Спосіб приготування препарату метафазних хромосом із патологічно змінених клітин крові хворих на мієлоїдні неоплазії людини

Реферат: Винахід належить до приготування препаратів метафазних хромосом із патологічно змінених клітин крові хворих на мієлоїдні неоплазії людини, що включає забір периферичної крові у стерильну пробірку з літієвим гепарином, відбір крові об'ємом 0,6-0,8 мл шприцом, у якому міститься суміш 5 мл поживного середовища RPMI-1640, 0,5 мл ETC та 0,2 мл 0,03 % розчину філграстиму або іншого гранулоцитарного колонієстимулюючого фактора в еквівалентній концентрації, з наступним культивуванням в термостаті при 37 °С протягом 24 год, фіксацією та диференційним фарбуванням клітин за допомогою G-методу. UA 115793 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до галузі медицини, зокрема клінічної діагностики в гематології, і може бути використаний для визначення спектра цитогенетичних змін при мієлоїдних неоплазіях людини (МНЛ), таких як ідіопатичний мієлофіброз, вторинний мієлофіброз, який виник в результаті трансформації есенціальної тромбоцитемії або справжньої поліцитемії, гостра та хронічна мієлоїдна лейкемія, мієлодиспластичні синдроми. Використання генетичних методів для діагностики МНЛ має обмежене застосування в Україні, незважаючи на чіткий етіологічний зв'язок цих захворювань із порушеннями в генетичному матеріалі. В нашій країні цитогетичний аналіз метафазних хромосом кісткового мозку шляхом культивування клітин аспірату in vitro для диференційного аналізу хромосом при МНЛ виконують лише в поодиноких лабораторіях. Невід'ємною складовою встановлення гематологічного діагнозу є результати цитогенетичного аналізу метафазних хромосом кісткового мозку з проведенням культивування клітин аспірату кісткового мозку in vitro, з подальшою стандартною фіксацією клітин і диференційним забарвленням метафазних хромосом за допомогою G-методу, що дозволяє виявити клінічно значущі хромосомні аномалії [Vaidya, R Monosomal karyotype in primary myelofibrosis is detrimental to both overall and leukemiafree survival /R. Vaidya, D. Caramazza, K.H. Begna //Blood. - 2011. - Vol. 117. - № 21. - P. 56125615]. Однак, існують обмеження для цитогенетичного дослідження кісткового мозку. Забір матеріалу є болісним для хворого, повинен проводитися кваліфікованим лікарем, вимагає використання дорогих одноразових пункційних голок. Також у багатьох випадках МНЛ значна кількість патологічних клітин переміщується в периферичну кров, печінку, селезінку або інші органи, у кістковому мозку залишається лише частина патологічного клону. Зокрема, при ідіопатичному мієлофіброзі кістковий мозок може бути практично повністю заміщеним фіброзною тканиною, що ускладнює або й робить неможливою голкову аспірацію кісткового мозку для стандартного цитогенетичного дослідження. Причому, чим більші фіброзні зміни кісткового мозку, тим більша кількість гемопоетичних клітин, зокрема, патологічних, переміщується у периферичну кров та інші органи. Таким чином, чим більша ймовірність неуспішної аспірації кісткового мозку внаслідок фіброзу, тим більша кількість патологічних клітин для аналізу з'являється в периферичній крові. Цитогенетичне дослідження периферичної крові в людини проводиться давно, однак його використовують переважно для генетичного консультування, а саме діагностики хромосомної патології, найчастіше, трисомії 21 хромосоми (синдром Дауна), моносомії Х-хромосоми (синдром Тернера), а також при гострих лейкеміях із високим рівнем бластів у периферичній крові. Обмеженість застосування цитогенетичного дослідження периферичної крові пов'язана з кількістю та проліферативною активністю досліджуваних субстратних клітин та особливістю стандартних методик цитогенетичного дослідження периферичної крові. В нормі клітини периферичної крові не діляться in vitro. тому для цитогенетичного дослідження стандартно застосовують стимулятор - фітогемаглютинін, який призводить до бласттрансформації Тлімфоцитів периферичної крові і їхнього входження в мітоз, однією зі стадій якого є метафаза. Це дозволяє провести дослідження метафазних хромосом під мікроскопом. У деяких випадках гострої лейкемії злоякісні клітини з периферичної крові можуть розпочинати мітотичний поділ без використання стимулятора in vitro, однак, при хронічних МНЛ та у багатьох випадках гострої лейкемії, подібних клітин в крові недостатньо для цитогенетичного аналізу. У випадку гострої лейкемії не є проблемним забір матеріалу кісткового мозку, оскільки він часто містить збільшену кількість клітинних елементів, значна частина яких є злоякісними. Такий кістковий мозок переважно легко аспірується пункційною голкою, при цьому отримується достатня кількість матеріалу для подальших цитологічних, цитогенетичних та імунофенотипових досліджень. При цьому в кістковому мозку локалізується найбільша кількість патологічно змінених клітин. У той же час. при хронічних МНЛ основна маса уражених хворобою клітин часто знаходиться поза кістковим мозком. При цьому патологічний клон через кров колонізує селезінку, печінку, рідше - лімфатичні вузли й інші органи та системи, тобто відбувається безперервне гематогенне метастазування. Таким чином, генетичні особливості патологічних клітин периферичної крові можуть стати ключем для розуміння поширення захворювання з кісткового мозку на інші органи. Кістковий мозок при МНЛ буває недостатньо клітинним, заміщеним фіброзною тканиною. При цьому його пункційний забір суттєво утруднюється та зростає ймовірність отримати недостатньо матеріалу для дослідження. Така ситуація ускладнює диференційний діагноз, прогнозування та моніторинг перебігу МНЛ. Проблему нестачі пункційного матеріалу з кісткового мозку можна обійти, використавши для діагностики периферичну кров, яка легко доступна для забору. Однак, як відомо, в крові при МНЛ кількість патологічних клітин може бути значно обмеженою, тому для результативного цитогенетичного дослідження необхідно провести концентрування патологічного субстрату з 1 UA 115793 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 великого об'єму крові або ж активно стимулювати проліферацію патологічно змінених клітин у культурі. Концентрування патологічно змінених клітин є складним із огляду на наявність великої кількості зрілих гранулоцитів у крові багатьох хворих на МНЛ, які при руйнуванні діють цитотоксично за рахунок вільних радикалів та літичних ферментів. Такий вплив може призводити до гальмування переходу клітин у мітоз, а отже, до зниження кількості метафазних пластинок у препаратах для цитогенетичного дослідження. Також, оскільки цитогенетичне дослідження передбачає культивування клітин in vitro, субстрат для дослідження повинен бути абсолютно стерильним, а маніпуляції з концентрування клітинних елементів можуть спричинити інфікування. Для уникнення таких ускладнень можна застосувати стимуляцію клітин, патологічно змінених при МНЛ. Зокрема таким природнім стимулятором гранулоцитопоезу є гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор (Г-КСФ). рекомбінантний варіант якого широко застосовують у клінічній практиці для стимулювання викиду гемопоетичних стовбурових клітин з кісткового мозку в периферичну кров із метою їх подальшої сепарації для трансплантації та/або для корекції гранулоцитопеній. Г-КСФ - це цитокін людини, який звичайно виробляється в організмі у відповідь на інфекційні ураження та запальні процеси іншого походження і потужно подразнює переважно мієлоїдний паросток кровотворення, зумовлюючи посилення проліферації клітин даного паростка. Г-КСФ може стимулювати також мегакаріоцитарний та еритроїдний паростки кровотворення людини, однак слабше, ніж мієлоїдний [Rosenbauer F. & Tenen D.G. Transcription factors in myeloid development: balancing differentiation with transformation /Frank Rosenbauer & Daniel G. Tenen //Nature Reviews Immunology. - 2007. - V.7. - P. 105-117]. При МНЛ уражаються клітини переважно мієлоїдного, а також еритроїдного та мегакаріоцитарного паростків кровотворення. Отже, Г-КСФ може стимулювати поділ патологічних клітин і бути застосованим як реагент при діагностиці МНЛ. Аналогом запропонованого способу є спосіб культивування клітин периферичної крові при мієлофіброзі [Singh, N.R. Polyploidy in myelofibrosis: analysis by cytogenetic and SNP array indicates association with advancing disease /N.R. Singh, C.M. Morris, M.K. Singh et al. //Molecular Cytogenetics. - 2013. - Vol.6. - DOI: 10.1186/1755-8166-6-59. [Електрон, ресурс]. - Режим доступу: http://www.molecularcytogenetics.Org/content/6/l/59], при якому в пробірку з гепарином набирають 10 мл периферичної крові. Клітини вирощують з лейкоцитарної плівки in vitro протягом 48 год. без мітогенної стимуляції. Суспензію клітин розкапують на предметні скельця з використанням стандартних протоколів [Rooney, D. Human Cytogenetics. Malignancy and Acquired Abnormalities. 3rd edition. New York: Oxford University Press; 2001]. Для зупинки поділу клітин на стадії метафази використовують колцемід (Life Technologies, США) або вінбластин-колхіцин (United Biosciences. QLD, Австралія) в кінцевій концентрації 2 мкг/мл протягом 1 год. або 0,3 мкг/мл протягом 24 год. при температурі 37 °C, відповідно. Далі проводять стандартну фіксацію клітин, розкапування суспензії клітин на предметні скельця з використанням стандартних протоколів і диференційне забарвлення метафазних хромосом за допомогою G-методу [Shaffer L.G., McGowan-Jordan J., Schmid M. (Eds): ISCN (2013): An International System for Human Cytogenetic Nomenclature. Basel: S. Karger; 2013]. Однак відбір лейкоцитарної плівки для подальшого культивування клітин in vitro технічно ускладнений і під час цієї маніпуляції зростає ризик інфікування культури клітин та, відповідно, неможливості отримання препаратів метафазних хромосом. Недоліками прототипу є також потреба в заборі порівняно великої кількості крові, необхідність використання спеціального стерильного лабораторного інструментарію. Іншим аналогом запропонованого способу є культивування Т-лімфоцитів периферичної крові із додаванням мітогену фітогемаглютиніну (ФГА) за допомогою напівмікрометоду. Кров набирається в пробірку з гепарином для запобігання коагуляції. В стерильну пробірку вводиться 0,5 мл цільної крові, 6 мл поживного середовища Ігла або N199, 1-1,5 мл ETC, розчин ФГА по 0,1 мл ("Difco M", США) або по 0,01 мл ("Difco P", США) і перемішується. Мітоген ФГА додається для стимуляції поділу Т-лімфоцитів, які самовільно не діляться. Потім пробірку поміщають в термостат на 72-96 год. і культивують при температурі 37 °C. Для зупинки поділу клітин на стадії метафази використовують колхіцин в концентрації 0,3-0,5 мкг/мл. Далі проводять стандартну фіксацію клітин, розкапування суспензії клітин на предметні скельця з використанням стандартних протоколів і диференційне забарвлення метафазних хромосом за допомогою Gметоду [Захаров А.Ф. Хромосомы человека. Атлас /А.Ф. Захаров, В.А. Бенюш, Н.П. Кулешов. М.: Медицина, 1982. С. 179-181. Hungerford, D.A. Leukocytes cultured from small inocula of whole blood and the preparation of metaphase chromosomes by treatment with hypotonic KCl /D.A. Hungerford //Stain Technol. - 1965. - Vol. 40(6). - P. 333-8.]. Недоліком є те, що при МНЛ Т-лімфоцити периферичної крові не уражаються патологічним процесом, тому таке дослідження буде у цьому випадку неінформативним. 2 UA 115793 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У прототипі запропонованого способу приготування препаратів метафазних хромосом із патологічно змінених клітин виконують шляхом культивування клітин аспірату кісткового мозку in vitro у стерильній пробірці [Czepulkowski B.H. Basic techniques for the preparation and analysis of chromosomes from bone marrow and leukemic blood /Czepulkowski B.H. Bratt R., Rooney D.E. //Human cytogenetics. Malignancy and abnormalities: A practical approach. - 1992. - 11:26 s.]. Після проведення пункції аспірат кісткового мозку вводять в стерильну пробірку, в яку додають антикоагулянт - літієвий гепарин чи ЕДТА (10 U/ml), поживне середовище RPMI, антибіотики пеніцилін (50 U/ml) та/або стрептоміцин (50 mg/мл), 20 % ембріональної телячої сироватки (ETC). Вся робота виконується в боксі (ламінарі). Клітини вирощують в термостаті протягом 24 год. при температурі 37 °C. Далі проводять стандартну фіксацію і диференційне забарвлення клітин за допомогою G-методу. Недоліком методу є інвазивність забору матеріалу - пункція кісткового мозку. У випадку фіброзу кісткового мозку для забору достатньої кількості аспірату необхідні повторні пункції, які є болісними маніпуляціями. У частини хворих навіть при повторних пункціях не вдається аспірувати кістковий мозок, а, отже, немає можливості провести цитогенетичне дослідження патологічно змінених клітин, адекватно оцінити перебіг і прогноз захворювання. Завданням винаходу є розробка такого способу приготування препаратів метафазних хромосом із патологічно змінених клітин хворих на МНЛ, який дозволить провести цитогенетичне дослідження венозної крові in vitro у хворих із вираженим фіброзом кісткового мозку, яким не вдається аспірувати матеріал кісткового мозку для стандартного цитогенетичного дослідження, оцінити цитогенетичні зміни при МНЛ, які не обмежуються кістковим мозком, зменшити інвазивність цитогенетичного дослідження при МНЛ, використовуючи доступні реагенти та лабораторне оснащення. Поставлене завдання вирішується тим, що у способі приготування препаратів метафазних хромосом із патологічно змінених клітин хворих на МНЛ, що включає забір крові у стерильну пробірку з літієвим гепарином, культивування клітин in vitro при температурі 37 °C в поживному середовищі RPMI-1640 з ембріональною телячою сироваткою (ETC), згідно з винаходом, периферичну кров об'ємом 0,6-0,8 мл, попередньо набрану в хворого з вени у пробірку і з неї відтягують шприцом об'ємом 10-12 мл, у якому міститься суміш 5 мл поживного середовища RPMI-1640, 0,5 мл ETC та 0,2 мл 0,03 % розчину філграстиму або іншого Г-КСФ в еквівалентній концентрації, попередньо набраних в умовах боксу (ламінару), після чого поруч із пальником добирають повітря, голку закривають ковпачком, а шприц поміщають з піднятою під кутом 30° голкою в термостат для культивування протягом 24 год. Запропонований спосіб дозволяє забезпечити вибіркову проліферацію клітин, які чутливі до Г-КСФ, зокрема, клітин мієлоїдного паростка гемопоезу людини, та, частково, еритроїдного та мегакаріоцитарного паростків, уникнувши проліферації Т-лімфоцитів крові, які не уражені неопластичним процесом [Growth Factors and in Health anf Disease. Vol. 2B. Ed.: D. Leroith, С. Bondy. JAI Press LTD, London: 1997. - P. 576-577.]. Також отримується можливість цитогенетичного дослідження венозної крові in vitro для виявлення прогностично небезпечних перебудов метафазних хромосом у хворих із вираженим фіброзом кісткового мозку, яким не вдається аспірувати матеріал кісткового мозку для стандартного цитогенетичного дослідження. Перевагами нашого способу є малоінвазивність, можливість проведення клінічно важливого генетичного дослідження у хворих на МНЛ, у яких воно пов'язане з особливими труднощами або неможливістю отримання матеріалу для дослідження, а також краща доступність проведення цитогенетичного дослідження за рахунок забору матеріалу з периферичної вени середнім медичним персоналом без участі лікаря, відсутності потреби в знеболенні та необхідності використання дорогих одноразових пункційних голок. При цьому як реагент не використовується фітогемаглютинін, чим забезпечується вища інформативність отриманої генетичної інформації, оскільки не відбувається стимуляції специфічно не уражених лімфоїдних елементів периферичної крові (Т-лімфоцитів), що дозволяє уникнути їхньої проліферації в культурі та появи незмінених метафазних пластинок при каріотипуванні, які б спотворювали результат цитогенетичного аналізу. Пропонований винахід пояснюється мікрофотографіями, що ілюструють клінічний випадок 1: на Фіг. 1 - мікрофото метафазної пластинки та ідіограма з препарату кісткового мозку хворої К.; каріотип: 49,ХХ, +3,+8,+9; на Фіг. 2 - мікрофото метафазної пластинки та ідіограма з препарату венозної крові, отриманого у хворої К. із використанням запропонованого способу; каріотип: 49,ХХ, +3,+8,+9. Спосіб здійснюють таким чином. У хворого на МНЛ набирають кров з вени у стерильну пробірку з літієвим гепарином. Потім з цієї пробірки відтягують 0,6-0,8 мл крові шприцом об'ємом 10-12 мл, у якому міститься суміш 5 мл поживного середовища RPMI-1640, 0,5 мл ETC 3 UA 115793 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 та 0,2 мл 0,03 % розчину філграстиму або іншого Г-КСФ в еквівалентній концентрації, попередньо набраних в умовах боксу (ламінару). Після чого поруч із пальником добирають повітря, голку закривають ковпачком, а шприц поміщають з піднятою під кутом 30° голкою в термостат для культивування клітин при температурі 37 °C протягом 24 год. Після закінчення культивування проводять стандартну фіксацію і диференційне фарбування клітин за допомогою G-методу. Після цього аналізують не менше 15 метафазних пластинок зі зразка. Клінічний приклад 1 При клінічному обстеженні хворій КНО, 67 років, в гематологічному відділенні клініки ДУ "Інститут патології крові та транс фузійної медицини НАМН" було встановлено діагноз: вторинний мієлофіброз, трансформація справжньої поліцитемії, гепатоспленомегалія, лейкоцитоз, IPSS-high [Gangat, N. DIPSS Plus: A Refined Dynamic International Prognostic Scoring System for Primary Myelofibrosis That Incorporates Prognostic Information From Karyotype, Platelet Count, and Transfusion Status /N. Gangat, D. Caramazza, R. Vaidya, G. George, K. Begna et. al. //Journal of Clinical Oncology. - 2011. - №4. - P. 392-397]. Діагноз підтверджено за допомогою гістологічного дослідження трепанобіоптату. Цитогенетичне дослідження кісткового мозку за стандартною методикою без мітогенної стимуляції, описаною в прототипі нашого способу. Встановлено каріотип: 49,ХХ, +3,+8,+9 (Фіг. 1). Мітотична активність в кістковому мозку була досить низькою (отримано лише 8 метафазних пластинок), що ускладнювало діагностику. Наявність трисомії 8-ої хромосоми є негативною прогностичною ознакою при мієлофіброзі, як і наявність трьох і більше цитогенетичних аномалій. Такі хворі мають суттєво меншу тривалість очікуваного життя, у них частіше і швидше відбувається трансформація в гостру лейкемію, а отже, вони потребують активного лікування, зокрема, алогенної трансплантації кісткового мозку. Цій хворій було проведено загальний аналіз крові, у якому було виявлено бластні клітини в кількості 2 % на фоні лейкоцитозу, виражений анізопойкілоцитоз еритроцитів, еритрокаріоцити, при нормальному рівні гемоглобіну та тромбоцитів. В один день з аспірацією кісткового мозку хворій було проведене, із застосуванням запропонованого нами способу, цитогенетичне дослідження шляхом культивування клітин венозної крові in vitro з використанням Г-КСФ. В результаті проведеного дослідження отримано 18 метафазних пластинок задовільної якості та встановлено каріотип: 49,ХХ, +3.+8,+9 (Фіг. 2). Аномалії каріотипу, які вдалося виявити із використанням запропонованого способу цитогенетичного дослідження шляхом культивування клітин венозної крові in vitro з використанням Г-КСФ, повністю співпали аномаліями, виявленими у клітинах з аспірату кісткового мозку з використанням стандартних методик. Однак при використанні запропонованого способу мітотичний індекс був вищим, а диференційний рисунок - чіткішим. Препарати, отримані з периферичної крові, були кращої якості та мали чіткіший диференційний рисунок, порівняно з препаратами кісткового мозку. Таким чином, дослідження 0,8 мл периферичної крові дозволило виявити клінічно важливі прогностично несприятливі зміни каріотипу у хворої з мієлопроліферативним захворюванням, які повністю співпали з результатами цитогенетичного дослідження аспірату кісткового мозку. Завдяки отриманому результату, хворій можна було запропонувати оптимальне лікування. Клінічний приклад 2 Хворій P., віком 65 років, було встановлено діагноз: ідіопатичний мієлофіброз, гепатоспленомегалія, портальна гіпертензія, гемолітична криза, анемія важкого ступеня. Захворювання перебігало хронічно протягом 12 років, хвора періодично лікувалася препаратами гідроксисечовини. При повторних пункціях грудини та клубової кістки аспірувати кістковий мозок не вдавалося, а отже, не було можливості провести цитогенетичне дослідження кісткового мозку із застосуванням стандартних методик. Натомість, хворій було проведене цитогенетичне дослідження венозної крові шляхом культивування клітин in vitro з використанням Г-КСФ запропонованим нами способом. Завдяки цьому вдалося отримати велику кількість метафазних пластинок, що вказувало на високу мітотичну активність клітин. В результаті проведеного дослідження отримано 16 метафазних пластинок задовільної якості та встановлено наступний каріотип з двома клонами клітин із множинними хромосомними аномаліями: 47,XX, del 5q12.1-qter, +mar1, +mar2,-9/48,XX, del 5q12.1-qter, +mar1, +mar2,+mar3,-9. Наявність таких хромосомних аномалій дозволяє віднести хвору до високої групи ризику за динамічною міжнародною оцінювальною прогностичною шкалою (DIPSS) [8], хоча, без врахування недоступних для цієї хворої даних стандартного цитогенетичного дослідження, її було віднесено до групи проміжного ризику-2. Однак, стан хворої протягом року спостереження погіршувався, вона стала залежною від трансфузій концентрату відмитих еритроцитів; попри 4 UA 115793 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 активну терапію, наростали зміни у загальному аналізі крові, прогресивно збільшувалися розміри печінки та селезінки. Таким чином, клінічно перебіг хвороби був агресивним, що є характернішим для хворих високої групи ризику та відповідає виявленим цитогенетичним аномаліям. Отже, застосування нашого способу в даному випадку дозволило отримати додаткову інформацію з потенційно важливим діагностичним та прогностичним значенням. Через один рік для оцінки динаміки цитогенетичних змін було повторно виконано цитогенетичне дослідження запропонованим нами способом. В результаті проведеного цитогенетичного дослідження периферичної крові у динаміці отримали 17 метафазних пластинок задовільної якості та встановлено наступний каріотип з двома клонами клітин із множинними хромосомними аномаліями: 47,XX, del 5q12.1-qter, +mar1, +mar2,-9/47,XX, del 5q12.1-qter, +mar1, +mar2,+mar3,9,-13. Таким чином, виявлено клональну еволюцію клітин зі зміною кількості та структури хромосом, поруч зі змінами, які спостерігали під час першого дослідження, що дає цитогенетичне підтвердження прогресування захворювання. Клінічний приклад 3. Хворий П., 64 p., з діагнозом: хронічна мієлоїдна лейкемія, фаза акселерації, гепатоспленомегалія, лейкоцитоз, індекс Sokal 2.75, EUTOS-141. Стан ECOG 2, індекс Карновського на час встановлення діагнозу - 60 %. Хворий отримував лікування в поліклініці гідроксисечовиною через значну гепатоспленомегалію, гіперлейкоцитоз та кахексію протягом 6 міс., проте перед проведенням цитогенетичного дослідження цитостатичний препарат був зупинений. За даними стандартного цитогенетичного дослідження кісткового мозку було виявлено каріотип: 46,XY, t(9;22)(q34;q11)[19]/45,XY, -22[1] Тобто, було підтверджено наявність клональної аномалії - філадельфійської хромосоми. Втрата 22-ої хромосоми була нерегулярною, оскільки її було виявлено лише в одній метафазній пластинці. Підтвердити чи спростувати методами стандартної цитогенетики подовження плечей 9-ої хромосоми в цій метафазі було важко, враховуючи конденсованість хромосом. За міжнародною цитогенетичною номенклатурою втрата хворомосоми в одній метафазній пластинці є недостатньою підставою вважати таку особливість цитогенетичною аномалією, яку слід враховувати у хворого. Таким чином, єдиною підтвердженою регулярною аномалією в кістковому мозку даного хворого була t(9;22)(q34;q11). В день забору кісткового мозку, хворому також набрали периферичну кров для цитогенетичного дослідження запропонованим способом. Отримано каріотип (Фіг. 3): 46,XY, t(9;22)(q34;q11)[20] Даний каріотип периферичної крові, згідно міжнародної цитогенетичної номенклатури, є ідентичним до каріотипу кісткового мозку, що підтверджує можливість використання запропонованого нами методу для цитогенетичного дослідження хворих на хронічну мієлоїдну лейкемію. Клінічний приклад 4. Хворий КВІ, 57 років, з діагнозом: рефрактерна анемія з надлишком бластів. Хворів близько 4 років. Отримував лікування препаратами вітаміну В12, фолієвої кислоти, трансфузії концентрату відмитих еритроцитів. Стан хворого поступово погіршувався, зростала потреба в трансфузіях. Було проведене цитогенетичне дослідження периферичної крові запропонованим способом. Отримано каріотип: 46,XY[5]/45,XY, -8[7]. Отже, у хворого виявлено клональний гіподиплоїдний каріотип із втратою 8-ої хромосоми. Гіподиплоїдія є типовою аномалією при мієлодиспластичному синдромі. На неї припадає понад половина випадків всіх хромосомних аномалій при цьому захворюванні [Cytogenetic profile of myelodysplastic syndromes with complex karyotypes: an analysis using spectral karyotyping /A. Martinez-Ramireza, M. Uriostea, S. Alvarez et al. //Cancer Genetics and Cytogenetics. - 2004. - V. 153. - Issue 1. - P. 39-47]. 50 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 55 60 Спосіб приготування препаратів метафазних хромосом із патологічно змінених клітин крові хворих на мієлоїдні неоплазії людини, що включає забір матеріалу у стерильну пробірку з літієвим гепарином, культивування клітин in vitro при температурі 37 °C в поживному середовищі RPMI-1640 з ембріональною телячою сироваткою (ETC), який відрізняється тим, що периферичну кров об'ємом 0,6-0,8 мл, попередньо набрану в хворого з вени у пробірку, відтягують шприцом об'ємом 10-12 мл, у якому міститься суміш 5 мл поживного середовища RPMI-1640, 0,5 мл ETC та 0,2 мл 0,03 % розчину філграстиму або іншого гранулоцитарного колонієстимулюючого фактора в еквівалентній концентрації, попередньо набраних в умовах 5 UA 115793 C2 боксу/ламінару, після чого поруч із пальником добирають повітря, голку закривають ковпачком, а шприц поміщають з піднятою під кутом 30° голкою в термостат для культивування протягом 24 год., з наступною стандартною фіксацією і диференційним фарбуванням клітин за допомогою G-методу. 6 UA 115793 C2 7 UA 115793 C2 Комп’ютерна верстка О. Рябко Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 8