Спосіб виготовлення медичних противірусних препаратів, що містять наночастинки, та препарат проти вірусів герпесу hiv і грипу h1n1, виготовлений за даним способом

Реферат: Винахід належить до способів виготовлення антивірусних препаратів, що містять неорганічні активні інгредієнти у вигляді наночастинок діоксиду церію. UA 106101 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до способів виготовлення антивірусних препаратів, що містять неорганічні активні інгредієнти у вигляді наночастинок, і може бути використаний, зокрема, для виготовлення наномедичних препаратів проти вірусів герпесу, грипу та інших вірусів. За останні десятиріччя з'явилося багато публікацій та патентів щодо застосування нанорозмірніх частинок різних неорганічних речовин для посилення дії медичних препаратів. Загальний підхід зводиться до того, що вибирають речовину, корисна дія якої, як лікувального засобу, вже відома, і намагаються підсилити дію цієї речовини, застосовуючи її у вигляді частинок найменшого розміру. Посилення дії речовини пояснюють тим, що наночастинки мають набагато більшу площу поверхні у порівнянні з речовиною макроскопічного розміру, тому хімічна активність речовини зростає пропорційно площині їх поверхні. - Наприклад, загальновідомо, що іони срібла нейтралізують шкідливі бактерії та мікроорганізми у воді. На думку експертів жоден мікроорганізм не витримає більше шести хвилин безпосередньо у колоїдному розчині срібла. Відомий спосіб [1] створення антимікробної композиції, яка містить біологічно стабілізовані наночастинки срібла розміром 1-100 нм. Наночастинки виявляють антимікробну активність у досить низьких ефективних концентраціях у мазі, лосьйоні, кремі, гелі, аерозолі та т.д. завдяки надзвичайно великій площині їх поверхні. Іон міді в складі багатьох ферментів є центром, в якому відбувається взаємодія з молекулярним киснем, здатність міді до зворотного відновлення обумовлює її участь в різних окислювально-відновлювальних процесах. Відомий спосіб та препарат проти вірусу пандемічного грипу типу А (H1Ν1) [2] на основі наночастинок йодиду міді (СuI) досить великих розмірів (~ 160 нм). Автори роботи стверджують, що наночастинки CuІ генерують гідроксильні радикали з одновалентними атомами міді (Сu+), а хімічний вплив гідроксильних радикалів призводить до деградації вірусних протеїнів, таких як гемаглютинін та нейрамінідаза, що відповідно знижує інфекційну активність вірусів. - Кремній є потужним каталізатором окислювально-відновлювальних реакцій, впливає на білковий, жировий і вуглеводний обмін, бере участь в утворенні багатьох гормонів і ферментів. Кремній у вигляді діоксиду (SiO2) міститься у всіх органах і тканинах людей, в клітинах крові, нирках, м'язах, печінці, рогівці і райдужні очей, гіпофізі, щитовидній залозі. Відомий спосіб застосування наночастинок гетерокристалічних мінералів, що містять у складі діоксид кремнію, як лікарського засобу [3], який проявляє власну високу хімічну і біологічну активність. Гетерокристалічні мінерали включають кварцит, сфен, лекоксен і рутильований кварц. - Золото з давнини застосовували як ліки. Золото має виражений бактерицидний ефект, підвищує тиск, активізує обмінні процеси, поліпшує циркуляцію крові. Золото застосовується для діагностики та лікування злоякісних пухлин, сполуки золота входять до складу препаратів для лікування ревматоїдного артриту і поліартриту. Відомий спосіб [4] пригнічення активності мікроорганізмів, у т.ч. дезактивації вірусів, за допомогою антимікробного препарату, який складається з наночастинок золота розміром не більше 4 мкм, нанесених поверх наночастинок діоксиду титану розміром не більше 30 мкм. Наночастинки золота наносять методом фізичного осадження з парової фази в окислювальній атмосфері, вміст золота в препараті складає від 0,005 до 10 вагових відсотків. - Діоксид титану - це найвідоміший інгредієнт, що часто використовується у вітамінах, сонцезахисних кремах, в косметичній продукції і продуктах харчування. Особа, яка приймає деякі з вітамінів, фактично приймає діоксид титану внутрішньо. В cosmcticsdatabase.com наведені списки багатьох тисяч косметичних продуктів, у т.ч. від відомих брендів, що містять двоокис титану. Відомий спосіб [5] впливу на вірус грипу Η3Ν2 за допомогою суспензії па основі наночастинок діоксиду титану ТіО2 з розмірами ~ 4-5 нм, яку додають у суспензію вірусів. Автори способу на підставі електронномікроскопічних досліджень доводять, що вже за 15 хвилин наночастинки налипають на зовнішню оболонку вірусу і викликають її локальне руйнування, що і призводить до втрати вірусами інфекційної активності. З огляду на вищенаведене, на думку авторів запропонованого винаходу, той факт, що антивірусні властивості мають різноманітні за хімічною природою наночастинки, доводить наявність деякого універсального фізичного механізму взаємодії між наночастинками та вірусами, не пов'язаного з хімічними властивостями наночастинок та вірусів. Уявлення авторів винаходу про фізичний механізм взаємодії між наночастинками та вірусами не має аналогів у відомих літературних джерелах і є таким: Відомо, що розміри вірусів частинок складають від десятків до сотень нм, наприклад характерні розміри аденовірусів ~ 70-90 нм, розмір вірусу імунодефіциту людини ~ 100 нм, 1 UA 106101 C2 5 10 15 характерні розміри вірусів простого герпесу ~ 170 нм, а вірусів грипу - до 200 нм [6]. Віруси - це найменші інфекційні агенти, що можуть відтворюватись лише всередині живої клітини. Відоме велике розмаїття вірусів, що розрізняються способами інфікування, "спеціалізацією" на клітинах та органах, що інфікуються, та пов'язаних з цим їхньою геометричною формою. Існує спільна для всіх вірусів закономірність - всі віруси мають протеїнову білкову оболонку, в багатьох випадках сферичної форми, всередині якої міститься вірусна нуклеїнова кислота (ДНК або РНК). Це означає, що вірус як ціле може розглядатись як нанорозмірний об'єкт з достатньо великими значеннями нелінійної поляризованості. В роботі [7] ми вперше теоретично довели, що якщо поблизу вірусу буде розташована поляризована наночастинка з розмірами порядку або меншими за лінійні розміри вірусу, з дуже великою вірогідністю між вірусом та частинкою виникне взаємодія, яка обумовлена флуктуаційними полями. Нелінійна взаємодія дипольних моментів наночастинки та вірусу призводить до утворення потенціалу, що на великих відстанях має-характер притягування, а на відстанях порядку розмірів цих об'єктів - відштовхування, з утворенням достатньо глибокої потенційної ями. Залежність такого потенціалу U від відстані між частинками d виглядає так: Ud  20 25 30 35 40 45 50 55  An  6n n  2,3  d   Bn  ,  d3n  де Аn та Вn - коефіцієнти, що залежать від розмірів, форми та матеріалу частинок. Характерною особливістю такого потенціалу є те, що його мінімум формується на відстанях порядку двох-трьох діаметрів паночастинки de. (кресл.). Система вірус-наночастинка, де наночастинка має радіус декілька манометрів, а вірус десятки манометрів, знаходиться у стабільному стані, коли наночастинка розташовується на відстані ~ 10 нм від вірусної оболонки. Стабільною буде також система вірус - декілька наночастинок, якщо певна кількість наночастинок розташовується навкруги вірусу на вказаній відстані. Потенційна енергетична яма тим глибше, тобто міцність взаємодії вірусу з наночастинкою тим вище, чим менше розмір наночастинки та чим більше її поляризованість. Взагалі поляризованість діелектриків характеризується безрозмірною величиною діелектричною проникністю. Діелектрики з високою діелектричною проникністю - це оксиди металів, наприклад, ΖrO2 і HfO2 Та2О5, або складні оксидні сполуки: ВаТіО3, SrTiO3, ВаSrТіО3. Діелектрична проникність масивних матеріалів змінюється від одиниць до десятків тисяч: у SiO2 вона дорівнює 3,9; Аl2О3-9, ВаSrТіО3-300. Діелектрична проникність оксиду церію СеО2-26, кристалів СеАlО3-3000-10000. Стабільність утворених комплексів вірус/наночастинки означає, що вірус з наночастинками переміщуються разом у будь-якому середовищі, яким може вода, дисперсний розчин або колоїд, рідина, що містить білок, наприклад альбумін, фізіологічний сольовий розчин, гель, спрей, аерозоль, мазь тощо. Взаємодія вірусу з наночастинками може бути резонансною - так званий конфігураційний резонанс, що призведе до аномально ефективного поглинання системою "вірус-наночастинка" енергії вакууму або будь-якого зовнішнього випромінення. Оцінки вказаної енергії для системи, що складається з вірусу розміром ~100 нм та наночастинки розміром ~ 10 нм, дають величину від 0,003 до 0,3 еВ. Поглинання такої енергії має приводити до незворотних перетворень в структурі вірусу, та відповідного зменшення або взагалі знешкодження патогенності вірусу [7]. Запропонований новий механізм взаємодії вірусів з наночастинками на основі ефекту підсилений локального електромагнітного поля, притаманного тільки нанорозмірним фізичним системам є універсальним, не залежить від форми і структури наночастинки та вірусу. Поле вакуумних флуктуацій, яке завжди існує у будь-якій фізичній системі, з великою вірогідністю впливає на вірус навіть за відсутності зовнішнього опромінення. Дуже важливий практичний висновок полягає ще й у тому, що через запропонований механізм буде взаємодіяти з вірусом наночастинка будь-якої речовини, незалежно від її хімічної природи, ступінь взаємодії залежить тільки від ступеня поляризації наночастинки. Знешкодження вірусної активності може відбуватись двома принципово різними механізмами. Перший реалізується ще до проникнення вірусу всередину живої клітини і зводиться до такого: a. Стала система "вірус-наночастинка" має геометричні характеристики, відмінні від характеристик окремого вірусу. Оскільки здатність вірусу проникати через клітинну мембрану суттєво визначається геометричним фактором, вірус з приєднаною наночастинкою (або декількома наночастинками) втрачає можливість проникнення всередину клітини і тим самим його інфекційна активність зменшується; 2 UA 106101 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 b. Завдяки дії локального поля на рецептори, що знаходяться на поверхні вірусу, молекулярні групи на рецепторах можуть модифікуватись аж до руйнування. Оскільки рецептори вірусу взаємодіють з відповідними утворенням на клітинній оболонці за принципом комплементарності (взаємодія типу ключ-замок), то будь-яке ушкодження рецептора призводить до неможливості проникнення вірусу всередину клітини; с. Дія локального поля на вірусну частинку може носити характер термічної дії. Через локальний нагрів вірусної капсиди остання може втрачати свої властивості і тим самим активность вірусу знижується. Інший механізм знешкодження інфекційної активності вірусу працює, коли деяким вірусам і після контакту з наночастинками вдається проникнути всередину клітини та інфікувати її. Такий шлях можливий з декількох причин. По-перше, не поблизу всіх вірусів, що проникли в організм можуть локалізуватись наночастинки (наприклад, на слизовій оболонці дихальних шляхів). Подруге, завдяки статистичній природі флуктуаційних взаємодій, не на кожній системі "віруснаночастинка" може формуватись достатньо сильне локальне поле або виділятись достатня кількість теплоти. Вірус, що проник всередину клітини, може розпочати процес самовідтворення завдяки взаємодії вірусної ДНК (РНК) з клітинними органелами. У такому випадку механізм знешкодження зводиться до такого: d. Якщо вірус попадає всередину клітини без наночастинки, запускаються процеси реплікації вірусної ДНК (РНК) і формування всередині клітини нових вірусів, що виходять через мембрану клітини і можуть інфікувати інші клітини. Але всі нові віруси зустрінуться з достатньою кількістю наночастинок і зменшення їхньої активності може відбуватись згідно з механізмами а.-с.; e. Якщо всередину клітини проникає вірус з локалізованою на ньому наночастинкою (або декількома наночастинками), дія локального поля, яке має флуктуаційне походження, на систему "вірус-наночастинка" знову може реалізуватись за механізмами а.-с.; f. Існує можливість блокування наночастинками процесів реплікації вірусної ДНК всередині клітини. Таким чином можна сподіватись, що взаємодія між наночастинкою та вірусом приведе до сильного зменшення вірусної активності і тому може бути використаною у клінічній практиці. На відміну від механізму хімічної взаємодії між вірусом і нанорозмірною речовиною лікувального препарату, коли контакт між ними має бути безпосереднім, запропонований механізм ґрунтується на польовій взаємодії між напорозмірними об'єктами - вірусами та наночастинками. Наночастинки розташовуються біля вірусу та зберігають майже фіксоване положення на відстані утворення потенційної енергетичної "ями", яка дорівнює двом-трьом діаметрам наночастинки. Стабільність такого утвореного комплексу вірус-наночастинки залежить від глибини потенційної енергетичної ями і є тим міцніше, чим вище поляризованість наночастинок. Аналогами запропонованого технічного рішення є [1-4]. Згідно з аналогами, для виготовлення антивірусної субстанції з наночастинками вибирають речовину, корисна дія якої, як лікувального засобу вже відома, і намагаються підсилити дію цієї речовини, застосовуючи її у вигляді частинок найменшого розміру. Загальний недолік аналогів полягає саме у способі вибору матеріалу наночастинок, тому що матеріал наночастинок вибирають, спираючись на відомі хімічні характеристики масивного матеріалу. Проте багато неорганічних речовин у формі наночастинок є токсичними для клітин живих істот і рослий. Обзорна інформація про токсичні властивості наночастинок різних речовин наведена у [8]: - Наночастинки срібла розміром 5-50 нм мають не тільки антибактеріальну, а й сильну цитотоксичну активність in vitro. - Наночастинки міді є токсичними для живих організмів. Наприклад, дослідженнями на мишах доведено, що наночастинки міді розміром 23,5 нм гостротоксичні для печінки, селезінки, нирок мишей при пероральном уведенні у дозах (ЛД50): 413, 5000 і 110 мг/кг. - Наночастинки SiO2 розміром 15 і 46 нм в певних дозах токсичні для культури клітин бронхоальвеолярної карциноми людини. Нанодроти і наночастинки діоксиду кремнію SiO2 в концентраціях вище 190 мкг/мл викликають руйнування мембрани і некроз епітеліальних клітин людини. - Наночастинки золота розміром 1,5 і 0,8 нм токсичні для ембріонів, тип та спосіб модифікації поверхні наночастинок золота впливає на розвиток токсичною ефекту in vitro, а також на функціональну активність макрофагів. Прототипом запропонованого винаходу є спосіб дезактивації вірусу грипу за допомогою суспензії наночастинок ТіO2 [5]. 3 UA 106101 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Згідно з прототипом, наночастинки ТіO2 виготовляють через гідроліз ТіСl4 у формі колоїдного розчину з водневим показником рН 6,7. Розмір наночастинок ТіO2 складає від 4 до 10 нм, з переважною більшістю частинок розміром 4-5 нм. З наночастинок ТіO2 готують суспензію у концентрації від 0,2 мг/л до 7 мг/л. Дію суспензії з наночастинками ТіO2 випробовували на розчинах штаму вірусу A/Aichi/2/68 (H3N2), який був вирощений на культурі клітин курячих ембріонів у формі суспензії (вірус-рідина алантоїсу) з інфекційним титром 6,5 і 9,5 lg TCD50/ml. Рівні об'єми (500 мл) суспензії вірусу грипу і суспензії наночастинок ТіO2 змішують та інкубують у темряві при кімнатній температурі. Здатність відчутно подавляти біологічну активність вірусу A/Aichi/2/68 (H3N2) виявляє суспензія з концентрацію наночастинок ТіO2 від 2,0 мг/л після інкубування у темряві протягом 15 годин. Ефект дезактивації залежить від часу інкубування, концентрації вірусу і концентрації наночастинок і не залежить від наявності денного освітлення або ультрафіолетового опромінення. Проте на усіх стадіях інкубування спостерігають непошкоджені віруси, які не контактують з наночастинками ТіO2. Автори прототипу не пов'язують дію наночастинок ТіO2 з їх фотокаталітичною активністю, та припускають, що дезактивація вірусів відбувається через руйнування наночастинками оболонки вірусу, а як наслідок і руйнування та розпад вібріона як цілого. Важливо відмітити, що автори прототипу не виказують жодного припущення щодо механізму руйнування оболонки вірусу наночастинками. Недоліки прототипу: Діоксид титану у формі нанорозмірних частинок є небезпечним для клітин живих організмів [9]. Останні дослідження показали, що наночастинки діоксиду титану можуть викликати ураження нервових клітин мозку. Заданими Міжнародною агентства з дослідження раку IARC, наночастинки ТіO2, що входять до складу кремів для засмаги, мають високу каталітичну активність та сприяють утворенню вільних радикалів (наприклад, синглетного кисню), легко руйнують не тільки компоненти самого крему, а й клітини шкіри людини і тому представляють реальну небезпеку для життя і здоров'я і здатні навіть викликати рак. Наночастинки оксиду титану ТіO2 розміром 20 нм при інгаляційном уведенні щурам здатні накопичуваться в лимфоїдних тканинах, ушкоджують ДНК лімфоцітов і клітин мозку. Ефект розвивається через генерування реактивних форм кисню, окисного стресу і накопичення малонового діальдегіду. Реактивність генерованого кисню залежить не тільки від розмірів наночастинок, але від того який структурою представлений ТіO2, кристалічної або аморфної. Заданими комплексного дослідження, проведеного вченими UCLA's Jonsson Comprehensive Cancer Center, діоксид титану викликав системні генетичні ушкодження у мишей, а за даними канадського центру з охорони здоров'я і безпеки, діоксид титану може бути канцерогеном і для людини [10]. Існує ряд речовин, наночастинки яких не мають токсичної дії та навіть корисні для живого [8]. Наприклад, наночастинки оксидів заліза Fe2O3 у дозах 2-6 мкг/кг навіть стимулюють ріст тварин, бактерицидну активність сиворотки крові, зростання загального білку у крові. Оксиди ітрію забезпечують захист нервових клітин від окислювального стресу, ·при цьому прояв захисною ефекту не залежить від розміру наночастинок [11]. Наночастинки оксидів ітрію виступають безпосередньо як антиоксиданти і зменшують вміст згубних для клітин реакційноздатних кисневмісних сполук. Найбільш корисними для живих істот є "наночастинки диоксиду церію СеO2 [12]. Наночастинки СеO2 на відміну від наночастинок багатьох інших матеріалів мають навпаки сприятливі для живих клітин властивості. Найбільш малотоксичні наночастинки СеО2 розміром менше 10 нм. Так, наночастинки СеO2 розміром 8 нм не мають цитотоксичного впливу і не викликають запалення на макрофагах мишей (RAW 267.4) і бронхіальних епітеліальних клітинах людини (BEAS-2В), подавляють активні форми кисню і захищають від окислювального стресу. Внутрішньовенне уведення 0,1 мл 0,15 мМ розчину наночастинок СеO2 розміром 7 нм трансгенним мишам МСР-1 з ішемічною кардіоміопатією інгібує процеси розвитку серцевої недостатності. Зниження токсичності і зростання антиоксидантної активності наночастинок СеO2 спостерігається аж до роміру наночастинок 0,6-0,8 нм. Нижче цих розмірів коректно говорити вже про молекулярні або іонні системи. Численні дослідження впливу наночастинок СеO2 на людину також свідчать про його дуже низьку токсичність, нанокристалічний оксид церію є безпечним для застосування in vivo, є активним у біохімічних окислювально-відновлюваних процессах у живих клітинах, насамперед під час інактивації. Діелектрична проникність масивного оксиду церію СеO2 дорівнює 26. 4 UA 106101 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Задачею запропонованого винаходу є забезпечення можливості створення антивірусних препаратів, що містять неорганічні активні інгредієнти у вигляді наночастинок, що біологічно безпечні (нетоксичні) для живих організмів. Поставлена задача вирішується тим, що на підставі запропонованою авторами винаходу механізму польової взаємодії між вірусами та наночастинками до складу будь-якого антивірусного препарату вибирають наночастинки найменшого розміру, але не більше 10 нм, з числа речовин, які мають достатньо високу діелектричну проникність і у нанорозмірному стані біологічно безпечні (нетоксичні). Новизною запропонованого способу є те, що на відміну від прототипу, у запропонованому способі матеріалом наночастинки у противірусному препараті може бути будь-яка речовина, що має здатність поляризуватись, розмір наночастинок має бути якнайменшим, але не більше 20 нм, речовину для наночастинок вибирають переважно з числа таких, що є біологічно безпечними для зараженого вірусом біологічного об'єкта. Переваги винаходу над прототипом та аналогами полягають у тому, що у запропонованому способі вибір матеріалу для наночастинок ґрунтується на запропонованому механізмі польової взаємодії між вірусом і наночастинками і тому не обмежується виключно хімічними властивостями матеріалу, що значно розширює діапазон речовий, які можливо застосувати у нанорозмірному вигляді для створення антивірусної субстанції, відкриває можливість створення нетоксичних для біологічних об'єктів препаратів. Приклади реалізації запропонованого способу. Приклад 1. Наночастинки оксиду церію СеО2 проти вірусу простого герпесу (HIV) Для визначення мінімальної активної концентрації (МАК) препарату, що являє собою розчин наночастинок СеО2 діаметром 2-3 нм, тест-вірус простого герпесу (HIV) у дозі 100 ТЦД50/0,1 мл (п'ятдесятивідсоткова тканинна цитопатична доза проти вірусу простого герпесу) вносили у культуру клітин RK13 та інкубували протягом 1 год. за температури 37 °C Після адсорбції вірусу на клітинах, його видаляли і клітини відмивали живильним середовищем, після чого у підтримуюче середовище (RPMI-1640+2 % фетальної сироватки) вносили препарат СеО 2 у розведеннях від 1:20 до 1:1280. Відсутність цитопатогенної дії (ЦПД) вірусу за наявності його в контрольному зразку, а також різниця інфекційного титру в досліджуваної культурі у порівнянні з контрольною (без внесення препарату) культурою вірусу простого герпесу, дозволили виявити МАК препарату. Результати досліджень подано в Табл. 1. Зазвичай вважають, що речовина або препарат виявляють антивірусну активність, якщо рівень репродукції вірусу знижується на 2,0 loglD50 і більше. Як видно з табл. 1 препарат СеО2 у розведеннях нижче 1:80 виявляє помітну антивірусну активність. Результати цих експериментів, що виконувались in vitro, було підсилено вивченням дії препаратів з наночастинками in vivo - на живих організмах. А саме, попередньо заражені вірусом простого герпесу миші отримували лікування за допомогою препарату СеO2 у розведеннях від 1:20 до 1:80. Дія препарату ставала помітною вже через декілька годин після обробки, що підтверджує високу ефективність запропонованою методу. Таким чином, препарат можна вважати активним відносно вірусу простого герпесу, якщо концентрація наночастинок у препараті відповідає розведенню менше за 1:80. Приклад 2. Наночастинки оксиду церію СеO2 проти вірусу грипу (Н1N1). Для визначення МАК препарату наночастинок СеO2 діаметром 2-3 нм проти вірусу грипу A/FM/1/47 (Н1N1) проводились дослідження як у прикладі 1. Тест-вірус у дозі 100 ТЦД50/0,1 мл вносили у культуру клітин MDCK та інкубували протягом 1 год. за температури 37 °C. Після адсорбції вірусу його видаляли, і клітини відмивали живильним середовищем 199, після чого у підтримуюче середовище (RPMI-1640+2 % фетальної сироватки) вносили препарат СеO2 у розведеннях від 1:20 до 1:1280. Результати досліджень подано в Таблиці 2. Відсутність цитопатогенної дії у досліджених культурах, за наявності його у контролях по відношенню до вірусу грипу A/FM/1/47 (Η1Ν1) та різниця інфекційних титрів вірусу грипу більше ніж на 2logID50 дозволили виявити МАК препарату, що як і у попередньому випадку відповідає розведенню 1:80. Приклад 3. Залежність дії препарату від розміру наночастинок. Наночастинки золота Au проти вірусу грипу A/FM/1/47 (H1N1). Як згадувалось вище, однією з характерних рис механізму антивірусної дії препаратів наночастинок є ефект підсилення локального поля. Цей ефект має проявляється більш дієво для частинок меншого розміру [7]. Для визначення залежності МАК препарату Au від розмірів наночастинок було проведено визначення МАК препарату (розчини наночастинок Au з діаметрами 7-10 та - 20 нм) проти вірусу грипу A/FM/1/47 (H1N1). Для цього як і у прикладі 1 тест-вірус у дозі 100 ТЦД50/0,1 мл 5 UA 106101 C2 5 10 15 20 25 вносили у культуру клітин ΜDCK та інкубували протягом 1 год. за температури 37 °C. Після адсорбції вірусу його видаляли, і клітини відмивали живильним середовищем 199, після чого у підтримуюче середовище (RPMI1640+2 % фетальної сироватки) вносили препарат Au у розведеннях від 1:20 до 1:1280. Результати досліджені, подано в Таблиці 3. Виявилося, що для частинок діаметром до 30 нм цитопатогенна дія препаратів у досліджених культурах відсутня. Для частинок діаметром 7÷10 пм МАК відповідає розведенню 1:80. Збільшення діаметра частинок до 20 нм призводить до збільшення МАК, яка відповідає розведенню 1:40. Подальше збільшення розмірів частинок призводить до втрати препаратом антивірусної активності. Таким чином, Приклад 3 доводить, дієвість запропонованого авторами винаходу механізму польової взаємодії між вірусами та наночастинками, а саме: чим менше розмір наночастинок (7÷10 нм порівняно з 20 нм), тим менша концентрація наночастинок у препараті потрібна (розведення 1:80 порівняно з 1:40) для досягнення рівнозначного ефекту впливу на віруси, тобто наночастинки меншого розміру більш ефективні. Приклади реалізації запропонованого способу доводять дієвість таких антивірусних субстанцій: - антивірусна субстанція, що містить наночастинки СеO2 розміром 2-3 нм, активна відносно вірусу простого герпесу (HIV), якщо концентрація наночастинок у препараті відповідає розведенню менше за 1:80 мкг/мл. антивірусна субстанція, що містить наночастинки СеO2 розміром 2-3 нм активна відносно вірусу грипу A/FM/1/47 (H1N1), якщо концентрація наночастинок у препараті відповідає розведенню менше за 1:80 мкг/мл. Оскільки згідно з [7] комплекси вірус/наночастинки стабільні та здатні переміщуватись у будь-якому середовищі, то носій, що містить наночастинки може бути у формі води, дисперсного розчину або колоїду, рідини, що містить білок, наприклад альбумін, фізіологічного сольового розчини, гелю, спрею, аерозолю, мазі тощо. Таблиця 1 МАК наночастинок СеO2 відносно до вірусу простого герпесу (HIV) Концентрація СеO2 (мкг/мл) 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 контрольна культура Титр вірусу, logID50 Інгібуюча активність, logID50 2,0 4,0 4,0 5,0 5,0 5,0 5,0 6,0 4,0 2,0 2,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Таблиця 2 МАК наночастинок СеO2 відносно до вірусу грипу H1N1 Концентрація СеO2 (мкг/мл) 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 контрольна культура Титр вірусу, logID50 2,0 2,0 2,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6 Інгібуюча активність, logID50 4,0 4,0 4,0 0 0 0 0 UA 106101 C2 Таблиця 3 МАК наночастинок Аu різного розміру відносно до вірусу грипу H1N1 Концентрація Au (мкг/мл) Наночастинки діаметром 7÷10 нм 1:20 1:40 1:80 1:160 Титр вірусу, logID50 Інгібуюча активність, logID50 2,0 4,0 4,0 5,0 4,0 4,0 4,0 1,0 Таблиця 3 (продовження). МАК наночастинок Au річного розміру по відношенню до вірусу грипу H1N1 Концентрація Au (мкг/мл) Наночастинки діаметром ~ 20 нм 1:20 1:40 1:80 контрольна культура 5 10 15 20 25 30 Титр вірусу, log ID50 Інгібуюча активність, log ID50 2,0 4,0 4,0 6,0 2,0 2,0 Посилання 1. Anti-Microbial Activity of Biologically Stabilized Silver Nano Particles, US Patent Application 20070218555. published on September 20. 2007 2. Yoshie Fujimori and al, Novel Antiviral Characteristics of Nanosized Copper(I) Iodide Particles Showing Inactivation Activity against 2009 Pandemic II1N1 Influenza Virus, Appl. Environ. Microbiol. 78. No4 (2012) p. 951-955 3. Наночастинки гетерокристалічного мінералу для застосування як лікарського засобу, патент України на винахід № 92048. опубл. 27.09.2010 6. 4. Process for Limiting the Growth of Microorganisms, US Patent Application US 2010/0247592. published on September 30, 2010. 5. Mazurkova N.A., Spitsyna Yu.E., Shikina N.V.et al. "Interaction of titanium dioxide nanoparticles with influenza virus", Nanotechnologies in Russia. 2010, Vol. 5. Nos. 5-6. pp. 417-420. 6. Шмараков I.O., Марченко М.М., Співак Μ.Я. Основи вірусології. Підручник - ЧМУ. 2011. 320 с. 7. Lozovski V., Lysenko V., Pyatnitsia V., Spivak M. Can nanoparticles be useful for antiviral therapy? Semiconductor Physics. Quantum Electronics & Optoelectronics. V. 14. N 4. (2011) P. 489491. 8. Исламов P.А. и др. Токсичность наноматериалов, http://www.nanometer.ru. 2009. 9. Gurr Jia-Ran et al. Ultrafine titanium dioxide particles in the absence of photoactivation can induce oxidative damage to human bronchial epithelial cells. - Toxicology. 213 (2005). p. 66-73. 10. Диоксид титана в витаминах и косметике: насколько это безопасно для человека? Агентство медицинской информации "Citolnform", http://citoinform.com/?a=2897&c=133 11. Dargusch R. Raitano J, Chan SW. Cerium and yttrium oxide nanoparticles are neuroprotective. Biochem. and Biophys. Res. Comm., 2006, v. 342(l). p. 86-91. 12. Щербаков А.Б., Жолобак Н.М., Иванов В.К., Третьяков Ю.Д., Спивак Н.Я. Наноматериалы на основе диоксида церия: свойства и перспективы использования в биологии и медицине. // Біотехнологія. - Т. 4. - № 1, 2011. - с. 9-28. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 35 1. Спосіб виготовлення медичних противірусних препаратів, що містять неорганічні активні інгредієнти у вигляді наночастинок, який відрізняється тим, що у посудину, в якій уже присутній носій, вибраний з води, дисперсного розчину або колоїду, рідини, яка містить білок, переважно альбумін, фізіологічного сольового розчину, гелю, спрею, аерозолю, мазі, додають, перемішуючи, при кімнатній температурі наночастинки оксиду церію, які здатні поляризуватись та не мають токсичного впливу на клітини живого організму, при цьому розмір наночастинок 7 UA 106101 C2 5 вибирають якнайменшим, але не більше 10 нм, а їх концентрація становить не менше ніж 1:80 мкг/мл. 2. Препарат проти вірусу герпесу і вірусу грипу H1N1, виготовлений способом за п. 1, який містить наночастинки діоксиду церію СеО2 розміром 2-3 нм у концентрації від 1:20 мкг/мл до 1:80 мкг/мл. Комп’ютерна верстка О. Рябко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 8