Спосіб приготування препаратів метафазних хромосом in vivo із аденокарцином товстої кишки для визначення спектра цитогенетичних змін при злоякісній трансформації епітелію в новоутвореннях товстої кишки

1. Спосіб приготування препаратів метафазних хромосом із аденокарциноми товстої кишки для визначення спектра цитогенетичних змін при злоякісній трансформації епітелію в новоутвореннях товстої кишки, що включає лабораторний цитогенетичний аналіз зразка біоптату новоутворен 3 34834 даванням ембріональної телячої сироватки із синхронізацією культури клітин метотрексатом [5]. Недоліком цього способу є тривале культивування клітин in vitro з синхронізацією культури клітин. У найближчому аналозі запропонованого способу аналіз метафазних хромосом аденокарцином товстої кишки проводили шляхом культивування клітин in vitro в середовищі RPMI з додаванням ембріональної телячої сироватки [6]. Як і у вищезгаданому аналозі, отримання препаратів метафазних хромосом виконувалось шляхом синхронізації культури клітин. Недоліком прототипу є культивування клітин in vitro, при якому відбувається селекція клітин певного типу, що може спотворювати об'єктивність результату. Крім того, результати аналізу пацієнт може отримати не раніше як через 5-10 днів. Завданням корисної моделі є розробка такого способу приготування препаратів метафазних хромосом із аденокарцином товстої кишки, який би за рахунок застосування прямого методу in vivo та забезпечення достатньої кількості клітин, дозволив би оцінити спектр аномалій хромосом - появу моносомій, делецій, транслокацій та інших перебудов у клонах клітин зі зміненою плоїдністю - за допомогою диференціального аналізу метафазних хромосом та спрогнозувати перебіг захворювання. Поставлене завдання досягається тим, що у способі приготування препаратів метафазних хромосом із аденокарцином товстої кишки для визначення спектру цитогенетичних змін при злоякісній трансформації епітелію в новоутворах товстої кишки, що включає лабораторний цитогенетичний аналіз зразка біоптату новоутвора товстої кишки, згідно з корисною моделлю, лабораторний цитогенетичний аналіз виконують прямим методом in vi vo, причому клітини біоптату новоутвора поміщають у середовище ИГЛА з подвійним набором амінокислот, в яке послідовно додають розчин колхіцину та розчин бромистого етидію, після чого проводять гіпотонізацію та фіксацію клітин. Поставлене завдання досягається також тим, що фіксацію клітин проводять у два етапи: спочатку проводять мацерацію клітин біоптату в розчині льодяної оцтової кислоти, а потім - розкапування залишку суспензії клітин над осадової рідини. Відмінністю нашого способу є отримання препаратів метафазних хромосом прямим методом in vi vo з аденокарцином товстої кишки. Хоча використання культури клітин (метод in vitro) відкриває можливості отримання більшої кількості мітозів, однак при культивуванні відбувається селекція клітин певного типу, які найкраще адаптовані до життя in vitro. Тому результати, отримані на культурі клітин, не можуть автоматично переноситися на цитогенетичні характеристики клітин, які знаходяться безпосередньо в пухлині. З іншого боку, якість і морфологічна будова метафазних хромосом культивованих клітин значно вища. У зв'язку з цим нами запропоновано вводити у середовище ИГЛА з подвійним набором амінокислот послідовно колхіцин і бромистий етидій, завдяки якому метафазні хромосоми стають менш компактними і набувають видовженої будови, а для забезпечення більшої кількості мітозів фіксацію проводити у 4 два етапи. Перевагою нашого способу є інформативність на генетичному рівні, швидкість виконання та дешевизна. Спосіб здійснюють таким чином. У пацієнтів з аденокарциномою товстої кишки проводять забір біоптату з новоутвора (аденокарциноми товстої кишки) і відразу ж переносять його в маленьку чашку Петрі з 3мл середовища ИГЛА, очищують очним пінцетом від згустків крові, відмивають і легко подрібнюють зразок пінцетом у іншій чашці Петрі з 3мл середовища ИГЛА. Після цього очищений зразок поміщають у центрифужну пробірку з 3мл середовища ИГЛА з подвійним набором амінокислот, куди послідовно вводять 0,5мл розчину колхіцину (10мкг/мл) та 0,3мл розчину бромистого етидію (100мкг/мл), ретельно збовтують для забезпечення контакту з усіма реагентами та інкубують у термостаті при 37°С. Через 2год. виконують центрифугування клітин протягом 5хв. при 1500об/хв. С упернатант відсмоктують, залишаючи 0,5мл розчину із шматком біоптату і клітинами, додають у пробірку по 3мл гіпотонічного розчину суміші хлористого калію (0,075М) і 1%-го цитрату натрію у співвідношенні 2:1 та інкубують у термостаті при 37°С. Через 1,5год. суміш відцентрифуговують протягом 5хв. при 1500об/хв., відсмоктують супернатант і до 0,5мл суспензії клітин з біоптатом додають приготований ex tempore 3мл охолодженого фіксатора - суміші етилового спирту і льодяної оцтової кислоти у співвідношенні 3:1 і витримують 30хв. в холодильнику при t=5-8°С. Фіксацію проводять у 2 етапи: I - шматок біоптату мацерують, легко розпилюючи краплю зі зразком струменем повітря на нагрітому до 60°С предметному скельці у краплі 30%-го розчину льодяної оцтової кислоти, скельце підсушують і нагрівають у термостаті 10хв.; II - у суспензію клітин з фіксатором, що залишилася у пробірці, додають ще 3мл охолодженого фіксатора і центрифугують 5хв. при 1500об/хв. Супернатант відсмоктують, а 0,5мл суспензії клітин розкапують на попередньо охолоджене мокре предметне скельце. Отримані препарати метафазних хромосом фарбують диференціально з використанням барвника Романовського, розчиненого у фосфатному буфері (рН=6,8) з додаванням 3-5 крапель 0,25%-го розчину трипсину. Після цього аналізують 7-15 метафазних пластинок зі зразка, що є достатньо для постановки діагнозу. Запропонований спосіб передбачає отримання результатів аналізу протягом доби, якщо забір біопсійного матеріалу проведено з 9 до 19год. ранку, або ж не пізніше 2 днів, якщо забір біопсійного матеріалу проведено пізніше. Приклад 1. Пацієнтка Ш.Г.П., 1926р.н., проживає у м. Шкло Яворівського району Львівської області. При обстеженні за допомогою колоноскопії у 2002р. у неї виявлено новоутвір низхідного відділу товстої кишки. Проведено гістологічне та цитогенетичне дослідження 2-х зразків біоптату новоутвору товстої кишки. Результати цитогенетичного дослідження 9 метафазних пластинок зразка, отриманого за запропонованим способом, показало присутність 2 клонів клітин з білядиплоїдним каріотипом, харак 5 34834 терним для аденокарциноми товстої кишки: 41, X, der (1) del 1(р13 ® pter), +3,+mar, -6,-6,-11,-14,-14,18,-Х[6]/ 44,ХХ, der (1) del 1(р13 ® pter),+3,+mar,6,-11,-14,-18[3]. Результат гістологічного дослідження: низькодиференційована аденокарцинома. Отримані нами результати цитогенетичного аналізу свідчать про несприятливий прогноз у зв'язку з присутністю прогностично небезпечних перебудов, які вдалося виявити за допомогою диференціального аналізу метафазних хромосом: делеції р-плечей 1-ї хромосоми, на якій знаходиться онкоген Nras-1р13, моносомії 18-ої хромосоми, на якій знаходиться онкоген DCC-18q21. Делеції поблизу цих онкогенів, які беруть участь у виникненні раку товстої кишки, свідчать про злоякісне переродження епітелію товстої кишки. Трисомія 3-ї хромосоми, яка присутня у 3-х копіях - з онкогенами FHIT і hMLH1-3p21-23, що беруть участь у виникненні раку товстої кишки, зумовлює порушення активності одного чи кількох онкогенів, що сприяє виникненню РТК. Відомо також про прогностично несприятливу перебудову - моносомію 18 хромосоми. Встановлений у цієї пацієнтки морфологічний ступінь злоякісності - низькодиференційована аденокарцинома, підтверджено гістологічним аналізом і співпадав з результатом цитогенетичного дослідження, яке на генетичному рівні дозволило оцінити спектр прогностично несприятливих перебудов метафазних хромосом, що вказували на злоякісне переродження епітелію товстої кишки. Приклад 2. Пацієнт Г.Я.С., 1927р.н. проживає у м. Львові. При обстеженні за допомогою сигмоїдоскопії у 2002р. у нього виявлено новоутвір прямої кишки на висоті 10см від ануса. Проведено гістологічне та цитогенетичне 2-х зразків біоптату новоутвору товстої кишки. Результати цитогенетичного дослідження 13 метафазних пластинок зразка новоутвора, отриманого за запропонованим способом, показало присутність 3 клонів клітин з білядиплоїдним, білятриплоїдним та білятетраплоїдним каріотипом: 51,XY,+3,+13,+16,+19,+mar,18[5]/86,XXX,YYY,+mar,+mar,+mar,-17,18[5]//109,XXX,YYYY, +mar,+mar,+mar+mar,+mar,+mar, -17,-18[3]. Отримані нами результати цитогенетичного аналізу свідчать про злоякісне переродження епітелію товстої кишки у зв'язку з присутністю прогностично небезпечних перебудов, які вдалося виявити за допомогою диференціального аналізу метафазних хромосом: численних делецій хромосом, які призвели до виникнення вкорочених хромосом-маркерів (mar), моносомій 17 і 18 хромосом, на яких знаходяться онкогени (на 17-ій - р53 Комп’ютерна в ерстка C.Литв иненко 6 17р13; на 18-ій - DCC-18q21), а трисомія і тетрасомія численних хромосом, на яких розміщені онкогени, що беруть участь у виникненні раку товстої кишки, зумовлює порушення активності онкогенів, що також свідчать про злоякісне переродження епітелію. Вдалося встановити не лише наявність поліплоїдії, але й виявити кількість копій кожної хромосоми, що є значно точнішим способом порівняно з цитоспектрофотометричним. Морфологічний ступінь злоякісності цього новоутвора - помірнодиференційована аденокарцинома з ділянками низької диференціації, підтверджено гістологічним заключенням і співпадав з результатом цитогенетичного дослідження, яке на генетичному рівні дозволило оцінити спектр прогностично небезпечних перебудов. Таким чином, за допомогою розробленого способу можна з більшою вірогідністю визначити спектр цитогенетичних змін при злоякісній трансформації епітелію товстої кишки шляхом лабораторного цитогенетичного аналізу аденокарцином товстої кишки in vivo, що важливо для планування та проведення лікувально-профілактичних заходів. Запропонований спосіб може бути використаний у лікувальних закладах. Джерела інформації: 1. Бучинська Л.Г., Поліщук Л.З. Вивчення зв'язку між рівнем експресії ядерцеутворюючи х районів хромосом і особливостями мітотичного режиму раку ендометрію //Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології. -1997. -Вип.3. С26-28. 2. Svedsen L.B., Thorup J., Larsen J.K. et al. (1989). Association between tumor DNA aneuploidy and in vitro tetraploidy of skin fibroblasts in patients with colorectal neoplasms. Scand. J.Gastroenterology. 24:755-760. 3. Kaz A.M., Brentnall T.A. (2006). Genetic testing for colon cancer. Nature Clinical Practice. Gastroenterology et Hepatology. Vol.3, N12: 670-679. 4. Поліщук Л.З., Налєскіна Л.А., Бучинська Л.Г., Несіна І.П. Роль генетичної нестабільності у розвитку злоякісних новоутворень //Шляхи та перспективи експериментальної онкології в Україні. Київ: Діа, 2001. -С.35-45. 5. Griffin СА., Lazar S., Hamilton SR. et al. (1993). Cytogenetic analysis of intestinal polyps in polyposis syndromes: comparison with sporadic colorectal adenomas //Cancer Genet. Cytogenet. 67(1): 14-20. 6. Muleris M., Salmon RJ, Dutrillaux A.M., Vielh P., Zafrani B.,Girodet J., Dutrillaux B. (1987) Characteristic chromosomal imbalances in near-diploid colorectal tumors. Cancer Genet Cytogenct 29:289-301. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601