Спосіб одержання тріпептидів

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРИПЕПТИЛОВ общей формулы X-y-W-NH 2 , где X - L-пироглутамил, V -пироглутамил, L-6-кетопипеколил,L -кетоимидазолидин-4-карбонил, L -тиазолидин-4-карбонил; У - 1. -норвалил, Ц -лейцил; п - L -пролил, D -пролил, Ь - и з о лейцил, L -гомопролил,L -пипеколип,L -тиаэолидин-4-карбонил, з - а к л ю ч а ю щ и й с я в том, что амид аминокислоты общей формулы H-W-NH2 , гдеW имеет указанные значения, ацичируют пентафторфенил овы?^ эфиром N-трет-бутилоксикарбониламинокислоты общей формулы Вос-У-ОРір, где Вое - трет-бутилоксикарбонил \ р£р - пентафторфенил; у имеет указанные значения, из полученного защищенного дипептида общей формулы Вос-У-\М- МИ2 , где Вое, У и W имеют указанные значения , путем ацилолиэа получают свободный дипептид общей формулы H-y-W~NH2l где у HW имеют указанные значения, который ацилируют пентафторфениловым эфиром N -карбобензоксиаминокислогы общей формулы Z -X-OPfp, где Z - бензилоксикарбонилj X и Р имеют указанные значения, до получения защищенного трипептида общей формулы Z -Х-У-W- H H 2 l где Z *Х, У и W имеют указанные значения , из которого путем каталитического гидрирования удаляют N-концевую защитную группу. ел 1 О 8 " r> L! Ь Изобретение относится к способу получения новых трипептидов - биологически активных соединений, которис могут найти применение в медицине . В пептидной химии широко используют способ получения пептидов путем ступенчатого наращивания пептидной цепи, начиная с С-концевой аминокислоты с помощью активированных эфиров U -защищенных аминокислот, например, пентафторфенидовых эфиров [і] Цель изобретения - получение новых трипептидов, обладающих ценными фармакологическими свойствами. Поставленная цель достигается способом получения трипептидов общей формулы X-y-Vj-HH2l [I) где X ~L -пироглутамил,D -пироглутамил , U-б-кетопипеколил , 1кетоимидазолидин-4-карбонил, і, -тиазолидин-4-карбонил -г У ~ L -норвалил , L -лейцил-, W - L -пролил,D -пролил, I -иэолейцил, L -гомопролил,L -пипеколил, L-тиаэолидин-4-карбонил, заключающимся в том, что амид аминокислоты общей Формулы H-\N-NH2, (Ш где W - имеет указанные значения ацилируют пентафторфениловым эфиром N-трет бутилоксикарбониламинокислоты общей формулы Вос-У-ОРІр, (ІПІ где Вое - трет-бутилоксикарбонил; Pfp - пентафторфенил; У - имеет указанные значения, из полученного защищенного дипептида общей формулы: НРго Кіс 10 15 20 25 30 40 - L -гомопролин; -Ь-2-кетоимидазолидин~4- * карбоновая кислота; Крс - L-6-кетопиперидин-2-карбоновая кислота; Р-р - и пипеколиновая кислота; Tea -L -тиазолидин-4-карбоновая кислота; ДЦГК - дициклогексилкарбодиимид; ДЦН - дици іш orексилмочевина; Pf p-OH - пеитафторфенол; ДМФД - диметилформамид. Оптическое вращение измеряют с помощью поляриметра "Perkin-Elmer 141". Тонкослойную хроматографию проводят на пластинках "Kieselgel G nach Stahl" фирмы "Иегск" ФРГ в следующих системах растворителей: 1. Хлороформ:метанол - 9:1. 2. Этилацетат:(пиридин:уксусная кислота: вода - 20:6:11) - 95:5. 3 . Этилацетат :(пиридин: уксусная кислота: вода - 20:6:11)' - 9:1. 4. Этилацетат: (пиридин:уксусная кислота:вода - 20:6:11) - 8:2. 5. Этилацетат: (пиридин:уксусная кислота: вода - 20:6:11) -3:2. 6. Этилацетат: (пиридин:уксусная кислота:вода - 20:6:11) - 2:3. Пятна на хроматограммах детектируют с помощью раствора нингидрина с последующим выдерживанием в течение 5 мин при 105°С и раствором толидин-йодистый калий после предварительной обработки газообразным хлором. Очистку конечных соединений осуществляют с помощью колоночной хроматографии с использованием в качестве сорбента "Силикагеля 6" фирмы "Merck" (ФРГ) с величиной частиц 0,062 - 0,2 нм. 5 ) П р и м е р 1- АмидЬ -пироглугде Вое, У и W - имеют указанные знатамил-Ь-лейцил-Ь-пипеколиновой кисчения, лоты. путем ацилолиза получают свободный Стадия 1 Ь Хлоргидрат амидаL -лей45 цил-1-пипеколиновой кислоты. дипептид общей формулы Н-У-№-МН 2 ( (V) 1,54 г (12 ммоль) H P - р-МН 2 суспен-.i где У и W - имеют указанные значедируют в 20 мл ДМФА, добавляют ния, Б, 16 г ( 1 ммоль) Boc-LeuGPfp, .3 который ацилируют пентафторфенило1,6 8 мл (12 ммоль) триэтиламина вым эфиром N -бензилоксикарбонил5 0 при перемешивании. Полученный растаминокислоты общей формулы вор упаривают в вакууме и полученX -X-OPfp. (VI) ное в остатке масло растворяют в где 1 - бонзилоксикарбонилЇ X и Pfp— 6 0 мл хлороформа. Раствор смешивают имеют указанные значения, с 0,2 мл 2-(диметиламино)-этиламидо получения защищенного трипептида на, через 5 мин промывают 1 н. растобщей формулы вором соляной кислоты (3 раза по 20 м л ) , і н. раствором бикарбоната 2 где 7. ,Х, У и W имеют указанные знанатрия (3 раза по 20 мл) и водой чения , (3 раза по 20 мл) , сушат над безиз которого путем каталитического 60 водным сульфатом натрия и упаривают. гидрирования удаляют N-концевую заОстаток растворяют в 3 мл этилацещитную группу- . тата и смешивают раствор с 10 мл В примерах, поясняющих практи5 н. раствора соляной кислоты в этилческое выполнение предлагаемого ацетате. Через 1 ч реакционную смесь способа получения трипептидов, исразбавляют эфиром, выпавший осадсж • пользованы следующие сокращения: 1085 SOS док растирают со смесью э гилацетата отфильтровывают и L-ушат в вакууме и эфира. В и т о г е , получают 1,33 г над безводным сульфатом натрия. (87,5%)сЄ p-Leu-Pflp-NH?. R,=0,60 (5) , В итоге получают 3,12 г (94%) 4 О [Ы]У=-86,4 ( О 1 . АсОН) . H-Leu-Pip- 4 2 »Ll. '$=0,46 (5) Элементный а н а л и з . Аминокислотным анализ. С Еи 0,95 (1,0); Leu 1,0 (1,0) ; PJ p 0,95 (1,0). 5 « Рассчитано,%: С 5 7 , 9 4 , Н 8 , 0 1 , W 15,90. Элементный анализ . C(7H;gN4O4 ( юл. вес 35 2,44) Рассчитано,*: С 15,90, н 8,01, Найдено,*: С 5 7 , 7 7 , Н,8,20 N15,90. С Н N П 2Я°4 1 ( м о л . в е с 352 , 44> Найдено,%: С 5 7 , 7 7 ; Н 8 , 2 0 ; N 15,83. Стадия 2. Амид б е н э и л о к с и к а р б о нил-L -пироглутамил-L л е и ц и л - Ь - п и п е колиновой кислоты. 3,13 г ( 1 1 , 2 ммоль}, H-Leu-p, p-NH a Ю М 15,83. Аминокисло1ный а н а л и з . ££и 0,95 ( l f 0 ) , Leu 1 , 0 ( 1 , 0 ) , Р, р 0,95 (1,0). П р и м е р 2. Амид L -пироглутамил-1д-лейцил-1-тиазолидин~4-карбоновой кислоты. 15 Стадия 1. Хлоргидрат амида I и 4,94 г 1(11,5 ммоль)Z -te.p~OPfp р а с лейцил-Ь-тиазолидин-4-карбоновой творяют в 35 мл Д Ф и р а с т в о р смеН А кислоты. 1 шивают с 1,57 мл ( l l , 2 ммоль) три1,81 г (11 ммоль) Н-Тса-МН2НСЄ с у с э т и л а м и н а . Реакционную смесь перемепендируют в 30 мл Д Ф и смешивают М А шивают 5 мин, добавляют 1,57 мл 20 с 3,97 г (10 ммоль) Boc-L ea-OF-fp, (Д1 , 2 ммоль) три э тилами на , переме1,49 г (11 ммоль) 1 - о к с и - б е н э т р и а ч о шивают в т е ч е н и е 20 мин и упаривают ла и 1,22 мл (11 ммоль) N -метилв в а к у у м е . Остаток растворяют в морфолина. Полученный р а с т в о р о т с т а 5 0 мл хлороформа и р а с т в о р промываивают в течение ночи при комнатной ют 1 н . раствором соляной кислоты 25 т е м п е т р а т у р е , затем упаривают в в а (2 р а з а по 30 мл) т \ н . раствором кууме и о с т а т о к растворяют в 80 мл б и к а р б о н а т а натрия (з р а з а по 30 мл) хлороформа. Р а с т в о р промывают 1 н* и 30 мл воды. Органическую фазу высушивараствором соляной кислоты (3 р а з а ют над безводным сульфатом натрия и по 20 м л ) , 1 н. раствором карбонаупаривают. Аморфный о с т а т о к переме30 та натрия (3 р а з а по 20 мл) и 10 мл шивают с холодным эфиром, эфир д е воды, высушивают над безводным с у л ь кантируют и оставшееся масло вносят фатом натрия и упаривают в вакууме. в н - г е к с а н до з а т в е р д е н и я . ПолученХлопьевидный аморфный о с т а т о к р а с т ный таким образом аморфный продукт воряют в 5 мл э т и л а ц е т а т а , смешива( 4 , 7 г) кристаллизуют из смеси э т и л 35 ют с 10 мл 7 н. р а с т в о р а соляной а ц е т а т - эфир. Получают 3,32 г (б1%) кислоты и э т и л а ц е т а т а . Через 1 ч 2 - t E p - L e U - P i р ~ М Н 2 . т . п л . 143-144°С, реакционную смесь разбавляют эфиром R 4 =O,51 (4) , [ и и 0,84 мл (б ммоль) триэтиламина. добавляют 0 , 2 г 10%-ного палладия Смесь перемешивают в течение 2 0 мин на активированном угле в к а ч е с т в е при комнатной температуре, затем к а т а л и з а т о р а и пропускают в р е а к ц и упаривают в вакууме. Остаток раствоонную смесь газообразный водород ряют в 50 мл хлороформа и раствор в т е ч е н и е 1 ч . Затем к а т а л и з а т о р отфильтровывают, фильтрат упаривают, 5Ь промывают 1 н. раствором соляной кислоты (З раза по 10 мл], 1 н. р а с т о с т а т о к растирают с эфиром. Полувором бикарбоната натрия (3 раза ченный таким образом сырой продукт по 10 мл) и 10 мл воды. Органическую ( 1 , 4 8 г) растворяют в 2 мл воды, фазу упаривают, остаток растирают осветляют активированным углем и отфильтровывают. В фильтрате р а с т 60 с эфиром и полученный сырой продукт очищают многократным осаждением из воряют 4 г х л о р и с т о г о натрия и смеси этилацетат - эфир. Получают р а с т в о р промывают хлороформом (3 1,64 г (56%)Z -СЄр-Leu-NIV . Т.пл. р а з а по 10 мл) Органическую фазу вы108-1Ю°С, R t =0,46 (4) , [ « Д 5 1 3 О сушивают над безводным сульфатом н а т р и я , упаривают и аморфный о с а £5 s 1O8S0OS алия Ч, Лмил U-пчроглутамнлі-тиа '•олилин- 4-карбоновой кисло гы, 1,6 2 г (3,3 ммоль) 1 -CPp-Leu-TcaN Н 2 растворяют в 6 мл охлажденного льлом 3,5 н. раствора бромистого водорода в ледяной уксусной кислоте. Раствор отстаивают в течение 1 , 5 ч при Q - 5°С. Затем реакционную смесь разбавляют эфиром, верхнюю фазу декантируют и оставшееся масло растворяют в 20 ^ воды. Водный раствор нейтрализуют твердым бикарбонатом натрия и - сстраги> руют эфиром (3 раза по 10 м л ) . Водную фазу упаривают в вакууме, остаток растворяют в 20 мл хлороформа, раствор высушивают безводным сульфатом натрия и упаривают. Аморфный остаток растирают с эфиром и высушивают. Полученнын сырой продукт (1/ 13 г) растворяют в элюирующей жидкости (4}, вводят в колонку, заполненную 20 г силикагеля. Колонку элюируют той же самой смесью растворителей. Из фракции, содержащей сырой продукт, выделяют 0,78 г аморфного продукта. Этот продукт растворяют в 20 мл воды, раствор осветляют активированным углем и лиофилизуют. Получают 0,6 2 г СЕрLeii-Tca-NH^ (53% от теории). Щ = 0,53 С5| , М о = - 1 4 5 , 0 й (С=1^ Ас0Н) ^ Аминокислотный анализ. СЄи 0,94 (1,0); Leu 1,0 (1,0) . П р и м е р 3. АмидL -пироглутаммл-[д-лейцил-1)-пролина. Стадии 1. Хлоргидрат амида: -L лейцил-1)-пролина. 0,91 г (8 ммоль) H-D-Pro-NH^ и 3,2 (8 ммоль) Boc-Leu-Opfp растворяют в 3 0 мл ДМФА, смешивают с 1,12 мл (8 ммоль) триэтиламина. Реакционную смесь выдерживают в течение ночи и затем упаривают. Остаток р а с т в о ряют в 6 0 мл хлороформа, раствор промывают 1 н. соляной кислотой (2 р а з а по 20 мл) , 1 н. раствором гидроокиси натрия (3 р а з а по 20 мл) и 20 мл Боды, сушат над безводным сернокислым натрием и упаривают. Остаток растворяют в 5 мл этилацет а т а , смешивают с 7 мл 4 н. р а с т в о ра хлористого водорода в э т и л а ц е т а т е . Реакционную смесь через 1 ч разбавляют эфиром, образовавшийся осадок отфильтровывают и сушат в вакууме над безводной гидроокисью натрия. В итоге получают 1,54 г (73%) H-Leu-Рг o-NH2HCP. Стадия 2. Амид бензилоксикарбонил-Ь-пироглутамил-Ь-лейцил-О-пролина. 1,54 г (5,8 ммоль) H-Let*- -Pro NH^ HCt растворяют в 20 мл ДМФА, смешивают с 0,81 мл (5,8 ммоль) триэтиламина и 2,58 г (б ммоль} 10 15 20 25 ЗО 35 40 45 50 55 Z -CEp-OpJp. Реакционную смесь пере мешивают 5 мин, добавляют 0,81 мл ( 5 , 8 ммоль) триэтитамина, перемешн'вают 10 мин и упаривают в вакууме. Остаток растворяют в 6 0 мл хлороформа, раствор промывают 1 н. р а с т в о ром соляной кислоты (3 раза по 15 мл) 1 н. раствором гидроокиси натрия (3 р а з а по 15 мл) и 15 мл воды, высушивают над безводным сульфатом натрия и упаривают. Аморфнмй о с т а ток растирают с эфиром. Полученный сырой продукт (2,1 г ) п е р е к р и с т а л л и з о вывают из 5 мл э т и л а ц е т а т а . В итоге получают 1,8 г (66г) Z - CEp-Leu-"DPro-MlLj. Т . п л . 153-157°С, R=0,38 (4) [оП --24 5°С (с = 1, АсОН) Стадия 3. Амид L-пироглутамилL -лейцил-0~пролин. 1,5 г ^ 3 , 2 5 ммоль) Z - Ctp-l*eu-D-Pn> НН^ растворяют в 70 мл метанола, раствор 11смешивают с 0,3 г 10%-ного палладия на активированном угле в к а ч е с т в е к а т а л и з а т о р а и пропускают через раствор водород в т е чение 1 ч , отфильтровывают катализ а т о р , фильтрат упаривают и аморфный о с т а т о к смешивают с эфиром. Полученный сырой продукт 0,94 г растворяют в в о д е , раствор о с в е т л я ют активированным углем и отфильтровывают, фильтрат лиоАилизуют. Получают 0,87 г ( 7 9 % С Є p-Leu-D-Pfo 1 ЦН 2 . ^=0,47 ^5);tо-МН2 НСР суслапы, установленные на столбике выпендируют в 20 мл ДМФА и при пересотой 7 см, не могли координиромешивании добавляют 0,84 мл (6 ммопьі вать свою поэииию в течение 30 с. триэтиламина и 2,3 г (6 ммоль) ВоеИз числа животных, не показавших Nv а-ОР{р. Через 15 мин добавляют каталепсии, путем проббитаналиэа 0,84 мл (6 ммоль) триэтиламина, определяли соответствующее Е р 5 0 - знаперемешивают 1 ч и упаривают в вачение для отдельных эффективных векууме . Остаток растворяют в 50 мл ществ . хлороформа, раствор промывают 1 н,э раствором соляной кислоты, 1 н. •>•* Опыты проводили с мужскими особяраствором гидрокарбоната натрия ми крыс, имеющими вес 160 - 180 г. (2 раза по 10 м л ) , высушивают над 2. Потенци-ирование локомоторной безводным сульфатом натрия и упаактивности мышей, вызванной с помощью ривают. Полученное в остатке масЦ-допа. ло растворяют в 6 мл этилацетата 60 Животным ввутрибрюшинно вводят в дои смешивают с 10 мл б н. раствора зе 40 мг/кг N-метил-№-пропаргилсоляной кислоты в этилацетате, чебенэиламина (паргилин) , а затем рез 1 ч реакционную смесь разбавля20 мг/кг ТРГ или описываемого триют эфиром, аморфный осадок растирапептида, подлежащего исследованию, ют и высушивают в вакууме над без£5 и,наконец, 100 мг/кгЬ-допа. Через 15 1085S05 ЗО, 60 и 90 мин после указанной обработки была измерена локомоторная активность животных. Установленные значения приведены в таблице в процентах, считая на значения, полученные с животными, обработанными ТРГ. Для этих опытов используют по 15 мышей-самцов весом 18-22 г. 3.Реэерлино-гипотермическое возвратное действие на мышей. Мышей-самцов весом 18-22 г, разделяют на группы по 10 животных, внутрибрюшинно вводят резерпином дозами 5 мг/кг. Через 16 ч животным вводят дозами по 20 мг/кг ТРГ или трипептида, подлежащего исследованию. Измеряют ректальную температуру животных перед обработкой резерпином (в таблице: "норм."), через 16 ч после обработки резерпином ^в таблице: "рез.") и через 1 или 2 ч после введения исследуемого трипептида (в таблице "после обработки") . 3 таблице указаны средние значения ректальной температуры, измеренной у групп по 10 мышей. 4. Влияние на продолжительность сна, вызванного гексобарбиталом. Мышам-самцам , разделенным на группы по 10 животных, Внутривенно вводят по 60 мг/кг гексобарбптала натрия, через Ю мин после этого ^животным внутрибрюшинно вводят дозами по 20 мг/кг веса ТРГ или исследуемый трипептид, подлежащий исследованию. Время сна указано в таблиX-y-2-NH2 Торможение галоперидольной каталепсии, 10 15 20 25 30 це в процентах, считая на значения, измеренные у животных контрольной группы (_средние значения для групп по 10 животных). 5. Этанольный наркоз. Мышам смешанного пола весом по 182 2 г, разделенным на группы по 20 животных , вводят внутрибрюшинно по 4,5 этанола. Через 10 мни после этого животным вводят внутрибрюшинно в дозе 20 мг/кг исследуемый трипептид. Время сна в таблице указано в процентах (среднее значение рпя группы по 20 животных), считая на значения, измеренные у животных контрольной группы. 6. Гормональная активность (ТРГдействие ) у крыс. Крысам-самцам (Wistar) с весом около 200 г, разделенным на группы по 7-8 животных, вводят внутривенно дозами по 20 мг/кг ТРГ или исследуемый трипептид. ТРГ-реакцию животных определяют через 15 мин после введения ТРГ или исследуемого трипептида из плазмы животного,в результате радиоиммунного исследования. Относительная эффективность рассчитана по методу четырех пунктов, при этом эффективность ТРГ принимали за 100. Средние значения биологической эффективности соединений общей формулы (1) , определенные в результате описанных фармакологических методов, представлены в таблице. Kpc-Leu-Pro 23,5 Возврат резерпино- Время Время ТРГсна, сна, вой гипотермии/ дейректальная темпе- выз- вызствие ванно- ванноратура, С го го 30 60 06 гекса-* этаномин мин мин мин норм. рез г 1 ч 2 ч б ар б и- лом, талом, % , к к конк кон- трольтроль- ным ным живот- ным ным 79 60 319 80 127 36,3 24,5 32,0 33,9 37 Kpc-Nva-Pro 10,6 30 Glp-Leu-Tca Glp-Leu-Pip Kpc-Nva-HPro мк/ кг Потенциирование L-допа локомоторной активное ти, %, после 45 65 63,3 23,9 33,1 32,5 51 46 0 31.4 120 171 142 52 36,2 24,9 33,1 32,2 39 53 0 38.5 120 35,3 15 201 63 89 30 112 108 36,4 36,3 24,6 30,7 31,0 38 20,7 26,5 32,2 76 60 35 7,2 36 D-Glp-Leu-Pro 70 15 54 58 115 36,5 27,4 25,8 25,6 97 54 0 Kic-Leu-Pro 80 30 118 70 98 35,5 24,1 27,7 28,8 59 69 0 ТРГ 80 15 100 100 100 36,2 25,9 35,5 30,2 56 35 100 П р и м е ч а н и е . Время гексобарбитального сна: ,(XtE) 38,4±Д,Зб мин', ; , - время этаноль'ного сна: (хіЕ), 46,9І2,17 мин. 17 1085505 Из данных таблицы видно, что опитакже такие аналоги ТРГ, у которых сываемые аналоги ТРГ обладают зна** в положении 1 находится 6-кетопипе чительным действием на центральную калиновая кислота. У этих проиэводиых гормональное действие ТРГ либо нервную систему. С этой точки зреполностью отсутствует, либо воспро ния особенно преимущественными являются такие производные, у которых 5 изводится до минимума, причем одновременно оказываемое на ценв положении 2 ТРГ-молекулы стоит тральную нервную систему дейалифатическая аминокислота с прямоствие увеличивается существенлинейной или разветвленной углеродно, в некоторых случаях даже в ной цепью. Предпочтительными являются с точки зрения этого действия 10 8 раз. Редактор н.Другая Составитель О.Галкин Техред А.Бабинец Корректор О.Билак Заказ 2047/56 Тираж 410 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная,4