Спосіб виготовлення препаратів метафазних хромосом свиней

Спосіб виготовлення препаратів метафазних хромосом свиней, який включає використання як біологічного об'єкта лейкоцитів периферичної крові, взятої стерильно з краніальної порожнистої вени в посудину з гепарином, культивування в середовищі Ігла при температурі 37°С в термостаті, припинення мітозу хромосом лейкоцитів колхіцином на стадії метафази за 1,5-2 години до завершення терміну культивування, відмивання клітин лейкоцитів гіпотонічним розчином хлористого калію (0,3 %) з наступним центрифугуванням, фіксацію сумішшю метанол:оцтова кислота (3:1); виготовлення препаратів розкопуванням відмитих клітин з висоти 15-20 см на предметні стекла, фарбування 2% розчином Гімза, який відрізняється тим, що для культивування клітин лейкоцитів використовують 0,5 мл цільної гепаринізованої крові, яку зразу ж після відбору вносять в стерильну посудину з середовищем Ігла, в яке попередньо додатково вводять 10% ембріональної телячої сироватки і культивують у термостаті протягом 48 годин, обережно перемішуючи інкубат двічі на добу. Корисна модель належить до сільськогосподарської біології, зокрема, біології свиней, а саме до цитогенетичних способів дослідження свиней і може бути застосований у лабораторіях науководослідних установ, які займаються селекційною роботою в свинарстві. В каріології свиней широко відомі і використовуються в лабораторній практиці для мікроскопічного аналізу хромосом клітини кісткового мозку, селезінки, периферичної крові, фібробластів або сім"яників (Ford C.E., Hamerton J.L. A colchicine hypotonic citrate squash sequences for mammalian chromosomes // Stain Technol. 1956.-Vol. 31.-P. 247-251). Виготовлення препаратів хромосом соматичних клітин різних тканин базуються на основних принципах, описаних у працях Форда, Хамертона (Ford, Hamerton, 1956) і Мурхеда із співавторами (Moorchead et aL, 1960), але в теперішній час багато із запропонованих цими авторами прийомів піддаються значним модифікаціям. Так, відомий спосіб отримання каріотипів свиней шляхом використання клітин кісткового мозку (Яковлев А.Ф. Цитогенетическая оценка племенных животных.- Москва: Агропромиздат, 1985. - С. 201-206; Ford C.E., Hamerton J.L. A colchicine hypotonic citrate squash sequences for mammalian chromosomes // Stain Technol. - 1956. - Vol. 31. - P. 247 251). У свиней спосіб включає пункцію в межах 3-5 сегменту грудної кістки. Переважно забирають біля 2 мл пунктату. Недоліком способу є те, що з пунктатом потрапляє кров, яка є серйозною перепоною для подальшого культивування. Відомі також способи виготовлення препаратів хромосом свиней із селезінки, фібробластів, сім'яників, ембріональних тканин (Графодатский А.С., Раджабли С И . Хромосомы сельскохозяйственных и лабораторных млекопитающих. Атлас. Новосибирск: Наука. Сиб. отделение, 1988. - 128 с ; Williams D., Hagen A., Runyan J., Lufferty 0. A method for the differentiation of male meiotic chromosome stages // J. Heredity. - 1971. - Vol. 62. - P. 1722). Зазначені способи вимагають великих матеріальних затрат на реактиви, тривалого часу для здійснення та забою свиней. Відомий спосіб одержання клітин з плазменного згустку (Дыгай A.M. Получение клеток из плазменного сгустка // Радиобиология, 1985. - т. XXI. С. 81-83. Спосіб включає виготовлення цитологічних препаратів клітинних культур в плазменому згустку шляхом їх культивування обробки у ферментативному середовищі з трипсином, висушування, фіксацію і фарбування. со 4394 Недоліком способу є недостатня якість препаратів в зв'язку з недостатнім диференціюванням клітин Відомий також спосіб виготовлення цитологічних препаратів клітинних культур в плазмовому згустку (АС СРСР № 1396740), в якому ферментативне середовище додатково вміщує, крім трипсина, глюкозу, хлористий натрій, цитрат натрія і лимонну кислоту Недоліком його є те, що в одержаних препаратах клітин неможливо виділити лейкоцити, з яких можна було б виготовити препарати метафазних хромосом Найбільш близьким по суті до способу, що заявляється, є спосіб виготовлення хромосомних препаратів свиней із лейкоцитів периферичної крові (Moorched Р , Nowell Р , Mellman W J , Battips D M , Hungerford D A Chromosome preparations of leucocytes cultured from human peripheral blood // Exp Cell Res -I960 -Vol 20 -P 613-616) Відомий спосіб включає використання в якості біологічного об'єкту лейкоцитів периферичної крові свиней, взятої стерильно з краніальної порожнистої вени в стерильні пробірки з гепарином, охолодження при температурі +4°С ЗО хвилин, відділення лейкоцитів з плазмою і використання Гі для культивування в поживному середовищі Ігла у співвідношенні 1 3, інкубування в термостаті при температурі +37°С протягом 72 годин, зупинку мітозу лейкоцитів в стадій" метафази, колхіцином за 1,5-2 години до завершення інкубування, відмивання клітин лейкоцитів розчином Хенкса та ГІПОТОНІЧНИМ розчином КС1 (0,3%) з наступним центрифугуванням, фіксацію сумішшю метанол оцтова кислота (3 1), розкапування відмитих клітин з висоти 15-20 см, фарбування 2% розчином Пмза Недоліки відомого способу полягають в його складності, довготривалості здійснення, високих економічних витратах на матеріали і реактиви, при цьому не завжди вдається досягнути стабільності результатів у отриманні достатньої КІЛЬКОСТІ метафазних пластинок, а також високої якості отриманих препаратів Заявлений нами спосіб усуває недоліки прототипа і забезпечує одержання за короткий термін якісних препаратів метафазних хромосом свиней в достатній для досліджень КІЛЬКОСТІ В основу корисної моделі покладено завдання розробити зручний у виконанні, швидкий у здійсненні та економічно вигідний спосіб виготовлення високоякісних препаратів метафазних хромосом свиней Технічний результат досягається тим, що для культивування лейкоцитів використовують 0,5 мл гепаризованої крові, яку зразу ж після відбору вносять в стерильний посуд з середовищем Ігла, в яке додатково вводять 10% ембріональної телячої сироватки та інкубують в термостаті протягом 48 годин, обережно перемішуючи інкубат ДВІЧІ на добу Культивування клітин лейкоцитів цільної гепаризованої крові (0,5 мл) свиней в ростовому середовищі Ігла (6,5 мл) шляхом інкубування в термостаті при температурі +37°С забезпечує оптимальні умови для росту і поділу хромосом, при цьому додавання до середовища 10% ембріональної телячої сироватки сприяє склеюванню форменних елементів крові (тромбоцитів і еритроцитів) і забезбечує чистоту культури клітин лейкоцитів, що необхідно для виготовлення якісних препаратів При зазначених умовах скорочення тривалості інкубації до 48 годин виявляється оптимальним і забезпечує одержання достатньої КІЛЬКОСТІ високоякісних метафазних пластинок з добрим розкидом хромосом В зв'язку з вище зазначеним, одержані за заявленим способом препарати мають високу якість, є показовими і з добрим розкидом хромосом При проведенні заявником патентноінформаційного пошуку знайдено технічне рішення (Moorched Р , Nowell Р , Mellman WJ,, Battips D M , Hungerford D A Chromosome preparations of leucocytes cultured from human peripheral blood // Exp Cell Res -1960 -Vol 20 -P 613-616), яке містить найбільшу КІЛЬКІСТЬ суттєвих ознак, спільних із заявленим способом (використання в якості об"єкта лейкоцитів периферичної крові, взятої стерильно з краніальної порожнистої вени в посуд з гепарином, культивування в середовищі Ігла при температурі +37° С в термостаті, припинення мітозу хромосом лейкоцитів на стадії метафази колхіцином за 1,5-2 години до завершення терміну культивування, відмивання клітин лейкоцитів ГІПОТОНІЧНИМ (0,3%) розчином хлористого калія з наступним центрифугуванням, фіксацію сумішшю метанол оцтова кислота (3 1), виготовлення препаратів розкопуванням відмитих клітин з висоти 15-20 см на предметні скла, фарбування 2 %-ним розчином Пмза) Однак наявність зазначених суттєвих ознак недостатня для одержання технічного результату, який забезпечує заявлений спосіб Технічних рішень, які б за сукупністю ознак повністю співпадали з ознаками заявленого рішення не виявлено Це дозволяє зробити висновок про ВІДПОВІДНІСТЬ заявленого рішення критерію винаходу (корисної моделі) "новизна" В джерелах патентної » науково-технічної інформації не знайдено ВІДОМОСТІ про ознаки, що відрізняють заявлений спосіб від прототипу і забезпечують досягнення технічного результату (для культивування клітин лейкоцитів використовують 0,5 мл цільної гепаринізованої крові, яку зразу ж після взяття вносять в стерильний посуд з середовищем Ігла, в яке попередньо додатково вводять 10%-ноі ембріональної телячої сироватки і культивують в термостаті протягом 48 годин, обережно перемішуючи інкубат ДВІЧІ на добу) Реалізацію заявленого способу здійснюють таким чином Кров забирають стерильним способом із краніальної порожнистої вени свиней (0,5 мл) в шприц і переносять в стерильну пробірку із гепарином (5 од гепарину на 1 мл крові), У стерильно перекриті флакони вносять 0,1 мл фітогемаглютенін, 6,5 мл ростового середовища Ігла +10% ембріональної телячої сироватки та 0,5 мл гепаризованої крові, струшують і вміщують для культивування у термостат на 48 годин при температурі +37°С, 4394 Клітини лейкоцитів культивують протягом 48 годин при температурі +37°С обережно перемішуючи вмютиме флаконів ДВІЧІ на добу, У кожний флакон додають до кінцевої концентрації 10 у колхіцину (0,1 мл на флакон за 1,5 годин до закінчення культивування клітин) Починаючи з цього етапу можна працювати у нестерильних умовах Перемішавши вмютиме флаконів, переливають їх у 15 мл центрифужні пробірки Клітини осаджують центрифугуванням за режиму 1500 об/хв протягом 10 хвилин і відбирають надосадову рідину за допомогою пастерівської піпетки, Осад ресуспендують і додають 6 мл попередньо нагрітого до 37°С гіпотонічного розчину 0,075 М КСІ і ставлять на 40-50 хвилин у термостат при температурі 37° С Потім центрифугують при 1500 об/хв упродовж 10 хвилин Надосадову рідину обережно відсмоктують, осад ресуспендують До осаду додають 5-6 мл метанол + оцтова кислота (3 1 ) і вміщують у холодильник на 40 хвилин Клітини осаджують центрифугуванням при 1500 об/хв протягом 10 хвилин Надосадову рідину відсмоктують Фіксатор змінюють 2-3 рази з проміжним ресуспендуванням і центрифугуваням клітин Після третьої зміни фіксатора супернатант відсмоктують, залишаючи 0,5 мл осаду Препарати метафазних хромосом готують методом розкапування з висоти 15-20 см на знежирені вологі охолоджені предметні скельця Скла підсушують в полум'ї горілки Препарати фарбують 2% розчином Пмза Запропонований нами спосіб дозволяє отримати значну КІЛЬКІСТЬ метафазних пластинок з добрим розкидом хромосом Приклади конкретного виконання способу Ефективність заявленого способу і його переваги перед прототипом підтверджені прикладом конкретного виконання У ТзОВ "Угринів" Сокальського району Львівської області відібрано 10 поросят 21-денного віку великої білої породи, які поділені шляхом аналогів на 2 групи Із 5-й поросят 1-ої групи готували препарати метафазних хромосом за відомим способом (прототип) Із поросят 2-ої групи - за заявленим способом з цільної крові поросят В цільну кров, добуту із краніальної порожнистої вени свиней, описаним в розділі 4 1 методом, додавали середовище Ігла з глутаміном, ембріональну сироватку телят і фітогемаглютинін Вмістимо пробірки перемішували ДВІЧІ на добу та інкубували 48 годин Решта елементів реалізації заявленого способу були однаковими при виготовленні препаратів метафазних хромосом за прототипом і новим способом Отримані результати представлені у таблиці 1 Дані таблиці свідчать, що найбільш оптимальним є отримана метаф азних хромосом за новим способом, про що говорить велика КІЛЬКІСТЬ аналізабельних метафазних пластинок Отже, заявлений нами спосіб забезпечує одержання високоякісних препаратів метафазних хромосом при економії часу на виготовлення і використання реактивів Таблиця 1 Характеристика застосованих способів отримання препаратів хромосом свиней Група І (прототип) II новий спосіб Об'єкт дослідження Лейкоцити крові Лейкоцити крові Комп ютерна верстка М Клюкін Всього метафазних пластинок 500 500 Підписне Якісних 435 500 Неякісних 65 0 Тираж 37 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності вул Урицького 45, м Київ, МСП 03680, Україна ДП 'Український інститут промислової власності вул Глазунова, 1, м К и ї в - 4 2 01601