Спосіб отримання препаратів метафазних хромосом із культури амніоцитів

Спосіб отримання препаратів метафазних хромосом із культури амнюцитів, який включає синхронізацію культури амнюцитів, внесення колхіцину, ппотонізацію та фіксацію, який відрізняється тим, що після внесення колхіцину культуру амнюцитів знімають зі скла культурального флакона, суспензію клітин центрифугують і після ппотонізацм та фіксації розкапують на предметні стекла Винахід відноситься до медичної генетики, а саме до цитогенетики і може бути використаний для отримання препаратів метафазних хромосом із культури амнюцитів ВІДОМІ способи отримання препаратів метафазних хромосом із культури амнюцитів, які ґрунтуються на синхронізації культури амнюцитів, вирощеній на покривних стеклах у чашках Петрі, внесенні розчину колхіцину, ппотонізацм та фіксації препаратів метафазних хромосом in situ [1, 2] Недоліком цих способів приготування препаратів метафазних хромосом з культури амнюцитів є трудомісткість, методична складність, поганий розкид хромосом на склі Найближчим аналогом є спосіб приготування препаратів метафазних хромосом з культури амніоцитів, який включає синхронізацію культури амніоцитів, вирощену у слайд-флаконах, внесення розчину колхіцину, ппотонізацію та фіксацію препаратів метафазних хромосом in situ [3] Недоліком цього способу приготування препаратів метафазних хромосом з культури амнюцитів in situ є поганий розкид хромосом Задачею винаходу є розробка такого способу отримання препаратів метафазних хромосом з культури амнюцитів, який би за рахунок знімання культури амнюцитів зі скла культурального флакона з послідуючим розкапуванням ппотонізованої та зафіксованоі-клітинної суспензії на предметні скла дозволив би покращити розкид хромосом Поставлена задача вирішується тим, що в способі отримання препаратів метафазних хромосом з культури амнюцитів, який включає синхроні зацію культури амнюцитів, внесення розчину колхіцину, ппотонізацію та фіксацію препаратів метафазних хромосом, згідно з винаходом, після внесення колхіцину в культуральне середовище, культуру амнюцитів знімають зі скла флакона, і після ппотонізацм та фіксації, суспензію клітин розкапують на предметні скла Знімання культури амнюцитів зі скла культурального флакона з наступним розкапуванням клітинної суспензії на предметні скла забезпечує більший вихід препаратів, придатних для цитогенетичного аналізу, оскільки розкапування забезпечує добрий розкид хромосом і знижує КІЛЬКІСТЬ пластин з ПОЛІПЛОІДНИМ та анеуплоідним набором хромосом При цьому, відпадає необхідність у повторних заборах біологічного матеріалу Спосіб виконують наступним чином сформовану культуру амнюцитів синхронізують заміною середовища росту, через 16-20 годин вносять 0,50,8мкг/мл колхіцину на 5-6 годин Далі культуру промивають, знімають зі скла трипсин-версеном та скрейпером, суспензію клітин центрифугують, ппотонізують 0.075М розчином КСІ, фіксують стандартним фіксатором (етанол оцтовою льодяною кислотою) та розкапують на предметні скла Приклад 1 Тетяна О , 22 роки, вагітність перша, 23-24 тижні, скерована на швазивну пренатальну діагностику у об'ємі амнюцентезу з приводу завищеного у 2,5 рази альфа-фетопротешу у крові, відносного багатовіддя та двобічних пієлоектазій плоду Клітини амнютичної рідина, отримані під час амнюцентезу, культивували до формування куль 00 ю 58404 тури амнюцитів, проводили заміну середовища з метою синхронізації клітин Через 16-20 годин у середовище вводили колхіцин в концентрації 0,50,8мкг/мл на 5-6 годин Далі середовище зливали, культуру промивали розчином HEPES та вносили по 3-4мл розчину трипсин-версену Через 2-3 хв розчин відсмоктували, а культури залишали ще на 5-6хв при кімнатній температурі Після цього флакони заливали середовищем, скрейпером зшкрябували решту клітин із дна флакона, клітини відцентрифуговували, до клітинної суспензії додавали 3-4мл 0.075М теплого розчину КСІ на 15хв, проби центрифугували, вводили стандартний охолоджений фіксатор етанол оцтова льодяна кислота в пропорції 3 1 Фіксацію проводили при кімнатній температурі протягом 30-40хв Суспензію клітин розкопували на предметні скла Приклад 2 Валентина Б, 36 років, 1-ша вагітність 17-18 тижнів Скерована на швазивну пренатальну діагностику в об'ємі амнюцентезу з приводу вікового цензу, заниженого рівня альфа-фетопротешу та завищеного хорюгонічного гонадотропшу в крові вагітної У рідного брата - син з синдромом Дауна Клітини амнютичної рідини культивували до формування культури амнюцитів, культуру синхронізували заміною середовища Через 16-20 годин у середовище вводили колхіцин в концентрації 0,5-0,8мкг/мл на 5-6 годин Далі середовище зливали, культуру промивали розчином HEPES та вносили 3-4 мл розчину трипсин-версену Через 2Зхв розчин відсмоктували, а культури залишали ще на 5-6хв при кімнатній температурі Після цього флакони заливали середовищем, скрейпером Комп'ютерна верстка Т Чепелсва зшкрябували решту клітин із дна флакона, клітини відцентрифуговували, до клітинної суспензії додавали 3-4мл 0.075М теплого розчину КСІ на 15хв , проби центрифугували, вводили стандартний охолоджений фіксатор етанол оцтова льодяна кислота в пропорції 3 1 Фіксацію проводили при кімнатній температурі протягом 30-40хв Суспензію клітин розкапували на предметні скла Запропонований спосіб використаний при 25 дослідженнях При цьому, у 20 випадках вдалося отримати більше 50 метафазних хромосомних пластин на скло з повним набором хромосом, придатних для аналізу, а у 5 випадках - 25-30 метафаз на скло з повним набором хромосом, придатних для аналізу, в той час як при використанні способу найближчого аналога в усіх 25 випадках отримані 10-15 метафазних пластин на скло Таким чином, використання запропонованого способу дозволяє збільшити вихід якісних препаратів хромосом при зменшенні КІЛЬКОСТІ клітинного матеріалу Джерела інформації 1 Гринберг К Н , Кухаренко В И , Золотухина Т В / / Методические рекомендации по культивированию клеток для диагностики наследственных болезней человека - М -1990 -С 19-22 2 Современные проблемы в клинической цитогенетике (под редакцией Н П Кулешова) - М 1991-С 103-104 3 Арбузова С Б , Хлевная Л А , Малова С А Усовершенствованная методика культивирования и фиксации амниоцитов человека // Биополимеры и клетка-1998- Т 14, №6 - С 559-560 - найближчий аналог Підписано до друку 05 08 2003 Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна