зв'язок(и), коли вони є частиною кепуючої структури, в основному знаходяться між два кінцевими нуклеотидами на 5'кінці і двома кінцевими нуклеотидами на 3'-кінці. У певних варіантах здійснення полінуклеотид крім однієї або декількох модифікацій в положенні 2', як описано вище, містить щонайменше один кінцевий фосфотіоатний монофосфат. Фосфотіоатний монофосфат може сприяти більш високій активності інгібіторів мкРНК і міметиків мкРНК, інгібуючи дію екзонуклеаз, а в деяких варіантах здійснення усуває необхідність в повністю пов'язаних фосфотіоатом полінуклеотидах і/або повнорозмірних інгібіторах. Фосфотіоатний монофосфат може знаходитися на 5'- і/або 3'-кінці олігонуклеотиду. Фосфотіоатний монофосфат визначений наведеними нижче структурами, де В являє собою основу, а R являє собою модифікацію в положенні 2', як описане вище: 4 UA 105390 C2 5’-фосфотіоатний монофосфат 3’-фосфотіоатний монофосфат 5 10 15 20 У певних варіантах здійснення в доповнення до фосфотіоатного монофосфату на 5'- і/або 3'-кінці полінуклеотид містить всі положення 2', модифіковані у вигляді 2'-OMe, або, альтернативно, пуринові нуклеотиди в положенні 2' модифіковані у вигляді 2'-OMe, при цьому піримідинові нуклеотиди в положенні 2' модифіковані у вигляді 2'-фтор. Як продемонстровано в цьому документі для інгібіторів miR-15b, полінуклеотид в цих варіантах здійснення не обов'язково повинен бути повністю пов'язаний фосфотіоатними зв'язками і/або не обов'язково повинен бути повнорозмірним (відносно відповідної зрілої послідовність мкРНК). Фосфотіоатні зв'язки можуть бути присутніми в деяких варіантах здійснення, наприклад, між останніми двома нуклеотидами на 5'- і/або 3'-кінці (наприклад, як частина кепуючої структури) або як такі, що чергуються з фосфодіефірними зв'язками. У цих або інших варіантах здійснення полінуклеотид на одному з 5'- і 3'-кінців або на обох 5'і 3'-кінцях може містити щонайменше один кінцевий залишок без основи. Група без основи не містить загальновідомих пуринових або піримідинових основ нуклеотидів, таких як аденозин, гуанін, цитозин, урацил або тимін. Таким чином, в таких групах без основи відсутня основа нуклеотиду, або вони містять в 1' положенні інші групи, що не є основою нуклеотиду. Наприклад, нуклеотид без основи може являти собою обернений нуклеотид без основи, наприклад, коли обернений фосфоамідит без основи пов'язаний з 5'-амідитом (замість 3' амідиту), що приводить до фосфатного зв'язку 5'-5'. Структура оберненого нуклеозиду без основи для 5'- і 3'-кінця полінуклеотиду представлена нижче. Полінуклеотиди з такими кепуючими структурами без основ з модифікаціями 2'-OMe можуть бути особливо ефективними, як показано в цьому документі для miR-21 (фіг. 6). 5’-кінець олігонуклеотиду 25 5 UA 105390 C2 3’-кінець олігонуклеотиду 5 10 15 20 25 30 35 40 Фосфотіоатні зв'язки використовують для того, щоб зробити полінуклеотиди більш стійкими до розщеплення нуклеазами. Хоч параметри хімічних модифікацій, які описуються в цьому документі, можуть включати фосфотіоатні зв'язки (включаючи їх у вигляді кепуючої структури, як описано), в певних варіантах здійснення внутрішні фосфотіоатні зв'язки виявляються необов'язковими внаслідок описаних 2'-модифікації і кепуючої модифікації. Однак в певних варіантах здійснення полінуклеотид містить один або декілька внутрішніх фосфотіоатних зв'язків (відмінних від зв'язків в кепі). Наприклад, полінуклеотид може бути частково пов'язаним фосфотіоатними зв'язками, наприклад, фосфотіоатні зв'язки можуть чергуватися з фосфодіефірними зв'язками. Полінуклеотид може містити повнорозмірну або укорочену послідовність мкРНК або повнорозмірну або укорочену антисмислову послідовність мкРНК, по суті складатися з або складатися з них. Як використовується в цьому документі, термін "повнорозмірна" відносно послідовності мкРНК стосується довжини зрілої послідовності мкРНК або її антисмислової копії. Таким чином, інгібітори і міметики, що описуються в цьому документі, можуть являти собою укорочені або повнорозмірні (смислові або антисмислові) зрілі послідовності мкРНК або можуть містити ці послідовності в комбінації з іншими полінуклеотидними послідовностями. Наприклад, інгібітори і міметики в деяких варіантах здійснення можуть відповідати послідовностям премкРНК і при-мкРНК або їх частинам, або можуть містити інші послідовності, що не є мкРНК. У певних варіантах здійснення мотив хімічних модифікацій, що описується в цьому документі, робить повнорозмірні антисмислові або смислові (зрілі) послідовності мкРНК необов'язковими. Довжина полінуклеотиду в певних варіантах здійснення складає від 5 до 25 нуклеотидів, від 8 до 18 нуклеотидів або від 12 до 16 нуклеотидів. У певних варіантах здійснення довжина полінуклеотиду становить приблизно 8 нуклеотидів або менше, приблизно 10 нуклеотидів або менше, приблизно 12 нуклеотидів або менше або приблизно 16 нуклеотидів або менше. У деяких варіантах здійснення довжина полінуклеотиду становить приблизно 16 нуклеотидів. Полінуклеотид може містити нуклеотидну послідовність, сконструйовану для імітації зрілої мкРНК, такої як зрілі мкРНК, наведені в таблиці 1 нижче, або націлення на неї. Полінуклеотид в цих або інших варіантах здійснення також може бути спрямований або альтернативно його можна сконструювати так, щоб він був спрямований на форми пре-мкРНК або при-мкРНК. У певних варіантах здійснення послідовність полінуклеотиду, сконструйованого для інгібування мкРНК, може містити від 1 до 5 (наприклад, 2, 3, або 4) невідповідностей відносно повністю комплементарної послідовності мкРНК (представленої в таблиці 1 нижче). У певних варіантах здійснення послідовність полінуклеотиду, сконструйованого для імітації мкРНК, може містити від 1 до 5 (наприклад, 2, 3, або 4) заміни нуклеотидів відносно зрілої послідовності мкРНК (представленої в таблиці 1 нижче). Такі антисмислові і смислові послідовності можна вводити, наприклад, в кшРНК або інші структури РНК, що містять стеблові і петльові ділянки. Такі послідовності, зокрема, можна використати для імітації функції мкРНК або впливу на неї для лікування або полегшення, нарівні з іншими, гіпертрофії серця, інфаркту міокарда, серцевої недостатності (наприклад, застійної серцевої недостатності), пошкодження судин і/або патологічного серцевого фіброзу. Характерні види терапевтичної застосовності мкРНК описані в посиланнях на патенти US і PCT, приведених в таблиці 1 нижче, кожна з яких, таким чином, в 6 UA 105390 C2 повному об'ємі включена як посилання. Зрілі і препроцесовані форми мкРНК описані в посиланнях на патенти, наведених нижче, і такі описи, таким чином, також включені як посилання. Таблиця 1 мкРНК 1 100 10b 125b 128 133a 133b 139 143 145 150 15a 15b 16 181b 195 197 199a 199b 206 208a 208b 20a 21 214 22 221 222 224 23a 26a 26b 28 29a 29b 29c 30a 30b 30c 30d 30e 342-3p 382 422a 378 424 483-3p 484 ПОСЛІДОВНІСТЬ мкРНК UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG UACCCUGUAGAACCGAAUUUGUG UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA UCACAGUGAACCGGUCUCUUU UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUG UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUA UCUACAGUGCACGUGUCUCCAG UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG UAGCAGCACAUCAUGGUUUACA UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG AACAUUCAUUGCUGUCGGUGGGU UAGCAGCACAGAAAUAUUGGC UUCACCACCUUCUCCACCCAGC CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC miR-199b-5p CCCAGUGUUUAGACUAUCUGUUC miR-199b-3p ACAGUAGUCUGCACAUUGGUUA UGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGG AUAAGACGAGCAAAAAGCUUGU AUAAGACGAACAAAAGGUUUGU UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA ACAGCAGGCACAGACAGGCAGU AAGCUGCCAGUUGAAGAACUGU AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC AGCUACAUCUGGCUACUGGGU CAAGUCACUAGUGGUUCCGUU AUCACAUUGCCAGGGAUUUCC UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU AAGGAGCUCACAGUCUAUUGAG UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU UAGCACCAUUUGAAAUCGGUUA UGUAAACAUCCUCGACUGGAAG UGUAAACAUCCUACACUCAGCU UGUAAACAUCCUACACUCUCAGC UGUAAACAUCCCCGACUGGAAG UGUAAACAUCCUUGACUGGAAG UCUCACACAGAAAUCGCACCCGU GAAGUUGUUCGUGGUGGAUUCG ACUGGACUUAGGGUCAGAAGGC ACUGGACUUGGAGUCAGAAGG CAGCAGCAAUUCAUGUUUUGAA UCACUCCUCUCCUCCCGUCUU UCAGGCUCAGUCCCCUCCCGAU 7 Посилання WO 2009/012468 WO 2009/012468 WO 2009/012468 WO 2009/012468 WO 2007/070483 WO 2009/012468 WO 2009/012468 WO 2009/012468 WO 2007/070483 WO 2007/070483 WO 2009/012468 WO 2009/062169 WO 2009/062169 WO 2009/062169 WO 2009/012468 WO 2009/012468 WO 2009/012468 WO 2009/012468 US 61/047,005 WO 2007/070483 WO 2008/016924 WO 2009/018492 US 60/950,565 WO 2009/058818 US 61/047,005 WO 2009/012468 WO 2009/012468 WO 2009/012468 WO 2009/012468 WO 2009/012468 WO 2007/070483 WO 2009/012468 WO 2009/012468 WO 2009/018493 WO 2009/018493 WO 2009/018493 PCT/US2010/031147 PCT/US2010/031147 WO 2009/012468 PCT/US2010/031147 PCT/US2010/031147 WO 2009/012468 WO 2009/012468 US 2009/0226375 WO 2009/012468 WO 2009/062169 WO 2009/012468 WO 2009/012468 UA 105390 C2 486-5p 497 499 542-5p 92a 92b let-7a let-7b let-7c let-7d let-7e let-7f let-7g 451 5 10 15 20 25 30 35 40 UCCUGUACUGAGCUGCCCCGAG CAGCAGCACACUGUGGUUUGU UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU UCGGGGAUCAUCAUGUCACGAGA UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU UAUUGCACUCGUCCCGGCCUCC UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU UGAGGUAGGAGGUUGUAUAGUU UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU UGAGGUAGUAGUUUGUACAGUU AAACCGUUACCAUUACUGAGUU WO 2009/012468 WO 2009/062169 WO 2009/018492 WO 2009/012468 WO 2009/012468 WO 2009/012468 WO 2009/012468 WO 2009/012468 WO 2009/012468 WO 2009/012468 WO 2009/012468 WO 2009/012468 WO 2009/012468 PCT/US2010/034227 У певних варіантах здійснення полінуклеотид містить антисмислову послідовність повністю або частково комплементарну (як описано) всій або частини при-, пре- або зрілій miR-15b, miR208a або miR-21. miR-15b, включаючи її структуру і процесинг і її потенціал для лікування (нарівні з іншими) гіпертрофії серця, серцевої недостатності або інфаркту міокарда, описані в WO 2009/062169, таким чином, в повному об'ємі включеному як посилання. Послідовність пре-мкРНК miR-15b людини, яку можна використати для конструювання інгібуючої мкРНК за винаходом, являє собою (від 5' до 3'): UUGAGGCCUU AAAGUACUGU AGCAGCACAU CAUGGUUUAC AUGCUACAGU CAAGAUGCGA AUCAUUAUUU GCUGCUCUAG AAAUUUAAGG AAAUUCAU. miR-208a, включаючи її структуру і процесинг і її потенціал для лікування (нарівні з іншими) гіпертрофії серця, серцевої недостатності або інфаркту міокарда, описані в WO 2009/018492, таким чином, в повному об'ємі включений як посилання. Послідовність пре-мкРНК miR-208a людини, яку можна використати для конструювання інгібуючої мкРНК за винаходом, являє собою (від 5' до 3'): ACGGGCGAGC UUUUGGCCCG GGUUAUACCU GAUGCUCACG UAUAAGACGA GCAAAAAGCU TGUUGGUCAG A. miR-21, включаючи її структуру і процесинг і її потенціал для лікування (нарівні з іншими) гіпертрофії серця, серцевої недостатності або інфаркту міокарда, описані в WO 2009/058818, таким чином, в повному об'ємі включений як посилання. Послідовність пре-мкРНК miR-21 людини, яку можна використати для конструювання інгібуючої мкРНК за винаходом, являє собою (від 5' до 3'): UGUCGGGUAG CUUAUCAGAC UGAUGUUGAC UGUUGAAUCU CAUGGCAACA CCAGUCGAUG GGCUGUCUGA CA. Якщо мкРНК-мішень являє собою miR-15b, miR-208a або miR-21, то полінуклеотид може скрізь містити 2'-OMe або 2'-OMe і 2'-F, як описано, і може містити фосфотіоатні монофосфатні кепи на 5'- і 3'-кінцях, і/або залишки без основ на 5'- і/або 3'-кінцях, і/або кеповані фосфотіоатними зв'язками кінці. Полінуклеотид може бути частково пов'язаний фосфотіоатними зв'язками, або бути повністю пов'язаним фосфодіефірними зв'язками, відмінними від необов'язкової наявності фосфотіоатних кінцевих кепів. Антисмисловий полінуклеотид може бути повністю комплементарним укороченій зрілій послідовності мкРНК, такій як приблизно 8, приблизно 10, приблизно 12, приблизно 14, приблизно 15, приблизно 16, приблизно 17 або приблизно 18 нуклеотидів в довжину (наприклад, приблизно від 14 до приблизно 18 нуклеотидів в довжину). У деяких варіантах здійснення полінуклеотид містить повнорозмірну антисмислову послідовність (відносно зрілої мкРНК) або складається з (або по суті складається) неї. У цьому контексті, термін "по суті складається з" означає, що на 5'-кінці і/або 3'-кінці можна додавати додаткові нуклеотиди, оскільки від 1 до 3 нуклеотидів на кожному кінці, при умові, що не буде порушена активність і/або специфічність полінуклеотиду відносно його мішені. Послідовність/структуру полінуклеотиду можна вибирати з фігури 1, або таблиці 2 нижче. Скорочення наведені в таблиці 3. 8 UA 105390 C2 Таблиця 2 мкРНКмішень 5 10 15 20 25 30 Умовне позначення Послідовність (від 5’ до 3’) Довжина Синтез полінуклеотидів, включаючи модифіковані полінуклеотиди за допомогою твердофазного синтезу, добре відомий і розглянутий в New Chemical Methods for Synthesizing Polynucleotides. Caruthers MH, Beaucage SL, Efcavitch JW, Fisher EF, Matteucci MD, Stabinsky Y. Nucleic Acids Symp. Ser. 1980; (7):215-23. Композиції, склади і доставка Полінуклеотид можна вводити в ряд макромолекулярних агрегатів або композицій. Такі комплекси для доставки можуть включати різноманітні ліпосоми, наночастинки і міцели, сформульовані для доставки пацієнту. Комплекси можуть включати одну або декілька фузогенних або ліпофільних молекул для ініціації проникнення через клітинну мембрану. Такі молекули описані, наприклад, в патенті США 7404969 і патенті США 7202227, які, таким чином, включені як посилання в повному об'ємі. У композиції або складі можна використати множину терапевтичних полінуклеотидів, кожний незалежно, як описано в цьому документі. Наприклад, в композиції або складі можна використати від 1 до 5 інгібіторів мкРНК і/або міметиків мкРНК, кожний незалежно, як указано вище, наприклад, на основі таблиць 1, 2 і фігури 1. Полінуклеотиди за винаходом можуть бути включені до складу різних фармацевтичних композицій. Фармацевтичні композиції потрібно отримувати в формі, придатній для призначеного застосування. Як правило, це включає отримання композицій, які по суті не містять пірогенів, а також інших домішок, які небезпечні для людей або тварин. Характерні системи для доставки/складання включають колоїдні дисперсні системи, макромолекулярні комплекси, нанокапсули, мікросфери, гранули і основані на ліпідах системи, включаючи емульсії "масло-в-воді", міцели, змішані міцели і ліпосоми. Комерційно доступні жирові емульсії, прийнятні для доставки нуклеїнових кислот за винаходом в тканині серцевого і скелетних м'язів включають інтраліпід (Intralipid®), ліпосин (Liposyn®), ліпосин II, ліпосин III, нутриліпід (Nutrilipid) і інші подібні ліпідні емульсії. Переважною колоїдною системою для застосування як носій для доставки in vivo є ліпосома (тобто, штучна мембранна везикула). Отримання і використання таких систем добре відоме в даній галузі. Характерні склади також описані в US 5981505; US 6217900; US 6383512; US 5783565; US 7202227; US 6379965; US 6127170; US 5837533; US 6747014 і WO03/093449, які, таким чином, включені як посилання в повному об'ємі. 9 UA 105390 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 У фармацевтичних композиціях і складах для отримання стабільних і таких, що дозволяють захоплення клітинами-мішенями носіїв для доставки можна використати прийнятні солі і буфери. Водні композиції згідно з даним винаходом містять ефективну кількість носія для доставки, що містить послідовності інгібуючих полінуклеотидів або полінуклеотидів мкРНК (наприклад, ліпосоми або інші комплекси), розчинені або дисперговані в фармацевтично прийнятному носії або водному середовищі. Фрази "фармацевтично прийнятний" або "фармакологічно прийнятний" належать до молекулярних структур і композицій, що не викликають при введенні тварині або людині несприятливих, алергічних або інших небажаних реакцій. Як використовується в цьому документі, "фармацевтично прийнятний носій" може включати один або декілька розчинників, буферів, розчинів, диспергуючих середовищ, покриттів, антибактерійних і протигрибкових засобів, ізотонічних і затримуючих всмоктування засобів і т. п., прийнятних для застосування в формулюванні фармацевтичних засобів, таких як фармацевтичні засоби, придатні для введення людям. Використання таких середовищ і засобів для фармацевтично активних речовин добре відоме в даній галузі. У композиції також можна додавати додаткові активні інгредієнти. Введення або доставку фармацевтичних композицій згідно з даним винаходом можна проводити будь-яким шляхом за умови, що тканина-мішень досяжна цим шляхом. Наприклад, введення можна проводити за допомогою інтрадермальної, підшкірної, внутрішньом'язової, інтраперитонеальної або внутрішньовенної ін'єкції, або за допомогою прямої ін'єкції в тканинумішень (наприклад, серцеву тканину). Фармацевтичні композиції, що містять інгібітори мкРНК, або експресуючі конструкції, що містять послідовності мкРНК, також можна вводити за допомогою катетерних систем або систем, ізолюючих коронарний кровотік для доставки терапевтичних засобів в серце. Різні катетерні системи для доставки терапевтичних засобів в серце і коронарні судини відомі в даній галузі. Деякі необмежувальні приклади способів, основаних на доставці за допомогою катетерів, або способів ізоляції коронарного кровотоку, придатних для використання згідно з даним винаходом, описані в патенті США № 6416510; патенті США № 6716196; патенті США № 6953466, WO 2005/082440, WO 2006/089340, патентній публікації США № 2007/0203445, патентній публікації США № 2006/0148742 і патентній публікації США № 2007/0060907, які все, таким чином, включені як посилання в повному об'ємі. Композиції або склади також можна вводити парентерально або інтраперитонеально. Як ілюстрація можна отримувати розчини кон’югатів у вигляді вільної основи або фармакологічно прийнятної солі у воді, прийнятним чином змішаної з поверхнево-активною речовиною, такою як гідроксипропілцелюлоза. Також можна отримувати дисперсії в гліцерині, рідких поліетиленгліколях і їх сумішах і в маслах. При звичайних умовах зберігання і застосування ці препарати, як правило, містять консервант для запобігання зростанню мікроорганізмів. Фармацевтичні форми, придатні для використання за допомогою ін'єкцій або доставки за допомогою катетера включають, наприклад, стерильні водні розчини або дисперсії і стерильні порошки для препаратів стерильних ін’єктованих розчинів або дисперсій, що приготовляються для негайного прийому. В основному, ці препарати є стерильними і рідкими в тому значенні, що їх легко ін’єктувати. Препарати повинні бути стабільними в умовах отримання і зберігання і повинні бути захищені від розкладаючої дії мікроорганізмів, таких як бактерії і гриби. Прийнятні розчинники або диспергуючі середовища можуть включати, наприклад, воду, етанол, поліол (наприклад, гліцерин, пропіленгліколь і рідкий поліетиленгліколь і т. п.), їх відповідні суміші і рослинні олії. Належну текучість можна підтримувати, наприклад, за допомогою використання покриття, такого як лецитин, підтримуючи необхідний розмір частинок у випадку дисперсії, і за допомогою використання поверхнево-активних речовин. Запобігання дії мікроорганізмів можна досягати різними антибактерійними протигрибковими засобами, наприклад, парабенами, хлорбутанолом, фенолом, сорбіновою кислотою, тимеросалом і т. п. В багатьох випадках, переважно, включати до складу засоби надання ізотонічності, наприклад, цукри або хлорид натрію. Пролонгованого всмоктування ін’єктованих композицій можна домагатися використанням в композиціях засобів, затримуючих всмоктування, наприклад, моностеарату алюмінію і желатину. Стерильні ін’єктовані розчини можна отримувати додаючи кон’югати у відповідній кількості в розчинник разом з будь-якими іншими інгредієнтами (наприклад, як перераховано вище) за бажанням. Як правило, дисперсії отримують, додаючи різні стерилізовані активні інгредієнти в стерильний носій, який містить основне диспергуюче середовище і інші бажані інгредієнти, наприклад, як перераховано вище. У випадку стерильних порошків для отримання стерильних ін’єктованих розчинів, переважні способи отримання включають способи вакуумного сушіння і 10 UA 105390 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ліофілізації, що дозволяють отримувати порошок активного інгредієнта(ів) і будь-якій бажаний додатковий інгредієнт з його попередньо стерильно профільтрованого розчину. Після формулювання, розчини, переважно, вводять способом, прийнятним для лікарської форми і в такій кількості, яка є терапевтично ефективною. Склади можна легко вводити в ряді лікарських форм, таких як ін’єктовані розчини, капсули з вивільненням лікарського засобу і т. п. Наприклад, для парентерального введення у водному розчині розчин, як правило, прийнятним чином забуферюють і спочатку роблять ізотонічним рідкий розріджувач, наприклад, з використанням відповідного сольового розчину або глюкози. Такі водні розчини можна використати, наприклад, для внутрішньовенного, внутрішньом'язового, підшкірного і інтраперитонеального введення. Переважно, як відомо фахівцям в даній галузі, використовують стерильні водні середовища, особливо з урахуванням даного опису. Як ілюстрація однократну дозуможна розчиняти в 1 мл ізотонічного розчину NaCl і або додавати в 1000 мл рідини для підшкірного введення або ін’єктувати в ділянку, що планується для введення (див. наприклад, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, сторінки 1035-1038 і 1570-1580). Залежно від стану суб'єкта, що піддається лікуванню, необхідно проводити деякі зміни дози. Особа, що відповідає за введення, в будь-якому випадку повинна визначати відповідну для конкретного індивідуума дозу. Крім того, для введення людині препарати повинні задовольняти стандартам стерильності, пірогенності, загальної безпеки на вимоги стандартів FDA Office of Biologics. Способи лікування Винахід стосується способу доставки полінуклеотидів в клітини ссавця і способів лікування, полегшення або запобігання прогресуванню стану у пацієнта, який являє собою ссавця. Як правило, спосіб включає введення полінуклеотиду або композиції, що містить його, пацієнту, який являє собою ссавця. Як вже описано, полінуклеотид може являти собою інгібітор мкРНК або міметик мкРНК (наприклад, з нуклеотидною послідовністю, сконструйованою для інгібування експресії або активності мкРНК). Таким чином, пацієнт може знаходитися в стані, пов'язаному з експресією РНК, такою як експресія мкРНК. Такі стани включають, наприклад, гіпертрофію серця, інфаркт міокарда, серцеву недостатність (наприклад, застійну серцеву недостатність), пошкодження судин, рестеноз або патологічний серцевий фіброз. Таким чином, винахід стосується застосування модифікованих полінуклеотидів і композицій за винаходом для лікування таких станів і для отримання лікарських засобів для таких способів лікування, як описано. мкРНК, залучені до станів, таких як гіпертрофія серця, інфаркт міокарда, серцева недостатність (наприклад, застійна серцева недостатність), пошкодження судин, рестеноз і/або патологічний серцевий фіброз, а також послідовності для впливу на функцію мкРНК описані в WO 2008/016924, WO 2009/058818, WO 2009/018492, WO 2009/018493, WO 2009/012468, WO 2009/062169 і WO 2007/070483, кожен з яких, таким чином, включений як посилання в повному об'ємі. Такі мкРНК і послідовності додатково перераховані в таблиці 1, а модифіковані полінуклеотиди на основі цих послідовностей наведені в таблиці 2 і на фігурі 1 і описані в цьому документі. У певних варіантах здійснення у пацієнта присутній один або декілька факторів ризику, включаючи, наприклад, тривалу неконтрольовану гіпертензію, нескориговане захворювання клапанів, хронічну стенокардію, нещодавно перенесений інфаркт міокарда, спадкову схильність до захворювання серця і патологічну гіпертрофію. Альтернативно або додатково, у пацієнта можуть діагностувати наявність генетичної схильності, наприклад, до гіпертрофії серця, або у нього в сімейному анамнезі може бути присутньою, наприклад, гіпертрофія серця. У цьому аспекті даний винахід може стосуватися поліпшеної переносимості фізичного навантаження, зниженої частоті госпіталізації, кращої якості життя, зниженій захворюваності і/або зниженій смертності у пацієнтів із серцевою недостатністю або гіпертрофією серця. Далі даний винахід проілюстрований наведеними нижче додатковими прикладами, які не треба розглядати як обмежувальні. Фахівці в даній галузі з урахуванням даного опису повинні розуміти, що в конкретних описаних варіантах здійснення можна здійснювати безліч змін і проте отримувати аналогічний або схожий результат без відхилення від суті і об'єму винаходу. ПРИКЛАДИ Синтезована панель інгібіторів мкРНК (одноланцюжкових олігонуклеотидів), спрямованих до мкРНК miR-15b. Послідовності і параметри модифікацій представлені в таблиці 3 нижче, зі скороченнями. 11 UA 105390 C2 Таблиця 3 Список молекул, синтезованих для скринінга для оптимізації хімічного складу Нуклеотидна одиниця або модифікація рибо-А рибо-G рибо-С рибо-U О-метил-А O-метил-G О-метил-С O-метил-U фтор-С фтор-U дезокси-А дезокси-G дезокси-С дезокси-Т ЗНК А ЗНК G ЗНК С ЗНК Т фосфат фосфотіоатний монофосфат Повнорозмірний почергові зв'язки PS Пов'язаний фосфотіоатним зв'язком Кінцеве кепування зі зв'язком PS 5'- і 3'-фосфотіоатний монофосфат Пов'язаний фосфодіефірним зв'язком 5 10 15 20 Скорочення Нуклеотидна одиниця або модифікація рибо-А Р=S рибо-G Р=S рибо-С Р=S рибо-U Р=S О-метил-А Р=S O-метил-G Р=S О-метил-С Р=S O-метил-U Р=S фтор-С Р=S фтор-U Р=S дезокси-А Р=S дезокси-G Р=S дезокси-С Р=S дезокси-Т Р=S ЗНК AP=S ЗНК GP=S ЗНК CP=S ЗНК TP=S rA rG rC rU mА mG mC mU fC fU Так dG dC dT IA IG IC IT р ps Ключ умовних позначень FL EO Скорочення rAs rGs rCs rUs mAs mGs mCs mUs fCs fUs dAs dGs dCs dTs IAs IGs ICs ITs PS EC POS PO Синтезовано три різних зворотно комплементарних інгібітори РНК з різною довжиною відносно зрілої miR-15b, 8 н., 16н. і повнорозмірний (22 н.). Хімічні модифікації в цьому прикладі включали 2'-OMe, 2'-F, 2'-дезокси, зв'язок за допомогою фосфотіоату і ЗНК, які об'єднували в специфічні мотиви. Мотиви включали фосфотіоатні зв'язки між двома основами на кожному кінці (кінцеве кепування фосфотіоатом). Додаткові модифікації включали кінцеве кепування залишками без основ (зворотний мотив без основи з фосфатним зв'язком 5'-5' на 5'-кінці і/або з фосфатним зв'язком 3'-3' на 3'-кінці, як описано в цьому документі) або фосфотіоатними монофосфатами на обох 3'- і 5'-кінцях. Структури синтезованих полінуклеотидів представлені на фігурі 1. Приклад 1: Інгібування miR-15b in vitro Панель тестували в клітинах HeLa при двох концентраціях, 10 нМ і 0,1 нМ. Дані отримували в аналізі з двома люциферазами. За допомогою цього аналізу не тестують інгібування мкРНК напряму, а точніше тестують дію інгібованої мкРНК, яку виявляють як збільшення під дією люциферази Renilla. Друга люцифераза, люцифераза світляка, не піддається інгібуванню мкРНК, і її застосовують як внутрішній контроль. Чим більше значення відношення люцифераз, тим краща активність інгібітору. Див., Vermeulen А, et al., Double-stranded regions are essential design components of potent inhibitors of RISC function RNA 13:723-730 (2007). Результати скринінга представлені на фігурі 2. 12 UA 105390 C2 5 10 На фігурі 2 надані результати, згруповані по довжині 16-членні і повнорозмірні олігонуклеотиди. Одним помітним хімічним мотивом був 2'-OMe з фосфотіоатним монофосфатом. На фігурі 3 представлене пряме порівняння фосфотіоатного монофосфату з фосфодіефірним або фосфотіоатним каркасом. Для "повнорозмірних" інгібіторів при концентрації 10 нм він еквівалентний з речовинами, що порівнюються, але при концентрації 0,1 нМ вони є набагато активнішими. Для довжини 16 нуклеотидів інгібітори без фосфотіоатного монофосфату взагалі не демонструють значної активності. Також несподіваним є те, що повністю фосфотіоатна молекула також не є такою ж активною; таким чином, мабуть цей спосіб кінцевого кепування вносить значний внесок в активність. Найбільш ефективні чотирнадцять інгібіторів з кожного скринінга вибирали для визначення IC50, і вони перераховані в таблиці 4. Таблиця 4 Найбільш ефективні хімічні склади 15 Молекули трансфікували в клітини HeLa при шести концентраціях в діапазоні від 100 нМ до 1 пМ. Через 48 годин, очищали загальну РНК і проводили кількісну ПЛР для визначення рівнів miR-15b і контрольної РНК. Розраховували IC50, і вони представлені в таблиці нижче. Молекули, що містять кінцеві фосфотіоатні монофосфати, перераховані напівжирним шрифтом в таблиці 5. 20 13 UA 105390 C2 Таблиця 5 5 10 15 20 25 30 Приклад 2: Інгібування miR-15b in vivo Синтезували десять інгібіторів (полінуклеотидів 5-14 з таблиці 5), спрямованих до miR-15b і тестували у нормальних мишей на вплив на рівні miR-15b. Мишам (n=4) дозували 80 мг/кг за допомогою ін'єкції в хвостову вену при низькому тиску і через чотири доби тканини аналізували на рівні miR-15b. Аналізували печінку і серце і дані порівнювали з мишами, яким ін’єктували фізіологічний розчин. У печінці і серці інгібітори з фосфотіоатними монофосфатними кепами (POS) продемонстрували сильне інгібування miR-15b (див. фігуру 4). Те, що ці молекули без якихнебудь внутрішніх фосфотіоатних зв'язків або кон’югування з холестерином були здатні продемонструвати таку дію в серці, було досить несподіваним. Ці експерименти демонструють, що існують унікальні мотиви модифікацій, які збільшують активність інгібіторів мкРНК. Стабільність до нуклеаз може бути важливою ознакою, оскільки молекули, повністю зв'язані фосфодіефірними зв'язками з модифікаціями 2'-OMe є менш ефективними, ніж молекули з фосфотіоатними зв'язками. Мабуть єдиним виключенням є те, коли кінці кеповані нуклеозидами без основ або кінцевими фосфотіоатними монофосфатами. Навіть у вигляді 16-членного олігомеру IC50 цієї кепованої на кінці молекули становить 80 пМ, тоді як IC50 повнорозмірного полінуклеотиду становить 180 пМ. Цей параметр модифікацій: полінуклеотид з 2'-OMe з кінцевими фосфотіоатними монофосфатами являє собою унікальний мотив. Приклад 3: Інгібування miR-208a Отримували повнорозмірні і 16-членні інгібітори miR-208a і тестували в кардіоміоцитах новонароджених щурів через 48 годин після трансфекції по експресії bMHC (що визначається кількісною ПЛР). Інгібітори тестували при 100 нМ і 1 нМ. Інгібітори, що тестуються, включали положення 2', модифіковані у вигляді: всіх 2'-OMe; А і G модифіковані у вигляді 2'-OMe, з С і U модифікованими у вигляді 2'-F; і дезокси-А і -G, з 2'-OMe С і U. Кепуючі структури включали залишки без основ і кеповані фосфотіоатним монофосфатом. miR-208 необхідний для позитивної регуляції експресії bMHC у відповідь на навантаження на серце і для репресії генів швидких скелетних м'язів в серці. Див. WO 2009/018492 і 2008/016924, кожний з яких, таким чином, включений як посилання. 14 UA 105390 C2 5 10 Результати представлені на фігурі 5. Як продемонстровано, модифіковані в положенні 2' полінуклеотиди з кінцевим кепуванням були ефективними відносно інгібування miR-208a, навіть в концентрації 1 нМ. Приклад 4: Інгібування miR-21 Інгібітори miR-21 (з кінцевим кепуванням) тестували in vitro при 100 нМ з використанням аналізу з двома люциферазами в клітинах HeLa. Результати представлені на фігурі 6. Як продемонстровано, інгібітори з всіма 2'-OMe з кінцевими кепами без основ або кепованими на кінцях фосфотіоатним монофосфатом були особливо ефективними. Відносно miR-15b, miR208 і інгібіторів miR-21 синтезували полінуклеотиди, представлені в наведеній нижче таблиці 6. Таблиця 6 15 20 25 Приклад 5: Розподіл інгібіторів miR-15b в тканинах in vivo Синтезували чотири інгібітори miR-15b (таблиця 7) і ін’єктували мишам для оцінки їх біорозподілу в тканинах. Мишей обробляли ангіотензином II (Ang II) людини, що вводиться за допомогою осмотичного насоса, який підшкірно імплантували на спині. Через сім діб після обробки Ang II мишам дозували 1×0,33 мг/кг, 1×1 мг/кг, 1×3,3 мг/кг, 1×33 мг/кг або 3×0,33 мг/кг. Остання доза означає, що мишам 3 послідовні доби дозували по 0,33 мг/кг. На добу 4 тварин умертвляли і тканини обробляли для аналізу біорозподілу. Протягом режиму дозування обробку Ang II продовжували. У таблиці 7 перераховані послідовність і конкретні модифікації кожного з олігонуклеотидів, що використовуються в цьому експерименті. Сполука 10134 містила ЗНК і 2'-дезоксинуклеотиди і повністю фосфотіоатний каркас. Сполука 10115 містила модифікації 2'-OMe і повністю фосфотіоатний каркас. Сполука 10623 містила модифікації 2'-OMe, повністю фосфотіоатний каркас і 3' і 5' фосфотіоатний монофосфат. Сполука 10624 містила модифікації 2'-OMe, фосфотіоатні і фосфодіефірні зв'язки, що чергуються, і 3' і 5' фосфотіоатний монофосфат. 15 UA 105390 C2 Таблиця 7 № сполуки 10134 10623 10624 10116 5 10 15 20 25 Назва Послідовність ("від 5' до 3') IAs;dCs;dCs;IAs;ITs;dGs;IAs,ITs;dGs;ITs;IGs; dCs;dTs;IGs;dCs;IT ps;mAs;mCs;mCs;mAs;mUs;mGs;mAs; 15b_OMe_16_PS_POS mUs;mGs;mUs;mGs;mCs;mUs;mGs;mCs;mUs;p ps;mAs;mC;mCs;mA;mUs;mG;mAs;mU;mGs; 15b_OMe_16_PSEO_POS mU;mGs;mC;mUs;mG;mCs;mUs;p mAs;mCs;mCs;mAs;mUs;mGs;mAs;mUs; 15b_OMe_16_PS mGs;mUs;mGs;mCs;mUs;mGs;mCs;mU 15b_DNA_LNA_16_PS Довжина 16 16 16 16 На фігурі 7 наведене накопичення інгібіторів в серці, печінці, нирках і легенях. При порівнянні кепованих 2'-OMe олігонуклеотидів з некепованими, кількість інгібітору, що доставляється у всі органи, часто була вищою при кепуванні з модифікацією POS. Ефект був найбільшим при найменшій дозі 1×0,33 мг/кг. Доставка в нирки при всіх чотирьох параметрах модифікацій залишалася фактично еквівалентною. Повністю модифікований фосфотіоатний каркас в порівнянні з модифікаціями, що чергуються, також продемонстрував найбільшу доставку в серце, печінку і легені. Всі публікації, патенти і патентні заявки, ті, що описуються і цитуються в цьому документі, повністю включені як посилання. Потрібно розуміти, що винахід, який описується, не обмежений конкретними описаними способами, протоколами і матеріалами, оскільки вони можуть варіювати. Також потрібно розуміти, що термінологія, яка використовується в цьому документі призначена тільки з метою опису конкретних варіантів здійснення і не призначена для обмеження об'єму даного винаходу, який обмежений тільки прикладеною формулою винаходу. Фахівцям в даній галузі очевидні, або їм із застосуванням не більше ніж загальноприйнятого експериментування стануть очевидні множина еквівалентів конкретних варіантів здійснення винаходу, що описується в цьому документі. Мається на увазі, що такі еквіваленти включені за допомогою прикладеної формули винаходу. ПОСИЛАННЯ Наведені нижче посилання, таким чином, повністю включені як посилання для всіх цілей. B.Sproat et al., Nucleic Acids Research 17: 3373-3386 (1989). E.L. Ruff et al., Journal of Organic Chemistry, 61:1547-1550 (1996). Н. Cramer et al., Helvetica Chimica Acta, 79: 2114-2136 (1996). Vermeulen А, et al., RNA 13:723-730 (2007). патент США 5998203. 16 UA 105390 C2 17 UA 105390 C2 18 UA 105390 C2 19 UA 105390 C2 20 UA 105390 C2 21 UA 105390 C2 22 UA 105390 C2 23 UA 105390 C2 24 UA 105390 C2 25 UA 105390 C2 26 UA 105390 C2 27 UA 105390 C2 28