Мутантний інтерлейкін-6 людини, молекула днк, що його кодує, вектор, клітина-хазяїн, а також спосіб одержання та використання мутантних il-6 для лікування захворювань, при яких il-6 має патогенний вплив

Область техники, к которой относится·изобретение. Настоящее изобретение относится к новому IL-6 мутеину (мутантному интерлейкину 6), кодирующей его последовательности ДНК и его применению в терапии, в том числе и в составе композиций. Предпосылки изобретения. Интерлейкин 6 выделяется в плазму во время травм или инфекций различными типами клеток. Он вовлечен в спектр активностей таких как иммунная защита, гематопоезис, созревание мегакариоцитов, образование тромбоцитов, острый фазовый ответ. [1] Играя ключевую роль в защите организма - хозяина IL-6 вовлечен в патогенез многих болезней таких как плазмоцитома/миелома, остеопорозис, неопластические и автоиммунные заболевания. [1] Рецепторный - комплекс IL-6 на клетках-мишенях состоит из двух различных субъединиц: 80 килодальтонной специфической лиганд связывающей субъединице и (IL6-Ra) и 130 килодальтонного сигнал трансдуцирующего белка (gp130). (2-4) IL6 (интерлейкин 6) связывается с лиганд связывающей субъединицей (IL6-Ra) и комплекс IL6/IL6Ra ассоциирует с димером gp130, посредством этого инициируя сигнал интерлейкина 6 (IL6). Сам по себе интерлейкин 6 (IL-6) не обнаруживает доступного измерению сродства к gp130 (сигнал-трансдуцирующему белку). [5. 6] Интерлейкин 6 является белком характеризующимся N-концевой вариабельностью. Ранее было показано [7], что он состоит из 184 аминокислот. (Эта нумерация аминокислот далее будет применена в заявке.) Предсказанием вторичной структуры белка на основе моделирования показано, что IL6 является членом семейства гематопоетических цитокининов, характеризуемым четырьмя антипараллельными аспиралями (А, В, С и D) [8, 9]. LIF (нгибиторный фактор лейкемии), CNTF (ресничный или мерцательный нейротропический фактор), IL 11 (интерлейкин 11), СТ 1 (кардиотропин) и OSM 1 (онкостатин М) также принадлежит к этому семейству. Все они используют белок gp130 в их рецепторном комплексе, что объясняет их перекрывающиеся биологические активности. [1, 10, 11] Делеционным анализом IL6 (интерлейкина 6) показано, что 28 N-концевых аминокислотных остатков не являются необходимыми для биологической активности ' молекулы. Удаление более чем 28 аминокислот инактивирует белок.(12) Дальнейшим изучением предсказано, что С-конец А-В петли/начало В спирали (район 2с, остатки G77-E95) вовлечены во взаимодействие с IL6Raa (лигандcвязывающей субъединицей) [9, 13-16]. Данный результат был подтвержден недавней публикацией модели IL6 (интерлейкина 6) человека [9], где эти два района ближайшие к области прикрепления. К настоящему времени идентифицированы два сайта взаимодействия IL6 (интерлейкина 6) с gp130 (лигандсвязывающей субъединицей). 1 Эпитопным картированием белка IL6 (интерлейкина 6) с нейтрализацией mAbs предоставлены доказательства, что остатки Q152-T162 (начало D-спирали) вовлечены во взаимодействие с gp130 (лигандсвязывающей субъединицей). [17-18]. Анализом химерных белков IL6 (интерлейкинов 6) человек/мышь показано наличие эпитопа внутри начала А-В петли IL6 (интерлейкина 6), вовлеченной в контактирование и активацию gp130 (лигандсвязывающей субъединицы). [9, 19] Недавно этот результат был подтвержден посредством демонстрации того, что лейцин 57 вовлечен в это взаимодействие. [20] Этот район находится в непосредственной близости к началу D спирали, поэтому эти два района вместе формируют один общий сайт взаимодействия с одним gp130 (лигандсвязывающей субъединицей). [9, 19, 21] 2 Второй сайт взаимодействия с gp130 (лигандсвязывающей субъединицей), был найден по аналогии с комплексом GH (ростовым гормоном)/GHR2, структура которого была определена с использованием рентгеноструктурного анализа. (22) Было предсказано, что части GH (ростового гормона) важные для взаимодействия со вторым GHR (рецептором) являются аналогичными с (частями) IL6 (йнтерлейкина 6) с одним из gp130 (лигандсвязывающей субъединицей). [23, 24]. В действительности замена двух аминокислот в А спирали (Y31D/G35F) и двух аминокислот в С-спирали (S118R/V121D) также приводит к мутантному белку IL6 (интерлейкину 6) с близким к нормальному связыванием IL6-Ra (рецептора), но не активному биологически. Эти четыре аминокислоты вероятно важны для 'взаимодействия со вторым белком gp130 (лигандсвязывающей субъединицей). [24, 25]. 3 Принимая во внимание обсуждавшееся ранее участие IL6 в патогенезе некоторых заболеваний, разработка ингибиторов активности IL6 (интерлейкина 6) является объектом активного изучения. Для достижения этой цели были применимы различные подходы, включая использование антител для IL-6 (интерлейкина 6), gp130 (лигандсвязывающей субъединицы), или др 80; применение растворимого gp130 (лигандсвязывающей субъединицы) мутантных белков для IL-6 (интерлейкина 6), или рецепторов IL-6 (интерлейкина 6). Заявитель исследовал возможность синтеза новых мутантных белков IL-6 (интерлейкинов 6), действующи х как антагонисты рецептора IL-6 (интерлейкина 6). С этой целью одним из научных подходов являлся синтез мутантов сохраняющих способность связывания с IL-6Ra, но теряющих способность использовать gp130 (лигандовязывающую субъединицу). Однако оптимальной молекулой является такая, которая не проявляет IL-6 активности (активности йнтерлейкина 6), но имеет более высокое сродство к рецептору IL-6Ra, чем IL-6 (интерлейкин 6) и содержит настолько меньше мутаций насколько это только возможно для IL-6, учитывая уменьшение риска антигенности. Раскрытие изобретения Заявителем было обнаружено, что комбинация точковых мутаций в положении 54 с двумя мутациями F170L/S176R увеличивающих сродство к IL-6Ra, и двух мутаций Q159E/T162P, уменьшающих зависимость взаимодействия с gp130 (лигандсвязывающей субъединицей), полученных на мутантах человеческого IL-6 (интерлейкина 6) сохраняющих сродство связывания с рецепторами, но не способных связываться с gp130 (лигандсвязывающей субъединицей). В частности, основным объектом данного изобретения является мутированный IL-6 человека, имеющий аминокислотную последовательность, представленную на фигуре 2, и на нуклеотидной последовательности с идентификационным номером 1, так же как и их внутренние фрагменты. Эта молекула вела себя как эффективный антагонист человеческого IL-6 на миеломе клеток линии XG-1 и показывает преимущества, описанные выше. Другим объектом изобретения является молекула ДНК, заключающая в себя и последовательность №:1, кодирующую полипептид, также как и его варианты, полученные в результате вырожденности генетического кода, или в результате точковых мутаций, кодирующи х полипептиды, имеющие одинаковую активность с полипептидом, представленным на №1. Следующим объектом настоящего изобретения является плазмидный вектор, содержащий нуклеотидную последовательность предмета изобретения. Следующим аспектом настоящего изобретения обеспечение использования этого белка в качестве медикамента. В частности это связано с использованием заявленного белка в производстве медикаментов для лечения болезней, в которых IL-6 имеет патогенное действие, таких как например плазмоцитома/миелома, остеопорозис, и неопластические и автоиммунные болезни. Медикаменты, преимущественно в форме фармацевтических смесей, содержащих белок представленный в изобретении вместе с одним или более фармацевтически приемлемых носителей и / или оболочек. Такие фармацевтические формы смесей также являются дальнейшим аспектом, настоящего изобретения. Одним из методов приготовления изобретенного мутантного белка является метод с использованием технологии ПЦР и синтетических олигонуклеотидов, содержащих несовпадения в основаниях, подлежащих мутированию в качестве праймеров. Экспрессия рекомбинантных белков изобретения, как описано здесь, может происходить в эукариотических клетках (таких как клетки дрожжей, насекомых или клетки млекопитающих) или прокариотические клетки, используя соответствующие вектора экспрессии. Может быть использован любой из известных методов (экспрессии). Например, ДНК молекула, кодирующая полипептид изобретения, вставляется соответствующим образом в сконструированные векторы экспрессии, с помощью техники известной из предшествующего уровня те хники (см. Sambrook et al, 1989). Двунитевая кДНК соединяется·с плазмидными векторами гомополимерным наращиванием или рестрикционным связыванием, включающим использование синтетических ДНК линкеров или техникой лигирования по тупым концам: ДНК лигаза используется для лигирования ДНК молекул и нежелательное, объединение избегается обработкой щелочной фосфатазой. Для того, чтобы быть способным экспрессировать, желательный протеин, вектор экспрессии должен включать также специфическую муклеотидную последовательность, содержащую транскрипционную и трансляционную регуляторную информацию, связанную с ДНК, кодирующей желательный протеин, путем, дающим возможность генной экспрессии и продукции белка. В первую очередь, для того, чтобы ген, транскрибировался, перед ним должен стоять промотор, узнаваемый РНК полимеразой, с которым полимераза связывается и таким образом инициирует транскрипционный процесс. Имеется множество таких промоторов для использования, которые работают с различной эффективностью (сильные и слабые промоторы). Для эукариотических хозяев могут быть применены различные транскрипционные и трансляционные последовательности, в зависимости от природы хозяина. Они могут быть получены из вирусных источников, таких как аденовирус, вирус папиломы крупного рогатого скота, вирус Симиана или сходных вирусов, где регуляторные сигналы ассоциированы с определенным геном, имеющим высокий уровень экспрессии. Примерами являются ТК промотор вируса герпеса, ранний промотор SV40, дрожжевой промотор gа14 гена и т.д. Регулярные сигналы инициации транскрипции, которые делают возможными репрессию и активацию, могут быть подобраны так, что может быть модулирована экспрессия генов. ДНК молекула, включающая в себя нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид изобретения, вставляется, в вектор(ы), имеющие операбельно связанные регуляторные сигналы транскрипции и трансляции, позволяющие интегрировать желательные генные последовательности в клетки хозяина. Клетки, которые были стабильно трансформированы введенной ДНК, могут отбираться введением· также одного или более маркеров, которые допускают селекцию клеток хозяина, содержащих вектор экспрессии. Маркер может · также предусматривать фототрофность для ауксотрофных хозяев, биоцидную устойчивость, например, к антибиотикам или тяжелым металлам, таким как медь или похожим. Селектируемый маркерный ген может быть либо напрямую связан с ДНК экспрессируемой генной последовательности или введен в ту же клетку котрансфекцией. Дополнительные элементы могут также быть нужны для оптимального синтеза протеинов изобретения. Факторы, необходимые в селекции специфической плазмиды или вирусного вектора включают: легкость, с которой реципиентные клетки, которые содержат вектор, могут быть узнаны и отселектированы от тех реципиентных клеток, которые не содержат вектор; количество копий вектора,, которое желательно в специфическом хозяине и желательна ли способность быть челночным вектором между клетками хозяина и различными другими видами. В то же время вектор(ы) или последовательности ДНК, содержащие конструкцию(и), полученные для экспрессии последовательности ДНК, могут быть введены в соответствующие клетки хозяина различными подходящими методами: трансформацией, трансфекцией, конъюгацией, слиянием протопластов, электропорацией, осаждением в фосфате кальция, прямой микроинъекцией и так далее.· Клетки-хозяева могут быть как прокариотическими так и зукариотическими. Преимуществом обладают эукариотические хозяева, например, клетки млекопитающих, таких как человек, обезьяна, мышь, клетки из яичников китайского хомячка (СНО), поскольку они проводят посттрансляционную модификацию белковых молекул, включая правильное свертывание или гликозилирование в нужном сайте. Дрожжевые клетки также могут производить посттрансляционную модификацию белков, включая гликозилирование. Ряд рекомбйнантных стратегий с использованием сильных промоторных последовательностей и высококопийных векторов, которые могут быть использованы для экспрессии требуемого белка в дрожжах. Дрожжи узнают лидерную последовательность клонированного генного продукта млекопитающих и секретируют пептид вместе с лидерной последовательностью (т.е. как препептид). После введения вектора(ов), клетки хозяина выращивались на селективной среде, где отбирались только вектор-содержащие клетки. Экспрессия клонированных генов приводила к продукции желаемого белка. Очистка рекомбинантного белка проводится любым из известных для этой цели методов, любым методом, включая экстракцию, осаждение, хроматографию, электрофорез и т.д. Преимущественным методом очистки заявленного белка является аффинная хроматография с использованием иммобилизованных на гелевой матрице колонки моноклональных антител, связывающихся с белкоммишенью. Неочищенные препараты, содержащие рекомбинантный белок пропускались через колонку. Белок будет оставаться на колонке специфически связываясь с антителами, в то время как примеси будут проходить сквозь нее. После отмывки, белок элюируется с колонки посредством изменения рН или ионной силы раствора. Изобретение далее будет описано в нижеследующи х примерах, которые не могут быть использованы никаким путем, поскольку защищены данным изобретением. Краткое описание чертежей Фиг.1 Точковые мутанты белка IL-6 (интерлейкина 6) человека. (А) Изображение белка IL-6 (интерлейкина 6) человека с четырьмя предсказанными а-спиралями показано заштрихованными прямоугольниками. Цифрами показаны первые и последние остатки а-спирали. Представлена аминокислотная последовательность районов 2с и 2а с их субрайонами внутри района 2а 1 и 2а2 для человеческого (наверху) и мышиного IL-6 (внизу). Присутствуют полученные точковые мутации в районе 2а. (В) Представлено выравнивание 2а района IL-6 (интерлейкинов 6) различных организмов. (С) Ленточная модель человеческого IL6. Изображение F78 (внизу) важно для связывания с рецептором IL6-Ra и К54 (наверху) важный для IL-6-Rа-зависимого взаимодействия с gp130 (лигандсвязывающей субъединицей). N-конец соответствуе т остатк у 17 человеческого IL-6 (Ehlers et al. 1994). Фиг.2 Нуклеотидная последовательность человеческого IL-6 мутеина (мутантного интерлейкина 6), объекта настоящего изобретения. Она содержит пять точковых мутаций по сравнению с человеческим IL-6 (интерлейкином 6), в положениях 54, 159, 162, 170, 176. Эти-замены выделены жирным, (шрифтом). Фиг.3 Связывание и биологическая активность точковых мутантов по позиции К54 человеческого IL-6 (интерлейкина 6). Связывание мутеина IL-6 (мутантного интерлейкина 6) с растворенным человеческим рецептором IL-6Ra. Представлено среднее из двух экспериментов. (В) деление клеток мыши линии В9 и (С) человеческих линии XG-1 в ответ на IL-6 мутанты. Представлен один из трех экспериментов. (D) Индукция экспрессии гаптоглобина IL-6 мутеином в клетках гепатомы человека. Количество требуемого для 50% экспрессии гаптоглобина человеческого IL-6 принято за 100%. Фиг.4 Связывание и биологическая активность точечных мутантов в положении К54 в комбинации с EPLR. (А) Связывание мутеина IL-6 (мутантного интерлейкина 6) с растворимым человеческим IL-6Ra. Представлено среднее из двух экспериментов. (В) деление клеток мыши линии В9 и (С) человеческой линии XG-1 в ответ на IL-6 мутанты. Представлен один из трех экспериментов. (D) Индукция экспрессии гаптоглобина IL-6 мутеином в клетках гепатомы человека. Показано количество экспрессии гаптоглобина в присутствии 1мкг/мл мутеина. Представлено среднее из двух экспериментов. Фиг.5 Эффект антагонизма точковой мутации К54 в комбинации с EP-LR на IL6 человека индуцированном делении клетках линии XG-1. Указанные концентрации IL6 мутантов добавлялись XG-1 в присутствии 100пкг/мл человеческого IL-6 и измерялось клеточное деление. Представлено среднее из двух экспериментов. ПРИМЕРЫ Материалы и методы Реактивы Эндонуклеазы рестрикции Асе I, EcoNI, Hind III, Nco I, Nhe I и Xba I были получены от компании AGS (Гейдельберг, Германия), полинуклеотидкиназа, щелочная фосфатаза тимуса теленка и Т4 ДНК лигаза получены от компании Bpehringer Mannheim (Манхейм, Германия). Эндонуклеаза рестрикции BspEl и Vent ДНК полимераза поставлены компанией NEN Biolabs (Швальбах, Германия) и среды для культур клеток получены от Gibco (Эггенстейн, Германия). Реагент Болтона-Хантера (74Тб k/mmol) и метка tran[S35] получены от фирмы Amersham (Амершам, Англия). Олигонуклеотиды бьши получены от фирмы Pharmacia (Фрейбург, Германия). Козьи и кроличьи поликлональные сывороточные антитела против человеческого гаптогяобина были предоставлены компанией Sigma (Дейзенховен, германия) и щелочная фосфатаза-конъюгант осла поликлональная сыворотка против иммуноглобулина G кролика из компании Pierce (Рокфорд, США). кДНК человеческого IL-6 были получены от докторов Т. Хирано, Т.Хишимото (Осака, Япония). Плазмида для бактериальной экспрессии pRSET 5d и организм-хозяин BLD 21 (DEЗ) был описан ранее Shopfer et al., [26] После замены сигнальной последовательности на кодон старта трансляции, кДНК кодирующая IL-6 человека была клонирована на вектор pRSET 5d по сайтам рестрикции Nco І и Hind ІІІ. [27]. Клетки человеческой миеломы линии XG-1 были в основном предоставлены доктором Б.Клейном (Нант, Франция). Растворимый IL-6Ra (интерлейкин-6Ка) был экспрессирован в E.coli, ренатурирован и очищен [28]. Поликлональные моноспецифические антитела против IL-6Ra (интepлeйкинa-6Ra) были приготовлены введением части экстрацеллюларного. домена растворимого белка IL-6Rа (интерлейкина-6Ra) кроликам [28]. Конструкция, векторов экспрессия Для введения точковых мутаций в районе аминокислоты 54 в интерлейкине-6 (pRSET 5d-huIL-6-K54X), четыре олигонуклеотида были вставлены и лигированы в EcoNl-Nhel рестрикт pRSET5d-мутанта 2а [9]. Олигонуклеотидами были: 5'ААС ATGTGTGAAAGC AGCGATGAGGCG3' смысловая последовательность (K54D) (№2) 5'СТАGCGCCTC ATCGCTGCTTTC ACAC3' антисмысловая последовательность (K54D) (№3) 5'AAC ATGTGTGAAAGC AGCGAAGAGGCG3' смысловая последовательность (K54E) (№4) 5'СТАGCGCCTCTTCGCTGCTTTC AC AC3' антисмысловая последовательность (K54E) (№5) 5'AAC ATGTGTGAAAGC AGCTTTGACGCG3' смысловая последовательность (K54F) (№6) 5'СТАGCGCCTC AAAGCTGCTTTC ACAC3' антисмысловая последовательность (K54F) (№7) 5’AAC ATGTGTGAAAGC AGC AATGAGGCG3' смысловая последовательность (K54N) (№8) 5’СТАGCG-CCTCATTGCTGCTTTC ACAC3' антисмысловая последовательность (K54N) (№9) 5’AAC ATGTGTGAAAGC AGCCCCGAGGCG3' смысловая последовательность (K54P) (№10) 5'СТАGCGCCTCGGGGCTGCTTTC ACAC3' антисмысловая последовательность (K54P) (№11) 5'GAAAGGAGAC AT'GTAАС АAGAGT3' смысловая последовательность (№12) 5'ATGTTACTCTTGTTACATGTCTCCTTT3' антисмысловая последовательность (№13) Чтобы объединить точковые мутации в районе аминокислоты 54 с двумя точковыми мутациями F170L/S176R (кратко обозначаемыми, LR) и две точковые мутации Q159E/T162P (кратко обозначаемыми, ЕР), были сконструированы векторы pRSET 6d-huIL-6-EP-K54X-LR лидированием фрагментов Ncol-Xbal комплементарной ДНК из pRSET-5d-huIL-6-K54X в Ncol-Xbal рестрицированный вектор pRSET 6d-huIL-6Q159E/T162P-2a2-F170L/S17R (кратко обозначаемыми, pRSET 6d-huIL-6-EP-2a2-LR) (19). Целостность всех конструкций была подтверждена анализом рестрикционных фрагментов и сиквенсом [29]. Приготовление белков Бактерии BL21(DEЗ) были трансформированы вектором экспрессии pRSET. Генная·экспрессия и ренатурация белков, переведенных в растворимое состояние из телец включения были произведены и описаны [27, 30, 31]. Ренатурированные белки были очищены до >90% гомогенности. Чистота рекомбинантных белков была проверена 12,5% SDS-PAGE и окрашиванием солями серебра. Связывание XL-6 (интерлейкина-6) с растворимым IL-6Ra (рецептором-6Ra) Очищенные IL-6 (интерлейкин-6) мутантные белки были последовательно разведены в PBS содержащем 0.02% TWEEN 20/0.2%BSA и добавлены к 1нг. человеческого 125I-IL-6 (интерлейкина-6) (60.000-90,000cpm/нг) и 1.7нг растворимого человеческого IL-6Ra (peцепторa-6Ra) экспрессированного в E.coli (28) до конечного объема 500мкл. После инкубации в течение ночи при 4°С IL-6/sIL-6Ra комплексы были иммунопреципетированны с использованием IL-6Ra (рецептор-6Ra) антисыворотки и протеин А Сефарозы, радиоактивность была подсчитана счетчиком Гейгера. Биологические анализы Для анализа пролиферации мышиных клеток В9 и человеческих линий XG-1, L-6 (интерлейкин-6) мутантные белки были последовательно разведены до концентраций, показанных на фигурах. Анализы выполнялись как описано ранее [32, 33]. Одна единица В9 соответствовавшая приблизительно 1пг человеческого IL-6 (интерлейкина-6) на мл, вела к половине от максимальной пролиферации клеток В9. С человеческими клетками XG-1 половина максимальной пролиферации была получена после стимуляции с 50пг/мл человеческого IL-6, Для анализа секреции белка в фазе пика, клетки гепатомы человека (Hep 3B) культивировались на среде Игла в модификации Дульбекка (DMEM) с 10% эмбриональной бычьей сывороткой, распределены на 96-луночные планшеты для культуры клеток и оставлены для достижения связывания. Клетки были отмыты PBS, хранились 1ч в DMEM без эмбриональной бычьей сыворотки, и потом были обработаны 20ч в 100мл свободной от сыворотки DMEM с возрастающими количествами IL-6 (интерлейкин-6) мутантных белков. Количество гаптоглобина секретированного в культуральную среду определялось фермент-связывающим иммуносорбентным анализом [34]. РЕЗУЛЬТАТЫ Аминокислота К54 IL-6 (интерлеихина-6) вовлечена, в IL-6Rа-зависимое gp130 взаимодействие Исследования, с человеческими/мышиными IL-6 химерными белками показали, что область 2а2 (остатки 50-55) IL-6 (интерлейкина-6) белка необходима для IL-6Ra (интерлейкин-6Ra)-зависимого взаимодействия с gр130 [19] (Фиг.1Α). Замена этих остатков против Соответствующи х мышиных аминокислот имела результатом уменьшение связывания с gр130 и 30-ти кратное снижение биоактивности человеческих XG-1 клеток. Выравнивание с десятью видами IL-6 (интерлейкина-6) показала, что внутри 2а2 области положительно заряженная К54 сохраняется в 8 видах, но меняется на отрицательно заряженную аспарагиновую кислоту в мышиной и крысиной аминокислотной последовательности [35, 36] (Фиг.1В). Поэтому произведена замена К54 (Фиг.1С) на аминокислоты показанные на Фиг.1А. Процедура клонирования привела" также к трем двухточечным мутациям IL-6: C44F/K54E, C50F/K54N и B52R/K54N, которые были также проанализированы (Фиг.1Α). Для исследования влияния К54 точковых мутаций на IL-6Ra-зависимое gр130 взаимодействие, проведено, в первую очередь измерение связывания IL-6Ra путем замещения человеческого 125I-IL-6, связанного с растворимой формой белка IL-6Ra на избыток точковых мутантов. Как показано на Фиг.3А, непомеченный человеческий дикий вариант IL-6 замещал человеческий 125I-IL-6, связываясь на 50% при использовании 10-20-кратного молярного избытка. Точковый мутант К54Р и двойной мутант S52R/K54N показал в 10 раз большее сродство, чем человеческий IL-6 (интерлейкин-6) , тогда как мутант К54Е имел в три раза меньшее сродство, чем huIL-6 к IL-6Ra. Другие исследованные мутанты показали сходное сродство с человеческим IL-6 (интерлейкином-6). Кроме того, мутанты стимулировали пролиферацию IL-6 (интерлейкин-6)-зависимых В9 клеток в той же мере, что и человеческий IL-6 (интерлейкин-6), что демонстрирует интактность их структуры (Фиг.3В). В клетках миеломы XG-1 и клетках человеческой гепатомы характер биоактивности IL-6 мутеина была: К54>S52R/K54N>huIL-6=K54F>K54D>К54Е>C50F/K54N>C44F/K54E, Так, мутанты К54Р и S52R/K54N имевшие наивысшее сродство к IL-6Ra (рецептору-6Ra) также показывали наивысшую биоактивность на человеческих клетках. Замена положительно заряженного лизина 54 против соответственно отрицательно наряженной аспарагиновой кислоты имела результатом только слегка ослабленную биоактивность в человеческих клетках, тогда как замена на Glu (глутаминовую кислоту) имела результатом существенное снижение (10-кратное) биоактивности. Недавно, было показано на мыши, что введение остатков 50-55 (область 2а2) и двух точковых мутаций F170L/S176R (обозначение, LR), которые повышают сродство к IL-6Ra (рецептору IL-6Ra), в двойной мутант Q159E/T162P (обозначение IL-6-EP), которые обнаруживают пониженное взаимодействие с gр130, приводит в результате к IL-6 мутеину (интерлейкин-6 мутантному белку) с о тсутствием биоактивности в человеческих клетках [19]. Сродство этого IL-6 мутанта (IL-6-EP-2a2-LR) к человеческому IL-6Ra (рецептору-6Ra) было схожим с таковой к человеческому IL-6 (интерлейкину-6). Этот IL-6 мутант был эффективным антагонистом рецептора IL-6 в высоко чувстви тельных человеческих IL-6 зависимых клетках линии миеломы человека XG-1. Были введены К54 мутанты в мутанты IL-6-EP-LR. Полученные в результате IL-6 мутантные белки были названы IL-6-EP-K54X-LR, где X обозначает все мутации введенные в позицию 54 (Фиг.1А). Мутант IL-6-EP-C44F/K54E-LR и мутант IL-6-EP-K54E-LR обнаружили пониженное сродство к человеческому IL-6Ra (рецептору-6-Ra), тогда как все другие мутанты вели себя как человеческий IL-6 (Фиг.4А). Пролиферация мышиных клеток В9 была сильно снижена для мутантов IL-6-EP-2a2-LR и IL-6-EPS52R/K54N-LR. Все другие-мутанты были приблизительно в 5-10 раз менее активны, чем человеческий IL-6 (Фиг.4В). В противоположность к этому, величина пролиферации клеток человеческой, миеломы XG-1 снижается на три порядка для мутантов IL-6-EP-LR, IL-6-EP-K54F-LR и IL-6-EP-S52R/K54N-LR (Рис.4С). Все другие мутанты не обнаруживали регистрируемой биоактивности. В человеческих Нер3В клетках только мутанты IL-6-EP-LR и IL-6-EP-K54F-LR обнаруживали остаточную активность (Фиг.4D). Когда мутанты без биоактивности были добавлены в возрастающих количествах к человеческим клеткам миеломы (XG-1) стимулированных 100пг/мл человеческого IL-6, было обнаружено ингибирование пролиферации. Фиг.5 показывает, что прибавление мутантов IL-6-EP-2a2-LR и IL-6-EP-K54P-LR приводит к 50% ингибированию пролиферации при ·приблизительно 100нг/мл, тогда как все другие мутанты были приблизительно в 5-10 раз менее эффективны. ОБСУЖДЕНИЕ АМИНОКИСЛОТА К54 ЯВЛЯЕТСЯ ЧАСТЬЮ gр130 СВЯЗАННОГО ЭПИТОПА Все IL-6 мутеины (интерлейкин-6 мутантные белки) с К54, замененной, различными аминокислотными остатками эффективно связывались с человеческим IL-6Ra (рецептором-6Ra). Интересно, что введение Р54 и двойной мутации S52R/R54N приводило к IL-6 (интерлейкинам-6) с более высоким сродством к человеческому IL-6Ra (рецептору-6Ra). С тех пор как 2а2 область, которая" включает остаток 54, была идентифицирована как участвующая во взаимодействии с gр130 [19], это указывает, скорее всего, на непрямой эффект. Сделано предположение, что присутствие Р54 или заряженной аминокислоты аргинина в положении 52 приводит к перемещению петли между спиралью А и спиралью В, посредством изменения местоположения области 2С, которая напрямую вовлечена в IL-6Ra (рецептором-6Ra) взаимодействие. Замена консервативного для восьми видов лизина 54, на аспарагиновую кислоту, являющуюся консервативной для мыши и крысы, ведет к слабому снижению активности, тогда как замена на глутаминовую кислоту, приводит к существенному снижению (в 10 раз) биоактивности. Хотя глутаминовая кислота несет боковую цепь на одну метальную группу длиннее, чем аспарагиновая кислота, похоже что расстояние между заряженной группой и человеческим IL-6Ra (рецептором-6Ra) существенно. Исходя из этих данных, возможно предсказать, что мутация по положению К54 взаимодействует с отрицательно заряженными остатками в положении 54 человеческого IL-6, приводя к восстановлению узнавания между gр130 и IL-6/IL-6Ra комплексом. Мутация в цистеинах положения 44 или 50 в IL-6 мутеине (мутантном интерлейкине-6) приводят к слабой потере биологической активности, что подтверждается недавними результатами Rock с соавторами (34), сумевшим продемонстрировать, что замена цистеинов в положениях 44 и 50 не приводит инактивации IL-6 мутеина. Взаимодействие лиганда с рецептором. Структура комплекса гормона роста человека с его рецептором (GH/GHR2) была показана в работе [22]. Сайт взаимодействия гормона роста с его рецептором многократно подвергался мутагенезу [38-40] и оценен вклад каждого аминокислотного остатка в энергию связывания [44]. С тех пор как комплекс ростовой гормон/его рецептор являются единственной парой из семейства гемопоетических цитокинов, чья структура разрешена на атомном уровне, она является парадигмой для других членов семейства. Для комплекса ростовой гормон/рецептор известно, что зпитоп взаимодействия для обоих состоит примерно из 30 аминокислотных остатков [41]. Однако вклад этих аминокислотных остатков не одинаков. Основной вклад в энергию связывания производят два гидрофобных взаимодействия. Это ядро связывания окружено менее важными для контакта остатками, которые в основном гидрофильны и частично гидратированы, они дают примерно треть вклада в энергию связывания. Существует теория, что такое определение сайтов связывания применимо и к другим взаимодействиям типа - лиганд/рецептор. [41]. Однако, как считается, К54 является одним из остатков окружения центрального района взаимодействия IL-6/gр130, имеющего слабый вклад в энергию взаимодействия. Относительно сильный эффект замены К54Р в антагонисте IL-6 мутеине является следствием структурных изменений в петле АВ. Антагонисты рецептора IL-6. Как известно, были идентифицированы два района вероятно контактирующие с gр130, (І) 2а2 район (остатки 50-55) и лейцин 57 комплиментарный вершине спирали D IL-6, [2] эпитет сформированный частями спиралей А, и D [9, 18-21, 23, 24]. Для связывания IL-6 с IL-6Ra необходим конец А-В петли (остаток 78), также как и С-конец белка (9,13-16). Ясно, что две молекулы gp130 необходимы для инициации сигнала и весьма вероятно, что роль двух сайтов взаимодействия с gp130 на IL-6 заключается во взаимодействии с двумя белками gр130. Перестройки вблизи обоих сайтов взаимодействия с gр130 приводили к образованию молекул способных связываться с рецептором, но не способных инициировать сигнал. Было показано, что такие молекулы могут быть использованы в качестве антагонистов рецептора для IL-6 [19, 21, 23, 24]. Факт одновременного увеличения связывающей характеристики IL-6 мутеина по отношению к IL-6Ra привел к так называемым суперантагонистам [19, 21, 24], что предполагает возможность изменения связывающих свойств различных субъединиц рецептора по какому либо независимому варианту. Новый антагонист рецептора IL-6, представленный в данной заявке на патент, содержит единственную К54Р замену в 2а2 районе, и тем не менее является столь же эффективным, как и недавно сконструированный IL-6 мутеин с пятью аминокислотными заменами в районе 2а2 [19]. Интересно, что мутантный К54Р белок показал большее связывание с IL-6Ra, чем IL-6, в то время как, комбинация мутантов ЕР и LR показала нормальное связывание. Говоря о терапевтическом потенциале антагонистов цитокиновых рецепторов понятно, что чем меньше аминокислот изменяется, тем меньше шанс, что .антагонист будет антигеном. Исходя из этой точки зрения IL-6 мутеин и IL-6-EP-K-54P-LR являются улучшением антагонистов рецептора IL-6 доступных ранее. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Akira, S et al., Ad v. Immunol. 54:1, 1993. 2. Yamasaki K. et al, Science 241:825, 1988. 3. Taga, T. et aL, Cell 58:573, 1989. 4. Hibi, Metal, Cell 63:1149, 1990. 5. Zohlnhöfer, D. et al., FEBS Lett. 306:219, 1992. 6. Murakami, Μ et aL, Science 260:1808, 1993. 7. Hirano, T. et al. Nature 324:73, 1986. 8. Bazan, J.F., Immunol. Today 11:350, 1990. 9. Efalers, M., J. Immunol. 153:1744, 1994. 10. Pennica, D. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 92:1142, 1995. 11. Pennica, D. et al., J. Biol. Chem. 270:10915, 1995. 12. Brakenhofi; J.P.J. et al., J. Immunol. 143:1175, 1989. 13. Krüttgen, A. et aL, FEBS Lett. 262:323, 1990. 14. Krüttgen, Α., et aL, FEBS Lett. 273:95, 1990. 15. Lutticken, C. et al., FEBS Lett. 282:265,1991. 16. Leebeck, F.W.G et aL, J. Biol. Chem. 267:14832,1992. 17. Brakenhoff; J.P.J, Serono Symp. Pub. Raven Press. 88:33, 1992. 18. Brakenho£ J.P.J., J. BioL Chem. 269:86, 1994. 19. Ehlers, M. et aL, J. BioL Chem. 270:8158, 1995. 20. De Hon, F.D. et aL, FEBS Lett. 369:187, 1995. 21. De Hon, F.D. et al, J. Exp. Med. 180:2395, 1994. 22. De Vos, A.M. et aL, Science 255:306, 1992. 23. Savino, К et al, EMBO J. 13:281,1994. 24. Savino, R et aL, EMBO J. 13:5863, 1994. 25. Paonessa, G. et aL, EMBO J. 14:1942, 1995. 26. Schoepfer, К et aL,. Neuron 5:393, 1990. 27. Van Dam, M.et aL, J. Biol. Chem. 268:15285, 1992. 28. Stoyan, Т., Eur. J. Biochem. 216:239, 1993. 29. Sanger, F. et aL, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74:5463, 1977. 30. Studier, F.W. et al., Meth. En zymol. 185:60, 1990. 31. Arcone, R. et al., Eur. J. Biochem. 198:541, 1991. 32. Aarden, LA et al., Eur. J. Immunl. 17:1411, 1987. 33. Zhang, X.-G. et al., Blood 76:2599, 1990. 34. Salvati, A.L. et aL, J. BioL Chem. 270:12242, 1995. 35. Van Snick, J. et al., Eur. J. ImmunoL 18:193, 1988. 36. Nortbemann, W. et aL, J. Biol. Chem. 264:16072,1989. 37. Rock, F.L. et aL, Biochem. 33:5146,1994. 38. Cunningham, B.C.et al, Science 244:1081, 1989. 39. Cunningham, B,C. et al., J. Моl Biol. 234:554, 1993. 40. Bass, S.H et aL, Proc. NatL Acad. Sci. U.S.A. 88:4498, 1991. 41. Clackson Т., et aL, Science 267:383, 1995. Перечень последовательностей (і) характеристики последовательности 1 (a) длина 212 аминокислот (b) тип аминокислоты (c) цепь (d) топология линейная (ii) тип молекулы - белковая (iii) негипотетическая (iv) антисмысловая (ν) тип фрагмента: N-концевой (νί) признаки (a) имя/ключ: белок (b) местонахождение 1.....184 (vii) описание последовательности с идентификационным номером 1 (2) информация для идентификации последовательности N2 (і) характеристики последовательности; (a) длина 27 пар оснований (b) тип нуклеиновая кислота (c) цепи одноцепочечная (d) топология линейная. (іі) тип молекулы геномная ДНК (iii) не гипотетичеекая (iv) описание последовательности 2 AAC ATGTGTG AAAGC AGCGATGAGGCG, (2) информация для идентификации последовательности 3 (і) характеристики последовательности; (а) длина 26 пар оснований (b) тин нуклеиновая кислота (c) цени одноцепочечная (d) топология линейная (ii) тип молекулы геномная ДНК (iiі) не гипотетическая (iv) описание последовательности 3 CTAGCGCCTC ATCGCTGCTTТС АСАС (2) информация для идентификации последовательности 4 (і) характеристики последовательности 4 (a) длина 27 пар оснований (b) тип нуклеиновая кислота (c) цени одноцепочечная (d) топология линейная (ίί) тип молекулы геномная ДНК (iii) не гипотетическая (iv) описание последовательности 4 AAC ATGTGTGAAAGC AGCGAAGAGGCG (2) информация для идентификации последовательности 5 (і) характеристики последовательности 5 (a) длина 26 пар оснований (b) тип нуклеиновая кислота (c) цени одноцепочечная (d) топология линейная (іі) тип молекулы геномная ДНК (iii) не гипотетическая (iv) описание последовательности 5 CTAGCGCCTCTTCSGCTGCTTТС АС АС (2) информация для идентификации последовательности 6 (і) характеристики последовательности 6 (a) длина 27 пар оснований (b) тип нуклеиновая кислота (c) цепи одноцепочечная (d) топология линейная (іі) тип молекулы геномная ДНК (iii) не гипотетическая (iν) описание последовательности 6 AAC ATGTGTGAAAGC AGCTTTGAGGCG (2) информация для идентификации последовательности 7 (і) характеристики последовательности 7 (a) длина 26 пар оснований (b) тип нуклеиновая кислота (c) цепи одноцепочечиая (U) топология линейная (іі) тип молекулы геномная ДНК (ііі) не гипотетическая (іν) описание последовательности 7 CTAGCGCCTC AAGCTGCTTТС АСАС (2) информация для идентификации последовательности 8 (і) характеристики последовательности 8 (a) длина 27 пар оснований (b) тип нуклеиновая кислота (c) цепи одноцепочечиая (d) топология линейная (іі) тип молекулы геномная ДНК (iii) не гипотетическая (iv) описание последовательности 8 AACTGTGTGAAAGC AGC AATGAGGCG (2) информация для Идентификации последовательности 9 (і) характеристики последовательности 9 (a) длина 26 пар оснований (b) тип нуклеиновая кислота (c) цепи одноцепочечная (d) топология линейная (іі) тип молекулы геномная ДНК (ііi) не гипотетическая (iv) описание последовательности 9 CTAGCGCCTC ATTGCTGCTTТСАС АС (2) информация для идентификации последовательности 10 (і) характеристики последовательности 10 (a) длина 27 пар основании (b) тип нуклеиновая кислота (c) цепи одноцепочечная (d) топология лилейная (іі) тип молекулы геномная ДНК (ііі) не гипотетическая (iv) описание последовательности 10 AAC ATGTGTGAAAGC ACCCCCGAGGCG (2) информация для идентификации последовательности 11 (і) характеристики последовательности 11 (a) длина 26 пар оснований (b) тип нуклеиновая кислота (c) цепи одноцепочечная, (d) топология линейная (іі) тип молекулы геномная ДНК (ііі) не гипотетическая (iv) описание последовательности 11 CTAGCGCCTCGGGGCTGCTTТС АСАС (2) информация для идентификации последовательности 12 (і) характеристики последовательности 12 (a) длина 23 пар оснований (b) тип нуклеиновая кислота (c) цепи одноцепочечная (d) топология линейная (іі) тип молекулы геномная ДНК (ііі) не гипотетическая (iv) описание последовательности 12 GAAAGGAGAC ATGTAAC AAGAGT (2) информация для идентификации последовательности 13 (і) характеристики последовательности 13 (a) длина 27 пар оснований (b) тип нуклеиновая кислота (c) цени одноцеиочсчиая (d) топология линейная (ii) тип молекулы геномная ДНК (ііі) не гипотетическая (iv) описание последовательности 13 ATGTTACTCTTGTAC ATGTСТССТТТ